纳豆芽孢杆菌的培养方法及其应用
纳豆芽孢杆菌的培养方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纳豆芽孢杆菌的培养方法及其应用，具体涉及纳豆芽孢杆菌的培养方 法、利用该培养方法制备饲料原料和纳豆芽孢杆菌在提高含豆柏物料中赖氨酸含量和/或 粗蛋白含量中的应用。
【背景技术】
[0002] 在饲料工业中，蛋白质饲料占有重要的地位，是配合饲料生产过程中补充饲料蛋 白不足必不可少的饲料原料。蛋白质饲料的代表性饲料有植物性饼柏、动物性鱼粉、血粉和 微生物蛋白饲料等。植物性饼柏是饲料行业中最重要的植物性蛋白饲料，其中以大豆饼柏 应用最为广泛，它是一种优质的蛋白质饲料来源，是各种配合饲料中的重要成分。
[0003] 赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，在饲料中添加适量的赖氨酸有利于动物 的生长、改善氨基酸平衡、提高饲料利用率、节约蛋白质资源。在饼柏类饲料中添加限制性 氨基酸，可以替代鱼粉，降低饲料成本，改善肉的品质，添加赖氨酸能改善屠体质量，提 高瘦肉率。
[0004] 近年来，动物性蛋白在逐渐减少，大豆饼柏作为作为较理想的蛋白饲料源而被大 规模使用。大豆柏的粗蛋白含量在30%-40%之间，必需氨基酸比例组成较好，饲料配合中 需添加赖氨酸以增加饲料氨基酸营养的全面性和均衡性。随着微生物在饲料行业上的研宄 深入，微生物菌种在饲料中的应用逐步受到人们的关注。微生物发酵技术在豆柏的研宄已 在国外展开，据国外研宄表明：大豆柏经微生物发酵后，赖氨酸等限制性氨基酸含量明显曾 加，蛋白质的利用率进一步提高，同时增加饲料原料中可以利用的种类，可为幼畜、幼禽和 水产养殖提供优质蛋白来源。
[0005] 纳豆芽孢杆菌是在二十世纪中期被发现并且分离培养出来，它具有很高活性的蛋 白酶、脂肪酶和淀粉酶，能够降解植物性饲料中的某些复杂的碳水化合物，分解蛋白质。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何提高饲料用大豆柏的赖氨酸含量和/或粗蛋 白含量。
[0007] 为解决以上技术问题，本发明提供了一种纳豆芽孢杆菌的培养方法。
[0008] 本发明所提供的纳豆芽孢杆菌的培养方法，包括在含豆柏的培养基中培养纳豆芽 孢杆菌，其中，所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6,其在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 10535 ;所述含豆柏的培养基包括有机碳源和有 机氮源，所述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆柏组成。
[0009] 为解决以上技术问题，本发明提供了饲料原料（发酵豆柏）的制备方法。
[0010] 本发明所提供的饲料原料（发酵豆柏）的制备方法，包括在上述含豆柏的培养基 中培养上述纳豆芽孢杆菌得到发酵物，所述发酵物为所述饲料原料。
[0011] 为解决以上技术问题，本发明提供了上述纳豆芽孢杆菌在提高上述含豆柏的培养 基中赖氨酸含量和/或粗蛋白含量中的应用。
[0012] 上述应用中，所述含豆柏的培养基具体可为含豆柏物料。
[0013] 上述方法和应用中，所述麦麸可为小麦麦麸，和/或所述豆柏可为大豆柏。
[0014] 上述方法和应用中，所述有机碳源和有机氮源中所述豆柏的质量含量大于0小于 等于15%。
[0015] 上述方法和应用中，所述有机碳源和有机氮源中所述豆柏的质量含量可为 5% -10%或 10%〇
[0016] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基还含有用于培养芽孢杆菌的无机盐。
[0017] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基具体可由所述有机碳源和有机氮源、无 机盐和水制成。
[0018] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基中所述无机盐可由K2HPO4, KH2PO4, MgSO4 和（NH4)2SO4组成。所述无机盐中K2HPO 4, KH2PO4, MgSO4和（NH4)2SO4的质量比可为2 :1 :1 : 10。
[0019] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基中所述有机碳源和有机氮源与所述无机 盐的质量比可为500:7。
[0020] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基中水的含量使所述含豆柏的培养基的含 水量为30% -40%即可。
[0021] 上述方法和应用中，所述有机碳源和有机氮源和所述无机盐均以干重计。
[0022] 上述方法中，所述培养的温度可为32_35°C，所述培养的时间可为72-120小时。
[0023] 上述方法中，所述含豆柏的培养基的pH为6. 8-7. 2。
[0024] 实验证明，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6接种豆柏含量不同的固体发酵 培养基进行发酵后，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6产量比不添加大豆柏的100% 麦麸固体发酵培养基分别平均增长118. 26%、206. 40%和141. 34%，其中10%豆柏固体发 酵培养基的NF01-6产量可达2. 92 X 109cfu/g，比对照增加206. 40%，表明本发明的纳豆芽 孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6在10%豆柏固体发酵培养基中的产量与100%麦麸固体 发酵培养基相比，显著增加。5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发酵培养基和15%豆 柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋白 含量比不接菌的对照分别增加3. 626%、4. 557%和0. 191%，赖氨酸含量比对照分别增加 25. 60 %、45. 60 %和38. 50 %。其中，10 %豆柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢杆菌（Baci I Ius natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋白含量为43. 59%，比对照增加4. 557%，赖氨酸含 量为2. 65%，比对照增加45. 60%。表明含大豆柏培养基接种纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535进行固体发酵后粗蛋白和赖氨酸增加效果明显，有效的提高 了植物蛋白中赖氨酸含量，提高了植物性蛋白饲料可利用性，具有较高的实用性和可推广 性。本发明在植物性蛋白饲料应用领域具有广阔的前景。
[0025] 保藏说明
[0026] 菌种名称：纳豆芽孢杆菌
[0027] 拉丁名：Bacillus natto
[0028] 菌株编号：NFOl _6
[0029] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0030] 保藏机构简称：CGMCC
[0031] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0032] 保藏日期：2015年2月6日
[0033] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 10535
【具体实施方式】
[0034] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535液体培养基的配制方法： 蛋白胨 5g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，MnSO4 · H2O 5mg，用水定容至 lOOOmL，pH 值为 6. 8-7. 2。
[0036] 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535固体培养基的配制方 法：蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，MnS04.H20 5mg，琼脂22g，用水定容至1000mL，pH值为 6. 8_7. 2〇
[0037] 实施例1、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535的保藏及培养
[0038] 1、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的分离、鉴定和保藏
[0039] 取自然发酵的大豆柏，用平板（蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂22g，用水定 容至100〇1111^口!1值为6.8-7.2)划线分离方法得到纳豆芽孢杆菌（1^(3；[11118 1^1:1:0)即01-6。 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6已于2015年02月06日保藏于中国普通微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10535。
[0040] 2、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535 的斜面培养
[0041] 挑取该菌种，对其用上述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535 固体培养基进行斜面培养，在32 °C下培养40h。
[0042] 3、菌种的液体培养
[0043] 挑取步骤2斜面培养的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535， 将其接种于500mL上述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535液体培养 基中，32 °C恒温摇床220r/min培养30h。
[0044] 4、菌株的鉴定
[0045] 4. 1、形态学鉴定
[0046] 将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的纳豆芽孢杆 菌（Bacillus natto)NF01-6进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿 润度、菌落表面状态（是否平坦、突起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放 射状等）。另一方面，对处于对数生长期的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6,经涂片 染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
[0047] 结果表明纳?芽抱杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535菌体杆状，大小 (0. 7-0. 8) μ mX (1. 5-1. 8) μ m，运动，鞭毛侧生。革兰氏阳性。内生孢子，具有较强耐热性。 芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，生长温度最高为45-55?，最 低为5-20°C。菌落近似圆形，边缘参差不整齐，表面微皱褶，不光滑，不透明。
[0048] 4. 2、16S rDNA 序列分析
[0049] 采用菌落PCR方法扩增纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6的16S rDNA片段 并克隆测序。结果表明纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6具有SEQ ID No. 1的16S rDNA片段序列。
[0050] 4. 3、生理生化特征鉴定
[0051] 参考《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京： 科学出版社，2011.)和《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Second Edition Volume Three》测定纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的生理生化特征。
[0052] 结果表明纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6好氧生长；接触酶阳性；V-P反 应阳性；利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖和木糖；水解淀粉、酪素；明胶液化；利用柠檬 酸盐；可还原硝酸盐；不利 用尿素。
[0053] 鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列分析结果，将纳豆芽孢杆菌 (Bacillus natto)NF01_6 鉴定为纳豆芽抱杆菌（Bacillus natto)。
[0054] 实施例2、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的固体发酵培养
[0055] 1.发酵菌种活化：
[0056] 将冷冻干燥保藏的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6菌种在培养基（蛋白 胨 5g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，MnS0 4·Η20 5mg，蒸馏水 100〇1111，？!1值为6.8-7.2，琼脂粉228， 121°〇灭菌3〇11^11)固体斜面划线转接，32°〇培养4011。
[0057] 2.种子液制备：
[0058] 将活化的一支斜面上的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6全部接种于装有 IOOrnl液体种子培养基（蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，MnS0 4·Η20 5mg，121°C灭菌30min) 的500ml三角瓶中，置220rpm摇床，32°C，培养30h，种子液制备完毕。
[0059] 3.配制固体发酵培养基：
[0060] 配制如下四种固体发酵培养基：100%麦麸固体发酵培养基、5%豆柏固体发酵培 养基、10 % S柏固体发酵培养基、15 % S柏固体发酵培养基。
[0061] 100%麦麸固体发酵培养基的配制方法如下：l〇〇〇g小麦麦麸、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg (NH4)2SO4,用石灰水调pH值为7. 0,使含水量为35% (质量百分含量）， 装入可灭菌的袋子，121°C灭菌40min。灭菌结束后冷却，得到100%麦麸固体发酵培养基。
[0062] 5%豆柏固体发酵培养基的配制方法如下：950g小麦麦麸、50g大豆柏、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg(NH4)2SO4,用石灰水调pH值为7.0,使含水量为35% (质量百分含 量），装入可灭菌的袋子，121°0灭菌4〇11^11。灭菌结束后冷却，得到5%豆柏固体发酵培养 基。
[0063] 10 %豆柏固体发酵培养基的配制方法如下：900g小麦麦麸、100g大豆柏、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg (NH4)2SO4,用石灰水调 pH 值为 7.0,使含水量为 35% (质量 百分含量），装入可灭菌的袋子，121°C灭菌40min。灭菌结束后冷却，得到10%豆柏固体发 酵培养基。
[0064] 15 %豆柏固体发酵培养基的配制方法如下：850g小麦麦麸、150g大豆柏、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg (NH4)2SO4,用石灰水调 pH 值为 7.0,使含水量为 35% (质量 百分含量），装入可灭菌的袋子，121 °C灭菌40min。灭菌结束后冷却，得到15%豆柏固体发 酵培养基。
[0065] 上述四种固体发酵培养基的配制方法中，除石灰水外，其它物料均以干重计。
[0066] 4.固体发酵培养：
[0067] 取步骤2的种子液，分别接入步骤3的100%麦麸固体发酵培养基、5%豆柏固体 发酵培养基、柏固体发酵培养基和柏固体发酵培养基中，接种比例均为10% (体积百分含量），搅拌均匀进行固体发酵培养，在32°C培养72h，得到纳豆芽孢杆菌固体发 酵培养物。实验重复三次，每次重复每种固体培养基设3个菌袋，每个菌袋所装的固体培 养基以干基计为200g。将纳豆芽孢杆菌固体发酵培养物进行菌落计数，换算为以干基计每 g固体培养基所形成的菌落形成单位（有效活菌数）cfu/g，得到纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6产量（简称为NF01-6产量）。其中，以平板稀释计数法进行计数：称取IOg(精 确到〇. Olg)固体发酵产物，放入内装100mL无菌水的三角瓶中，置摇床振荡30min，转速 200r/min。振荡后静置20min制成1 :10的均勾稀释液。采用10倍稀释法稀释。用灭菌吸 管吸取1 :10稀释液5ml，注入含有45ml无菌水的三角瓶中，制成I :100的稀释液，依次制 成10倍递增稀释液。选取三个合适稀释度悬液各取〇. lml，加至直径为90mm的培养基平板 上，将菌液均匀涂布。每个稀释度重复三次。放置30°C温度下培养。
[0068] 结果如表1所示，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6接种不同固体发酵培养 基进行发酵后，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6产量比不添加大豆柏的100%麦麸 固体发酵培养基分别平均增长118. 26%、206. 40%和141. 34%，其中10%豆柏固体发酵培 养基的NF01-6产量可达2. 92X 109cfu/g，比对照增加206. 40%，表明本发明的纳豆芽孢杆 菌（Bacillus natto)NF01-6在10%豆柏固体发酵培养基中的产量与100%麦麸固体发酵 培养基相比，显著增加。纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6在各种固体发酵培养基的 芽孢形成率为90%。
[0069] 表1.四种固体发酵培养基的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6产量
[0070]
[0071] 实施例3、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的发酵产物养分测定
[0072] 1.发酵菌种活化：
[0073] 同实施例2步骤1。
[0074] 2.种子液制备：
[0075] 同实施例2步骤2。
[0076] 3.配制固体发酵培养基：
[0077] 按照实施例2步骤三的方法配制5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发酵培 养基和15 % 柏固体发酵培养基。
[0078] 4.固体发酵培养：
[0079] 取步骤2的种子液，分别接入步骤3的5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发 酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基中，接种比例均为10% (体积百分含量），搅拌均匀进 行固体发酵培养，在35°C培养72h，分别得到名称为5%豆柏接菌、10%豆柏接菌和15%豆 柏接菌的纳豆芽孢杆菌固体发酵培养物。同时设置5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固 体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基不接菌的对照，即将5%豆柏固体发酵培养基、 10%豆柏固体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基均在35°C培养72h，分别得到名称为 5 %豆柏CKUO %豆柏CK和15 %豆柏CK的对照发酵产物。实验重复三次，每次重复每种固 体培养基设3个菌袋，每个菌袋所装的固体培养基以干基计为200g。
[0080] 发酵产物依据饲料中粗蛋白测定方法（GB/T 6432-1994)和饲料中氨基酸的测定 方法（GB/T 18246-2000)进行粗蛋白和全谱氨基酸的测定。结果如表2和表3所示，5% 豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢 杆菌（Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋白含量比对照分别增加3.626%、 4. 557%和0· 191 %，赖氨酸含量比对照分别增加25. 60%、45· 60%和38. 50%。其中，10% 豆柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋 白含量为43. 59%，比对照增加4. 557%，赖氨酸含量为2. 65%，比对照增加45. 60%。表明 本发明的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6发酵含有大豆柏的物料，发酵后粗蛋白和 赖氨酸的含量都有提高，特别是赖氨酸含量有显著的增加。
[0081] 表2.不同培养基固体发酵产物粗蛋白含量的测定
[0082]
[0084] 表3.不同培养基固体发酵产物全谱氨基酸的测定
[0085]
[0086] 表2中，发酵产物粗蛋白含量是粗蛋白占发酵产物干基（干重）的质量百分含量。
[0087] 表3中，每种氨基酸的含量是每种氨基酸占发酵产物干基（干重）的质量百分含 量。
【主权项】
1. 纳豆芽孢杆菌的培养方法，包括在含豆柏的培养基中培养纳豆芽孢杆菌，其特征在 于：所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心的保藏编号为CGMCCNo. 10535 ;所述含豆柏的培养基包括有机碳源和有机氮源， 所述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆柏组成。2. 饲料原料的制备方法，包括在含豆柏的培养基中培养纳豆芽孢杆菌得到发酵物，所 述发酵物为所述饲料原料，其特征在于：所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6,其在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo. 10535 ;所述含豆柏 的培养基包含有机碳源和有机氮源，所述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆柏组成。3. 纳豆芽孢杆菌在提高含豆柏物料中赖氨酸含量和/或粗蛋白含量中的应用，其特征 在于：所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心的保藏编号为CGMCCNo. 10535 ;所述含豆柏物料包括有机碳源和有机氮源，所 述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆柏组成。4. 根据权利要求1或2所述的方法或权利要求3所述的应用，其特征在于：所述麦麸 为小麦麦麸，和/或所述豆柏为大豆柏。5. 根据权利要求1至4中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述有机碳源和有机 氮源中所述豆柏的质量含量大于〇小于等于15%。6. 根据权利要求1至5中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述有机碳源和有机 氮源中所述豆柏的质量含量为5% -10%。7. 根据权利要求1至6中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述有机碳源和有机 氮源中所述豆柏的质量含量为10%。8. 根据权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为32-35°C， 所述培养的时间为72-120小时。9. 根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：所述含豆柏的培养基的pH为 6. 8~7, 2〇
【专利摘要】本发明公开了纳豆芽孢杆菌的培养方法及其应用。该纳豆芽孢杆菌的培养方法，包括在含豆粕的培养基中培养纳豆芽孢杆菌，其中，所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.10535；所述含豆粕的培养基包括有机碳源和有机氮源，所述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆粕组成。实验证明含大豆粕培养基接种纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No.10535进行固体发酵后粗蛋白和赖氨酸增加效果明显，有效的提高了植物蛋白中赖氨酸含量，提高了植物性蛋白饲料可利用性，具有较高的实用性和可推广性。CGMCC No.1053520150206
【IPC分类】C12R1/07, C12N1/20, A23K1/14
【公开号】CN104894026
【申请号】CN201510336555
【发明人】马晓彤, 张晓霞, 顾金刚, 李世贵, 李静梅, 吕运
【申请人】中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月17日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纳豆芽孢杆菌的培养方法及其应用，具体涉及纳豆芽孢杆菌的培养方 法、利用该培养方法制备饲料原料和纳豆芽孢杆菌在提高含豆柏物料中赖氨酸含量和/或 粗蛋白含量中的应用。
【背景技术】
[0002] 在饲料工业中，蛋白质饲料占有重要的地位，是配合饲料生产过程中补充饲料蛋 白不足必不可少的饲料原料。蛋白质饲料的代表性饲料有植物性饼柏、动物性鱼粉、血粉和 微生物蛋白饲料等。植物性饼柏是饲料行业中最重要的植物性蛋白饲料，其中以大豆饼柏 应用最为广泛，它是一种优质的蛋白质饲料来源，是各种配合饲料中的重要成分。
[0003] 赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，在饲料中添加适量的赖氨酸有利于动物 的生长、改善氨基酸平衡、提高饲料利用率、节约蛋白质资源。在饼柏类饲料中添加限制性 氨基酸，可以替代鱼粉，降低饲料成本，改善肉的品质，添加赖氨酸能改善屠体质量，提 高瘦肉率。
[0004] 近年来，动物性蛋白在逐渐减少，大豆饼柏作为作为较理想的蛋白饲料源而被大 规模使用。大豆柏的粗蛋白含量在30%-40%之间，必需氨基酸比例组成较好，饲料配合中 需添加赖氨酸以增加饲料氨基酸营养的全面性和均衡性。随着微生物在饲料行业上的研宄 深入，微生物菌种在饲料中的应用逐步受到人们的关注。微生物发酵技术在豆柏的研宄已 在国外展开，据国外研宄表明：大豆柏经微生物发酵后，赖氨酸等限制性氨基酸含量明显曾 加，蛋白质的利用率进一步提高，同时增加饲料原料中可以利用的种类，可为幼畜、幼禽和 水产养殖提供优质蛋白来源。
[0005] 纳豆芽孢杆菌是在二十世纪中期被发现并且分离培养出来，它具有很高活性的蛋 白酶、脂肪酶和淀粉酶，能够降解植物性饲料中的某些复杂的碳水化合物，分解蛋白质。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何提高饲料用大豆柏的赖氨酸含量和/或粗蛋 白含量。
[0007] 为解决以上技术问题，本发明提供了一种纳豆芽孢杆菌的培养方法。
[0008] 本发明所提供的纳豆芽孢杆菌的培养方法，包括在含豆柏的培养基中培养纳豆芽 孢杆菌，其中，所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6,其在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 10535 ;所述含豆柏的培养基包括有机碳源和有 机氮源，所述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆柏组成。
[0009] 为解决以上技术问题，本发明提供了饲料原料（发酵豆柏）的制备方法。
[0010] 本发明所提供的饲料原料（发酵豆柏）的制备方法，包括在上述含豆柏的培养基 中培养上述纳豆芽孢杆菌得到发酵物，所述发酵物为所述饲料原料。
[0011] 为解决以上技术问题，本发明提供了上述纳豆芽孢杆菌在提高上述含豆柏的培养 基中赖氨酸含量和/或粗蛋白含量中的应用。
[0012] 上述应用中，所述含豆柏的培养基具体可为含豆柏物料。
[0013] 上述方法和应用中，所述麦麸可为小麦麦麸，和/或所述豆柏可为大豆柏。
[0014] 上述方法和应用中，所述有机碳源和有机氮源中所述豆柏的质量含量大于0小于 等于15%。
[0015] 上述方法和应用中，所述有机碳源和有机氮源中所述豆柏的质量含量可为 5% -10%或 10%〇
[0016] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基还含有用于培养芽孢杆菌的无机盐。
[0017] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基具体可由所述有机碳源和有机氮源、无 机盐和水制成。
[0018] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基中所述无机盐可由K2HPO4, KH2PO4, MgSO4 和（NH4)2SO4组成。所述无机盐中K2HPO 4, KH2PO4, MgSO4和（NH4)2SO4的质量比可为2 :1 :1 : 10。
[0019] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基中所述有机碳源和有机氮源与所述无机 盐的质量比可为500:7。
[0020] 上述方法和应用中，所述含豆柏的培养基中水的含量使所述含豆柏的培养基的含 水量为30% -40%即可。
[0021] 上述方法和应用中，所述有机碳源和有机氮源和所述无机盐均以干重计。
[0022] 上述方法中，所述培养的温度可为32_35°C，所述培养的时间可为72-120小时。
[0023] 上述方法中，所述含豆柏的培养基的pH为6. 8-7. 2。
[0024] 实验证明，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6接种豆柏含量不同的固体发酵 培养基进行发酵后，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6产量比不添加大豆柏的100% 麦麸固体发酵培养基分别平均增长118. 26%、206. 40%和141. 34%，其中10%豆柏固体发 酵培养基的NF01-6产量可达2. 92 X 109cfu/g，比对照增加206. 40%，表明本发明的纳豆芽 孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6在10%豆柏固体发酵培养基中的产量与100%麦麸固体 发酵培养基相比，显著增加。5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发酵培养基和15%豆 柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋白 含量比不接菌的对照分别增加3. 626%、4. 557%和0. 191%，赖氨酸含量比对照分别增加 25. 60 %、45. 60 %和38. 50 %。其中，10 %豆柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢杆菌（Baci I Ius natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋白含量为43. 59%，比对照增加4. 557%，赖氨酸含 量为2. 65%，比对照增加45. 60%。表明含大豆柏培养基接种纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535进行固体发酵后粗蛋白和赖氨酸增加效果明显，有效的提高 了植物蛋白中赖氨酸含量，提高了植物性蛋白饲料可利用性，具有较高的实用性和可推广 性。本发明在植物性蛋白饲料应用领域具有广阔的前景。
[0025] 保藏说明
[0026] 菌种名称：纳豆芽孢杆菌
[0027] 拉丁名：Bacillus natto
[0028] 菌株编号：NFOl _6
[0029] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0030] 保藏机构简称：CGMCC
[0031] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0032] 保藏日期：2015年2月6日
[0033] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 10535
【具体实施方式】
[0034] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535液体培养基的配制方法： 蛋白胨 5g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，MnSO4 · H2O 5mg，用水定容至 lOOOmL，pH 值为 6. 8-7. 2。
[0036] 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535固体培养基的配制方 法：蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，MnS04.H20 5mg，琼脂22g，用水定容至1000mL，pH值为 6. 8_7. 2〇
[0037] 实施例1、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535的保藏及培养
[0038] 1、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的分离、鉴定和保藏
[0039] 取自然发酵的大豆柏，用平板（蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂22g，用水定 容至100〇1111^口!1值为6.8-7.2)划线分离方法得到纳豆芽孢杆菌（1^(3；[11118 1^1:1:0)即01-6。 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6已于2015年02月06日保藏于中国普通微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10535。
[0040] 2、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535 的斜面培养
[0041] 挑取该菌种，对其用上述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535 固体培养基进行斜面培养，在32 °C下培养40h。
[0042] 3、菌种的液体培养
[0043] 挑取步骤2斜面培养的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535， 将其接种于500mL上述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535液体培养 基中，32 °C恒温摇床220r/min培养30h。
[0044] 4、菌株的鉴定
[0045] 4. 1、形态学鉴定
[0046] 将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的纳豆芽孢杆 菌（Bacillus natto)NF01-6进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿 润度、菌落表面状态（是否平坦、突起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放 射状等）。另一方面，对处于对数生长期的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6,经涂片 染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
[0047] 结果表明纳?芽抱杆菌（Bacillus natto)NF01-6CGMCC No. 10535菌体杆状，大小 (0. 7-0. 8) μ mX (1. 5-1. 8) μ m，运动，鞭毛侧生。革兰氏阳性。内生孢子，具有较强耐热性。 芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，生长温度最高为45-55?，最 低为5-20°C。菌落近似圆形，边缘参差不整齐，表面微皱褶，不光滑，不透明。
[0048] 4. 2、16S rDNA 序列分析
[0049] 采用菌落PCR方法扩增纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6的16S rDNA片段 并克隆测序。结果表明纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6具有SEQ ID No. 1的16S rDNA片段序列。
[0050] 4. 3、生理生化特征鉴定
[0051] 参考《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京： 科学出版社，2011.)和《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Second Edition Volume Three》测定纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的生理生化特征。
[0052] 结果表明纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6好氧生长；接触酶阳性；V-P反 应阳性；利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖和木糖；水解淀粉、酪素；明胶液化；利用柠檬 酸盐；可还原硝酸盐；不利 用尿素。
[0053] 鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列分析结果，将纳豆芽孢杆菌 (Bacillus natto)NF01_6 鉴定为纳豆芽抱杆菌（Bacillus natto)。
[0054] 实施例2、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的固体发酵培养
[0055] 1.发酵菌种活化：
[0056] 将冷冻干燥保藏的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6菌种在培养基（蛋白 胨 5g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，MnS0 4·Η20 5mg，蒸馏水 100〇1111，？!1值为6.8-7.2，琼脂粉228， 121°〇灭菌3〇11^11)固体斜面划线转接，32°〇培养4011。
[0057] 2.种子液制备：
[0058] 将活化的一支斜面上的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6全部接种于装有 IOOrnl液体种子培养基（蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，MnS0 4·Η20 5mg，121°C灭菌30min) 的500ml三角瓶中，置220rpm摇床，32°C，培养30h，种子液制备完毕。
[0059] 3.配制固体发酵培养基：
[0060] 配制如下四种固体发酵培养基：100%麦麸固体发酵培养基、5%豆柏固体发酵培 养基、10 % S柏固体发酵培养基、15 % S柏固体发酵培养基。
[0061] 100%麦麸固体发酵培养基的配制方法如下：l〇〇〇g小麦麦麸、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg (NH4)2SO4,用石灰水调pH值为7. 0,使含水量为35% (质量百分含量）， 装入可灭菌的袋子，121°C灭菌40min。灭菌结束后冷却，得到100%麦麸固体发酵培养基。
[0062] 5%豆柏固体发酵培养基的配制方法如下：950g小麦麦麸、50g大豆柏、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg(NH4)2SO4,用石灰水调pH值为7.0,使含水量为35% (质量百分含 量），装入可灭菌的袋子，121°0灭菌4〇11^11。灭菌结束后冷却，得到5%豆柏固体发酵培养 基。
[0063] 10 %豆柏固体发酵培养基的配制方法如下：900g小麦麦麸、100g大豆柏、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg (NH4)2SO4,用石灰水调 pH 值为 7.0,使含水量为 35% (质量 百分含量），装入可灭菌的袋子，121°C灭菌40min。灭菌结束后冷却，得到10%豆柏固体发 酵培养基。
[0064] 15 %豆柏固体发酵培养基的配制方法如下：850g小麦麦麸、150g大豆柏、2g K2HPO4, Ig KH2PO4, Ig MgSO4, IOg (NH4)2SO4,用石灰水调 pH 值为 7.0,使含水量为 35% (质量 百分含量），装入可灭菌的袋子，121 °C灭菌40min。灭菌结束后冷却，得到15%豆柏固体发 酵培养基。
[0065] 上述四种固体发酵培养基的配制方法中，除石灰水外，其它物料均以干重计。
[0066] 4.固体发酵培养：
[0067] 取步骤2的种子液，分别接入步骤3的100%麦麸固体发酵培养基、5%豆柏固体 发酵培养基、柏固体发酵培养基和柏固体发酵培养基中，接种比例均为10% (体积百分含量），搅拌均匀进行固体发酵培养，在32°C培养72h，得到纳豆芽孢杆菌固体发 酵培养物。实验重复三次，每次重复每种固体培养基设3个菌袋，每个菌袋所装的固体培 养基以干基计为200g。将纳豆芽孢杆菌固体发酵培养物进行菌落计数，换算为以干基计每 g固体培养基所形成的菌落形成单位（有效活菌数）cfu/g，得到纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6产量（简称为NF01-6产量）。其中，以平板稀释计数法进行计数：称取IOg(精 确到〇. Olg)固体发酵产物，放入内装100mL无菌水的三角瓶中，置摇床振荡30min，转速 200r/min。振荡后静置20min制成1 :10的均勾稀释液。采用10倍稀释法稀释。用灭菌吸 管吸取1 :10稀释液5ml，注入含有45ml无菌水的三角瓶中，制成I :100的稀释液，依次制 成10倍递增稀释液。选取三个合适稀释度悬液各取〇. lml，加至直径为90mm的培养基平板 上，将菌液均匀涂布。每个稀释度重复三次。放置30°C温度下培养。
[0068] 结果如表1所示，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6接种不同固体发酵培养 基进行发酵后，纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6产量比不添加大豆柏的100%麦麸 固体发酵培养基分别平均增长118. 26%、206. 40%和141. 34%，其中10%豆柏固体发酵培 养基的NF01-6产量可达2. 92X 109cfu/g，比对照增加206. 40%，表明本发明的纳豆芽孢杆 菌（Bacillus natto)NF01-6在10%豆柏固体发酵培养基中的产量与100%麦麸固体发酵 培养基相比，显著增加。纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6在各种固体发酵培养基的 芽孢形成率为90%。
[0069] 表1.四种固体发酵培养基的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6产量
[0070]
[0071] 实施例3、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01_6的发酵产物养分测定
[0072] 1.发酵菌种活化：
[0073] 同实施例2步骤1。
[0074] 2.种子液制备：
[0075] 同实施例2步骤2。
[0076] 3.配制固体发酵培养基：
[0077] 按照实施例2步骤三的方法配制5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发酵培 养基和15 % 柏固体发酵培养基。
[0078] 4.固体发酵培养：
[0079] 取步骤2的种子液，分别接入步骤3的5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发 酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基中，接种比例均为10% (体积百分含量），搅拌均匀进 行固体发酵培养，在35°C培养72h，分别得到名称为5%豆柏接菌、10%豆柏接菌和15%豆 柏接菌的纳豆芽孢杆菌固体发酵培养物。同时设置5%豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固 体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基不接菌的对照，即将5%豆柏固体发酵培养基、 10%豆柏固体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基均在35°C培养72h，分别得到名称为 5 %豆柏CKUO %豆柏CK和15 %豆柏CK的对照发酵产物。实验重复三次，每次重复每种固 体培养基设3个菌袋，每个菌袋所装的固体培养基以干基计为200g。
[0080] 发酵产物依据饲料中粗蛋白测定方法（GB/T 6432-1994)和饲料中氨基酸的测定 方法（GB/T 18246-2000)进行粗蛋白和全谱氨基酸的测定。结果如表2和表3所示，5% 豆柏固体发酵培养基、10%豆柏固体发酵培养基和15%豆柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢 杆菌（Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋白含量比对照分别增加3.626%、 4. 557%和0· 191 %，赖氨酸含量比对照分别增加25. 60%、45· 60%和38. 50%。其中，10% 豆柏固体发酵培养基培养纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6得到的发酵产物的粗蛋 白含量为43. 59%，比对照增加4. 557%，赖氨酸含量为2. 65%，比对照增加45. 60%。表明 本发明的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)NF01-6发酵含有大豆柏的物料，发酵后粗蛋白和 赖氨酸的含量都有提高，特别是赖氨酸含量有显著的增加。
[0081] 表2.不同培养基固体发酵产物粗蛋白含量的测定
[0082]
[0084] 表3.不同培养基固体发酵产物全谱氨基酸的测定
[0085]
[0086] 表2中，发酵产物粗蛋白含量是粗蛋白占发酵产物干基（干重）的质量百分含量。
[0087] 表3中，每种氨基酸的含量是每种氨基酸占发酵产物干基（干重）的质量百分含 量。
【主权项】
1. 纳豆芽孢杆菌的培养方法，包括在含豆柏的培养基中培养纳豆芽孢杆菌，其特征在 于：所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心的保藏编号为CGMCCNo. 10535 ;所述含豆柏的培养基包括有机碳源和有机氮源， 所述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆柏组成。2. 饲料原料的制备方法，包括在含豆柏的培养基中培养纳豆芽孢杆菌得到发酵物，所 述发酵物为所述饲料原料，其特征在于：所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6,其在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo. 10535 ;所述含豆柏 的培养基包含有机碳源和有机氮源，所述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆柏组成。3. 纳豆芽孢杆菌在提高含豆柏物料中赖氨酸含量和/或粗蛋白含量中的应用，其特征 在于：所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心的保藏编号为CGMCCNo. 10535 ;所述含豆柏物料包括有机碳源和有机氮源，所 述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆柏组成。4. 根据权利要求1或2所述的方法或权利要求3所述的应用，其特征在于：所述麦麸 为小麦麦麸，和/或所述豆柏为大豆柏。5. 根据权利要求1至4中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述有机碳源和有机 氮源中所述豆柏的质量含量大于〇小于等于15%。6. 根据权利要求1至5中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述有机碳源和有机 氮源中所述豆柏的质量含量为5% -10%。7. 根据权利要求1至6中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述有机碳源和有机 氮源中所述豆柏的质量含量为10%。8. 根据权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为32-35°C， 所述培养的时间为72-120小时。9. 根据权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：所述含豆柏的培养基的pH为 6. 8~7, 2〇
【专利摘要】本发明公开了纳豆芽孢杆菌的培养方法及其应用。该纳豆芽孢杆菌的培养方法，包括在含豆粕的培养基中培养纳豆芽孢杆菌，其中，所述纳豆芽孢杆菌的菌株编号为NF01-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.10535；所述含豆粕的培养基包括有机碳源和有机氮源，所述有机碳源和有机氮源由麦麸和豆粕组成。实验证明含大豆粕培养基接种纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No.10535进行固体发酵后粗蛋白和赖氨酸增加效果明显，有效的提高了植物蛋白中赖氨酸含量，提高了植物性蛋白饲料可利用性，具有较高的实用性和可推广性。CGMCC No.1053520150206
【IPC分类】C12R1/07, C12N1/20, A23K1/14
【公开号】CN104894026
【申请号】CN201510336555
【发明人】马晓彤, 张晓霞, 顾金刚, 李世贵, 李静梅, 吕运
【申请人】中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月17日
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