一种渔用海洋微生态制剂及其制备方法
一种渔用海洋微生态制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生态制剂的技术领域，尤其涉及一种渔用海洋微生态制剂及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 目前水产养殖业存在着病害越来越严重，传统的抗生素和化工消毒剂难以为继， 由此产生的养殖水体排放给养殖区带来了严重污染，从九十年代开始光合细菌在水产养殖 上应用技术不断进步，近几年以来益生素在水产养殖上的应用方兴未艾，芽孢杆菌在养殖 业上推广的技术日趋成熟，给微生物在水产养殖业上的应用提供了可借鉴的依据，中国台 湾九十年代就把乳酸菌应用于养殖业，至今具备一定的应用水平，我国对乳酸菌的研宄和 应用只是刚刚开始，乳酸菌具有定植养殖动物肠道抑制病原菌和助消化吸收；消除水体的 有机物，有害物质等特性，对水产养殖可持续发展提供了有力的保障。
[0003] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)属于乳杆菌科，乳杆菌属，革兰氏阳 性。植物乳杆菌是同型发酵乳酸菌，在发酵过程中只产生乳酸，是典型的兼性厌氧菌，有很 强的发酵碳水化合物的能力，较耐盐，与其它乳酸菌有协同作用。戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)属于球菌，乳酸菌属，革兰氏阳性，兼性厌氧性，具有产酸高、性能稳定、降解 效果佳、耐盐性较高等优势，常用于秸杆发酵及饲料添加剂。植物乳杆菌和戊糖片球菌是农 业部2013年第2045号公告《饲料添加剂品种目录（2013)》中规定做为微生态制剂可以直 接饲喂养殖动物的饲料级微生物添加剂菌种。植物乳杆菌和戊糖片球菌是乳酸菌的两个不 同种类。
[0004] 在现有技术中，植物乳杆菌和戊糖片球菌通常是被分别用来作为水产生物的微生 物添加剂，对于两者的综合运用，还鲜有报道。有鉴于此，本发明人研宄和设计了一种渔用 海洋微生态制剂及其制备方法，本案由此产生。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种渔用海洋微生态制剂及其制备方法，本发明对植物乳 杆菌和戊糖片球菌，筛选出规模化生产的培养基配方，以提高饲料效率，进而促进植物乳 杆菌和戊糖片球菌微生态制剂在水产养殖上的推广应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
[0007] -种渔用海洋微生态制剂，包括植物乳杆菌及戊糖片球菌，所述植物乳杆菌及所 述戊糖片球菌的菌数比为2:1。
[0008] -种渔用海洋微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤一、菌种的活化与扩大培养：
[0010] 一级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落至100mL灭菌MRS培养基中，置于 35°C恒温水浴摇床上培养24h ;植物乳杆菌和戊糖片球菌各接种4瓶，目的是活化菌种；24h 后取菌液涂布MRS平板多个，置于35°C恒温箱内静置培养24h，待菌落长出，置于4°C冰箱保 种，待用；
[0011] 二级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落接种至200ml灭菌MRS中，两种菌各 共接种6瓶，置于35°C恒温水浴摇床上培养24h ;
[0012] 三级培养：取培养好的菌液IOml至2000ml灭菌MRS培养基中，置于35°C恒温水 浴摇床上培养24h，得到种子液，采用真空干燥法生产植物乳杆菌2kg、戊糖片球菌30kg，菌 数均达亿级；
[0013] 步骤二、发酵培养基的配制：
[0014] 蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠2g，梓 檬酸二钠2g，七水合硫酸镁0. 5g，五水硫酸锰0. 2g，吐温-801ml，定容至IL ;
[0015] 步骤三、发酵培养：
[0016] 将所述植物乳杆菌及所述戊糖片球菌按菌数比为2:1的混合菌接种于所述发酵 培养基，接种量为2%，所述发酵培养基中按C:N为12:1添加葡萄糖和大豆蛋白胨，发酵温 度35°C、初始PH为6. 5,搅拌为12h搅拌1次，每次搅拌时间为5min，以PH达到4. 0以下为 发酵终点；
[0017] 步骤四、过滤出料：
[0018] 发酵至终点后，对发酵液进行过滤出料，再进行分装，制得本渔用海洋微生态制 剂。
[0019] 作为实施例的优选方式，所述混合菌的菌数为10亿/g。
[0020] 本发明对植物乳杆菌和戊糖片球菌，筛选出了规模化生产的培养基配方，大大提 高了饲料效率，植物乳杆菌和戊糖片球菌的代谢产物具有协同作用的能力，在生产应用中 远远高于单体的效能，有效促进了植物乳杆菌和戊糖片球菌微生态制剂在水产养殖上的推 广应用。
【附图说明】
[0021] 图1两种乳酸菌的比例对其代谢产物的影响；
[0022] 图2碳源对两种乳酸菌生长的影响；
[0023] 图3氮源对两种乳酸菌生长的影响；
[0024] 图4缓冲盐对两种乳酸菌生长的影响；
[0025] 图5生长因子对两种乳酸菌生长的影响；
[0026] 图6不同接种量对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响；
[0027] 图7不同发酵温度对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响；
[0028] 图8不同初始pH对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[0030] 一种渔用海洋微生态制剂，包括植物乳杆菌及戊糖片球菌，所述植物乳杆菌及所 述戊糖片球菌的菌数比为2:1。
[0031] 取此配比实验的发酵液进行养殖中试，经过10天投喂，实验组的虾个体明显大于 其他组，肠道较粗，蠕动能力强，摄食快。因此，植物乳杆菌与戊糖片球菌的最佳发酵比例为 2:1〇
[0032] 我们对0. 7cm的幼虾进行乳酸菌投喂，对比没有投喂的各组，效果显示尤为明显， 按照2 :1配比投喂的幼虾，表现在活力强、受惊吓时弹跳反应较为明显、肠道较粗、蠕动能 力强、尾扇展开幅度较大等特点。
[0033] 实施例2
[0034] 一种渔用海洋微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0035] 步骤一、菌种的活化与扩大培养：
[0036] 一级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落至100mL灭菌MRS培养基中，置于 35°C恒温水浴摇床上培养24h ;植物乳杆菌和戊糖片球菌各接种4瓶，目的是活化菌种；24h 后取菌液涂布MRS平板多个，置于35°C恒温箱内静置培养24h，待菌落长出，置于4°C冰箱保 种，待用；
[0037] 二级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落接种至200ml灭菌MRS中，两种菌各 共接种6瓶，置于35°C恒温水浴摇床上培养24h ;
[0038] 三级培养：取培养好的菌液IOml至2000ml灭菌MRS培养基中，置于35°C恒温水 浴摇床上培养24h，得到种子液，采用真空干燥法生产植物乳杆菌2kg、戊糖片球菌30kg，菌 数均达亿级；
[0039] 所述MRS培养基为：蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二 钾2g，乙酸钠2g，柠檬酸二钠2g，七水合硫酸镁0. 5g，五水硫酸锰0. 2g，吐温-801ml，定容 至1L。
[0040] 步骤二、发酵培养基的配制：
[0041] 蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠2g，梓 檬酸二钠2g，七水合硫酸镁0. 5g，五水硫酸锰0. 2g，吐温-801ml，定容至IL ;
[0042] 步骤三、发酵培养：将所述植物乳杆菌及所述戊糖片球菌按菌数比为2:1的混合 菌接种于所述发酵培养基，接种量为2%，所述发酵培养基中按C:N为12:1添加葡萄糖和大 豆蛋白胨，发酵温度35°C、初始PH为6. 5,搅拌为12h搅拌1次，每次搅拌时间为5min，以 PH达到4.0以下为发酵终点；
[0043] 步骤四、过滤出料：发酵至终点后，对发酵液进行过滤出料，再进行分装，制得本渔 用海洋微生态制剂。
[00 44] 作为实施例的优选方式，所述混合菌的菌数为10亿/g。
[0045] 实施例3植物乳杆菌和戊糖片球菌浓度配比研宄
[0046] 植物乳杆菌与戊糖片球菌的比例设计为：1:1、1:2、1 :3、1:4、2:1、3:1六个比例。 按比例接种至MRS培养基（121 °C、30min灭菌）中，置于35 °C恒温水浴培养箱中缓慢震荡培 养12h，取菌液检测菌数和PH，每个比例三个平行，试验结果以平均值表示，结果如表1及图 1所示。
[0047] 表1两种乳酸菌的比例对其代谢产物的影响
[0048]
[0049] 由于植物乳杆菌和戊糖片球菌的代谢产物存在协同作用，因此为了更好的经济效 益，对这两种菌株的配比进行研宄，判断方法是以PH高低和菌数高低判断，由图1可知，当 植物乳杆菌与戊糖片球菌的比例为2:1时，PH较低，同时菌数也不低，因此植物乳杆菌与戊 糖片球菌最佳发酵配比是2:1。另外，取此配比实验的发酵液进行养殖中试，经过10天投 喂，投喂2:1配比发酵液的虾明显大于其他组，肠道活力强，摄食快。
[0050] 实施例4植物乳杆菌和戊糖片球菌培养基的优化筛选
[0051] 4. 1不同碳源对植物乳杆菌和戊糖片球菌培养的影响
[0052] 在MRS液体培养基基础上，选择蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖以及葡萄糖与乳糖质 量比2 :1的复合糖5种碳源，质量分数都为5%，按2%接种量接种种子液于发酵培养基中， 初始pH6. 0,培养温度35°C，置于恒温箱内静置培养18h，测定培养液的菌落数，每组试验三 个平行，结果以平均值表示，结果如表2及图2所示。
[0053] 表2碳源对两种乳酸菌生长的影响
[0054]
[0055] -从图2和表2可以看出，促进两种乳酸菌生长的最佳碳源是葡萄糖。以葡萄糖作 为碳源时，所得的发酵菌浓度明显高于其他碳源，浓度可达20.0 X 108cuf/ml，而蔗糖、麦 芽糖、乳糖和复合糖作为碳源对两种乳酸菌生长的影响效果相近。
[0056] 4. 2不同氮源对植物乳杆菌和戊糖片球菌培养的影响
[0057] 在MRS液体培养基基础上，选择大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、硝酸钠、硫酸铵 5种氮源，质量分数都为1%。按2%接种量接种种子液于发酵培养基中，初始pH6. 0,培养 温度35°C，置于恒温箱内静置培养18h，测定培养液的菌落数，每组试验三个平行，结果以 平均值表示，结果如表3及图3所示。
[0058] 表3氮源对两种乳酸菌生长的影响
[0059]
[0060]
[0061] 从图3和表3可以看出，促进两种乳酸菌生长的最佳氮源是大豆蛋白胨。以大豆 蛋白胨作为氮源时，获得的发酵菌浓度最高，为19. OX 108cuf/ml，胰蛋白和酵母浸粉作为 氮源效果次之，硝酸钠和硫酸按效果最差。
[0062] 4. 3不同缓冲盐对植物乳杆菌和戊糖片球菌培养的影响
[0063] 在MRS液体培养基基础上，选择缓冲盐：轻质碳酸钙、磷酸氢二钾、醋酸钠、碳酸氢 钙。质量分数为5%。。按2%接种量接种种子液于发酵培养基中，初始培养基PH = 6. 5,培 养温度35°C，置于恒温培养箱静置培养18h，测定菌落数，每组试验三个平行，结果以平均 值表示，结果如表4及图4所示。
[0064] 表4缓冲盐对两种乳酸菌生长的影响
[0065]
[0066] 从图4和表4可以看出，促进两种乳酸菌生长的缓冲盐是磷酸氢二钾。以磷酸氢 二钾为缓冲盐时，获得的发酵菌浓度最高，为18. 9X 108cuf/ml。
[0067] 4. 4不同生长因子对植物乳杆菌和戊糖片球菌培养的影响
[0068] 在MRS液体培养基基础上，选择生长因子：番茄汁、玉米浆、复合维生素、酵母膏、 麦芽汁。质量分数为5%。，按2%接种量接种种子液于发酵培养基中，初始培养基PH = 6. 5， 培养温度35°C，置于恒温培养箱静置培养18h，测定菌落数，每组试验三个平行，结果以平 均值表不，结果如表5及图5所不。
[0069] 表5生长因子对两种乳酸菌生长的影响
[0070]
[0071] 从图5和表5可以看出，促进两种乳酸菌生长的最佳生长因子是番茄汁。
[0072] 本实施例对培养基的优化是建立在MRS培养基的基础上的，对碳源和氮源进行优 化。结果显示：最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为大豆蛋白胨、最佳缓冲盐为磷酸氢二钾。本 实施例还进一步研宄了生长因子对两种乳酸菌的生长影响，结果显示番茄汁最为有效。
[0073] 实施例5植物乳杆菌和戊糖片球菌混合发酵培养条件的优化
[0074] 5. 1接种量的选择
[0075] 选择不同接种量1%、2%、3%、5%、9%，接种种子液于发酵培养基中，初始 pH6. 0,培养温度36°C，置于恒温箱内静置培养18h，测定培养液的菌落数，每组试验三个平 行，结果以平均值表示，结果如表6及图6所示。
[0076] 表6不同接种量对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响
[0077]
W ' ' ' ' ' '
[0078]
[0079] 由图6可以看出，植物乳杆菌和戊糖片球菌的发酵接种量为2%时，发酵菌数达 20X108cuf/ml，确定2%为最佳接种量。接种量过高，菌体生长不好，可能是因为在发酵初 始阶段培养基中的营养物质不能满足大量菌体生长的需求。
[0080] 5.2温度的选择
[0081] 按最佳接种量接种种子液于发酵培养基中，初始pH6. 0,分别在25°C、30°C、35°C、 40°C、45°C静置培养18h，测定其菌落数，每组试验三个平行，结果以平均值表示，结果如表 7及图7所示。
[0082] 表7不同发酵温度对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响
[0083]
[0084] 由图7和表7可以看出，植物乳杆菌和戊糖片球菌的发酵温度为35°C，发酵菌数达 26 X 108cuf/ml，确定35°C为最佳发酵温度。温度变化会直接影响菌体内蛋白质、酶的活性， 温度过高会使得细胞内蛋白质变性，影响核糖体、RNA等大分子的稳定性；温度过低会降低 酶活力，引起细胞膜流动性的变化，从而影响菌体的正常生长。
[0085] 5. 3最佳pH值的选择
[0086] 选择pH值分别为L 5、7· 0、6· 5、6· 0、5· 0、4· 0,在15L发酵罐内分批发酵，按最佳 接种量接种，最佳温度培养，搅拌速度控制在l〇〇r/min，每隔3h测定菌落数，选择其最佳pH 值，每组试验三个平行，结果以平均值表示，结果如表8及图8所示。
[0087] 表8不同初始pH对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响
[0088]
[0089] 由图8可以看出，植物乳杆菌和戊糖片球菌的发酵PH为6.5 °C，发酵菌数达 23X 108cuf/ml，确定6. 5为最佳发酵PH。PH值越低，植物乳杆菌所受酸胁迫的影响越大， 所以最佳pH值应该控制在6. 5左右。
[0090] 综上所述，植物乳杆菌和戊糖片球菌的最佳发酵条件为：温度35°C、初始PH为 6. 5,接种量为2%，搅拌为12h搅拌1次，每次搅拌时间为5min。
[0091] 实施例6植物乳杆菌和戊糖片球菌在南美白对虾养殖中的应用
[0092] 6. 1材料与方法
[0093] 6. I. 1养殖对象
[0094] 高位池养殖南美白对虾
[0095] 6. 1.2推广应用场所
[0096] 广东惠东平海80亩对虾高位池养殖场
[0097] 广东饶平60亩对虾高位池养殖场
[0098] 6. 1. 3植物乳杆菌和戊糖片球菌混合菌的发酵生产
[0099] 培养基：乳酵素（根据MRS配方配制）80kg，菌种200g(10亿/g)，按C:N为12:1 适当添加 葡萄糖和大豆蛋白胨。
[0100] 发酵条件：35°C，ia搅拌5min，发酵量为2吨/罐，以PH达到4. O以下为发酵终 点，以此条件发酵2罐4吨，发酵终点乳酸菌菌数均高于10亿/ml。如果需要高密度发酵， 则需指数流加碳源、氮源、磷酸氢二钾。
[0101] 生产流程：消毒罐体一清洗罐体一加过滤水一加热（搅拌混匀）至35°C -停止加 热一边搅拌边加入培养基一调培养基PH-待搅拌均匀后加入菌粉，继续搅拌5min-按优 化条件设定控制柜，自动发酵一PH显示4. 0时，发酵终止一过滤出料一分装。
[0102] 6. L 4数据测量和处理方法
[0103] 应用以成活率、饵料系数、单位面积产量和单位面积纯利润作为生产性能指标，用 以下公式分别计算：
[0104] 成活率（％)=实验结束后活虾总数/实验开始时活虾总数X 100% ;
[0105] 饵料系数：饲料使用量/增重量；
[0106] 单位面积纯利润=(总收入-饲料费-苗种费-水电费-生物肥料费-塘租金）/ 面积。
[0107] 6. 2实验结果
[0108] 我们投放0.7cm长的SIS南美白对虾苗种，放苗密度为10万尾，放苗后随着开始 投饵（饵料全部使用对虾全价配合饲料），使用我们发酵的混合菌拌饲料投喂虾苗，一天投 喂两次，每次投喂量为5%。，连续投喂7天之后，与试验对照组的幼虾比较，甲壳色泽明亮， 肠道明显较粗，蠕动有力，虾体活力较强。
[0109] 投喂乳酸菌混合菌我们按照连续投喂7天，暂停5天的原则，整个过程对虾摄食正 常，没有出现其它不良现象。
[0110] 表9惠东平海高位池白对虾试验组与对照组生产指标对比
[0111]
[0112] 注：试验组与对照组放苗量都为9万尾/亩，每个虾塘均为2亩
[0113] 表10广东饶平白对虾试验组与对照组生产指标对比
[0114]
[0115] 注：试验组与对照组放苗量均为10万尾/亩，每个虾塘均为3亩
[0116] 2013年9月28日，对两个养殖场的对虾进行收捕，并进行了成活率、产量、饵料系 数测定和纯利润的计算，结果见表9和表10。从表9可知，试验组与对照组对比，成活率 高2. 80%，平均重量高4. 32g/尾，产量高180kg/亩，饵料系数低0. 12,纯利润多6000元/ 亩。从表10可知，试验组与对照组对比，成活率高2. 22%，，平均重量高2. 38g/尾，产量高 200kg/亩，饵料系数低0.08,纯利润多5000元/亩。可见，两个养殖场在饲料中添加植物 乳杆菌和戊糖片球菌混合菌后，养殖的南美白对虾成活率、对虾重量、亩产产量和亩产纯利 润均比对照组高，饵料系数试验组都比对照组低。
[0117] 6. 3分析讨论
[0118] 6. 3. 1乳酸菌对南美白对虾养殖成活率的影响
[0119] 结果见表9,对照组的成活率为77. 78%，低于试验组的成活率2. 22%，同时由于 下半年台风较多，周围养殖效果都不好，病害很多，排塘率居高不下。实验表明，乳酸菌能够 改善非特异性免疫系统功能，提高抗应激能力、抗病力、从而提高对虾的成活率。试验组对 虾规格、重量均比对照组高，亩产产量试验组为对照组的1. 18倍，饵料系数试验组比对照 组低10%，亩产纯利润试验组是对照组的1. 5倍。说明植物乳杆菌和戊糖片球菌能够改善 调节对虾肠道内的微生物菌群的平衡，促进肠道对营养物质的吸收，加快对虾生长速度，提 高饵料的利用率，降低生产成本。
[0120] 6. 3. 2乳酸菌对白对虾生长的影响
[0121] 经过整个养殖过程的观察，进行乳酸菌的饲料拌料投喂，试验组的饵料系数要比 对照组的低0. 08,说明了乳酸菌定植于肠道内膜可以改善肠道的消化功能，提高饵料的吸 收率，同时也能够提供营养，减少饲料的投喂量，同时还能够提高白对虾的抗应激能力。
[0122] 乳酸菌随着残饵排放与与养殖水体还能够净化水质，减轻养殖后期水体的污染压 力。
[0123] 从表上显示，使用乳酸菌投喂饲料可以大大提高了养殖效益，剔除传统使用抗生 素的养殖方法，为水产养殖可持续发展提供有力的实验证据。
[0124] 本项目生产了 4吨植物乳杆菌和戊糖片球菌混合渔用海洋微生态制剂，并推广应 用于140多亩养殖面积中，一个是在广东惠东平海80亩养殖场使用，另一个是在广东饶平 60亩对虾高位池养殖场使用，使用结果显示本产品能够降低水体的有机污染，净化水体，还 可抑制、杀死病源微生物，并可作为食料添加剂，补充营养成分，改善养殖动物胃肠道的有 益菌群，达到生态防治的目的。同时提高了水产养殖动物的摄食量，加速了其生长，缩短养 殖周期，从而创造更大的经济效益。微生态制剂的使用，代替了传统抗生素，从而减少因抗 生素的过度使用导致的致病细菌耐药性增加，养殖环境生态平衡破坏，经过食物链进入人 体，危害到人类健康等。
[0125] 本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应 认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种渔用海洋微生态制剂，其特征在于：包括植物乳杆菌及戊糖片球菌，所述植物 乳杆菌及所述戊糖片球菌的菌数比为2:1。2. -种如权利要求1所述的渔用海洋微生态制剂的制备方法，其特征在于：包括以下 步骤： 步骤一、菌种的活化与扩大培养： 一级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落至100mL灭菌MRS培养基中，置于35°C恒温水浴摇床上培养24h;植物乳杆菌和戊糖片球菌各接种4瓶，目的是活化菌种；24h后 取菌液涂布MRS平板多个，置于35°C恒温箱内静置培养24h，待菌落长出，置于4°C冰箱保 种，待用； 二级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落接种至200ml灭菌MRS中，两种菌各共接 种6瓶，置于35°C恒温水浴摇床上培养24h; 三级培养：取培养好的菌液IOml至2000ml灭菌MRS培养基中，置于35°C恒温水浴摇 床上培养24h，得到种子液，采用真空干燥法生产植物乳杆菌2kg、戊糖片球菌30kg，菌数均 达亿级； 步骤二、发酵培养基的配制： 蛋白胨l〇g，牛肉浸膏l〇g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠2g，柠檬酸 二钠2g，七水合硫酸镁0. 5g，五水硫酸锰0. 2g，吐温-801ml，定容至IL; 步骤三、发酵培养： 将所述植物乳杆菌及所述戊糖片球菌按重量配比2:1的混合菌接种于所述发酵培养 基，接种量为2%，所述发酵培养基中按C:N为12:1添加葡萄糖和大豆蛋白胨，发酵温度 35°C、初始PH为6. 5,搅拌为12h搅拌1次，每次搅拌时间为5min，以PH达到4. 0以下为发 酵终点； 步骤四、过滤出料： 发酵至终点后，对发酵液进行过滤出料，再进行分装，制得本渔用海洋微生态制剂。3. 如权利要求2所述的一种渔用海洋微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述混合 菌的菌数为10亿/g。
【专利摘要】本发明公开了一种渔用海洋微生态制剂，包括植物乳杆菌及戊糖片球菌，所述植物乳杆菌及所述戊糖片球菌的菌数比为2:1；本发明还公开了一种渔用海洋微生态制剂的制备方法，包括：步骤一、菌种的活化与扩大培养；步骤二、发酵培养基的配制；步骤三、发酵培养；步骤四、过滤出料。本发明对植物乳杆菌和戊糖片球菌，筛选出了规模化生产的培养基配方，大大提高了饲料效率，植物乳杆菌和戊糖片球菌的代谢产物具有协同作用的能力，在生产应用中远远高于单体的效能，有效促进了植物乳杆菌和戊糖片球菌微生态制剂在水产养殖上的推广应用。
【IPC分类】C12N1/20, A23K1/16, C12R1/01, C12R1/25
【公开号】CN104894028
【申请号】CN201510339159
【发明人】肖潮雄, 陈学豪, 熊玲芳, 陈启春, 陈朝文
【申请人】诺可信（厦门）生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生态制剂的技术领域，尤其涉及一种渔用海洋微生态制剂及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 目前水产养殖业存在着病害越来越严重，传统的抗生素和化工消毒剂难以为继， 由此产生的养殖水体排放给养殖区带来了严重污染，从九十年代开始光合细菌在水产养殖 上应用技术不断进步，近几年以来益生素在水产养殖上的应用方兴未艾，芽孢杆菌在养殖 业上推广的技术日趋成熟，给微生物在水产养殖业上的应用提供了可借鉴的依据，中国台 湾九十年代就把乳酸菌应用于养殖业，至今具备一定的应用水平，我国对乳酸菌的研宄和 应用只是刚刚开始，乳酸菌具有定植养殖动物肠道抑制病原菌和助消化吸收；消除水体的 有机物，有害物质等特性，对水产养殖可持续发展提供了有力的保障。
[0003] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)属于乳杆菌科，乳杆菌属，革兰氏阳 性。植物乳杆菌是同型发酵乳酸菌，在发酵过程中只产生乳酸，是典型的兼性厌氧菌，有很 强的发酵碳水化合物的能力，较耐盐，与其它乳酸菌有协同作用。戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)属于球菌，乳酸菌属，革兰氏阳性，兼性厌氧性，具有产酸高、性能稳定、降解 效果佳、耐盐性较高等优势，常用于秸杆发酵及饲料添加剂。植物乳杆菌和戊糖片球菌是农 业部2013年第2045号公告《饲料添加剂品种目录（2013)》中规定做为微生态制剂可以直 接饲喂养殖动物的饲料级微生物添加剂菌种。植物乳杆菌和戊糖片球菌是乳酸菌的两个不 同种类。
[0004] 在现有技术中，植物乳杆菌和戊糖片球菌通常是被分别用来作为水产生物的微生 物添加剂，对于两者的综合运用，还鲜有报道。有鉴于此，本发明人研宄和设计了一种渔用 海洋微生态制剂及其制备方法，本案由此产生。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种渔用海洋微生态制剂及其制备方法，本发明对植物乳 杆菌和戊糖片球菌，筛选出规模化生产的培养基配方，以提高饲料效率，进而促进植物乳 杆菌和戊糖片球菌微生态制剂在水产养殖上的推广应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
[0007] -种渔用海洋微生态制剂，包括植物乳杆菌及戊糖片球菌，所述植物乳杆菌及所 述戊糖片球菌的菌数比为2:1。
[0008] -种渔用海洋微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤一、菌种的活化与扩大培养：
[0010] 一级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落至100mL灭菌MRS培养基中，置于 35°C恒温水浴摇床上培养24h ;植物乳杆菌和戊糖片球菌各接种4瓶，目的是活化菌种；24h 后取菌液涂布MRS平板多个，置于35°C恒温箱内静置培养24h，待菌落长出，置于4°C冰箱保 种，待用；
[0011] 二级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落接种至200ml灭菌MRS中，两种菌各 共接种6瓶，置于35°C恒温水浴摇床上培养24h ;
[0012] 三级培养：取培养好的菌液IOml至2000ml灭菌MRS培养基中，置于35°C恒温水 浴摇床上培养24h，得到种子液，采用真空干燥法生产植物乳杆菌2kg、戊糖片球菌30kg，菌 数均达亿级；
[0013] 步骤二、发酵培养基的配制：
[0014] 蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠2g，梓 檬酸二钠2g，七水合硫酸镁0. 5g，五水硫酸锰0. 2g，吐温-801ml，定容至IL ;
[0015] 步骤三、发酵培养：
[0016] 将所述植物乳杆菌及所述戊糖片球菌按菌数比为2:1的混合菌接种于所述发酵 培养基，接种量为2%，所述发酵培养基中按C:N为12:1添加葡萄糖和大豆蛋白胨，发酵温 度35°C、初始PH为6. 5,搅拌为12h搅拌1次，每次搅拌时间为5min，以PH达到4. 0以下为 发酵终点；
[0017] 步骤四、过滤出料：
[0018] 发酵至终点后，对发酵液进行过滤出料，再进行分装，制得本渔用海洋微生态制 剂。
[0019] 作为实施例的优选方式，所述混合菌的菌数为10亿/g。
[0020] 本发明对植物乳杆菌和戊糖片球菌，筛选出了规模化生产的培养基配方，大大提 高了饲料效率，植物乳杆菌和戊糖片球菌的代谢产物具有协同作用的能力，在生产应用中 远远高于单体的效能，有效促进了植物乳杆菌和戊糖片球菌微生态制剂在水产养殖上的推 广应用。
【附图说明】
[0021] 图1两种乳酸菌的比例对其代谢产物的影响；
[0022] 图2碳源对两种乳酸菌生长的影响；
[0023] 图3氮源对两种乳酸菌生长的影响；
[0024] 图4缓冲盐对两种乳酸菌生长的影响；
[0025] 图5生长因子对两种乳酸菌生长的影响；
[0026] 图6不同接种量对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响；
[0027] 图7不同发酵温度对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响；
[0028] 图8不同初始pH对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[0030] 一种渔用海洋微生态制剂，包括植物乳杆菌及戊糖片球菌，所述植物乳杆菌及所 述戊糖片球菌的菌数比为2:1。
[0031] 取此配比实验的发酵液进行养殖中试，经过10天投喂，实验组的虾个体明显大于 其他组，肠道较粗，蠕动能力强，摄食快。因此，植物乳杆菌与戊糖片球菌的最佳发酵比例为 2:1〇
[0032] 我们对0. 7cm的幼虾进行乳酸菌投喂，对比没有投喂的各组，效果显示尤为明显， 按照2 :1配比投喂的幼虾，表现在活力强、受惊吓时弹跳反应较为明显、肠道较粗、蠕动能 力强、尾扇展开幅度较大等特点。
[0033] 实施例2
[0034] 一种渔用海洋微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0035] 步骤一、菌种的活化与扩大培养：
[0036] 一级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落至100mL灭菌MRS培养基中，置于 35°C恒温水浴摇床上培养24h ;植物乳杆菌和戊糖片球菌各接种4瓶，目的是活化菌种；24h 后取菌液涂布MRS平板多个，置于35°C恒温箱内静置培养24h，待菌落长出，置于4°C冰箱保 种，待用；
[0037] 二级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落接种至200ml灭菌MRS中，两种菌各 共接种6瓶，置于35°C恒温水浴摇床上培养24h ;
[0038] 三级培养：取培养好的菌液IOml至2000ml灭菌MRS培养基中，置于35°C恒温水 浴摇床上培养24h，得到种子液，采用真空干燥法生产植物乳杆菌2kg、戊糖片球菌30kg，菌 数均达亿级；
[0039] 所述MRS培养基为：蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二 钾2g，乙酸钠2g，柠檬酸二钠2g，七水合硫酸镁0. 5g，五水硫酸锰0. 2g，吐温-801ml，定容 至1L。
[0040] 步骤二、发酵培养基的配制：
[0041] 蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠2g，梓 檬酸二钠2g，七水合硫酸镁0. 5g，五水硫酸锰0. 2g，吐温-801ml，定容至IL ;
[0042] 步骤三、发酵培养：将所述植物乳杆菌及所述戊糖片球菌按菌数比为2:1的混合 菌接种于所述发酵培养基，接种量为2%，所述发酵培养基中按C:N为12:1添加葡萄糖和大 豆蛋白胨，发酵温度35°C、初始PH为6. 5,搅拌为12h搅拌1次，每次搅拌时间为5min，以 PH达到4.0以下为发酵终点；
[0043] 步骤四、过滤出料：发酵至终点后，对发酵液进行过滤出料，再进行分装，制得本渔 用海洋微生态制剂。
[00 44] 作为实施例的优选方式，所述混合菌的菌数为10亿/g。
[0045] 实施例3植物乳杆菌和戊糖片球菌浓度配比研宄
[0046] 植物乳杆菌与戊糖片球菌的比例设计为：1:1、1:2、1 :3、1:4、2:1、3:1六个比例。 按比例接种至MRS培养基（121 °C、30min灭菌）中，置于35 °C恒温水浴培养箱中缓慢震荡培 养12h，取菌液检测菌数和PH，每个比例三个平行，试验结果以平均值表示，结果如表1及图 1所示。
[0047] 表1两种乳酸菌的比例对其代谢产物的影响
[0048]
[0049] 由于植物乳杆菌和戊糖片球菌的代谢产物存在协同作用，因此为了更好的经济效 益，对这两种菌株的配比进行研宄，判断方法是以PH高低和菌数高低判断，由图1可知，当 植物乳杆菌与戊糖片球菌的比例为2:1时，PH较低，同时菌数也不低，因此植物乳杆菌与戊 糖片球菌最佳发酵配比是2:1。另外，取此配比实验的发酵液进行养殖中试，经过10天投 喂，投喂2:1配比发酵液的虾明显大于其他组，肠道活力强，摄食快。
[0050] 实施例4植物乳杆菌和戊糖片球菌培养基的优化筛选
[0051] 4. 1不同碳源对植物乳杆菌和戊糖片球菌培养的影响
[0052] 在MRS液体培养基基础上，选择蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖以及葡萄糖与乳糖质 量比2 :1的复合糖5种碳源，质量分数都为5%，按2%接种量接种种子液于发酵培养基中， 初始pH6. 0,培养温度35°C，置于恒温箱内静置培养18h，测定培养液的菌落数，每组试验三 个平行，结果以平均值表示，结果如表2及图2所示。
[0053] 表2碳源对两种乳酸菌生长的影响
[0054]
[0055] -从图2和表2可以看出，促进两种乳酸菌生长的最佳碳源是葡萄糖。以葡萄糖作 为碳源时，所得的发酵菌浓度明显高于其他碳源，浓度可达20.0 X 108cuf/ml，而蔗糖、麦 芽糖、乳糖和复合糖作为碳源对两种乳酸菌生长的影响效果相近。
[0056] 4. 2不同氮源对植物乳杆菌和戊糖片球菌培养的影响
[0057] 在MRS液体培养基基础上，选择大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、硝酸钠、硫酸铵 5种氮源，质量分数都为1%。按2%接种量接种种子液于发酵培养基中，初始pH6. 0,培养 温度35°C，置于恒温箱内静置培养18h，测定培养液的菌落数，每组试验三个平行，结果以 平均值表示，结果如表3及图3所示。
[0058] 表3氮源对两种乳酸菌生长的影响
[0059]
[0060]
[0061] 从图3和表3可以看出，促进两种乳酸菌生长的最佳氮源是大豆蛋白胨。以大豆 蛋白胨作为氮源时，获得的发酵菌浓度最高，为19. OX 108cuf/ml，胰蛋白和酵母浸粉作为 氮源效果次之，硝酸钠和硫酸按效果最差。
[0062] 4. 3不同缓冲盐对植物乳杆菌和戊糖片球菌培养的影响
[0063] 在MRS液体培养基基础上，选择缓冲盐：轻质碳酸钙、磷酸氢二钾、醋酸钠、碳酸氢 钙。质量分数为5%。。按2%接种量接种种子液于发酵培养基中，初始培养基PH = 6. 5,培 养温度35°C，置于恒温培养箱静置培养18h，测定菌落数，每组试验三个平行，结果以平均 值表示，结果如表4及图4所示。
[0064] 表4缓冲盐对两种乳酸菌生长的影响
[0065]
[0066] 从图4和表4可以看出，促进两种乳酸菌生长的缓冲盐是磷酸氢二钾。以磷酸氢 二钾为缓冲盐时，获得的发酵菌浓度最高，为18. 9X 108cuf/ml。
[0067] 4. 4不同生长因子对植物乳杆菌和戊糖片球菌培养的影响
[0068] 在MRS液体培养基基础上，选择生长因子：番茄汁、玉米浆、复合维生素、酵母膏、 麦芽汁。质量分数为5%。，按2%接种量接种种子液于发酵培养基中，初始培养基PH = 6. 5， 培养温度35°C，置于恒温培养箱静置培养18h，测定菌落数，每组试验三个平行，结果以平 均值表不，结果如表5及图5所不。
[0069] 表5生长因子对两种乳酸菌生长的影响
[0070]
[0071] 从图5和表5可以看出，促进两种乳酸菌生长的最佳生长因子是番茄汁。
[0072] 本实施例对培养基的优化是建立在MRS培养基的基础上的，对碳源和氮源进行优 化。结果显示：最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为大豆蛋白胨、最佳缓冲盐为磷酸氢二钾。本 实施例还进一步研宄了生长因子对两种乳酸菌的生长影响，结果显示番茄汁最为有效。
[0073] 实施例5植物乳杆菌和戊糖片球菌混合发酵培养条件的优化
[0074] 5. 1接种量的选择
[0075] 选择不同接种量1%、2%、3%、5%、9%，接种种子液于发酵培养基中，初始 pH6. 0,培养温度36°C，置于恒温箱内静置培养18h，测定培养液的菌落数，每组试验三个平 行，结果以平均值表示，结果如表6及图6所示。
[0076] 表6不同接种量对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响
[0077]
W ' ' ' ' ' '
[0078]
[0079] 由图6可以看出，植物乳杆菌和戊糖片球菌的发酵接种量为2%时，发酵菌数达 20X108cuf/ml，确定2%为最佳接种量。接种量过高，菌体生长不好，可能是因为在发酵初 始阶段培养基中的营养物质不能满足大量菌体生长的需求。
[0080] 5.2温度的选择
[0081] 按最佳接种量接种种子液于发酵培养基中，初始pH6. 0,分别在25°C、30°C、35°C、 40°C、45°C静置培养18h，测定其菌落数，每组试验三个平行，结果以平均值表示，结果如表 7及图7所示。
[0082] 表7不同发酵温度对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响
[0083]
[0084] 由图7和表7可以看出，植物乳杆菌和戊糖片球菌的发酵温度为35°C，发酵菌数达 26 X 108cuf/ml，确定35°C为最佳发酵温度。温度变化会直接影响菌体内蛋白质、酶的活性， 温度过高会使得细胞内蛋白质变性，影响核糖体、RNA等大分子的稳定性；温度过低会降低 酶活力，引起细胞膜流动性的变化，从而影响菌体的正常生长。
[0085] 5. 3最佳pH值的选择
[0086] 选择pH值分别为L 5、7· 0、6· 5、6· 0、5· 0、4· 0,在15L发酵罐内分批发酵，按最佳 接种量接种，最佳温度培养，搅拌速度控制在l〇〇r/min，每隔3h测定菌落数，选择其最佳pH 值，每组试验三个平行，结果以平均值表示，结果如表8及图8所示。
[0087] 表8不同初始pH对植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵的影响
[0088]
[0089] 由图8可以看出，植物乳杆菌和戊糖片球菌的发酵PH为6.5 °C，发酵菌数达 23X 108cuf/ml，确定6. 5为最佳发酵PH。PH值越低，植物乳杆菌所受酸胁迫的影响越大， 所以最佳pH值应该控制在6. 5左右。
[0090] 综上所述，植物乳杆菌和戊糖片球菌的最佳发酵条件为：温度35°C、初始PH为 6. 5,接种量为2%，搅拌为12h搅拌1次，每次搅拌时间为5min。
[0091] 实施例6植物乳杆菌和戊糖片球菌在南美白对虾养殖中的应用
[0092] 6. 1材料与方法
[0093] 6. I. 1养殖对象
[0094] 高位池养殖南美白对虾
[0095] 6. 1.2推广应用场所
[0096] 广东惠东平海80亩对虾高位池养殖场
[0097] 广东饶平60亩对虾高位池养殖场
[0098] 6. 1. 3植物乳杆菌和戊糖片球菌混合菌的发酵生产
[0099] 培养基：乳酵素（根据MRS配方配制）80kg，菌种200g(10亿/g)，按C:N为12:1 适当添加 葡萄糖和大豆蛋白胨。
[0100] 发酵条件：35°C，ia搅拌5min，发酵量为2吨/罐，以PH达到4. O以下为发酵终 点，以此条件发酵2罐4吨，发酵终点乳酸菌菌数均高于10亿/ml。如果需要高密度发酵， 则需指数流加碳源、氮源、磷酸氢二钾。
[0101] 生产流程：消毒罐体一清洗罐体一加过滤水一加热（搅拌混匀）至35°C -停止加 热一边搅拌边加入培养基一调培养基PH-待搅拌均匀后加入菌粉，继续搅拌5min-按优 化条件设定控制柜，自动发酵一PH显示4. 0时，发酵终止一过滤出料一分装。
[0102] 6. L 4数据测量和处理方法
[0103] 应用以成活率、饵料系数、单位面积产量和单位面积纯利润作为生产性能指标，用 以下公式分别计算：
[0104] 成活率（％)=实验结束后活虾总数/实验开始时活虾总数X 100% ;
[0105] 饵料系数：饲料使用量/增重量；
[0106] 单位面积纯利润=(总收入-饲料费-苗种费-水电费-生物肥料费-塘租金）/ 面积。
[0107] 6. 2实验结果
[0108] 我们投放0.7cm长的SIS南美白对虾苗种，放苗密度为10万尾，放苗后随着开始 投饵（饵料全部使用对虾全价配合饲料），使用我们发酵的混合菌拌饲料投喂虾苗，一天投 喂两次，每次投喂量为5%。，连续投喂7天之后，与试验对照组的幼虾比较，甲壳色泽明亮， 肠道明显较粗，蠕动有力，虾体活力较强。
[0109] 投喂乳酸菌混合菌我们按照连续投喂7天，暂停5天的原则，整个过程对虾摄食正 常，没有出现其它不良现象。
[0110] 表9惠东平海高位池白对虾试验组与对照组生产指标对比
[0111]
[0112] 注：试验组与对照组放苗量都为9万尾/亩，每个虾塘均为2亩
[0113] 表10广东饶平白对虾试验组与对照组生产指标对比
[0114]
[0115] 注：试验组与对照组放苗量均为10万尾/亩，每个虾塘均为3亩
[0116] 2013年9月28日，对两个养殖场的对虾进行收捕，并进行了成活率、产量、饵料系 数测定和纯利润的计算，结果见表9和表10。从表9可知，试验组与对照组对比，成活率 高2. 80%，平均重量高4. 32g/尾，产量高180kg/亩，饵料系数低0. 12,纯利润多6000元/ 亩。从表10可知，试验组与对照组对比，成活率高2. 22%，，平均重量高2. 38g/尾，产量高 200kg/亩，饵料系数低0.08,纯利润多5000元/亩。可见，两个养殖场在饲料中添加植物 乳杆菌和戊糖片球菌混合菌后，养殖的南美白对虾成活率、对虾重量、亩产产量和亩产纯利 润均比对照组高，饵料系数试验组都比对照组低。
[0117] 6. 3分析讨论
[0118] 6. 3. 1乳酸菌对南美白对虾养殖成活率的影响
[0119] 结果见表9,对照组的成活率为77. 78%，低于试验组的成活率2. 22%，同时由于 下半年台风较多，周围养殖效果都不好，病害很多，排塘率居高不下。实验表明，乳酸菌能够 改善非特异性免疫系统功能，提高抗应激能力、抗病力、从而提高对虾的成活率。试验组对 虾规格、重量均比对照组高，亩产产量试验组为对照组的1. 18倍，饵料系数试验组比对照 组低10%，亩产纯利润试验组是对照组的1. 5倍。说明植物乳杆菌和戊糖片球菌能够改善 调节对虾肠道内的微生物菌群的平衡，促进肠道对营养物质的吸收，加快对虾生长速度，提 高饵料的利用率，降低生产成本。
[0120] 6. 3. 2乳酸菌对白对虾生长的影响
[0121] 经过整个养殖过程的观察，进行乳酸菌的饲料拌料投喂，试验组的饵料系数要比 对照组的低0. 08,说明了乳酸菌定植于肠道内膜可以改善肠道的消化功能，提高饵料的吸 收率，同时也能够提供营养，减少饲料的投喂量，同时还能够提高白对虾的抗应激能力。
[0122] 乳酸菌随着残饵排放与与养殖水体还能够净化水质，减轻养殖后期水体的污染压 力。
[0123] 从表上显示，使用乳酸菌投喂饲料可以大大提高了养殖效益，剔除传统使用抗生 素的养殖方法，为水产养殖可持续发展提供有力的实验证据。
[0124] 本项目生产了 4吨植物乳杆菌和戊糖片球菌混合渔用海洋微生态制剂，并推广应 用于140多亩养殖面积中，一个是在广东惠东平海80亩养殖场使用，另一个是在广东饶平 60亩对虾高位池养殖场使用，使用结果显示本产品能够降低水体的有机污染，净化水体，还 可抑制、杀死病源微生物，并可作为食料添加剂，补充营养成分，改善养殖动物胃肠道的有 益菌群，达到生态防治的目的。同时提高了水产养殖动物的摄食量，加速了其生长，缩短养 殖周期，从而创造更大的经济效益。微生态制剂的使用，代替了传统抗生素，从而减少因抗 生素的过度使用导致的致病细菌耐药性增加，养殖环境生态平衡破坏，经过食物链进入人 体，危害到人类健康等。
[0125] 本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应 认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种渔用海洋微生态制剂，其特征在于：包括植物乳杆菌及戊糖片球菌，所述植物 乳杆菌及所述戊糖片球菌的菌数比为2:1。2. -种如权利要求1所述的渔用海洋微生态制剂的制备方法，其特征在于：包括以下 步骤： 步骤一、菌种的活化与扩大培养： 一级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落至100mL灭菌MRS培养基中，置于35°C恒温水浴摇床上培养24h;植物乳杆菌和戊糖片球菌各接种4瓶，目的是活化菌种；24h后 取菌液涂布MRS平板多个，置于35°C恒温箱内静置培养24h，待菌落长出，置于4°C冰箱保 种，待用； 二级培养：在超净工作台中取斜面保存单菌落接种至200ml灭菌MRS中，两种菌各共接 种6瓶，置于35°C恒温水浴摇床上培养24h; 三级培养：取培养好的菌液IOml至2000ml灭菌MRS培养基中，置于35°C恒温水浴摇 床上培养24h，得到种子液，采用真空干燥法生产植物乳杆菌2kg、戊糖片球菌30kg，菌数均 达亿级； 步骤二、发酵培养基的配制： 蛋白胨l〇g，牛肉浸膏l〇g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠2g，柠檬酸 二钠2g，七水合硫酸镁0. 5g，五水硫酸锰0. 2g，吐温-801ml，定容至IL; 步骤三、发酵培养： 将所述植物乳杆菌及所述戊糖片球菌按重量配比2:1的混合菌接种于所述发酵培养 基，接种量为2%，所述发酵培养基中按C:N为12:1添加葡萄糖和大豆蛋白胨，发酵温度 35°C、初始PH为6. 5,搅拌为12h搅拌1次，每次搅拌时间为5min，以PH达到4. 0以下为发 酵终点； 步骤四、过滤出料： 发酵至终点后，对发酵液进行过滤出料，再进行分装，制得本渔用海洋微生态制剂。3. 如权利要求2所述的一种渔用海洋微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述混合 菌的菌数为10亿/g。
【专利摘要】本发明公开了一种渔用海洋微生态制剂，包括植物乳杆菌及戊糖片球菌，所述植物乳杆菌及所述戊糖片球菌的菌数比为2:1；本发明还公开了一种渔用海洋微生态制剂的制备方法，包括：步骤一、菌种的活化与扩大培养；步骤二、发酵培养基的配制；步骤三、发酵培养；步骤四、过滤出料。本发明对植物乳杆菌和戊糖片球菌，筛选出了规模化生产的培养基配方，大大提高了饲料效率，植物乳杆菌和戊糖片球菌的代谢产物具有协同作用的能力，在生产应用中远远高于单体的效能，有效促进了植物乳杆菌和戊糖片球菌微生态制剂在水产养殖上的推广应用。
【IPC分类】C12N1/20, A23K1/16, C12R1/01, C12R1/25
【公开号】CN104894028
【申请号】CN201510339159
【发明人】肖潮雄, 陈学豪, 熊玲芳, 陈启春, 陈朝文
【申请人】诺可信（厦门）生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
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