一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在低温青贮中的应用
一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在低温青贮中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在低温青贮中的应 用。
【背景技术】
[0002] 青贮是在乳酸菌的厌氧发酵作用下将碳水化合物转化为有机酸，从而使pH降低 达到长期贮存的目的。乳酸菌和温度是青贮饲料发酵品质好坏的决定性因素。
[0003] 小麦秸杆是寒冷地区冬春饲补的饲料作物，由于寒冷地区温度低，限制乳酸菌的 生长，很难发酵出品质优良并可以长期贮存的饲料。
[0004] 因此，筛选出耐高低温、耐盐、耐酸碱的抗逆性较强的菌株，并将其作为发酵剂添 加到低温青贮小麦秸杆饲料中，将会对高寒地区的青贮饲料制作有着巨大的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一株乳酸乳球菌乳酸亚种。
[0006] 本发明所提供的乳酸乳球菌乳酸亚种具体为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl_666,该菌株已于2015年4月28日保藏于中国典型培养物保藏 中心（简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏 中心），其保藏编号为CCTCC NO :M 2015255。
[0007] 所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666 从中国 青海省明察县城油菜分离得到的，该菌株单菌落为圆形，革兰氏染色阴性，不产过氧化氢； 该菌株不能够发酵葡萄糖产气，为同型发酵。在5°C和KTC长势良好，45°C环境生长微弱， 在50°C不生长，表明该菌株均有良好的耐低温生长能力。该菌株在3. 00 %和6. 50%的NaCl 浓度中均生长良好微弱，表明该菌株具有一般的耐盐能力。液体5°C培养7天，该菌株的上 清液PH降到4. 0,培养到10-14天时pH降到3. 5,表明其产酸能力较好。该菌株在pH4. 0-9. 0 的环境中生长良好，表明该菌株有较好的耐酸碱生长能力。其16S rDNA序列如序列表中序 列1所示。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种菌剂。
[0009] 本发明所提供的菌剂的活性成分为所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis)QH1-666。
[0010] 所述菌剂除了包含作为活性成的所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666外，还可包含辅料，如MRS固体培养基（溶剂为水，溶质及其浓度 如下：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温 801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵2g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 25g/L，琼脂17g/L)等。 [0011] 本发明的第三个目的是提供一种青贮饲料添加剂。
[0012] 本发明所提供的青贮饲料添加剂的活性成分为所述乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO ：M 2015255〇
[0013] 本发明的第四个目的是提供一种青贮饲料。
[0014] 本发明所提供的青贮饲料中含有所述青贮饲料添加剂。
[0015] 所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255或所述菌剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0016] (al)抑制细菌；
[0017] (a2)制备细菌抑制剂；
[0018] (a3)制备所述青贮饲料添加剂；
[0019] (a4)制备所述青贮饲料。
[0020] 所述（al)的应用为非疾病诊断或治疗的应用。
[0021] 在所述（al)和所述（a2)中，所述细菌具体可为藤黄微球菌和/或沙门氏菌。
[0022] 其中，所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255或所述菌剂对所述细菌的抑制具体为30°C条件下的抑制。
[0023] 所述青贮饲料添加剂在制备所述青贮饲料中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明的第五个目的是提供一种制备所述青贮饲料的方法。
[0025] 本发明所提供的制备所述青贮饲料的方法，具体可包括：将青贮原料与所述乳酸 乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255混合， 进行固体厌氧发酵，收集所有发酵产物，得到所述青贮饲料；
[0026] 在本发明中，所述青贮原料为小麦秸杆；具体为乳熟期小麦秸杆，水分含量 73. 27%，切割成l-2cm小段。
[0027] 在所述方法中，所述小麦稻杆和所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的配比可为 100g :105cfu ;所述发酵为低温发 酵；所述低温可为5°C ;所述发酵的时间可为30天。
[0028] 本发明所提供的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC Ν0:Μ 2015255具有耐低温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并在低温青贮（5°C )过 程中迅速繁殖并产酸降PH，有效的抑制有害杂菌的生长或产生，粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维 等营养成分有效保留，达到长期保存青贮饲料的效果。
[0029] 保藏说明
[0030] 菌种名称：乳酸乳球菌乳酸亚种
[0031] 拉丁名：（Lactococcus lactis subsp. lactis)
[0032] 菌株编号：QH1-666
[0033] 保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0034] 保藏机构简称：CCTCC
[0035] 地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心
[0036] 保藏日期：2015年4月28日
[0037] 保藏中心登记入册编号：CCTCC NO :M 2015255
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 实施例 1、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的 分离与鉴定
[0041] 一、菌株QH1-666的分尚与筛选
[0042] 取中国青海省明察县城油菜10g，放入90mL无菌水，震荡10秒，吸取ImL液体放 于I. 5mL离心管，依次稀释101，103, IO5倍，取稀释液体20 μ L分别涂布到MRS琼脂培养基 上，30°C厌氧培养48小时，取单菌落MRS固体培养基扩大培养，将获得的其中一株菌编号为 QH1-666。
[0043] 其中，所述MRS固体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬 酸铵2g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 25g/L，琼脂17g/L。
[0044] 二、菌株QH1-666的鉴定
[0045] 从以下几个方面对步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-666进行鉴定。
[0046] 1、形态学鉴定
[0047] 步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-666单菌落革兰氏染色后，显微镜下观察单菌 落形状呈圆形。
[0048] 2、生理生化特征鉴定
[0049] 步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-666革兰氏染色阴性，不产过氧化氢，不能够 发酵葡萄糖产气，为同型发酵。
[0050] 利用API 50CH检测菌株QH1-666对不同碳源的发酵情况。结果如表1所不。可 见，菌株QH1-666可以利用苦杏仁戒，熊果苷，七叶灵，水杨苷，纤维二糖，麦芽糖，乳糖，葡 萄糖，核糖，果糖，L-树胶醛醣，蔗糖，蜜二糖，海藻糖，D-木糖，半乳糖，甘露糖，甘露醇做碳 源进行发酵；不能利用D-来苏糖，D-阿拉伯糖醇，糖原，木糖醇，松三糖，山梨醇，D-阿拉伯 糖，L-阿拉伯糖，纤维糖，L-木糖，核糖醇，山梨糖，半乳糖醇，β -甲基-木糖苷，甘油，赤藓 糖醇，2-酮 基-葡糖酸盐，菊粉，糖原，D-海藻糖，5-酮基-葡糖酸盐，鼠李糖，L-海藻糖， α -甲基-D-甘露糖，棉子糖，D-松二糖，D-塔格糖，α -甲基-D-葡糖苷做碳源进行发酵； 可以微弱利用淀粉，龙胆二糖，葡糖酸盐做碳源进行发酵。
[0051] 表1菌株QH1-666对不同碳源的发酵情况
[0052]
[0053] 注：" + "表示阳性，即能利用；表示阴性，即不能利用；"w"表示弱阳性，即微弱 利用。
[0054] 3、16S rDNA序列同源性分析
[0055] 提取步骤一所得的菌株QH1-666的基因组DNA，以其为模板，采用细菌通用引物进 行PCR扩增，获得菌株QH1-666的16S rDNA片段，并进行序列测定，其序列为序列表中序 列 1。将序列 1 在 GenBank 数据库中进行 BLAST(http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast. cgi)同源性比对，确定菌种类别。
[0056] 根据上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一所 得的菌株QH1-666鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. Iactis)，并于 2015年4月28日保藏于4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为： 湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，邮编430072)，其保 藏编号为CCTCC NO :M 2015255,其分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus Iactis subsp. lactis)QHl-666〇
[0057] 实施例 2、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666 在 不同温度、PH及盐浓度下的生长
[0058] 1、不同温度下乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666的生长
[0059] 将活化的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255接种于MRS液体培养基，分别在5、10、45和50°C温度下恒温 培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值（0D600)，以观察不同温度下乳酸乳球菌乳 酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的生长情况。
[0060] 其中，MRS液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏IOg/ L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵 2g/L，硫酸镁 2g/L，硫酸锰(λ 25g/L ;ρΗ6· 8。
[0061] 结果如表2所示，可见乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC N0:M 2015255在5°C和10°C长势良好，45°C环境生长微弱，在50°C不能生 长，表明该菌株均有良好的耐低温生长能力。
[0062] 2、不同 pH 下乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的生长
[0063] 用lmol/L的盐酸和lmol/L的氢氧化钠将MRS液体培养基（配方同上）的起始pH 分别调至3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、9. 0和10. 0, 30 °C恒温静置培养乳酸乳球菌乳酸 亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255,培养24h，培养过 程中不调酸，用分光光度计测定600nm处光吸收值（0D600)，以观察不同pH下乳酸乳球菌乳 酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的生长情况。
[0064] 结果如表2所示，可见乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255在pH4. 0-9. 0的环境中生长良好，表明该菌株有较好的耐酸 碱生长能力。
[0065] 3、不同盐浓度下乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666的生长
[0066] 将活化的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255分别接种于含有NaCl的质量百分含量为3%和6. 5%的MRS 液体培养基（配方同上，PH6. 8)，于30°C恒温静置培养24h，用分光光度计测定600nm处光 吸收值（0D600)，以观察不同盐浓度下乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666的生长情况。
[0067] 结果如表2所示，可见乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255在3. 00%和6. 50%的NaCl浓度中均生长良好微弱，表明该 菌株具有一般的耐盐能力。
[0068] 4、低温（5°C )培养定期测定pH变化
[0069] 将MRS液体培养基（配方同上，pH6. 8) I. 5ml放于2ml离心管，接入QH1-666单菌 落，5°C培养，分别在7天，10天，14天时用pH酸度计测定滤液的pH值。实验重复3次，结 果以平均值的形式表示。
[0070] 结果如表2所示，可见低温条件（5°C )液体培养7天，乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255 的上清液pH 降到4.0， 培养到10-14天时pH降到3. 5,表明其产酸能力较好。
[0071] 表2菌株QH1-666在不同环境下的生长特征
[0072]
[0073] 注：" + "表示生长良好；"w"表示生长微弱（0D600大于0.3视为生长良好，大于 〇. 2小于等于0. 3为生长微弱）。
[0074] 根据以上结果，可知乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. Iactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255的生长适应能力很强，可耐极端环境存活繁殖。
[0075] 实施例 3、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的 抑菌活性测定
[0076] 供试细菌：藤黄微球菌，藤黄微球菌，沙门氏菌和大肠杆菌。
[0077] 1、将活化的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC Ν0:Μ 2015255接种于MRS液体培养基（配方同上，pH6. 8)中，30°C培养48h， 发酵液经1000 Orpm离心5min，取上清液用于测定。
[0078] 2、采用牛津杯双层平板法测定其抑菌活性，将已灭菌的琼脂培养基加热到完全 融化，倒在培养皿内，每皿15ml (下层），待其凝固。此外，将融化的PDA培养基冷却到 50°C左右混入供试细菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。 以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm、外径8mm、高IOmm的圆形小 管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入步骤1获得的乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255发酵液。加满后置37°C 培养16-18小时，观察结果，抑菌圈用尺量。以MRS液体培养基取代发酵液作为对照。实验 重复3次，结果以平均值的形式表示。
[0079] 结果如表3所示，可见：在30°C培养条件下，乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255对藤黄微球菌和沙门氏菌有较好的抑 制作用。
[0080] 表3菌株QH1-666的抑菌活性
[0081]
[0082] 注：抑菌圈直径包含牛津杯外径（7. 8mm) 表示无抑菌圈。
[0083] 实施例 4、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-6 66 青 IC小麦稻杆
[0084] 青贮原料：乳熟期小麦秸杆，水分含量73. 27%，切割成l_2cm小段。
[0085] -、制备小麦秸杆青贮饲料
[0086] 1、以乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255作为饲料添加剂制备小麦秸杆青贮饲料
[0087] (1)乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl_666CCTCC NO :M 2015255菌悬液的制备
[0088] 无菌条件下，取乳酸乳球菌乳酸亚种（L. lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC M 2015255接种于MRS液体培养基中30°C培养过夜，得到乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255菌悬液，菌悬液中乳酸乳球菌乳酸亚 种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的含量为 IO6Cfu/ ml 〇
[0089] 其中，MRS液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏IOg/ L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵 2g/L，硫酸镁 2g/L，硫酸锰(λ 25g/L ;ρΗ6· 8。
[0090] (2)以乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255作为饲料添加剂制备小麦秸杆青贮饲料
[0091] 将乳熟期小麦收割后用去穗，铡刀切成l-2cm左右长短（水分含量73. 27% )，取 100g放入青IC袋中，将步骤（1)获得的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255菌悬液每袋100 μ 1分别加入青贮袋中，混匀，利用真 空包装机抽真空后密封，放入5°C冰柜内。
[0092] 2、对照小麦秸杆青贮饲料
[0093] 将乳熟期小麦收割后用去穗，铡刀切成l-2cm左右长短（水分含量72. 37% )，取 100g放入青贮袋中，将无菌水每袋100 μ 1分别加入青贮袋中，混匀，利用真空包装机抽真 空后密封，放入5°C冰柜内。
[0094] 二、低温青贮过程中小麦秸杆的微生物变化测定
[0095] 采用平板稀释法测定微生物变化。将饲料样品IOg加入到90ml无菌蒸馏水中， 利用漩涡振荡器震荡30s，10倍梯度稀释，然后分别取10'ΚΓ 3和KT5倍样品稀释液各 20 μ 1涂布在MRS (用于检测乳酸菌）、BLB (用于检测大肠杆菌）、PDA (用于检测酵母菌和 霉菌，根据菌落形态，肉眼区分，霉菌菌落呈绒毛状，絮状，蜘蛛网状，呈现其孢子的颜色，而 酵母菌比较小，杆状，螺旋状，球状，菌落表面光滑或粘稠或干燥）NA(用于检测好氧细菌） 培养基上；将KT 1和KT2倍样品稀释液Iml在75°C水浴锅水浴15min后，分别取20 μ 1涂 布在NA(用于检测芽孢杆菌）和CLO(用于检测梭菌）培养基（CL0培养基的配方：每升 培养基中含有蛋白胨15g，大豆蛋白胨7. 5g，酵母膏7. 5g，牛肉膏7. 5g，柠檬酸铁铵lg，亚 硫酸氢钠 lg，L-半胱氨酸盐酸盐0. 75g，琼脂15g，余量为水）上，将这些涂布好的培养基 倒置放于30°C恒温培养箱培养48h，其中MRS和CLO培养基应放置于厌氧培养箱，其它培 养基放置于普通恒温培养箱即可。培养48小时后记单菌落个数为n，菌落（logCFU/g)= l〇g1Q[(nX10)/20X10_3]。实验重复3次，结果以平均值土标准差的形式表示。
[0096] 结果如表4所示，可见：低温（5°C )条件下，青贮第1天，添加乳酸乳球菌乳酸亚 种（Lactococcus lactis subsp.lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255 的青贮小麦秸杆 与对照组相比，乳酸菌数量高6个数量级；青贮第3和第7天，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的青贮小麦秸杆与对 照组相比，乳酸菌数量高3个数量级；在青贮第3天和第7天，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的青贮小麦秸杆中的 大肠杆菌数量极显著低于对照组（P < 〇. 01)，在青贮第30天，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的青贮饲料没有检出 大肠杆菌；青IC第7天，添加乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC N0:M 2015255的青贮饲料没有检出芽孢杆菌。总之，青贮小麦秸杆中添加 乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255， 乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 迅速生长为优势菌株，可以有效的抑制大肠杆菌，芽孢杆菌等有害杂菌的生长。
[0097] 表4低温青贮（5°C )过程中小麦秸杆的微生物变化（logCFU/g)a
[0098]
[0099] 注：3平均值土标准差（η = 3)。ND表示没有检测到。同一纵列含有不同大写字 母代表差异性极显著（P < 〇. 01);同一纵列含有不同小写字母表示差异显著（P < 〇. 05)。 [0100] 三、低温青贮过程中小麦秸杆的pH、游离水和干重含量变化的测定
[0101] 1、pH测定方法
[0102] 将饲料样品IOg加入到90ml无菌蒸馏水中，利用漩涡振荡器震荡30s，取液体通过 滤纸过滤，利用PH酸度计测定滤液的pH值。实验重复3次，结果以平均值土标准差的形 式表不。
[0103] 2、游离水含量和干重含量的测定方法
[0104] 65°C，48h干燥法，首先将一张白纸订成一个纸袋，在分析天平上对纸袋进行称重， 记为W1，将饲料样品放入纸袋中，称总重，记为W2,恒温通风65°C干燥48h后，放置于干燥 器中30min后称重，记为W3。游离水分（％) = (W2-W3V(W2-W1)X100。干重（％)= 100% -游离水分（％)。实验重复3次，结果以平均值土标准差的形式表示。
[0105] 结果如表5所示，可见：在整个低温（5°C)青贮过程中，添加乳酸乳球菌乳酸 亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis)QHl_666CCTCC NO :M 2015255 的小麦稻杆青 贮饲料pH均极显著低于没有添加菌剂的对照组（P < 0. 01)，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp.lactis)QHl_666CCTCC NO :M 2015255 的青饲料，在青 第7天时pH降到了 3. 79的十分利于青贮的水平，表明在5°C低温环境下，添加乳酸乳球菌 乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255 可以迅速有 效的将青贮小麦秸杆PH降低到利于青贮水平。与对照组相比，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255 对游离水分和干重含 量没有显著影响，表明青贮小麦秸杆保留了饲料的鲜嫩多汁。
[0106] 表5低温青贮（5°C )过程中小麦秸杆的pH、游离水和干重含量变化（％ /鲜重）a
[0107]
[0108] 注：3平均值土标准差（η = 3) 表示差异显著（P彡0. 05) ;"NS"表示差异不 显著（p > 0· 05)。
[0109] 四、低温青贮过程中小麦秸杆的粗脂肪、粗蛋白和中性洗涤纤维变化的测定
[0110] 1、粗脂肪的测定
[0111] 采用乙醚萃取法。饲料样品在乙醚中3h萃取抽提粗脂肪，除了中性脂肪外，磷酸 脂质、游离脂肪酸、脂溶性色素等也包含在内。
[0112] ( 1)脂肪瓶放置于l〇〇°C烘箱中干燥2h后，取出置于干燥器中放凉lh，称重，记为 Wlo
[0113] (2)分析天平称取lg(W2)左右饲料样品置于滤纸上，包好后将滤纸塞进脂肪桶 内，用脱脂棉堵口。
[0114] (3)将装有饲料样品的脂肪桶放入脂肪抽出装置内，接上脂肪瓶，加入约50ml乙 醚于脂肪瓶瓶中，打开冷却水系统，开始3h以上抽提。
[0115] (4)完成抽提以后，取出脂肪桶，将脂肪瓶置于100°C烘箱中3h干燥后，取出放在 干燥器中冷却30m，称重，记为W3。
[0116] 粗脂肪（％ ) = (W3-W1)/W2X100。实验重复3次，结果以平均值土标准差的形 式表不。
[0117] 2、粗蛋白的测定
[0118] 采用消煮定量法测定粗蛋白。
[0119] (1)通过分析天平称取约Ig(Wl)饲料样品，称量纸包好以后放入消煮管中，加入 〇. 2g硫酸铜和6. Og硫酸钾。
[0120] ⑵轻轻加入20ml浓硫酸于消煮管中，轻轻震荡，使样品充分分布在浓硫酸中。
[0121] (3)将消煮管连接装置放置于消煮管上，阻止硫酸的挥发。
[0122] (4)打开循环水装置，将消煮管放置在消煮装置上，开始加热至420°C。
[0123] (5)等待消煮管内液体变为绿色透明后，继续420°C消煮2h。
[0124] (6)消煮分解完成以后，关掉消煮装置，取下消煮管放于隔热板上放凉。
[0125] (7)冷却后，将消化管放入凯氏定氮仪，开始滴定（根据A0AC(0fficial Methods of Analysis[Μ]. 15th ed. Association of official analytical chemists. Arlington, VA. 1999)记述的方法进行分析）。
[0126] 全氮量（％ ) = n(Vl-V2) XMX0· 014/W1 XlOO ;
[0127] 粗蛋白质量（％ )=全氮量（％ ) Χ6· 25 ;
[0128] 其中，Vl :滴定量ml ;V2 :空白滴定量；M :滴定液HCl的浓度；Wl :样品重量。
[0129] 实验重复3次，结果以平均值土标准差的形式表示。
[0130] 3、中性洗绦纤维（neutral detergent fiber，NDF)的测定
[0131] 植物性饲料经中性洗涤剂煮沸处理以后，不溶解的残渣为中性洗涤纤维，主要为 细胞壁成分，中性洗涤纤维包括纤维素、本质素和半纤维素，可以用作定量草食家畜粗饲料 的采食量。
[0132] (1)预先20min打开粗纤维测定仪器和冷却循环水。
[0133] (2)分析天平称取约0. 5g(Wl)左右饲料样品放置于玻璃坩埚内。
[0134] (3)上机，加入IOOrnl中性洗涤剂3% (3g/100ml)十二烷基硫酸钠和适量丁辛醇 作消泡剂，100°c加热至沸腾，保持50°C左右加热70min。
[0135] (4)抽滤以后、取下玻璃坩埚，利用丙酮冲洗三次。
[0136] (5)将玻璃坩埚放于通风橱中干燥过夜。
[0137] (6)将干燥以后的玻璃坩埚放置于烘箱内，135°C恒温通风干燥2h以上，放入干燥 器中冷却Ih后，称重，记为W2。
[0138] (7)玻璃坩埚放于电炉上进行灰化，直至烟散尽，使用坩埚钳取出坩埚放置于 530°C马弗炉中加热灰化2h后，取出放置于干燥器中Ih放凉，称重，记为W3。
[0139] NDF (%) = (W2-W3)/W1X100〇
[0140] 实验重复3次，结果以平均值土标准差的形式表示。
[0141] 结果如表6所示，可见：在整个低温（5°C)青贮过程中，乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255 对小麦秸杆青贮饲料 的粗蛋白和中性洗涤纤维含量没有显著影响；青贮第1天和青贮第3天，青贮小麦秸杆的 粗脂肪含量变化起伏较大，其余青IC时间添加乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255的实验组与对照组相比没有显著变化。总之 在5°C低温青贮过程中，粗蛋白，中性洗涤纤维和粗脂肪成分均保留较好。
[0142] 表6低温青贮（5°C )过程中小麦秸杆的粗脂肪、粗蛋白和中性洗涤纤维的变化 (% /鲜重r
[0143]
[0144] 注：3平均值土标准差（n = 3) ;"NS"表示差异不显著（p > 0. 05) 表示差异 显著（P < 0. 05)。NDF为中性洗涤纤维。
[0145] 综上所述，可见乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC Ν0:Μ 2015255在低温青贮（5°C)过程中迅速繁殖并产酸降pH，有效的抑制 有害杂菌的生长或产生，粗蛋白、粗脂肪、粗纤维等营养成分有效保留，达到长期保存青贮 饲料的效果。
【主权项】
1. 乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QHl_666,其在中国典型 培养物保藏中心保藏编号为CCTCCNO:M2015255。2. -种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸 亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QH1-666。3. -种青贮饲料添加剂，其特征在于：所述青贮饲料添加剂的活性成分为权利要求1 所述的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QH1-666。4. 一种青贮饲料，其特征在于：所述青贮饲料中含有权利要求3所述的青贮饲料添加 剂。5. 根据权利要求4所述的青贮饲料，其特征在于：所述青贮饲料是按照权利要求9或 10所述的方法制备得到的。6. 权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis) QH1-666或权利要求2所述的菌剂在如下任一中的应用： (al)抑制细菌； (a2)制备细菌抑制剂； (a3)制备权利要求3所述的青贮饲料添加剂； (a4)制备权利要求4所述的青贮饲料； 在所述（al)和所述（a2)中，所述细菌具体为藤黄微球菌和/或沙门氏菌。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcuslactissubsp.lactis)QHl_666或所述菌剂对所述细菌的抑制为30°C条件 下的抑制。8. 权利要求3所述的青贮饲料添加剂在制备权利要求4或5所述的青贮饲料中的应 用。9. 制备权利要求4所述青贮饲料的方法，包括：将青贮原料与权利要求1所述的乳酸 乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QH1-666混合，进行固体厌氧发酵， 收集所有发酵产物，得到所述青贮饲料； 所述青贮原料具体为小麦秸杆。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述小麦秸杆和所述乳酸 乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QHl_666 的配比为100g:105cfu;和 /或 所述发酵为低温发酵；所述低温为5°C;和/或 所述发酵的时间为30天。
【专利摘要】本发明公开了一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在低温青贮中的应用。本发明所提供的乳酸乳球菌乳酸亚种具体为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)QH1-666，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015255。本发明所提供的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)QH1-666CCTCC NO：M 2015255具有耐低温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并在低温青贮(5℃)过程中迅速繁殖并产酸降pH，有效的抑制有害杂菌的生长或产生，粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维等营养成分有效保留，达到长期保存青贮饲料的效果。CCTCC NO：M 201525520150428
【IPC分类】A23K1/16, C12N1/20, A23K3/02, C12R1/01
【公开号】CN104894030
【申请号】CN201510340152
【发明人】谈重芳, 崔美岩, 张淼, 李立, 曾庆鹏, 张利浩, 张蓓, 张志霞, 陈骏, 王雁萍, 焦浈
【申请人】郑州大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在低温青贮中的应 用。
【背景技术】
[0002] 青贮是在乳酸菌的厌氧发酵作用下将碳水化合物转化为有机酸，从而使pH降低 达到长期贮存的目的。乳酸菌和温度是青贮饲料发酵品质好坏的决定性因素。
[0003] 小麦秸杆是寒冷地区冬春饲补的饲料作物，由于寒冷地区温度低，限制乳酸菌的 生长，很难发酵出品质优良并可以长期贮存的饲料。
[0004] 因此，筛选出耐高低温、耐盐、耐酸碱的抗逆性较强的菌株，并将其作为发酵剂添 加到低温青贮小麦秸杆饲料中，将会对高寒地区的青贮饲料制作有着巨大的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一株乳酸乳球菌乳酸亚种。
[0006] 本发明所提供的乳酸乳球菌乳酸亚种具体为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl_666,该菌株已于2015年4月28日保藏于中国典型培养物保藏 中心（简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏 中心），其保藏编号为CCTCC NO :M 2015255。
[0007] 所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666 从中国 青海省明察县城油菜分离得到的，该菌株单菌落为圆形，革兰氏染色阴性，不产过氧化氢； 该菌株不能够发酵葡萄糖产气，为同型发酵。在5°C和KTC长势良好，45°C环境生长微弱， 在50°C不生长，表明该菌株均有良好的耐低温生长能力。该菌株在3. 00 %和6. 50%的NaCl 浓度中均生长良好微弱，表明该菌株具有一般的耐盐能力。液体5°C培养7天，该菌株的上 清液PH降到4. 0,培养到10-14天时pH降到3. 5,表明其产酸能力较好。该菌株在pH4. 0-9. 0 的环境中生长良好，表明该菌株有较好的耐酸碱生长能力。其16S rDNA序列如序列表中序 列1所示。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种菌剂。
[0009] 本发明所提供的菌剂的活性成分为所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis)QH1-666。
[0010] 所述菌剂除了包含作为活性成的所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666外，还可包含辅料，如MRS固体培养基（溶剂为水，溶质及其浓度 如下：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温 801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵2g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 25g/L，琼脂17g/L)等。 [0011] 本发明的第三个目的是提供一种青贮饲料添加剂。
[0012] 本发明所提供的青贮饲料添加剂的活性成分为所述乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO ：M 2015255〇
[0013] 本发明的第四个目的是提供一种青贮饲料。
[0014] 本发明所提供的青贮饲料中含有所述青贮饲料添加剂。
[0015] 所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255或所述菌剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0016] (al)抑制细菌；
[0017] (a2)制备细菌抑制剂；
[0018] (a3)制备所述青贮饲料添加剂；
[0019] (a4)制备所述青贮饲料。
[0020] 所述（al)的应用为非疾病诊断或治疗的应用。
[0021] 在所述（al)和所述（a2)中，所述细菌具体可为藤黄微球菌和/或沙门氏菌。
[0022] 其中，所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255或所述菌剂对所述细菌的抑制具体为30°C条件下的抑制。
[0023] 所述青贮饲料添加剂在制备所述青贮饲料中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明的第五个目的是提供一种制备所述青贮饲料的方法。
[0025] 本发明所提供的制备所述青贮饲料的方法，具体可包括：将青贮原料与所述乳酸 乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255混合， 进行固体厌氧发酵，收集所有发酵产物，得到所述青贮饲料；
[0026] 在本发明中，所述青贮原料为小麦秸杆；具体为乳熟期小麦秸杆，水分含量 73. 27%，切割成l-2cm小段。
[0027] 在所述方法中，所述小麦稻杆和所述乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的配比可为 100g :105cfu ;所述发酵为低温发 酵；所述低温可为5°C ;所述发酵的时间可为30天。
[0028] 本发明所提供的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC Ν0:Μ 2015255具有耐低温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并在低温青贮（5°C )过 程中迅速繁殖并产酸降PH，有效的抑制有害杂菌的生长或产生，粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维 等营养成分有效保留，达到长期保存青贮饲料的效果。
[0029] 保藏说明
[0030] 菌种名称：乳酸乳球菌乳酸亚种
[0031] 拉丁名：（Lactococcus lactis subsp. lactis)
[0032] 菌株编号：QH1-666
[0033] 保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0034] 保藏机构简称：CCTCC
[0035] 地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心
[0036] 保藏日期：2015年4月28日
[0037] 保藏中心登记入册编号：CCTCC NO :M 2015255
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 实施例 1、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的 分离与鉴定
[0041] 一、菌株QH1-666的分尚与筛选
[0042] 取中国青海省明察县城油菜10g，放入90mL无菌水，震荡10秒，吸取ImL液体放 于I. 5mL离心管，依次稀释101，103, IO5倍，取稀释液体20 μ L分别涂布到MRS琼脂培养基 上，30°C厌氧培养48小时，取单菌落MRS固体培养基扩大培养，将获得的其中一株菌编号为 QH1-666。
[0043] 其中，所述MRS固体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬 酸铵2g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 25g/L，琼脂17g/L。
[0044] 二、菌株QH1-666的鉴定
[0045] 从以下几个方面对步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-666进行鉴定。
[0046] 1、形态学鉴定
[0047] 步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-666单菌落革兰氏染色后，显微镜下观察单菌 落形状呈圆形。
[0048] 2、生理生化特征鉴定
[0049] 步骤一分离并筛选得到的菌株QH1-666革兰氏染色阴性，不产过氧化氢，不能够 发酵葡萄糖产气，为同型发酵。
[0050] 利用API 50CH检测菌株QH1-666对不同碳源的发酵情况。结果如表1所不。可 见，菌株QH1-666可以利用苦杏仁戒，熊果苷，七叶灵，水杨苷，纤维二糖，麦芽糖，乳糖，葡 萄糖，核糖，果糖，L-树胶醛醣，蔗糖，蜜二糖，海藻糖，D-木糖，半乳糖，甘露糖，甘露醇做碳 源进行发酵；不能利用D-来苏糖，D-阿拉伯糖醇，糖原，木糖醇，松三糖，山梨醇，D-阿拉伯 糖，L-阿拉伯糖，纤维糖，L-木糖，核糖醇，山梨糖，半乳糖醇，β -甲基-木糖苷，甘油，赤藓 糖醇，2-酮 基-葡糖酸盐，菊粉，糖原，D-海藻糖，5-酮基-葡糖酸盐，鼠李糖，L-海藻糖， α -甲基-D-甘露糖，棉子糖，D-松二糖，D-塔格糖，α -甲基-D-葡糖苷做碳源进行发酵； 可以微弱利用淀粉，龙胆二糖，葡糖酸盐做碳源进行发酵。
[0051] 表1菌株QH1-666对不同碳源的发酵情况
[0052]
[0053] 注：" + "表示阳性，即能利用；表示阴性，即不能利用；"w"表示弱阳性，即微弱 利用。
[0054] 3、16S rDNA序列同源性分析
[0055] 提取步骤一所得的菌株QH1-666的基因组DNA，以其为模板，采用细菌通用引物进 行PCR扩增，获得菌株QH1-666的16S rDNA片段，并进行序列测定，其序列为序列表中序 列 1。将序列 1 在 GenBank 数据库中进行 BLAST(http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast. cgi)同源性比对，确定菌种类别。
[0056] 根据上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一所 得的菌株QH1-666鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. Iactis)，并于 2015年4月28日保藏于4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为： 湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，邮编430072)，其保 藏编号为CCTCC NO :M 2015255,其分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus Iactis subsp. lactis)QHl-666〇
[0057] 实施例 2、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666 在 不同温度、PH及盐浓度下的生长
[0058] 1、不同温度下乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666的生长
[0059] 将活化的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255接种于MRS液体培养基，分别在5、10、45和50°C温度下恒温 培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值（0D600)，以观察不同温度下乳酸乳球菌乳 酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的生长情况。
[0060] 其中，MRS液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏IOg/ L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵 2g/L，硫酸镁 2g/L，硫酸锰(λ 25g/L ;ρΗ6· 8。
[0061] 结果如表2所示，可见乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC N0:M 2015255在5°C和10°C长势良好，45°C环境生长微弱，在50°C不能生 长，表明该菌株均有良好的耐低温生长能力。
[0062] 2、不同 pH 下乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的生长
[0063] 用lmol/L的盐酸和lmol/L的氢氧化钠将MRS液体培养基（配方同上）的起始pH 分别调至3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、9. 0和10. 0, 30 °C恒温静置培养乳酸乳球菌乳酸 亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255,培养24h，培养过 程中不调酸，用分光光度计测定600nm处光吸收值（0D600)，以观察不同pH下乳酸乳球菌乳 酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的生长情况。
[0064] 结果如表2所示，可见乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255在pH4. 0-9. 0的环境中生长良好，表明该菌株有较好的耐酸 碱生长能力。
[0065] 3、不同盐浓度下乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666的生长
[0066] 将活化的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255分别接种于含有NaCl的质量百分含量为3%和6. 5%的MRS 液体培养基（配方同上，PH6. 8)，于30°C恒温静置培养24h，用分光光度计测定600nm处光 吸收值（0D600)，以观察不同盐浓度下乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666的生长情况。
[0067] 结果如表2所示，可见乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255在3. 00%和6. 50%的NaCl浓度中均生长良好微弱，表明该 菌株具有一般的耐盐能力。
[0068] 4、低温（5°C )培养定期测定pH变化
[0069] 将MRS液体培养基（配方同上，pH6. 8) I. 5ml放于2ml离心管，接入QH1-666单菌 落，5°C培养，分别在7天，10天，14天时用pH酸度计测定滤液的pH值。实验重复3次，结 果以平均值的形式表示。
[0070] 结果如表2所示，可见低温条件（5°C )液体培养7天，乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255 的上清液pH 降到4.0， 培养到10-14天时pH降到3. 5,表明其产酸能力较好。
[0071] 表2菌株QH1-666在不同环境下的生长特征
[0072]
[0073] 注：" + "表示生长良好；"w"表示生长微弱（0D600大于0.3视为生长良好，大于 〇. 2小于等于0. 3为生长微弱）。
[0074] 根据以上结果，可知乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. Iactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255的生长适应能力很强，可耐极端环境存活繁殖。
[0075] 实施例 3、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666 的 抑菌活性测定
[0076] 供试细菌：藤黄微球菌，藤黄微球菌，沙门氏菌和大肠杆菌。
[0077] 1、将活化的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC Ν0:Μ 2015255接种于MRS液体培养基（配方同上，pH6. 8)中，30°C培养48h， 发酵液经1000 Orpm离心5min，取上清液用于测定。
[0078] 2、采用牛津杯双层平板法测定其抑菌活性，将已灭菌的琼脂培养基加热到完全 融化，倒在培养皿内，每皿15ml (下层），待其凝固。此外，将融化的PDA培养基冷却到 50°C左右混入供试细菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。 以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm、外径8mm、高IOmm的圆形小 管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入步骤1获得的乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255发酵液。加满后置37°C 培养16-18小时，观察结果，抑菌圈用尺量。以MRS液体培养基取代发酵液作为对照。实验 重复3次，结果以平均值的形式表示。
[0079] 结果如表3所示，可见：在30°C培养条件下，乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255对藤黄微球菌和沙门氏菌有较好的抑 制作用。
[0080] 表3菌株QH1-666的抑菌活性
[0081]
[0082] 注：抑菌圈直径包含牛津杯外径（7. 8mm) 表示无抑菌圈。
[0083] 实施例 4、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-6 66 青 IC小麦稻杆
[0084] 青贮原料：乳熟期小麦秸杆，水分含量73. 27%，切割成l_2cm小段。
[0085] -、制备小麦秸杆青贮饲料
[0086] 1、以乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255作为饲料添加剂制备小麦秸杆青贮饲料
[0087] (1)乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl_666CCTCC NO :M 2015255菌悬液的制备
[0088] 无菌条件下，取乳酸乳球菌乳酸亚种（L. lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC M 2015255接种于MRS液体培养基中30°C培养过夜，得到乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255菌悬液，菌悬液中乳酸乳球菌乳酸亚 种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的含量为 IO6Cfu/ ml 〇
[0089] 其中，MRS液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏IOg/ L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵 2g/L，硫酸镁 2g/L，硫酸锰(λ 25g/L ;ρΗ6· 8。
[0090] (2)以乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255作为饲料添加剂制备小麦秸杆青贮饲料
[0091] 将乳熟期小麦收割后用去穗，铡刀切成l-2cm左右长短（水分含量73. 27% )，取 100g放入青IC袋中，将步骤（1)获得的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255菌悬液每袋100 μ 1分别加入青贮袋中，混匀，利用真 空包装机抽真空后密封，放入5°C冰柜内。
[0092] 2、对照小麦秸杆青贮饲料
[0093] 将乳熟期小麦收割后用去穗，铡刀切成l-2cm左右长短（水分含量72. 37% )，取 100g放入青贮袋中，将无菌水每袋100 μ 1分别加入青贮袋中，混匀，利用真空包装机抽真 空后密封，放入5°C冰柜内。
[0094] 二、低温青贮过程中小麦秸杆的微生物变化测定
[0095] 采用平板稀释法测定微生物变化。将饲料样品IOg加入到90ml无菌蒸馏水中， 利用漩涡振荡器震荡30s，10倍梯度稀释，然后分别取10'ΚΓ 3和KT5倍样品稀释液各 20 μ 1涂布在MRS (用于检测乳酸菌）、BLB (用于检测大肠杆菌）、PDA (用于检测酵母菌和 霉菌，根据菌落形态，肉眼区分，霉菌菌落呈绒毛状，絮状，蜘蛛网状，呈现其孢子的颜色，而 酵母菌比较小，杆状，螺旋状，球状，菌落表面光滑或粘稠或干燥）NA(用于检测好氧细菌） 培养基上；将KT 1和KT2倍样品稀释液Iml在75°C水浴锅水浴15min后，分别取20 μ 1涂 布在NA(用于检测芽孢杆菌）和CLO(用于检测梭菌）培养基（CL0培养基的配方：每升 培养基中含有蛋白胨15g，大豆蛋白胨7. 5g，酵母膏7. 5g，牛肉膏7. 5g，柠檬酸铁铵lg，亚 硫酸氢钠 lg，L-半胱氨酸盐酸盐0. 75g，琼脂15g，余量为水）上，将这些涂布好的培养基 倒置放于30°C恒温培养箱培养48h，其中MRS和CLO培养基应放置于厌氧培养箱，其它培 养基放置于普通恒温培养箱即可。培养48小时后记单菌落个数为n，菌落（logCFU/g)= l〇g1Q[(nX10)/20X10_3]。实验重复3次，结果以平均值土标准差的形式表示。
[0096] 结果如表4所示，可见：低温（5°C )条件下，青贮第1天，添加乳酸乳球菌乳酸亚 种（Lactococcus lactis subsp.lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255 的青贮小麦秸杆 与对照组相比，乳酸菌数量高6个数量级；青贮第3和第7天，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的青贮小麦秸杆与对 照组相比，乳酸菌数量高3个数量级；在青贮第3天和第7天，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的青贮小麦秸杆中的 大肠杆菌数量极显著低于对照组（P < 〇. 01)，在青贮第30天，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 的青贮饲料没有检出 大肠杆菌；青IC第7天，添加乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC N0:M 2015255的青贮饲料没有检出芽孢杆菌。总之，青贮小麦秸杆中添加 乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255， 乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255 迅速生长为优势菌株，可以有效的抑制大肠杆菌，芽孢杆菌等有害杂菌的生长。
[0097] 表4低温青贮（5°C )过程中小麦秸杆的微生物变化（logCFU/g)a
[0098]
[0099] 注：3平均值土标准差（η = 3)。ND表示没有检测到。同一纵列含有不同大写字 母代表差异性极显著（P < 〇. 01);同一纵列含有不同小写字母表示差异显著（P < 〇. 05)。 [0100] 三、低温青贮过程中小麦秸杆的pH、游离水和干重含量变化的测定
[0101] 1、pH测定方法
[0102] 将饲料样品IOg加入到90ml无菌蒸馏水中，利用漩涡振荡器震荡30s，取液体通过 滤纸过滤，利用PH酸度计测定滤液的pH值。实验重复3次，结果以平均值土标准差的形 式表不。
[0103] 2、游离水含量和干重含量的测定方法
[0104] 65°C，48h干燥法，首先将一张白纸订成一个纸袋，在分析天平上对纸袋进行称重， 记为W1，将饲料样品放入纸袋中，称总重，记为W2,恒温通风65°C干燥48h后，放置于干燥 器中30min后称重，记为W3。游离水分（％) = (W2-W3V(W2-W1)X100。干重（％)= 100% -游离水分（％)。实验重复3次，结果以平均值土标准差的形式表示。
[0105] 结果如表5所示，可见：在整个低温（5°C)青贮过程中，添加乳酸乳球菌乳酸 亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis)QHl_666CCTCC NO :M 2015255 的小麦稻杆青 贮饲料pH均极显著低于没有添加菌剂的对照组（P < 0. 01)，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp.lactis)QHl_666CCTCC NO :M 2015255 的青饲料，在青 第7天时pH降到了 3. 79的十分利于青贮的水平，表明在5°C低温环境下，添加乳酸乳球菌 乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis)QHl-666CCTCC NO :M 2015255 可以迅速有 效的将青贮小麦秸杆PH降低到利于青贮水平。与对照组相比，添加乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255 对游离水分和干重含 量没有显著影响，表明青贮小麦秸杆保留了饲料的鲜嫩多汁。
[0106] 表5低温青贮（5°C )过程中小麦秸杆的pH、游离水和干重含量变化（％ /鲜重）a
[0107]
[0108] 注：3平均值土标准差（η = 3) 表示差异显著（P彡0. 05) ;"NS"表示差异不 显著（p > 0· 05)。
[0109] 四、低温青贮过程中小麦秸杆的粗脂肪、粗蛋白和中性洗涤纤维变化的测定
[0110] 1、粗脂肪的测定
[0111] 采用乙醚萃取法。饲料样品在乙醚中3h萃取抽提粗脂肪，除了中性脂肪外，磷酸 脂质、游离脂肪酸、脂溶性色素等也包含在内。
[0112] ( 1)脂肪瓶放置于l〇〇°C烘箱中干燥2h后，取出置于干燥器中放凉lh，称重，记为 Wlo
[0113] (2)分析天平称取lg(W2)左右饲料样品置于滤纸上，包好后将滤纸塞进脂肪桶 内，用脱脂棉堵口。
[0114] (3)将装有饲料样品的脂肪桶放入脂肪抽出装置内，接上脂肪瓶，加入约50ml乙 醚于脂肪瓶瓶中，打开冷却水系统，开始3h以上抽提。
[0115] (4)完成抽提以后，取出脂肪桶，将脂肪瓶置于100°C烘箱中3h干燥后，取出放在 干燥器中冷却30m，称重，记为W3。
[0116] 粗脂肪（％ ) = (W3-W1)/W2X100。实验重复3次，结果以平均值土标准差的形 式表不。
[0117] 2、粗蛋白的测定
[0118] 采用消煮定量法测定粗蛋白。
[0119] (1)通过分析天平称取约Ig(Wl)饲料样品，称量纸包好以后放入消煮管中，加入 〇. 2g硫酸铜和6. Og硫酸钾。
[0120] ⑵轻轻加入20ml浓硫酸于消煮管中，轻轻震荡，使样品充分分布在浓硫酸中。
[0121] (3)将消煮管连接装置放置于消煮管上，阻止硫酸的挥发。
[0122] (4)打开循环水装置，将消煮管放置在消煮装置上，开始加热至420°C。
[0123] (5)等待消煮管内液体变为绿色透明后，继续420°C消煮2h。
[0124] (6)消煮分解完成以后，关掉消煮装置，取下消煮管放于隔热板上放凉。
[0125] (7)冷却后，将消化管放入凯氏定氮仪，开始滴定（根据A0AC(0fficial Methods of Analysis[Μ]. 15th ed. Association of official analytical chemists. Arlington, VA. 1999)记述的方法进行分析）。
[0126] 全氮量（％ ) = n(Vl-V2) XMX0· 014/W1 XlOO ;
[0127] 粗蛋白质量（％ )=全氮量（％ ) Χ6· 25 ;
[0128] 其中，Vl :滴定量ml ;V2 :空白滴定量；M :滴定液HCl的浓度；Wl :样品重量。
[0129] 实验重复3次，结果以平均值土标准差的形式表示。
[0130] 3、中性洗绦纤维（neutral detergent fiber，NDF)的测定
[0131] 植物性饲料经中性洗涤剂煮沸处理以后，不溶解的残渣为中性洗涤纤维，主要为 细胞壁成分，中性洗涤纤维包括纤维素、本质素和半纤维素，可以用作定量草食家畜粗饲料 的采食量。
[0132] (1)预先20min打开粗纤维测定仪器和冷却循环水。
[0133] (2)分析天平称取约0. 5g(Wl)左右饲料样品放置于玻璃坩埚内。
[0134] (3)上机，加入IOOrnl中性洗涤剂3% (3g/100ml)十二烷基硫酸钠和适量丁辛醇 作消泡剂，100°c加热至沸腾，保持50°C左右加热70min。
[0135] (4)抽滤以后、取下玻璃坩埚，利用丙酮冲洗三次。
[0136] (5)将玻璃坩埚放于通风橱中干燥过夜。
[0137] (6)将干燥以后的玻璃坩埚放置于烘箱内，135°C恒温通风干燥2h以上，放入干燥 器中冷却Ih后，称重，记为W2。
[0138] (7)玻璃坩埚放于电炉上进行灰化，直至烟散尽，使用坩埚钳取出坩埚放置于 530°C马弗炉中加热灰化2h后，取出放置于干燥器中Ih放凉，称重，记为W3。
[0139] NDF (%) = (W2-W3)/W1X100〇
[0140] 实验重复3次，结果以平均值土标准差的形式表示。
[0141] 结果如表6所示，可见：在整个低温（5°C)青贮过程中，乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC NO :M 2015255 对小麦秸杆青贮饲料 的粗蛋白和中性洗涤纤维含量没有显著影响；青贮第1天和青贮第3天，青贮小麦秸杆的 粗脂肪含量变化起伏较大，其余青IC时间添加乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)QH1-666CCTCC NO :M 2015255的实验组与对照组相比没有显著变化。总之 在5°C低温青贮过程中，粗蛋白，中性洗涤纤维和粗脂肪成分均保留较好。
[0142] 表6低温青贮（5°C )过程中小麦秸杆的粗脂肪、粗蛋白和中性洗涤纤维的变化 (% /鲜重r
[0143]
[0144] 注：3平均值土标准差（n = 3) ;"NS"表示差异不显著（p > 0. 05) 表示差异 显著（P < 0. 05)。NDF为中性洗涤纤维。
[0145] 综上所述，可见乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) QH1-666CCTCC Ν0:Μ 2015255在低温青贮（5°C)过程中迅速繁殖并产酸降pH，有效的抑制 有害杂菌的生长或产生，粗蛋白、粗脂肪、粗纤维等营养成分有效保留，达到长期保存青贮 饲料的效果。
【主权项】
1. 乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QHl_666,其在中国典型 培养物保藏中心保藏编号为CCTCCNO:M2015255。2. -种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸 亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QH1-666。3. -种青贮饲料添加剂，其特征在于：所述青贮饲料添加剂的活性成分为权利要求1 所述的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QH1-666。4. 一种青贮饲料，其特征在于：所述青贮饲料中含有权利要求3所述的青贮饲料添加 剂。5. 根据权利要求4所述的青贮饲料，其特征在于：所述青贮饲料是按照权利要求9或 10所述的方法制备得到的。6. 权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis) QH1-666或权利要求2所述的菌剂在如下任一中的应用： (al)抑制细菌； (a2)制备细菌抑制剂； (a3)制备权利要求3所述的青贮饲料添加剂； (a4)制备权利要求4所述的青贮饲料； 在所述（al)和所述（a2)中，所述细菌具体为藤黄微球菌和/或沙门氏菌。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcuslactissubsp.lactis)QHl_666或所述菌剂对所述细菌的抑制为30°C条件 下的抑制。8. 权利要求3所述的青贮饲料添加剂在制备权利要求4或5所述的青贮饲料中的应 用。9. 制备权利要求4所述青贮饲料的方法，包括：将青贮原料与权利要求1所述的乳酸 乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QH1-666混合，进行固体厌氧发酵， 收集所有发酵产物，得到所述青贮饲料； 所述青贮原料具体为小麦秸杆。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述小麦秸杆和所述乳酸 乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis)QHl_666 的配比为100g:105cfu;和 /或 所述发酵为低温发酵；所述低温为5°C;和/或 所述发酵的时间为30天。
【专利摘要】本发明公开了一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在低温青贮中的应用。本发明所提供的乳酸乳球菌乳酸亚种具体为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)QH1-666，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015255。本发明所提供的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)QH1-666CCTCC NO：M 2015255具有耐低温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并在低温青贮(5℃)过程中迅速繁殖并产酸降pH，有效的抑制有害杂菌的生长或产生，粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维等营养成分有效保留，达到长期保存青贮饲料的效果。CCTCC NO：M 201525520150428
【IPC分类】A23K1/16, C12N1/20, A23K3/02, C12R1/01
【公开号】CN104894030
【申请号】CN201510340152
【发明人】谈重芳, 崔美岩, 张淼, 李立, 曾庆鹏, 张利浩, 张蓓, 张志霞, 陈骏, 王雁萍, 焦浈
【申请人】郑州大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
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