一种海洋来源小单孢菌scsio01819、酶制剂溶液及其制备方法和应用
一种海洋来源小单孢菌scsio 01819、酶制剂溶液及其制备方法和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种利用海洋微生物生产脂肪酶制剂并利用其进行珍珠加工及制备 鱿鱼内脏水解蛋白的技术，具体涉及一种海洋来源小单孢菌SCSIO 01819、酶制剂溶液及其 制备方法和应用。
【背景技术】：
[0002] 近年来，由于养殖环境等条件的变化，我国海水珍珠只有极少数呈现银白色，品质 明显下降，养殖效益降低。漂白和染色是提升珍珠品质的有效加工手段，可创造良好经济效 益。日本于1922年首次报道了珍珠加工的技术，至今仍保持国际领先的地位（张傯，肖志 会et al. 2009)。我国于20世纪70年代就开始了珍珠加工的研宄工作，对漂白机理、漂白 剂、漂白工艺、染料等进行了深入研宄，并开发了一些珍珠加工的方法，但在实际应用中还 未达到理想效果。20世纪90年代，我国引进了日本的低温珍珠加工技术，应用后取得良好 效果。但是日本技术的前处理工艺、漂白剂、染色剂成分等内容仍然保密，我国珍珠产业未 掌握珍珠精深加工的核心技术，行业发展受到制约（沈海光，曾生1996;童银洪，邓陈茂et al. 2010)。中国科学院南海海洋研宄所经过十余年的研发工作，成功开发了海洋微生物酶 介导的珍珠漂白和染色技术，利用海洋微生物酶定向改造珍珠层内的杂蛋白，并介导活性 染料进入珍珠层深层，加工效果达到或超过了日本技术的平（张傯，龙丽娟et al. 2008)。
[0003] 珍珠层含有少量长链饱和脂肪酸、脂肪酸甘油酯、留醇等物质。这些脂溶性成分导 致了珍珠层的强疏水性，堵塞亚分子通道，不利于漂白和染色剂到达有效作用部位。传统的 前处理方法中，通过用有机溶剂、碱液浸泡和皂煮等方法进行脱脂（张小丽1997)。因珍珠 层由六边形霰石结晶与角蛋白堆积形成，结构致密，传统脱脂方法中碱性溶液和有机溶剂 不能充分和脂类接触，效果未能达到最佳。
[0004] 鱿鱼内脏的深入开发利用具有经济和环保意义。随着我国海洋捕捞业的迅速发 展，鱿鱼已成为我国重要的水产加工原料之一。鱿鱼加工处理过程中，一般有15%左右的内 脏废弃物产生。这些废弃物含有丰富的蛋白质，但极易腐烂变质，难以储存。常见的处理方 式为提取鱿鱼油后掩埋，近期也有对鱿鱼内脏进行初级加工制成鱿鱼溶浆直接用作鱼类饲 料的报道，但是未经精深加工，这种饲料生物利用率不高，还会导致水体环境的富营养化， 增加养殖动物病害爆发的机会，同时也难以长期保存。因而传统处理方式不仅经济效益低， 造成资源浪费，还会引起环境污染。因此，研宄开发鱿鱼内脏的精深加工技术，对于发掘鱿 鱼废弃物的经济价值，降低环境污染，有重要意义（王龙，2006)。
[0005] 将大分子粗蛋白酶解成小肽后用作海水养殖饲料的功能蛋白源，是鱿鱼内脏深度 开发利用的有效方式。蛋白质是动物最重要的营养物质之一。对于海水养殖动物而言，饲 料中的蛋白质不仅用于组织合成，还是重要的供能物质，蛋白的需求量远高于陆生动物。提 高水生动物对蛋白质的利用率，是促进动物营养吸收的有力措施。在饲料中使用酶解蛋白 替代粗蛋白，不仅可以降低饲料系数，还具有促进矿物质吸收、提高免疫力和降低幼苗畸形 率等功效。因此，使用生物酶技术将鱿鱼粗蛋白水解转化为水产动物更易吸收、同时具备一 定生理功能的蛋白源是一种有效的高值化利用方式。
[0006] 鱿鱼内脏的酶解方法研宄已经引起广泛重视。薛长湖、刘春娥等研宄了酶的种类、 用量、反应温度、反应时间等因素对鱿鱼内脏粗蛋白转化率的影响（刘春娥，2004);酶解鱿 鱼内脏还可生产海味素（苏鹤声，1996)。已报道的鱿鱼内脏酶解方法中，采用的酶的种类 有胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及这些酶的 混合物。张傯等发明了这一种海洋微生物酶酶解制备鱿鱼小肽的方法，在酶解过程中利用 海洋微生物生产的酶制剂，破坏对肽链水解位点有保护作用的鱿鱼蛋白的糖基侧链，可以 使鱿鱼内脏蛋白在更温和条件下水解成肽类，减少过度水解，具有很高的功能肽得率（张 傯，2011)。
【发明内容】
：
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea)SCSI001819,该菌于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. M 9737。
[0008] 本发明所述的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819,是 从我国南海北部（E 116° 17. 75f，N 118° 53. 71V )水深30米的海底沉积物中分离获 得的。常规PCR扩增Micromonospora chalcea SCSIO 01819的16S rDNA并测序并提交到 GenBank中，得到序列号KR052241。对16S rDNA核苷酸序列进行BLAST分析，结果显示，该 菌株与M. chalcea的相似度为99. 4%，说明该菌株SCSIO 01819为小单孢菌属（如图1所 示）。邻接法表明该菌株与一组小单孢菌属物种的系统进化关系，证明该菌属于小单孢菌属 的一种。
[0009] 形态学特征和生理生化分析：
[0010] 该菌属于革兰氏阳性，好氧放线菌，孢子球状表面光滑。菌落圆形直径1.3-2. 0_， 突起成丘。无可溶性色素产生。生长初期红色至深红色，成熟及后期变棕色和黑褐色。能 水解淀粉、纤维素、吐温20,40,60,牛奶凝固和胴化，硝酸盐还原反应阳性；H 2S产生，吐温 80水解阴性。明胶液化、接触酶和氧化酶反应阳性，黑色素产生和脲酶反应阴性。可以利 用D-纤维二糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，D-麦芽糖，D-甘露糖，D-棉子糖，L-鼠李糖，D-核 糖，D-蔗糖，D-乳糖，D-山梨糖和和果糖为唯一碳源和能源生长，而不能利用D-木糖，松 三糖、D-海藻糖。pH、盐浓度和温度的耐受范围分别为pH 6. 0-9.0,0-5%和10-45°C，最适 生长温度25-30度，？!17-8,3%盐浓度。细胞壁含有11168〇-〇4?。优势醌为疆-10〇1 2)。6+〇 摩尔含量为68. 0(±0. 5) %。根据以上形态学、生理学、化学等分析，其与已知最接近的菌株 Micromonospora chalcea DSM 43026τ较为相似，且 16S rRNA基因序列相似性达到 99. 4%; 因此，综合分析多项分类数据，鉴定此菌株为小单孢菌属Micromonospora chalcea的一个 菌株SCSIO 01819。该菌于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. M 9737,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
[0011] 本发明的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819能够发 酵生产具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液，该酶制剂溶液可用于珍珠加工和制备鱿鱼 内脏水解蛋白。因此，本发明的第二个目的是提供海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalCea)SCSI001819在制备具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液中的应用。
[0012] 本发明的第三个目的是提供所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液，其特征在于， 是通过以下方法制备的：
[0013] 将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到菌种 活化培养基中，在28~37°C下培养12~48小时，将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基 的容器中，在pH = 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，当发酵液脂肪酶活力 达到1000~3000u/mL，蛋白酶活力达到1500~3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌 体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，即得到珍珠脱脂用SCSIO 01819酶 制剂溶液-1。
[0014] 所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液，其特征在于，是通过以下方法制备的：
[0015] 将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到菌种 活化培养基中，在28~37°C下培养12~48小时；将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基 的容器中，在pH = 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，蛋白酶活力达到2500~ 3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留 菌体，即得到鱿鱼内脏蛋白水解用SCSIO 01819酶制剂溶液-2。
[0016] 所述的活化培养基，优选，每IL培养基的配方为：酵母提取物4. 0g，麦芽提取物 10. 〇g，葡萄糖 4. 0g，50%陈海水 I. 0L。
[0017] 在脂肪酶活性的酶制剂溶液的制备方法中，所述的诱导产酶发酵培养基，优选，每 IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，马氏珍珠贝软体部的石油醚 浸提物1. 〇~I. 5g，蔗糖0. 5~2. 0g，30~50 %陈海水1L，超滤膜的截流分子量为100~ 300KDa。所述的马氏珍珠贝软体部石油醚浸提物是干燥软体部经石油醚浸泡提取后，取提 取液减压蒸干所得的残留物。
[0018] 在具有蛋白酶活性的酶制剂溶液的制备方法中，所述的诱导产酶发酵培养基，优 选，每IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，脱脂鱿鱼内脏浆2. 0~ 4.(^，蔗糖0.5~2.(^，30~50%陈海水1匕超滤膜的截流分子量为100-3001(0&。所述的 脱脂鱿鱼内脏浆是将鱿鱼内脏匀浆后，加入等体积水搅拌均匀，以石油醚或正己烷萃取三 次后，下层液体蒸发掉除去一半水分制得。
[0019] 所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-1适宜作用pH范围在7. 5~13,最适pH为10， 适宜作用温度范围为28~37°C，最适作用温度为35°C。所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-2 适宜作用pH范围在7. 5~13,最适pH为10,适宜作用温度范围为28~37°C，最适作用温 度为35°C。
[0020] 本发明的SCSIO 01819酶制剂溶液-1可用于珍珠加工，可以使珍珠层蛋白结构变 松散，促使酶制剂浸入珍珠层深层。气相色谱和质谱联用分析表明，珍珠层的脂类成分中 大部分为中性脂，主要以甘油三脂肪酸酯的形似存在。本发明中，珍珠层中性脂可在SCSIO 01819酶制剂溶液-1作用下水解为甘油和极性脂（游离脂肪酸），与原有极性脂一起被溶 解于碱性溶液，从而被洗脱，达到脱除珍珠层脂类的目的。与有机溶剂浸泡、皂煮精炼等传 统方法比较，本发明的方法可以更彻底地脱除中性脂，珍珠层总脂类的脱除 率大幅提升，珍 珠层的渗透性增大，使漂白和染色试剂更容易到达粘结片状霰石结构的杂色角蛋白，显著 缩短加工周期，在珍珠层被破坏（麻点）出现前完成漂白，提升精深加工成品珠质量，提高 漂白的成品率。
[0021] 因此，本发明的第四个目的是提供SCSIO 01819酶制剂溶液-1在珍珠层脂类脱除 中的应用。
[0022] 所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-1在珍珠层脂类脱除中的应用，其特征在于，包 括以下步骤：
[0023] (1)、将珍珠原珠与SCSIO 01819酶制剂溶液-1以珠-液比2~5 :1比例（m:v) 混合，调节pH值到8. 5~13. 0,温度28~37°C，浸泡脱脂12~24小时，将珍珠从SCSIO 01819酶制剂溶液-1中取出，并用滤纸吸干表面液体；
[0024] (2)、将步骤（1)处理所得珍珠用无水乙醇浸泡，珍珠与无水乙醇的比例为2~3 : I (m/v)，0. 5~2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面溶剂，重复3次后晾干，脱去珍珠层水分和 残留酶制剂，即可脱除珍珠层脂类。
[0025] 使用上述方法处理后珍珠脂类脱除率为76. 9%~82. 3%。
[0026] 本发明的SCSIO 01819酶制剂溶液-2可用于催化鱿鱼内脏蛋白的水解，定向水解 粗蛋白产生具有水产动物保健功能的肽类。以SCSIO 01819酶制剂为催化剂制备的鱿鱼 内脏水解蛋白中，分子量1000~1000 ODa的肽类含量高于传统商品蛋白酶催化水解产物， 并且具有显著的促进水产动物生长，降低幼苗死亡率的作用。
[0027] 因此，本发明的第五个目的是提供SCSIO 01819酶制剂溶液-2在制备水解鱿鱼内 脏蛋白中的应用。
[0028] 所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-2在制备水解鱿鱼内脏蛋白中的应用，其特征在 于，包括以下步骤：
[0029] 将鱿鱼内脏碎成浆状后与SCSIO 01819酶制剂溶液-2按体积比1~5:1 (V :v)混 合进行酶解，反应的起始pH值为7. 0~13. 0,温度为40~50°C，时间10~20小时，酶解 物经静置，分为粗脂肪层和水层，除去脂肪层后干燥，即得具有促进水产动物生长和降低死 亡率的水解鱿鱼内脏蛋白。
[0030] 本发明利用海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819生产具 有脂肪酶活性和蛋白酶活性的脂肪酶制剂，再利用其进行珍珠层脱脂，脱除珍珠层中的脂 类成分，增强漂白剂染色剂在珍珠层内的渗透性，从而提升珍珠加工的效果，缩短加工的周 期；还可用于制备水解鱿鱼内脏蛋白，水解鱿鱼加工下脚料制备功能肽类。
[0031] 本发明的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819 于 2014 年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No. M 9737,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【附图说明】：
[0032] 图1是海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819的系统发育 树；
[0033] 图2是珍珠层总脂GC/MS分析的总离子流图；
[0034] 图3是珍珠层脂类甲酯化后GC-MS分析。
【具体实施方式】：
[0035] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0036] 实施例中的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. M 9737。 珍珠原珠为海水养殖污斑珠（直径为3-5mm)。原珠和马氏珍珠贝软体部由广州市祺福珍珠 加工有限公司提供，产于广东省湛江市。酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖为恒新生物技术 有限公司产；玉米粉、大豆粉、蔗糖购自超市；陈海水采自海南三亚鹿回头；超滤膜包为颇 尔0A300C12和0A100C12 (Pall，美国，截留分子量分别为300KDa和IOOKDa);用于成分分析 的氯仿、甲醇、正己烷购自默克公司（Merck，德国），无水乙醇购自、石油醚购自广州化学试 剂厂，酪蛋白、聚乙烯醇（聚合度1750 ± 50)购自大博试剂公司，橄榄油购自百灵威科技有 限公司，纯水为密理博Ri〇s5纯水机制备。其余有机试剂购于天津百世试剂公司，无机试剂 购于广州化学试剂厂。
[0037] 实验方法：
[0038] 1、脂肪酶活测定：按国家标准《脂肪酶制剂-GB/T 23535-2009》中的方法测定。
[0039] 2、蛋白酶活力测定方法：按中华人民共和国专业标准《蛋白酶活力测定法SB/T 10317-1999》方法测定。
[0040] 3、水解蛋白中肽类分子量分布参照国家标准《大豆肽粉-GB/T 22392-2008》中的 方法测定。
[0041] 4、珍珠层脂溶性成分的提取及含量的测定方法
[0042] 取待测珍珠，剥离珍珠层，用玛瑙研钵研磨，得珍珠初碎粉。参照Marthe Roussea 等人的方法（Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 145 (2006) 1 - 9)，称 取珍珠初碎粉30g，磨碎后加入500mL甲醇，同时剧烈搅拌，然后小心破碎所有块状物，室 温下静置混合物半小时，间歇搅拌。将甲醇1/2体积的氯仿搅拌加入，使用分散机（IKA Disperser T 10)匀浆20分钟后，离心沉淀固态残渣，上清液移入圆底烧瓶中。残渣移回烧 杯，并且重新以同样的步骤再提取两次。合并萃取液，真空下蒸干为浸膏（脂肪-蛋白混合 物），重新用10倍体积的氯仿被萃取该浸膏3次，萃取液合并后用氯仿脱脂的2号滤纸过滤 至分液漏斗。向滤液中加入甲醇和0.1mol/mL的氯化钾溶液，使氯仿、甲醇、氯化钾溶液的 最终比例为10 :5 :3。在震荡并4摄氏度或更低温度下储存后，随后让混合液回暖到室温。 混合液清晰分层后回收氯仿层，40°C减压蒸干，移至安瓿瓶，40°C下烘干恒重后精确称量重 量，即珍珠层总脂类重量。
[0043] 珍珠层中总脂、中性脂和极性脂含量用下面公式计算：
[0044] 总脂（％) = (A-B)/m_ 100%
[0045] 式中：A -恒重后装有珍珠粉中提取出的总脂容器的质量（g);
[0046] B -容器质量（g);
[0047] m -脱脂前珍珠粉样品质量（g)。
[0048] 将总脂加入硅胶柱（200-300目），用石油醚/乙醚（9:1，v/v)和石油醚/乙醚/ 乙酸（7:3:0. 2, v/v)依次各洗脱10个柱体积，分别收集两个溶剂系统的洗脱液，40°C减压 蒸馏除去溶剂，得中性脂（石油醚/乙醚洗脱部分）和极性脂（石油醚/乙醚/乙酸洗脱 部分），移至安瓿瓶，40°C下烘干恒重后精确称量重量，用于计算珍珠层中的中性和极性脂 类含量。
[0049] 极性脂类（％ ) = (A极性 _B)/m _ 100%
[0050] 中性脂类（％ ) = (A中性 _B)/m _ 100%
[0051] 式中：AwjP -分别为恒重后装有极性和中性脂类提取物容器质量（g) ;B - 容器质量（g) ;m-脱脂前珍珠粉样品质量（g)。
[0052] 实施例1 :珍珠层脂溶性成分的提取及含量的测定
[0053] 按照实验方法"珍珠层脂溶性成分的提取及含量的测定方法"部分，取原珠 1000 g 测量其总脂及其中中性脂脂和极性脂的含量，重复3次。珍珠层总脂含量为0. 49±0. 05%， 中性脂0. 33±0. 03%，极性脂0. 11±0. 02%。以上结果表明，珍珠层脂类成分以游离脂肪 酸和甘油三脂肪酸酯为主，甘油三脂肪酸脂含量高于游离脂肪酸。
[0054] 取珍珠总脂，以及甲酯化的总脂进行气象色谱和质谱联用分析。甲酯化反应参照 《中华人民共和国国家标准》GB/T 2154-2008/1S0/TS 17764:2002的方法，进行，具体方法 如下。
[0055] 准确称量5-7mg脂类样品至反应瓶，加入正己烧lmL，再加入5mg无水硫酸钠，震荡 溶解试样。加入IOOuL甲醇化钾溶液，密封反应瓶，用震荡器剧烈振摇3分钟，仔细取出含 脂肪酸甲酯上层液，用于GC/MS分析。
[0056] 色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱（30mX0. 53mmX0. 25μπι)，进样口温度：280°C， 分流比：30:1，载气为：氦气，流速：lml/min。柱温从50°C开始，保持Imin后，以5°C /min的 速度升温至280 °C。
[0057] 质谱条件：
[0058] GC-MS接口温度：280°C，轰击源为：电子轰击源，电子能量：70eV，离子源温度： 200°C，扫描范围：45 ~lOOOamu。
[0059] 珍珠层总脂GC/MS分析的总离子流图如图2所示。色谱图中主要有21个峰，通过 NIST数据系统检索（NIST MASS SPECTRA DATABASE)鉴定了其中17个化合物，其名称与面 积归一化法计算所得相对含量如表1所示。
[0060] 表1.珍珠层脂类成分分析
[0061]
[0062]
[0063] 甲酯化的珍珠层脂类GC-MS分析分析结果见附图3和表2所示。GC-MS图谱主要 显示了 8个脂肪酸甲酯类化合物的色谱峰。通过NIST数据系统检索（NIST MASS SPECTRA DATABASE)鉴定了它们的结构，其名称与面积归一化法计算所得相对含量见表2。
[0064] 表2.甲酯化的珍珠层脂类成分分析
[0065]
[0066] GC/MS分析结果表明，海水珍珠层脂类成分中含有脂肪酸、长链烃、醛、卤代脂肪酸 酯等成分，其中十五酸和3-氯丙酸十七烷基酯含量最高。甲酯化后，总脂中脂肪酸甘油酯 分子中的脂肪酸部分被转化为甲酯，而游离脂肪酸未被转化，其GC/MS分析所得各种脂肪 酸甲酯的种类和含量可以揭示中性脂中脂肪酸的组成特点。珍珠层总脂甲酯化后，其GC/ MS分析结果显示（表2)，十五酸甲酯、十七酸甲酯、棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯四种成分的含 量之和超过总量的90%，说明它们是珍珠层中性脂中的主要脂肪酸。同时这些GC/MS分析 结果还表明游离脂肪酸和脂肪酸甘油酯中的脂肪酸组成有明显差别。
[0067] 实施例2 :制备"SCSI0 01819酶制剂溶液-1"及进行珍珠层脱脂
[0068] 1、将海洋小单孢菌SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在摇床上发酵培 养48小时，... 温度为28°C，转速为120rmp，得活化菌液。活化培养基组成为酵母提取物4. 0g， 麦芽提取物10. 〇g，葡萄糖4. 0g，50 %陈海水I. 0L。
[0069] 2、活化的菌液500mL加入装有诱导产酶发酵培养基7. 5L的发酵罐中（保兴， 10L)，在初始pH = 7. 5、28°C下培养96小时，发酵液脂肪酶活力达到1000u/mL，蛋白酶活 力达到1500u/mL。移出菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌 体，得"SCSIO 01819酶制剂溶液-1"5. 5L。滤膜的截留分子量为lOOKDa。每升诱导产酶 发酵培养基组成如下：玉米粉2. 0g，大豆粉0.5g，马氏珍珠贝软体部（干）的石油醚浸提物 I. 〇g，蔗糖 〇· 5g，30%陈海水 1L。
[0070] 3、取原珠1000g，装入5000mL烧杯中，再加入步骤2所述"SCSI0 01819酶制剂溶 液-1"2L，用Imol/mL NaOH调节pH值至8. 5,保持温度为28°C，浸泡12小时，取出后用滤 纸吸干水分。
[0071] 4、用无水乙醇2L浸泡步骤3所得珍珠，0. 5小时后取出珍珠用滤纸吸干珍珠表面 乙醇，重复浸泡3次，40°C下烘干后得脱脂珍珠。
[0072] 5、采用《南珠加工前处理技术规范》方法（Al和Bl处理液），对珍珠（1000 g)进行 碱液和有机溶剂浸泡预处理，40°C下烘干后得脱脂珍珠。
[0073] 6、分别测定步骤4、5所得珍珠以及作为空白对照的原珠的珍珠层总脂、中性脂和 极性脂的含量，重复3次，结果见表3。
[0074] 7、根据总酯、中性脂、极性脂含量测试结果，用下式计算处理后珍珠的脂类脱除 率。
[0075] 脱除率（％) =(空白对照脂含量-脱脂后脂含量）/空白对照脂含量X100
[0076] 本实施例各实验的总酯、中性脂、极性脂脱除率的测试结果列于附表3。
[0077] 表3.总脂、中性脂、极性脂脱除率的测试结果
[0078]
[0079] 应用《南珠加工前处理技术规范》的传统碱液结合有机溶剂浸泡的前处理方法处 理后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂的脱除率分别为：53. 5%、43. 3%、71. 3% ;使用本 专利的方法处理珍珠后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂脱除率分别为：80. 4%、82. 3%、 76. 9%。传统方法可以较为有效的去处珍珠层中的游离脂肪酸，但是对与以甘油三脂肪酸 酯为主的中性脂脱除效果较差。而本专利的方法中，脂肪酶可以充分接触到珍珠层中的甘 油脂肪酸酯类物质，并催化其水解转化为甘油和游离脂肪酸，易被碱性溶液所溶解洗脱，总 体脱脂效果明显强于碱液和有机溶剂浸泡的方法。
[0080] 实施例3 :制备"SCSI0 01819酶制剂溶液-1"及进行珍珠层脱脂
[0081] 1、将海洋小单孢菌SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在摇床上发酵培 养12小时，温度为37°C，转速为120rmp。活化培养基组成为酵母提取物4. 0g，麦芽提取物 10. 〇g，葡萄糖 4. Og，50%陈海水 1.0 L。
[0082] 2、活化的菌液500mL加入7L诱导产酶发酵培养基的发酵罐中（保兴，10L)，在初 始pH = 8. 0、温度37°C下培养12小时，发酵液脂肪酶活力达到3000单位/mL，蛋白酶活力 达到3000单位/mL。移出菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留 菌体，得珍珠脱脂用酶制剂溶液4. 6L。滤膜的截留分子量为300KDa。诱导产酶发酵培养基 组成如下：玉米粉4. 0g，大豆粉2. 0g，马氏珍珠贝软体部（干）的石油醚浸提物I. 5g，蔗糖 2. 0g，50%陈海水1L。超滤膜的截流分子量为300KDa。
[0083] 3、取原珠 1000 g装入容器，再加入步骤2所述小单孢菌SCSIO 01819的发酵制得 的酶制剂溶液5L，用lmol/L NaOH溶液调节pH值至13. 0保持温度为37°C，浸泡24小时， 取出后用滤纸吸干水分。
[0084] 4、用无水乙醇3L浸泡步骤3所得珍珠，2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面乙醇并 晾干，重复浸泡3次，40°C烘干后得SCSIO 01819珍珠层脱脂珍珠。
[0085] 5、取脂商品肪酶DENIE-DEG NS-G酶制剂（30000U/g) 170g溶于IL水中，制成活力 约5000U/mL的溶液，加入KOH溶液（lmol/L)调节pH至13. 0。DENIE-DEG NS-G是上海丹 尼悦生物科技有限公司出产的碱性脂肪酶制剂，常用于皮革脱脂。其最佳活力温度为50°C， 最佳 pH 值 12. 0-13. 0。
[0086] 6、称取原珠1000g，小心浸入DENIE-DEG NS-G酶制剂溶液，保持温度为50°C，浸泡 24小时。从DENIE-DEG NS-G酶制剂溶液中取出珍珠，并用滤纸吸干珍珠表面水分。
[0087] 7、用无水乙醇3L浸泡步骤6所得珍珠，2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面乙醇，换 新的无水乙醇浸泡，重复3次，滤纸吸干溶剂40°C烘干后得DENIE-DEG NS-G珍珠层脱脂的 珍珠。
[0088] 8、用实施例2中的方法测量步骤4、7所得珍珠以及作为空白对照的原珠的珍珠层 中脂类、中性脂和极性脂的含量，重复3次。计算脱脂率，结果列于表4。
[0089] 表4.总脂、中性脂、极性脂脱除率的测试结果
[0090]
[0091] DENIE-DEG NS-G酶制剂溶液脱脂后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂脱除率分 别为：58. 6%、57. 6%、67. 1% ;使用本专利的方法处理珍珠后，珍珠层中总脂类、中性脂和 极性脂脱除率分别为：76. 4%、79. 4%、67. 0% ;SCSIO 01819脱脂作用明显强于DENIE-DEG NS-G酶制剂。结合实施例3的分析结果，可以发现DENIE-DEG NS-G酶制剂脱除中性脂的 效果强于传统的碱液加有机溶剂的方法，脱除极性脂的作用略弱于传统方法。SCSIO 01819 对总脂类、中性脂和极性脂的脱除效果都明显强于DENIE-DEG NS-G酶制剂，可能是由于 SCSIO 01819酶制剂除脂肪酶或外还具有蛋白酶活性，可以使珍珠层中的角蛋白结构变松 散，使得包裹在其中的脂类成分更容易接触到酶制剂，从而转化成脂肪酸和甘油，易溶解于 碱性溶液被洗脱。
[0092] 实施例4 :珍珠漂白效果的评估
[0093] 1、配制聚乙二醇甲醚质量分数为0. 2%，双氧水体积分数为5%的海水珍珠漂白 液。
[0094] 2、取实施例2、3的小单孢菌SCSIO 01819酶制剂处理后珍珠、《南珠加工前处理技 术规范》方法处理珍珠、DENIE-DEG NS-G酶制剂脱脂后的珍珠，以及作为空白对照的原珠 各100粒，分别放入50mL磨口三角烧瓶中，温度控制在35°C左右，每2天换一次漂白液，定 时轻微摇动锥形瓶（一天2次），漂白后取出珍珠样品，滤纸吸干表面漂白液，用海水浸泡 ld，然后用蒸馏水反复冲洗干净，40°C下干燥，对漂白效果进行评估。共进行5次实验，漂白 时间依次为2、4、6、8、10天。统计每批珍珠的漂白率、长麻率。原珠颜色记为0级，然后从 深至浅分别为灰、灰白、浅灰白、浅黄白、玉白和雪白色，依次定为1，2, 3,4和5级。漂白后 颜色达到4和5级视为达标，漂白率用下式计算：
[0095] 漂白率（％)=达标珍珠粒数/原珠粒数X 100
[0096] 加工后珍珠出现1个以上腐蚀斑点视为长麻，长麻率用下式计算：
[0097] 长麻率（％)=出现腐蚀斑点珍珠粒数/原珠粒数X 100
[0098] 分析结果见表5。
[0099] 表5.漂白率和长麻率
[0100]
[0101]
[0102] 由表5可知，使用"SCSIO 0189酶制剂-1"脱脂后的珍珠，加入过氧化氢漂白液 后，2天后有14%珍珠达到漂白标准，8天后漂白率达到最尚98%。而《南珠加工肖U处理技 术规范》方法脱脂珍珠、DENIE-DEG NS-G酶制剂脱脂方法脱脂珍珠、未处理原珠最早出现颜 色达标的珍珠时间均为4天，而DENIE-DEG NS-G酶制剂脱脂脱脂珍珠漂白10天后颜色达 标率可到达96 %，《南珠加工前处理技术规范》处理珍珠和原珠第十天后颜色达标率为66 % 和45%，还未达到最高值。所有方法处理的珍珠漂白8天后都出现了少量麻点，第10天较 多珍珠出现麻点（15~32%)。上述结果显示，漂白效果和珍珠脱脂率，尤其是中性脂脱除 率有明显关系，脱脂率最尚的SCSIO 01819酶制剂处理的珍珠层渗透性最强，漂白剂可以 充分与作用部位接触，在最短时间内达到98%的漂白率，而此时仅有1 %的长麻率；而其它 方法不能在珍珠大规模长麻之前达到最高漂白率，说明SISI00189酶制剂在海水珍珠层脱 脂方面有明显优势。
[0103] 实施例5 :制备SCSIO 01819酶制剂溶液-2及鱿鱼内脏水解蛋白
[0104] 1、将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到菌 种活化培养基中，在摇床上发酵培养12小时，温度为28°C，pH值为7. 5,转速为120rmp，得 活化菌液。活化培养基组成为酵母提取物4. Og，麦芽提取物10.0 g，葡萄糖4. Og，50 %陈海 水 I. 0L。
[0105] 2、活化的菌液500mL加入装有诱导产酶发酵培养基7. 5L的发酵罐中（保兴， 10L)，在初始pH = 7. 5、37°C下培养12小时，蛋白酶活力达到约2500u/mL。移出菌液离心除 去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，得"SCSI0 01819酶制剂溶-2" 液5L。滤膜的截留分子量为300KDa。每升诱导产酶发酵培养基组成如下：玉米粉2.0g，大 豆粉〇. 5g，鱿鱼内脏浆2. Og，蔗糖0. 5g，30%陈海水1L。
[0106] 3、称取IOkg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎10min，得约9. 3L糊状 物。取5kg内脏衆，按1:1 (内脏浆：酶制剂）比例加入上一步制成的酶制剂溶液并搅拌混 合，调节反应的起始pH值为7. 0,温度为40°C，时间10小时，搅拌速度50rpm。水解完成 后，酶解物经静置，粗脂肪层和水层分离，除去脂肪层后脱水干燥，得鱿鱼内脏的水解蛋白 (I. 70kg) 〇
[0107] 实施例6 :制备SCSIO 01819酶制剂溶液-2及鱿鱼内脏水解蛋白
[0108] 1、将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到 菌种活化培养基 中，在摇床上发酵培养48小时，温度为37°C，pH值为8. 0,转速为120rmp， 得活化菌液。培养基组成为酵母提取物4. Og，麦芽提取物10.0 g，葡萄糖4. Og，50 %陈海水 1.0 L0
[0109] 2、活化的菌液500mL加入装有诱导产酶发酵培养基7. 5L的发酵罐中（保兴， 10L)，在初始pH = 8. 0、28°C下培养96小时，蛋白酶活力达到约3000u/mL。移出菌液离心 除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，得SCSIO 01819酶制剂溶液 5L。滤膜的截留分子量为lOOKDa。每升诱导产酶发酵培养基组成如下：玉米粉4.0g，大豆 粉2. Og，鱿鱼内脏浆4. Og，蔗糖2. 0g，50%陈海水1L。
[0110] 3、称取IOkg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎lOmin，得约9. OL糊状 物。取5kg糊状物，按5 :1 (内脏浆：酶制剂）比例加入上一步制成的酶制剂溶液并搅拌混 合，调节反应的起始pH值为13.0,温度为50°C，时间20小时，搅拌速度50rpmin。水解完 成后，酶解物经静置，粗脂肪层和水层分离，除去脂肪层后脱水干燥，得鱿鱼内脏水解蛋白 (I. 72kg) 〇
[0111] 实施例7 :制备用于对比试验的鱿鱼内脏水解蛋白
[0112] 称取IOkg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎10min，得约9. IL糊状物。 取5kg糊状物，向糊状物中入碱性蛋白酶（终浓度lOOOu/mL)，调节反应的起始pH值为8. 0， 温度为45°C，时间20小时，搅拌速度50r/min。水解完成后，酶解物经静置，粗脂肪层和水 层分离，除去脂肪层后脱水干燥，得鱿鱼内脏水解蛋白（I. 78kg)。
[0113] 实施例8 :实施例5、6和7制备的鱿鱼水解蛋白中肽类的分子量分布测定
[0114] 实施例5、6和7制备的鱿鱼水解蛋白中肽类的分子量分布按国家标准《大豆肽 粉-GB/T22392-2008》中的方法测定，结果见表6。
[0115] 表6.实施例5、6和7制备的鱿鱼水解蛋白中肽类的分子量分布测定
[0116]
[0117]
[0118] 表6数据表明，由SCSIO 01819酶制剂制备的水解蛋白，分子量1000-10000Da之 间的肽类含量超过40%，明显高于用碱性蛋白酶催化的水解产物中相应分子量段的含量。
[0119] 实施例9 :鱿鱼水解蛋白对奥尼罗非鱼仔鱼生长率和死亡率的影响
[0120] 奥尼罗非鱼鱼苗由广东海大集团畜牧水产研宄中心提供，为出膜1天的同一批奥 尼罗非鱼仔鱼。实验前先将仔鱼放在50L的塑料桶内驯养2天，驯养期间不投喂饵料。
[0121] 将奥尼罗非鱼鱼苗分成1个对照组和4个实验组，其中对照组所用的饲料配方是 鱼粉46%，麦芽根15%，茨粉19%，酵母3%，大豆卵磷脂1%，胆碱0.5%，磷酸氢钙0.5%， 复合维生素0. 4%，合矿物盐0. 6 %，纤维素8 %，豆油1 %，褐藻酸钠1 %，明胶4%。
[0122] 实验组1所用的饲料配方是鱼粉41%，实施例5得到的鱿鱼水解蛋白5%，其余组 分与对照组相同。
[0123] 实验组2所用的饲料配方是鱼粉41 %，实施例6得到的鱿鱼小肽5 %，其余组分与 对照组相同。
[0124] 实验组3所用的饲料配方是鱼粉36%，实施例5得到的鱿鱼小肽10%，其余组分 与对照组相同。
[0125] 实验组4所用的饲料配方是鱼粉36 %，实施例6得到的鱿鱼小肽10 %，其余组分 与对照组相同。
[0126] 饲养鱼苗桶里放置气石，24h充气，每天换水50%，吸出桶底废物，并用恒温棒控 制温度为27°C。每天投喂仔鱼体重10%的配合饵料3次；实验周期21天，重复3次。
[0127] 死亡率和增重率用下面公式计算：
[0128] 在实验开始和结束时分别测量奥尼罗非鱼的体重（精确到0.0 Olg)，以及鱼苗数 量。
[0129] 死亡率=(实验开始时鱼苗数量-实验结束时鱼苗数量）/实验开始时育苗数 量 X 100%
[0130] 绝对增重率=(实验结束时鱼苗重量（g)_实验开始时鱼苗重量（g))/实验天数
[0131] 结果是，对照组中鱼苗的死亡率是54% ±3%，绝对增重率0. 0033±0. 0012g/天， 实验组1中鱼苗的死亡率是41% ±8%，绝对增重率0. 0062±0. 0005g/天，实验组2中鱼 苗的死亡率是45% ±10%，绝对增重率0. 0068±0.0 Ollg/天，实验组3中鱼苗的死亡率是 35% ±8%，绝对增重率0. 0055±0. 0015g/天，实验组4中鱼苗的死亡率是38% ±10%，绝 对增重率 0. 0059±0. 0008g/ 天。
[0132] 以上结果表明，用鱿鱼水解蛋白部分替代鱼粉后，奥尼罗非鱼仔鱼死亡率明显降 低，增重率明显增加。替代比例达到鱼粉重量5%时，即可观察到显著差异。
【主权项】
L海洋来源的小单胞菌（Micromonosporachalcea)SCSIO01819,保藏编号：CGMCC No.M9737。 2?权利要求1所述的海洋来源的小单胞菌（Micromonosporachalcea)SCSIO01819在 制备具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液，是 通过以下方法制备的： 将海洋来源的小单胞菌（Micromonosporachalcea)SCSIO01819菌种转接到菌种活化 培养基中，在28~37°C下培养12~48小时，将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基的容 器中，在pH= 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，当发酵液脂肪酶活力达到 1000~3000u/mL，蛋白酶活力达到1500~3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和 残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，即得到珍珠脱脂用SCSIO01819酶制剂 溶液-1。 所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液，是通过以下方法制备的： 将海洋来源的小单胞菌（Micromonosporachalcea)SCSI0 01819菌种转接到菌种活 化培养基中，在28~37°C下培养12~48小时；将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基的 容器中，在pH= 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，蛋白酶活力达到2500~ 3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留 菌体，即得到鱿鱼内脏蛋白水解用SCSIO01819酶制剂溶液-2。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的活化培养基，每IL培养基的配 方为：酵母提取物4. 0g，麦芽提取物10. 0g，葡萄糖4. 0g，50%陈海水I. 0L。
5. 根据权利要求3所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液，其特征在于，所述的诱导产 酶发酵培养基，每IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，马氏珍珠贝 软体部的石油醚浸提物1. 〇~I. 5g，蔗糖0. 5~2. 0g，30~50%陈海水1L，超滤膜的截流 分子量为1〇〇~300KDa，所述的马氏珍珠贝软体部石油醚浸提物是干燥软体部经石油醚浸 泡提取后，取提取液减压蒸干所得的残留物。
6. 根据权利要求3所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液，其特征在于，所述的诱导 产酶发酵培养基，每IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，脱脂鱿 鱼内脏浆2. 0~4. 0g，蔗糖0. 5~2. 0g，30~50 %陈海水1L。超滤膜的截流分子量为 100-300KDa，所述的脱脂鱿鱼内脏浆是将鱿鱼内脏匀浆后，加入等体积水搅拌均匀，以石油 醚或正己烷萃取三次后，下层液体蒸发掉除去一半水分制得。
7. 权利要求3所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液在珍珠层脂类脱除中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： (1) 、将珍珠原珠与SCSIO01819酶制剂溶液-1以珠-液比2~5 :1比例（v:m)混合， 调节pH值到8. 5~13. 0,温度28~37°C，浸泡脱脂12~24小时，将珍珠从SCSIO01819 酶制剂溶液-1中取出，并用滤纸吸干表面液体； (2) 、将步骤（1)处理所得珍珠用无水乙醇浸泡，珍珠与无水乙醇的比例为2~3 :1 (m/ V)，0. 5~2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面溶剂，重复3次后晾干，脱去珍珠层水分和残留 酶制剂，即可脱除珍珠层脂类。
9. 权利要求3所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液在制备水解鱿鱼内脏蛋白中的应 用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 将鱿鱼内脏碎成浆状后与SCSIO01819酶制剂溶液-2按体积比1~5:1(V:v)混合进 行酶解，反应的起始pH值为7. 0~13. 0,温度为40~50°C，时间10~20小时，酶解物经 静置，分为粗脂肪层和水层，除去脂肪层后干燥，即得具有促进水产动物生长和降低死亡率 功能的水解鱿鱼内脏蛋白。
【专利摘要】本发明公开一种海洋来源小单孢菌SCSIO 01819、酶制剂溶液及其制备方法和应用。海洋来源小单孢菌SCSIO 01819于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.M9737。本发明利用海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819生产具有脂肪酶活性和蛋白酶活性的酶制剂，再利用其进行珍珠层脱脂，脱除珍珠层中的脂类成分，增强漂白剂染色剂在珍珠层内的渗透性，从而提升珍珠加工的效果，缩短加工的周期；还可用于催化鱿鱼内脏蛋白的水解，可以定向转化粗蛋白产生具有提高水产动物幼苗存活率和增重率功能的肽类，酶制剂为催化剂制备的鱿鱼内脏水解蛋白中，分子量1000-10000Da的肽类含量高于传统商品蛋白酶催化水解产物，并且具有显著的促进水产动物生长，降低幼苗死亡率的作用。CGMCC No.M973720140925
【IPC分类】C12P21/06, C12N1/20, C12R1/30, C12N9/52, C12N9/20
【公开号】CN104894034
【申请号】CN201510366099
【发明人】龙丽娟, 尹浩, 田新朋, 齐振雄, 尹团, 张偲
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种利用海洋微生物生产脂肪酶制剂并利用其进行珍珠加工及制备 鱿鱼内脏水解蛋白的技术，具体涉及一种海洋来源小单孢菌SCSIO 01819、酶制剂溶液及其 制备方法和应用。
【背景技术】：
[0002] 近年来，由于养殖环境等条件的变化，我国海水珍珠只有极少数呈现银白色，品质 明显下降，养殖效益降低。漂白和染色是提升珍珠品质的有效加工手段，可创造良好经济效 益。日本于1922年首次报道了珍珠加工的技术，至今仍保持国际领先的地位（张傯，肖志 会et al. 2009)。我国于20世纪70年代就开始了珍珠加工的研宄工作，对漂白机理、漂白 剂、漂白工艺、染料等进行了深入研宄，并开发了一些珍珠加工的方法，但在实际应用中还 未达到理想效果。20世纪90年代，我国引进了日本的低温珍珠加工技术，应用后取得良好 效果。但是日本技术的前处理工艺、漂白剂、染色剂成分等内容仍然保密，我国珍珠产业未 掌握珍珠精深加工的核心技术，行业发展受到制约（沈海光，曾生1996;童银洪，邓陈茂et al. 2010)。中国科学院南海海洋研宄所经过十余年的研发工作，成功开发了海洋微生物酶 介导的珍珠漂白和染色技术，利用海洋微生物酶定向改造珍珠层内的杂蛋白，并介导活性 染料进入珍珠层深层，加工效果达到或超过了日本技术的平（张傯，龙丽娟et al. 2008)。
[0003] 珍珠层含有少量长链饱和脂肪酸、脂肪酸甘油酯、留醇等物质。这些脂溶性成分导 致了珍珠层的强疏水性，堵塞亚分子通道，不利于漂白和染色剂到达有效作用部位。传统的 前处理方法中，通过用有机溶剂、碱液浸泡和皂煮等方法进行脱脂（张小丽1997)。因珍珠 层由六边形霰石结晶与角蛋白堆积形成，结构致密，传统脱脂方法中碱性溶液和有机溶剂 不能充分和脂类接触，效果未能达到最佳。
[0004] 鱿鱼内脏的深入开发利用具有经济和环保意义。随着我国海洋捕捞业的迅速发 展，鱿鱼已成为我国重要的水产加工原料之一。鱿鱼加工处理过程中，一般有15%左右的内 脏废弃物产生。这些废弃物含有丰富的蛋白质，但极易腐烂变质，难以储存。常见的处理方 式为提取鱿鱼油后掩埋，近期也有对鱿鱼内脏进行初级加工制成鱿鱼溶浆直接用作鱼类饲 料的报道，但是未经精深加工，这种饲料生物利用率不高，还会导致水体环境的富营养化， 增加养殖动物病害爆发的机会，同时也难以长期保存。因而传统处理方式不仅经济效益低， 造成资源浪费，还会引起环境污染。因此，研宄开发鱿鱼内脏的精深加工技术，对于发掘鱿 鱼废弃物的经济价值，降低环境污染，有重要意义（王龙，2006)。
[0005] 将大分子粗蛋白酶解成小肽后用作海水养殖饲料的功能蛋白源，是鱿鱼内脏深度 开发利用的有效方式。蛋白质是动物最重要的营养物质之一。对于海水养殖动物而言，饲 料中的蛋白质不仅用于组织合成，还是重要的供能物质，蛋白的需求量远高于陆生动物。提 高水生动物对蛋白质的利用率，是促进动物营养吸收的有力措施。在饲料中使用酶解蛋白 替代粗蛋白，不仅可以降低饲料系数，还具有促进矿物质吸收、提高免疫力和降低幼苗畸形 率等功效。因此，使用生物酶技术将鱿鱼粗蛋白水解转化为水产动物更易吸收、同时具备一 定生理功能的蛋白源是一种有效的高值化利用方式。
[0006] 鱿鱼内脏的酶解方法研宄已经引起广泛重视。薛长湖、刘春娥等研宄了酶的种类、 用量、反应温度、反应时间等因素对鱿鱼内脏粗蛋白转化率的影响（刘春娥，2004);酶解鱿 鱼内脏还可生产海味素（苏鹤声，1996)。已报道的鱿鱼内脏酶解方法中，采用的酶的种类 有胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及这些酶的 混合物。张傯等发明了这一种海洋微生物酶酶解制备鱿鱼小肽的方法，在酶解过程中利用 海洋微生物生产的酶制剂，破坏对肽链水解位点有保护作用的鱿鱼蛋白的糖基侧链，可以 使鱿鱼内脏蛋白在更温和条件下水解成肽类，减少过度水解，具有很高的功能肽得率（张 傯，2011)。
【发明内容】
：
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea)SCSI001819,该菌于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. M 9737。
[0008] 本发明所述的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819,是 从我国南海北部（E 116° 17. 75f，N 118° 53. 71V )水深30米的海底沉积物中分离获 得的。常规PCR扩增Micromonospora chalcea SCSIO 01819的16S rDNA并测序并提交到 GenBank中，得到序列号KR052241。对16S rDNA核苷酸序列进行BLAST分析，结果显示，该 菌株与M. chalcea的相似度为99. 4%，说明该菌株SCSIO 01819为小单孢菌属（如图1所 示）。邻接法表明该菌株与一组小单孢菌属物种的系统进化关系，证明该菌属于小单孢菌属 的一种。
[0009] 形态学特征和生理生化分析：
[0010] 该菌属于革兰氏阳性，好氧放线菌，孢子球状表面光滑。菌落圆形直径1.3-2. 0_， 突起成丘。无可溶性色素产生。生长初期红色至深红色，成熟及后期变棕色和黑褐色。能 水解淀粉、纤维素、吐温20,40,60,牛奶凝固和胴化，硝酸盐还原反应阳性；H 2S产生，吐温 80水解阴性。明胶液化、接触酶和氧化酶反应阳性，黑色素产生和脲酶反应阴性。可以利 用D-纤维二糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，D-麦芽糖，D-甘露糖，D-棉子糖，L-鼠李糖，D-核 糖，D-蔗糖，D-乳糖，D-山梨糖和和果糖为唯一碳源和能源生长，而不能利用D-木糖，松 三糖、D-海藻糖。pH、盐浓度和温度的耐受范围分别为pH 6. 0-9.0,0-5%和10-45°C，最适 生长温度25-30度，？!17-8,3%盐浓度。细胞壁含有11168〇-〇4?。优势醌为疆-10〇1 2)。6+〇 摩尔含量为68. 0(±0. 5) %。根据以上形态学、生理学、化学等分析，其与已知最接近的菌株 Micromonospora chalcea DSM 43026τ较为相似，且 16S rRNA基因序列相似性达到 99. 4%; 因此，综合分析多项分类数据，鉴定此菌株为小单孢菌属Micromonospora chalcea的一个 菌株SCSIO 01819。该菌于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. M 9737,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
[0011] 本发明的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819能够发 酵生产具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液，该酶制剂溶液可用于珍珠加工和制备鱿鱼 内脏水解蛋白。因此，本发明的第二个目的是提供海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalCea)SCSI001819在制备具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液中的应用。
[0012] 本发明的第三个目的是提供所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液，其特征在于， 是通过以下方法制备的：
[0013] 将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到菌种 活化培养基中，在28~37°C下培养12~48小时，将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基 的容器中，在pH = 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，当发酵液脂肪酶活力 达到1000~3000u/mL，蛋白酶活力达到1500~3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌 体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，即得到珍珠脱脂用SCSIO 01819酶 制剂溶液-1。
[0014] 所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液，其特征在于，是通过以下方法制备的：
[0015] 将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到菌种 活化培养基中，在28~37°C下培养12~48小时；将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基 的容器中，在pH = 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，蛋白酶活力达到2500~ 3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留 菌体，即得到鱿鱼内脏蛋白水解用SCSIO 01819酶制剂溶液-2。
[0016] 所述的活化培养基，优选，每IL培养基的配方为：酵母提取物4. 0g，麦芽提取物 10. 〇g，葡萄糖 4. 0g，50%陈海水 I. 0L。
[0017] 在脂肪酶活性的酶制剂溶液的制备方法中，所述的诱导产酶发酵培养基，优选，每 IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，马氏珍珠贝软体部的石油醚 浸提物1. 〇~I. 5g，蔗糖0. 5~2. 0g，30~50 %陈海水1L，超滤膜的截流分子量为100~ 300KDa。所述的马氏珍珠贝软体部石油醚浸提物是干燥软体部经石油醚浸泡提取后，取提 取液减压蒸干所得的残留物。
[0018] 在具有蛋白酶活性的酶制剂溶液的制备方法中，所述的诱导产酶发酵培养基，优 选，每IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，脱脂鱿鱼内脏浆2. 0~ 4.(^，蔗糖0.5~2.(^，30~50%陈海水1匕超滤膜的截流分子量为100-3001(0&。所述的 脱脂鱿鱼内脏浆是将鱿鱼内脏匀浆后，加入等体积水搅拌均匀，以石油醚或正己烷萃取三 次后，下层液体蒸发掉除去一半水分制得。
[0019] 所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-1适宜作用pH范围在7. 5~13,最适pH为10， 适宜作用温度范围为28~37°C，最适作用温度为35°C。所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-2 适宜作用pH范围在7. 5~13,最适pH为10,适宜作用温度范围为28~37°C，最适作用温 度为35°C。
[0020] 本发明的SCSIO 01819酶制剂溶液-1可用于珍珠加工，可以使珍珠层蛋白结构变 松散，促使酶制剂浸入珍珠层深层。气相色谱和质谱联用分析表明，珍珠层的脂类成分中 大部分为中性脂，主要以甘油三脂肪酸酯的形似存在。本发明中，珍珠层中性脂可在SCSIO 01819酶制剂溶液-1作用下水解为甘油和极性脂（游离脂肪酸），与原有极性脂一起被溶 解于碱性溶液，从而被洗脱，达到脱除珍珠层脂类的目的。与有机溶剂浸泡、皂煮精炼等传 统方法比较，本发明的方法可以更彻底地脱除中性脂，珍珠层总脂类的脱除 率大幅提升，珍 珠层的渗透性增大，使漂白和染色试剂更容易到达粘结片状霰石结构的杂色角蛋白，显著 缩短加工周期，在珍珠层被破坏（麻点）出现前完成漂白，提升精深加工成品珠质量，提高 漂白的成品率。
[0021] 因此，本发明的第四个目的是提供SCSIO 01819酶制剂溶液-1在珍珠层脂类脱除 中的应用。
[0022] 所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-1在珍珠层脂类脱除中的应用，其特征在于，包 括以下步骤：
[0023] (1)、将珍珠原珠与SCSIO 01819酶制剂溶液-1以珠-液比2~5 :1比例（m:v) 混合，调节pH值到8. 5~13. 0,温度28~37°C，浸泡脱脂12~24小时，将珍珠从SCSIO 01819酶制剂溶液-1中取出，并用滤纸吸干表面液体；
[0024] (2)、将步骤（1)处理所得珍珠用无水乙醇浸泡，珍珠与无水乙醇的比例为2~3 : I (m/v)，0. 5~2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面溶剂，重复3次后晾干，脱去珍珠层水分和 残留酶制剂，即可脱除珍珠层脂类。
[0025] 使用上述方法处理后珍珠脂类脱除率为76. 9%~82. 3%。
[0026] 本发明的SCSIO 01819酶制剂溶液-2可用于催化鱿鱼内脏蛋白的水解，定向水解 粗蛋白产生具有水产动物保健功能的肽类。以SCSIO 01819酶制剂为催化剂制备的鱿鱼 内脏水解蛋白中，分子量1000~1000 ODa的肽类含量高于传统商品蛋白酶催化水解产物， 并且具有显著的促进水产动物生长，降低幼苗死亡率的作用。
[0027] 因此，本发明的第五个目的是提供SCSIO 01819酶制剂溶液-2在制备水解鱿鱼内 脏蛋白中的应用。
[0028] 所述的SCSIO 01819酶制剂溶液-2在制备水解鱿鱼内脏蛋白中的应用，其特征在 于，包括以下步骤：
[0029] 将鱿鱼内脏碎成浆状后与SCSIO 01819酶制剂溶液-2按体积比1~5:1 (V :v)混 合进行酶解，反应的起始pH值为7. 0~13. 0,温度为40~50°C，时间10~20小时，酶解 物经静置，分为粗脂肪层和水层，除去脂肪层后干燥，即得具有促进水产动物生长和降低死 亡率的水解鱿鱼内脏蛋白。
[0030] 本发明利用海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819生产具 有脂肪酶活性和蛋白酶活性的脂肪酶制剂，再利用其进行珍珠层脱脂，脱除珍珠层中的脂 类成分，增强漂白剂染色剂在珍珠层内的渗透性，从而提升珍珠加工的效果，缩短加工的周 期；还可用于制备水解鱿鱼内脏蛋白，水解鱿鱼加工下脚料制备功能肽类。
[0031] 本发明的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819 于 2014 年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No. M 9737,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【附图说明】：
[0032] 图1是海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819的系统发育 树；
[0033] 图2是珍珠层总脂GC/MS分析的总离子流图；
[0034] 图3是珍珠层脂类甲酯化后GC-MS分析。
【具体实施方式】：
[0035] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0036] 实施例中的海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. M 9737。 珍珠原珠为海水养殖污斑珠（直径为3-5mm)。原珠和马氏珍珠贝软体部由广州市祺福珍珠 加工有限公司提供，产于广东省湛江市。酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖为恒新生物技术 有限公司产；玉米粉、大豆粉、蔗糖购自超市；陈海水采自海南三亚鹿回头；超滤膜包为颇 尔0A300C12和0A100C12 (Pall，美国，截留分子量分别为300KDa和IOOKDa);用于成分分析 的氯仿、甲醇、正己烷购自默克公司（Merck，德国），无水乙醇购自、石油醚购自广州化学试 剂厂，酪蛋白、聚乙烯醇（聚合度1750 ± 50)购自大博试剂公司，橄榄油购自百灵威科技有 限公司，纯水为密理博Ri〇s5纯水机制备。其余有机试剂购于天津百世试剂公司，无机试剂 购于广州化学试剂厂。
[0037] 实验方法：
[0038] 1、脂肪酶活测定：按国家标准《脂肪酶制剂-GB/T 23535-2009》中的方法测定。
[0039] 2、蛋白酶活力测定方法：按中华人民共和国专业标准《蛋白酶活力测定法SB/T 10317-1999》方法测定。
[0040] 3、水解蛋白中肽类分子量分布参照国家标准《大豆肽粉-GB/T 22392-2008》中的 方法测定。
[0041] 4、珍珠层脂溶性成分的提取及含量的测定方法
[0042] 取待测珍珠，剥离珍珠层，用玛瑙研钵研磨，得珍珠初碎粉。参照Marthe Roussea 等人的方法（Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 145 (2006) 1 - 9)，称 取珍珠初碎粉30g，磨碎后加入500mL甲醇，同时剧烈搅拌，然后小心破碎所有块状物，室 温下静置混合物半小时，间歇搅拌。将甲醇1/2体积的氯仿搅拌加入，使用分散机（IKA Disperser T 10)匀浆20分钟后，离心沉淀固态残渣，上清液移入圆底烧瓶中。残渣移回烧 杯，并且重新以同样的步骤再提取两次。合并萃取液，真空下蒸干为浸膏（脂肪-蛋白混合 物），重新用10倍体积的氯仿被萃取该浸膏3次，萃取液合并后用氯仿脱脂的2号滤纸过滤 至分液漏斗。向滤液中加入甲醇和0.1mol/mL的氯化钾溶液，使氯仿、甲醇、氯化钾溶液的 最终比例为10 :5 :3。在震荡并4摄氏度或更低温度下储存后，随后让混合液回暖到室温。 混合液清晰分层后回收氯仿层，40°C减压蒸干，移至安瓿瓶，40°C下烘干恒重后精确称量重 量，即珍珠层总脂类重量。
[0043] 珍珠层中总脂、中性脂和极性脂含量用下面公式计算：
[0044] 总脂（％) = (A-B)/m_ 100%
[0045] 式中：A -恒重后装有珍珠粉中提取出的总脂容器的质量（g);
[0046] B -容器质量（g);
[0047] m -脱脂前珍珠粉样品质量（g)。
[0048] 将总脂加入硅胶柱（200-300目），用石油醚/乙醚（9:1，v/v)和石油醚/乙醚/ 乙酸（7:3:0. 2, v/v)依次各洗脱10个柱体积，分别收集两个溶剂系统的洗脱液，40°C减压 蒸馏除去溶剂，得中性脂（石油醚/乙醚洗脱部分）和极性脂（石油醚/乙醚/乙酸洗脱 部分），移至安瓿瓶，40°C下烘干恒重后精确称量重量，用于计算珍珠层中的中性和极性脂 类含量。
[0049] 极性脂类（％ ) = (A极性 _B)/m _ 100%
[0050] 中性脂类（％ ) = (A中性 _B)/m _ 100%
[0051] 式中：AwjP -分别为恒重后装有极性和中性脂类提取物容器质量（g) ;B - 容器质量（g) ;m-脱脂前珍珠粉样品质量（g)。
[0052] 实施例1 :珍珠层脂溶性成分的提取及含量的测定
[0053] 按照实验方法"珍珠层脂溶性成分的提取及含量的测定方法"部分，取原珠 1000 g 测量其总脂及其中中性脂脂和极性脂的含量，重复3次。珍珠层总脂含量为0. 49±0. 05%， 中性脂0. 33±0. 03%，极性脂0. 11±0. 02%。以上结果表明，珍珠层脂类成分以游离脂肪 酸和甘油三脂肪酸酯为主，甘油三脂肪酸脂含量高于游离脂肪酸。
[0054] 取珍珠总脂，以及甲酯化的总脂进行气象色谱和质谱联用分析。甲酯化反应参照 《中华人民共和国国家标准》GB/T 2154-2008/1S0/TS 17764:2002的方法，进行，具体方法 如下。
[0055] 准确称量5-7mg脂类样品至反应瓶，加入正己烧lmL，再加入5mg无水硫酸钠，震荡 溶解试样。加入IOOuL甲醇化钾溶液，密封反应瓶，用震荡器剧烈振摇3分钟，仔细取出含 脂肪酸甲酯上层液，用于GC/MS分析。
[0056] 色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱（30mX0. 53mmX0. 25μπι)，进样口温度：280°C， 分流比：30:1，载气为：氦气，流速：lml/min。柱温从50°C开始，保持Imin后，以5°C /min的 速度升温至280 °C。
[0057] 质谱条件：
[0058] GC-MS接口温度：280°C，轰击源为：电子轰击源，电子能量：70eV，离子源温度： 200°C，扫描范围：45 ~lOOOamu。
[0059] 珍珠层总脂GC/MS分析的总离子流图如图2所示。色谱图中主要有21个峰，通过 NIST数据系统检索（NIST MASS SPECTRA DATABASE)鉴定了其中17个化合物，其名称与面 积归一化法计算所得相对含量如表1所示。
[0060] 表1.珍珠层脂类成分分析
[0061]
[0062]
[0063] 甲酯化的珍珠层脂类GC-MS分析分析结果见附图3和表2所示。GC-MS图谱主要 显示了 8个脂肪酸甲酯类化合物的色谱峰。通过NIST数据系统检索（NIST MASS SPECTRA DATABASE)鉴定了它们的结构，其名称与面积归一化法计算所得相对含量见表2。
[0064] 表2.甲酯化的珍珠层脂类成分分析
[0065]
[0066] GC/MS分析结果表明，海水珍珠层脂类成分中含有脂肪酸、长链烃、醛、卤代脂肪酸 酯等成分，其中十五酸和3-氯丙酸十七烷基酯含量最高。甲酯化后，总脂中脂肪酸甘油酯 分子中的脂肪酸部分被转化为甲酯，而游离脂肪酸未被转化，其GC/MS分析所得各种脂肪 酸甲酯的种类和含量可以揭示中性脂中脂肪酸的组成特点。珍珠层总脂甲酯化后，其GC/ MS分析结果显示（表2)，十五酸甲酯、十七酸甲酯、棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯四种成分的含 量之和超过总量的90%，说明它们是珍珠层中性脂中的主要脂肪酸。同时这些GC/MS分析 结果还表明游离脂肪酸和脂肪酸甘油酯中的脂肪酸组成有明显差别。
[0067] 实施例2 :制备"SCSI0 01819酶制剂溶液-1"及进行珍珠层脱脂
[0068] 1、将海洋小单孢菌SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在摇床上发酵培 养48小时，... 温度为28°C，转速为120rmp，得活化菌液。活化培养基组成为酵母提取物4. 0g， 麦芽提取物10. 〇g，葡萄糖4. 0g，50 %陈海水I. 0L。
[0069] 2、活化的菌液500mL加入装有诱导产酶发酵培养基7. 5L的发酵罐中（保兴， 10L)，在初始pH = 7. 5、28°C下培养96小时，发酵液脂肪酶活力达到1000u/mL，蛋白酶活 力达到1500u/mL。移出菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌 体，得"SCSIO 01819酶制剂溶液-1"5. 5L。滤膜的截留分子量为lOOKDa。每升诱导产酶 发酵培养基组成如下：玉米粉2. 0g，大豆粉0.5g，马氏珍珠贝软体部（干）的石油醚浸提物 I. 〇g，蔗糖 〇· 5g，30%陈海水 1L。
[0070] 3、取原珠1000g，装入5000mL烧杯中，再加入步骤2所述"SCSI0 01819酶制剂溶 液-1"2L，用Imol/mL NaOH调节pH值至8. 5,保持温度为28°C，浸泡12小时，取出后用滤 纸吸干水分。
[0071] 4、用无水乙醇2L浸泡步骤3所得珍珠，0. 5小时后取出珍珠用滤纸吸干珍珠表面 乙醇，重复浸泡3次，40°C下烘干后得脱脂珍珠。
[0072] 5、采用《南珠加工前处理技术规范》方法（Al和Bl处理液），对珍珠（1000 g)进行 碱液和有机溶剂浸泡预处理，40°C下烘干后得脱脂珍珠。
[0073] 6、分别测定步骤4、5所得珍珠以及作为空白对照的原珠的珍珠层总脂、中性脂和 极性脂的含量，重复3次，结果见表3。
[0074] 7、根据总酯、中性脂、极性脂含量测试结果，用下式计算处理后珍珠的脂类脱除 率。
[0075] 脱除率（％) =(空白对照脂含量-脱脂后脂含量）/空白对照脂含量X100
[0076] 本实施例各实验的总酯、中性脂、极性脂脱除率的测试结果列于附表3。
[0077] 表3.总脂、中性脂、极性脂脱除率的测试结果
[0078]
[0079] 应用《南珠加工前处理技术规范》的传统碱液结合有机溶剂浸泡的前处理方法处 理后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂的脱除率分别为：53. 5%、43. 3%、71. 3% ;使用本 专利的方法处理珍珠后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂脱除率分别为：80. 4%、82. 3%、 76. 9%。传统方法可以较为有效的去处珍珠层中的游离脂肪酸，但是对与以甘油三脂肪酸 酯为主的中性脂脱除效果较差。而本专利的方法中，脂肪酶可以充分接触到珍珠层中的甘 油脂肪酸酯类物质，并催化其水解转化为甘油和游离脂肪酸，易被碱性溶液所溶解洗脱，总 体脱脂效果明显强于碱液和有机溶剂浸泡的方法。
[0080] 实施例3 :制备"SCSI0 01819酶制剂溶液-1"及进行珍珠层脱脂
[0081] 1、将海洋小单孢菌SCSIO 01819菌种转接到菌种活化培养基中，在摇床上发酵培 养12小时，温度为37°C，转速为120rmp。活化培养基组成为酵母提取物4. 0g，麦芽提取物 10. 〇g，葡萄糖 4. Og，50%陈海水 1.0 L。
[0082] 2、活化的菌液500mL加入7L诱导产酶发酵培养基的发酵罐中（保兴，10L)，在初 始pH = 8. 0、温度37°C下培养12小时，发酵液脂肪酶活力达到3000单位/mL，蛋白酶活力 达到3000单位/mL。移出菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留 菌体，得珍珠脱脂用酶制剂溶液4. 6L。滤膜的截留分子量为300KDa。诱导产酶发酵培养基 组成如下：玉米粉4. 0g，大豆粉2. 0g，马氏珍珠贝软体部（干）的石油醚浸提物I. 5g，蔗糖 2. 0g，50%陈海水1L。超滤膜的截流分子量为300KDa。
[0083] 3、取原珠 1000 g装入容器，再加入步骤2所述小单孢菌SCSIO 01819的发酵制得 的酶制剂溶液5L，用lmol/L NaOH溶液调节pH值至13. 0保持温度为37°C，浸泡24小时， 取出后用滤纸吸干水分。
[0084] 4、用无水乙醇3L浸泡步骤3所得珍珠，2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面乙醇并 晾干，重复浸泡3次，40°C烘干后得SCSIO 01819珍珠层脱脂珍珠。
[0085] 5、取脂商品肪酶DENIE-DEG NS-G酶制剂（30000U/g) 170g溶于IL水中，制成活力 约5000U/mL的溶液，加入KOH溶液（lmol/L)调节pH至13. 0。DENIE-DEG NS-G是上海丹 尼悦生物科技有限公司出产的碱性脂肪酶制剂，常用于皮革脱脂。其最佳活力温度为50°C， 最佳 pH 值 12. 0-13. 0。
[0086] 6、称取原珠1000g，小心浸入DENIE-DEG NS-G酶制剂溶液，保持温度为50°C，浸泡 24小时。从DENIE-DEG NS-G酶制剂溶液中取出珍珠，并用滤纸吸干珍珠表面水分。
[0087] 7、用无水乙醇3L浸泡步骤6所得珍珠，2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面乙醇，换 新的无水乙醇浸泡，重复3次，滤纸吸干溶剂40°C烘干后得DENIE-DEG NS-G珍珠层脱脂的 珍珠。
[0088] 8、用实施例2中的方法测量步骤4、7所得珍珠以及作为空白对照的原珠的珍珠层 中脂类、中性脂和极性脂的含量，重复3次。计算脱脂率，结果列于表4。
[0089] 表4.总脂、中性脂、极性脂脱除率的测试结果
[0090]
[0091] DENIE-DEG NS-G酶制剂溶液脱脂后，珍珠层中总脂类、中性脂和极性脂脱除率分 别为：58. 6%、57. 6%、67. 1% ;使用本专利的方法处理珍珠后，珍珠层中总脂类、中性脂和 极性脂脱除率分别为：76. 4%、79. 4%、67. 0% ;SCSIO 01819脱脂作用明显强于DENIE-DEG NS-G酶制剂。结合实施例3的分析结果，可以发现DENIE-DEG NS-G酶制剂脱除中性脂的 效果强于传统的碱液加有机溶剂的方法，脱除极性脂的作用略弱于传统方法。SCSIO 01819 对总脂类、中性脂和极性脂的脱除效果都明显强于DENIE-DEG NS-G酶制剂，可能是由于 SCSIO 01819酶制剂除脂肪酶或外还具有蛋白酶活性，可以使珍珠层中的角蛋白结构变松 散，使得包裹在其中的脂类成分更容易接触到酶制剂，从而转化成脂肪酸和甘油，易溶解于 碱性溶液被洗脱。
[0092] 实施例4 :珍珠漂白效果的评估
[0093] 1、配制聚乙二醇甲醚质量分数为0. 2%，双氧水体积分数为5%的海水珍珠漂白 液。
[0094] 2、取实施例2、3的小单孢菌SCSIO 01819酶制剂处理后珍珠、《南珠加工前处理技 术规范》方法处理珍珠、DENIE-DEG NS-G酶制剂脱脂后的珍珠，以及作为空白对照的原珠 各100粒，分别放入50mL磨口三角烧瓶中，温度控制在35°C左右，每2天换一次漂白液，定 时轻微摇动锥形瓶（一天2次），漂白后取出珍珠样品，滤纸吸干表面漂白液，用海水浸泡 ld，然后用蒸馏水反复冲洗干净，40°C下干燥，对漂白效果进行评估。共进行5次实验，漂白 时间依次为2、4、6、8、10天。统计每批珍珠的漂白率、长麻率。原珠颜色记为0级，然后从 深至浅分别为灰、灰白、浅灰白、浅黄白、玉白和雪白色，依次定为1，2, 3,4和5级。漂白后 颜色达到4和5级视为达标，漂白率用下式计算：
[0095] 漂白率（％)=达标珍珠粒数/原珠粒数X 100
[0096] 加工后珍珠出现1个以上腐蚀斑点视为长麻，长麻率用下式计算：
[0097] 长麻率（％)=出现腐蚀斑点珍珠粒数/原珠粒数X 100
[0098] 分析结果见表5。
[0099] 表5.漂白率和长麻率
[0100]
[0101]
[0102] 由表5可知，使用"SCSIO 0189酶制剂-1"脱脂后的珍珠，加入过氧化氢漂白液 后，2天后有14%珍珠达到漂白标准，8天后漂白率达到最尚98%。而《南珠加工肖U处理技 术规范》方法脱脂珍珠、DENIE-DEG NS-G酶制剂脱脂方法脱脂珍珠、未处理原珠最早出现颜 色达标的珍珠时间均为4天，而DENIE-DEG NS-G酶制剂脱脂脱脂珍珠漂白10天后颜色达 标率可到达96 %，《南珠加工前处理技术规范》处理珍珠和原珠第十天后颜色达标率为66 % 和45%，还未达到最高值。所有方法处理的珍珠漂白8天后都出现了少量麻点，第10天较 多珍珠出现麻点（15~32%)。上述结果显示，漂白效果和珍珠脱脂率，尤其是中性脂脱除 率有明显关系，脱脂率最尚的SCSIO 01819酶制剂处理的珍珠层渗透性最强，漂白剂可以 充分与作用部位接触，在最短时间内达到98%的漂白率，而此时仅有1 %的长麻率；而其它 方法不能在珍珠大规模长麻之前达到最高漂白率，说明SISI00189酶制剂在海水珍珠层脱 脂方面有明显优势。
[0103] 实施例5 :制备SCSIO 01819酶制剂溶液-2及鱿鱼内脏水解蛋白
[0104] 1、将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到菌 种活化培养基中，在摇床上发酵培养12小时，温度为28°C，pH值为7. 5,转速为120rmp，得 活化菌液。活化培养基组成为酵母提取物4. Og，麦芽提取物10.0 g，葡萄糖4. Og，50 %陈海 水 I. 0L。
[0105] 2、活化的菌液500mL加入装有诱导产酶发酵培养基7. 5L的发酵罐中（保兴， 10L)，在初始pH = 7. 5、37°C下培养12小时，蛋白酶活力达到约2500u/mL。移出菌液离心除 去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，得"SCSI0 01819酶制剂溶-2" 液5L。滤膜的截留分子量为300KDa。每升诱导产酶发酵培养基组成如下：玉米粉2.0g，大 豆粉〇. 5g，鱿鱼内脏浆2. Og，蔗糖0. 5g，30%陈海水1L。
[0106] 3、称取IOkg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎10min，得约9. 3L糊状 物。取5kg内脏衆，按1:1 (内脏浆：酶制剂）比例加入上一步制成的酶制剂溶液并搅拌混 合，调节反应的起始pH值为7. 0,温度为40°C，时间10小时，搅拌速度50rpm。水解完成 后，酶解物经静置，粗脂肪层和水层分离，除去脂肪层后脱水干燥，得鱿鱼内脏的水解蛋白 (I. 70kg) 〇
[0107] 实施例6 :制备SCSIO 01819酶制剂溶液-2及鱿鱼内脏水解蛋白
[0108] 1、将海洋来源的小单胞菌（Micromonospora chalcea) SCSIO 01819菌种转接到 菌种活化培养基 中，在摇床上发酵培养48小时，温度为37°C，pH值为8. 0,转速为120rmp， 得活化菌液。培养基组成为酵母提取物4. Og，麦芽提取物10.0 g，葡萄糖4. Og，50 %陈海水 1.0 L0
[0109] 2、活化的菌液500mL加入装有诱导产酶发酵培养基7. 5L的发酵罐中（保兴， 10L)，在初始pH = 8. 0、28°C下培养96小时，蛋白酶活力达到约3000u/mL。移出菌液离心 除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，得SCSIO 01819酶制剂溶液 5L。滤膜的截留分子量为lOOKDa。每升诱导产酶发酵培养基组成如下：玉米粉4.0g，大豆 粉2. Og，鱿鱼内脏浆4. Og，蔗糖2. 0g，50%陈海水1L。
[0110] 3、称取IOkg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎lOmin，得约9. OL糊状 物。取5kg糊状物，按5 :1 (内脏浆：酶制剂）比例加入上一步制成的酶制剂溶液并搅拌混 合，调节反应的起始pH值为13.0,温度为50°C，时间20小时，搅拌速度50rpmin。水解完 成后，酶解物经静置，粗脂肪层和水层分离，除去脂肪层后脱水干燥，得鱿鱼内脏水解蛋白 (I. 72kg) 〇
[0111] 实施例7 :制备用于对比试验的鱿鱼内脏水解蛋白
[0112] 称取IOkg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎10min，得约9. IL糊状物。 取5kg糊状物，向糊状物中入碱性蛋白酶（终浓度lOOOu/mL)，调节反应的起始pH值为8. 0， 温度为45°C，时间20小时，搅拌速度50r/min。水解完成后，酶解物经静置，粗脂肪层和水 层分离，除去脂肪层后脱水干燥，得鱿鱼内脏水解蛋白（I. 78kg)。
[0113] 实施例8 :实施例5、6和7制备的鱿鱼水解蛋白中肽类的分子量分布测定
[0114] 实施例5、6和7制备的鱿鱼水解蛋白中肽类的分子量分布按国家标准《大豆肽 粉-GB/T22392-2008》中的方法测定，结果见表6。
[0115] 表6.实施例5、6和7制备的鱿鱼水解蛋白中肽类的分子量分布测定
[0116]
[0117]
[0118] 表6数据表明，由SCSIO 01819酶制剂制备的水解蛋白，分子量1000-10000Da之 间的肽类含量超过40%，明显高于用碱性蛋白酶催化的水解产物中相应分子量段的含量。
[0119] 实施例9 :鱿鱼水解蛋白对奥尼罗非鱼仔鱼生长率和死亡率的影响
[0120] 奥尼罗非鱼鱼苗由广东海大集团畜牧水产研宄中心提供，为出膜1天的同一批奥 尼罗非鱼仔鱼。实验前先将仔鱼放在50L的塑料桶内驯养2天，驯养期间不投喂饵料。
[0121] 将奥尼罗非鱼鱼苗分成1个对照组和4个实验组，其中对照组所用的饲料配方是 鱼粉46%，麦芽根15%，茨粉19%，酵母3%，大豆卵磷脂1%，胆碱0.5%，磷酸氢钙0.5%， 复合维生素0. 4%，合矿物盐0. 6 %，纤维素8 %，豆油1 %，褐藻酸钠1 %，明胶4%。
[0122] 实验组1所用的饲料配方是鱼粉41%，实施例5得到的鱿鱼水解蛋白5%，其余组 分与对照组相同。
[0123] 实验组2所用的饲料配方是鱼粉41 %，实施例6得到的鱿鱼小肽5 %，其余组分与 对照组相同。
[0124] 实验组3所用的饲料配方是鱼粉36%，实施例5得到的鱿鱼小肽10%，其余组分 与对照组相同。
[0125] 实验组4所用的饲料配方是鱼粉36 %，实施例6得到的鱿鱼小肽10 %，其余组分 与对照组相同。
[0126] 饲养鱼苗桶里放置气石，24h充气，每天换水50%，吸出桶底废物，并用恒温棒控 制温度为27°C。每天投喂仔鱼体重10%的配合饵料3次；实验周期21天，重复3次。
[0127] 死亡率和增重率用下面公式计算：
[0128] 在实验开始和结束时分别测量奥尼罗非鱼的体重（精确到0.0 Olg)，以及鱼苗数 量。
[0129] 死亡率=(实验开始时鱼苗数量-实验结束时鱼苗数量）/实验开始时育苗数 量 X 100%
[0130] 绝对增重率=(实验结束时鱼苗重量（g)_实验开始时鱼苗重量（g))/实验天数
[0131] 结果是，对照组中鱼苗的死亡率是54% ±3%，绝对增重率0. 0033±0. 0012g/天， 实验组1中鱼苗的死亡率是41% ±8%，绝对增重率0. 0062±0. 0005g/天，实验组2中鱼 苗的死亡率是45% ±10%，绝对增重率0. 0068±0.0 Ollg/天，实验组3中鱼苗的死亡率是 35% ±8%，绝对增重率0. 0055±0. 0015g/天，实验组4中鱼苗的死亡率是38% ±10%，绝 对增重率 0. 0059±0. 0008g/ 天。
[0132] 以上结果表明，用鱿鱼水解蛋白部分替代鱼粉后，奥尼罗非鱼仔鱼死亡率明显降 低，增重率明显增加。替代比例达到鱼粉重量5%时，即可观察到显著差异。
【主权项】
L海洋来源的小单胞菌（Micromonosporachalcea)SCSIO01819,保藏编号：CGMCC No.M9737。 2?权利要求1所述的海洋来源的小单胞菌（Micromonosporachalcea)SCSIO01819在 制备具有脂肪酶及蛋白酶活性的酶制剂溶液中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液，是 通过以下方法制备的： 将海洋来源的小单胞菌（Micromonosporachalcea)SCSIO01819菌种转接到菌种活化 培养基中，在28~37°C下培养12~48小时，将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基的容 器中，在pH= 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，当发酵液脂肪酶活力达到 1000~3000u/mL，蛋白酶活力达到1500~3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和 残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留菌体，即得到珍珠脱脂用SCSIO01819酶制剂 溶液-1。 所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液，是通过以下方法制备的： 将海洋来源的小单胞菌（Micromonosporachalcea)SCSI0 01819菌种转接到菌种活 化培养基中，在28~37°C下培养12~48小时；将活化的菌液加入诱导产酶发酵培养基的 容器中，在pH= 7. 5~8. 0、温度28~37°C下培养12~96小时，蛋白酶活力达到2500~ 3000u/mL时，停止发酵，将菌液离心除去菌体和残余培养基，上清液经超滤进一步除去残留 菌体，即得到鱿鱼内脏蛋白水解用SCSIO01819酶制剂溶液-2。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的活化培养基，每IL培养基的配 方为：酵母提取物4. 0g，麦芽提取物10. 0g，葡萄糖4. 0g，50%陈海水I. 0L。
5. 根据权利要求3所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液，其特征在于，所述的诱导产 酶发酵培养基，每IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，马氏珍珠贝 软体部的石油醚浸提物1. 〇~I. 5g，蔗糖0. 5~2. 0g，30~50%陈海水1L，超滤膜的截流 分子量为1〇〇~300KDa，所述的马氏珍珠贝软体部石油醚浸提物是干燥软体部经石油醚浸 泡提取后，取提取液减压蒸干所得的残留物。
6. 根据权利要求3所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液，其特征在于，所述的诱导 产酶发酵培养基，每IL培养基的配方为：玉米粉2. 0~4. 0g，大豆粉0. 5~2. 0g，脱脂鱿 鱼内脏浆2. 0~4. 0g，蔗糖0. 5~2. 0g，30~50 %陈海水1L。超滤膜的截流分子量为 100-300KDa，所述的脱脂鱿鱼内脏浆是将鱿鱼内脏匀浆后，加入等体积水搅拌均匀，以石油 醚或正己烷萃取三次后，下层液体蒸发掉除去一半水分制得。
7. 权利要求3所述的具有脂肪酶活性的酶制剂溶液在珍珠层脂类脱除中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： (1) 、将珍珠原珠与SCSIO01819酶制剂溶液-1以珠-液比2~5 :1比例（v:m)混合， 调节pH值到8. 5~13. 0,温度28~37°C，浸泡脱脂12~24小时，将珍珠从SCSIO01819 酶制剂溶液-1中取出，并用滤纸吸干表面液体； (2) 、将步骤（1)处理所得珍珠用无水乙醇浸泡，珍珠与无水乙醇的比例为2~3 :1 (m/ V)，0. 5~2小时后取出珍珠用滤纸吸干表面溶剂，重复3次后晾干，脱去珍珠层水分和残留 酶制剂，即可脱除珍珠层脂类。
9. 权利要求3所述的具有蛋白酶活性的酶制剂溶液在制备水解鱿鱼内脏蛋白中的应 用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 将鱿鱼内脏碎成浆状后与SCSIO01819酶制剂溶液-2按体积比1~5:1(V:v)混合进 行酶解，反应的起始pH值为7. 0~13. 0,温度为40~50°C，时间10~20小时，酶解物经 静置，分为粗脂肪层和水层，除去脂肪层后干燥，即得具有促进水产动物生长和降低死亡率 功能的水解鱿鱼内脏蛋白。
【专利摘要】本发明公开一种海洋来源小单孢菌SCSIO 01819、酶制剂溶液及其制备方法和应用。海洋来源小单孢菌SCSIO 01819于2014年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.M9737。本发明利用海洋来源的小单胞菌(Micromonospora chalcea)SCSIO 01819生产具有脂肪酶活性和蛋白酶活性的酶制剂，再利用其进行珍珠层脱脂，脱除珍珠层中的脂类成分，增强漂白剂染色剂在珍珠层内的渗透性，从而提升珍珠加工的效果，缩短加工的周期；还可用于催化鱿鱼内脏蛋白的水解，可以定向转化粗蛋白产生具有提高水产动物幼苗存活率和增重率功能的肽类，酶制剂为催化剂制备的鱿鱼内脏水解蛋白中，分子量1000-10000Da的肽类含量高于传统商品蛋白酶催化水解产物，并且具有显著的促进水产动物生长，降低幼苗死亡率的作用。CGMCC No.M973720140925
【IPC分类】C12P21/06, C12N1/20, C12R1/30, C12N9/52, C12N9/20
【公开号】CN104894034
【申请号】CN201510366099
【发明人】龙丽娟, 尹浩, 田新朋, 齐振雄, 尹团, 张偲
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
最新回复(0)