一种芽孢杆菌的筛选方法及其应用
一种芽孢杆菌的筛选方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌的筛选方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 番前（Lycopersicon esculentum Mill)为我国普遍栽培的果蔬之一。据农业部 统计，2001年我国番茄栽培面积位居亚洲首位，世界第二。到目前为止，我国每年的番茄栽 培面积都稳定在110万hm 2左右。因此发展我国番茄生产具有重要的战略意义。
[0003] 随着番茄栽培面积的不断扩大，栽培品种单一，栽培模式和栽培管理技术不当，番 茄病虫害也越来越严重，特别是在保护地栽培的番茄病虫害更为严重。其中番茄青枯病是 其中一种非常严重的病害之一，在我国南方各省市番茄种植区域均有严重发生。该病害是 由前科劳尔氏菌（R. solanacearum，EF smith，简称青枯菌）引起的一种世界范围的毁灭性 土传细菌病害，在高温、高湿的条件下容易爆发，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，并且 在部分低温地区同样发现青枯菌的存在，给全球的农作物生产带来极大的威胁。该病害一 旦发生就难以控制，往往造成作物大面积萎蔫死亡甚至绝收，导致番茄产量严重下降，严重 制约着番茄产业的发展和经济效益的提高。
[0004] 青枯菌是引起番茄、茄子、烟草、辣椒等多种经济作物青枯病的病原菌，但尚无有 效的方法控制其造成的危害。使用化学农药防治青枯病，不仅经济成本高，而且会污染环 境，危害人类健康。因此，利用具有环境友好、持续有效的生物防治技术对土传青枯病进行 防控，越来越受广大农业生产工作者的欢迎和关注。其中利用植物根际有益微生物防治土 传病害成为生物防治的重要研宄领域。利用植物根际有益微生物防治番茄青枯病，并且促 进番茄作物的生长，对番茄栽培乃至整个农作物栽培领域都具有十分重要的意义。
[0005] 生防菌防控植物病害的关键是其能够在植物根际竞争定殖，尤其是有病原微生物 的存在于土壤或植物根部时更显得非常重要。室内平板试验中筛选得到的产拮抗物质能力 强的拮抗菌因其根际定殖能力差同样未必能达到理想的生物防控效果。但同样有研宄指出 根际定殖能力强的生防菌株未必就能够能取得很好的生防效果，并且大部分定殖能力强的 根际微生物属于革兰氏阴性菌，不利于用于农业生产应用及商业产品的开发。芽孢杆菌因 其能耐热抗逆、产内生芽孢，并具有抗逆能力强、功能性强、易储藏运输、分布广泛、防病稳 定性高等特点，为其在农业生产中表现出非芽孢杆菌所没有的优势，基于其开发的生防菌 剂，以及微生物有机肥等生防产品已成功投入使用并取得了良好的生防效果。但是有些芽 孢杆菌在室内平板的拮抗效果很好，但是在土壤中却不能发挥相应的作用。因此，有必要开 发和筛选出在根际定殖能力强兼有较强拮抗能力的新的菌株资源，从而为生物防控菌剂的 开发提供新的微生物资源。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种具有较强根际定植能力和拮抗能力的微生物菌株的 筛选方法。
[0007] 为达到以上目的，本发明提供了一种芽孢杆菌的筛选方法，所述方法包括菌株的 植物根际定殖能力筛选和菌株对病原微生物诘抗能力筛选。
[0008] 可选的，所述方法包括以下步骤：
[0009] 1)芽孢杆菌的筛选：将采集的土壤样品稀释得到菌悬液，将菌悬液涂布于制备好 的LB培养基平板上，然后倒置于30°C培养箱中培养48h，挑取不同形态的、生长良好的单菌 落反复划线，纯化分离菌株，并将所获得的单菌落转接至LB培养基斜面上，30°C恒温培养 48h，筛选获得芽孢杆菌；
[0010] 2)植株根际定殖能力筛选及病原微生物拮抗能力筛选：将筛选出来的芽孢杆菌 在LB培养基上划线培养后用无菌的磷酸缓冲液冲洗获得芽孢杆菌的混合菌悬液1，然后再 将混合菌悬液1接种至限菌条件下培养的植株根际，在植株根际培养一周后再将植株根际 的芽孢杆菌分离培养，筛选出数量最多的芽孢杆菌获得植株根际定殖能力强的菌株；再将 植株根际定殖能力强的芽孢杆菌与病原微生物进行室内平板对峙试验，挑选抑菌圈大的菌 株，即为对病原微生物具有强拮抗能力的菌株。
[0011] 其中，所述土壤样品可以为生长在植物病原微生物病害严重的地区的健康作物植 株的根际土壤。例如，当所要筛选的芽孢杆菌为具有番茄青枯菌抑制能力的芽孢杆菌时，可 以取番茄青枯病连作障碍严重地区的健康番茄植株的根际土壤。
[0012] 可选的，所述植株根际定植能力筛选包括以下步骤：
[0013] 将限菌条件下培养的植株芽浸泡在所述芽孢杆菌的混合菌悬液1中处理 25-35min后置于装有无菌营养液PNS及石英砂的组培瓶中培养，培养的条件为25°C下每天 12h光照，12h黑暗，连续培养6-8d获得植株幼苗；收集所述植株幼苗的根并浸泡于磷酸缓 冲液中，充分振荡混匀获得菌悬液2,然后将所得菌悬液2稀释涂布于LB培养基上，待在黑 暗中30°C恒温培养48h后，将所得菌落用磷酸缓冲液冲洗得到菌悬液3,最后挑选数量最多 且不同菌落形态的菌株为根部定殖能力强的芽孢杆菌。
[0014] 其中，优选利用相同的方法对菌悬液3再进行1-3轮植株根际定植能力筛选获得 根际定植能力强的芽孢杆菌。
[0015] 其中，所述挑选数量最多的菌株指代挑选稀释涂布过程中，数量级最高的芽孢杆 菌。
[0016] 可选的，所述平板对峙实验包括以下步骤：
[0017] 用无菌牙签挑取所述根际定植能力强的芽孢杆菌的单菌落点接到NA平板上，培 养12h后，用装有病原微生物菌悬液的喷瓶喷1次，30°C培养24h后测定抑菌圈直径，其中， 在所述病原微生物菌悬液中有效活菌数含量为l〇 1(lCFU/ml。
[0018] 可选的，可以对所述根际定植能力强的菌株进行进一步菌学鉴定，从而进行分类 筛选，例如可以通过鉴定进一步获得解淀粉芽孢杆菌菌株。
[0019] 在本发明所提供的方法中，所述芽孢杆菌包括但不限于定植于作物根际的有病原 微生物拮抗能力的芽孢杆菌。
[0020] 本发明还提供了利用所述筛选方法筛选得到的芽孢杆菌菌株。
[0021] 可选的，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌。
[0022] 本发明还提供了所述芽孢杆菌菌株在植物病原菌抑制中的应用。
[0023] 可选的，所述应用包括制备含有所述芽孢杆菌菌株的菌剂，其中，所述菌剂含有所 述芽孢杆菌的培养液。
[0024] 可选的，在所述菌剂中，芽孢杆菌的含量为1.0X109-1.0X101(lCFU/g。
[0025] 可选的，所述应用包括抑制番茄青枯菌、马铃薯立枯病病原菌、黄瓜立枯病菌、油 菜菌核病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花黄萎病菌或香蕉枯萎病菌。
[0026] 可选的，所述应用为抑制番茄青枯菌，促进番茄生长。
[0027] 利用本发明所提供的方法筛选得到的芽孢杆菌菌株不仅在平板培养时可高效抑 制微生物病原菌，而且在温室试验中其防治效果高达80%以上。筛选获得的芽孢杆菌作为 作物病害的有效生物防治材料，可以用于开发新的生物农药或生物防治菌剂，具有广阔的 应用前景。
【附图说明】
[0028] 图1为菌株T-5对番茄青枯病病原菌的抑制效果图。
【具体实施方式】
[0029] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给 出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在 不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0030] 实施例1
[0031] 实施例1用于说明本发明所述的芽孢杆菌菌株的筛选方法。
[0032] 1)取江苏省南京市麒麟镇番茄青枯病连作障碍严重的农田中健康番茄植株的根 际土壤10g，加入到装有90ml无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分摇动30min，使得样品 与无菌水混和均匀，制得样品悬液。
[0033] 2)将制得的样品悬液置于温度为80°C的水浴中加热30min，以杀死不产芽孢的细 菌和其他微生物，然后在无菌条件吸取Iml的样品悬液加入到装有9ml无菌水的试管中，振 荡均匀，制得1〇_ 2样品稀释液， 并依次稀释制得10 _3、1〇_4、1〇_5、1〇_6、1〇_ 7的稀释液。
[0034] 3)分别取10-4、10-5、ΚΓ6、KT 7浓度梯度的各样品稀释液0.1 ml涂布至相应制备好 的LB培养基平板上，30°C倒置培养48h。根据菌落形态特征挑取形态等形状差异比较明显 的菌落分别点接至同一 LB平板中，30°C倒置培养48h。
[0035] 4)待点接至同一 LB平板上的芽孢杆菌长出之后，用无菌的磷酸缓冲液冲洗所有 菌体，制备成混合菌液。然后接种至番茄根部进行富集培养。
[0036] 5)番茄植株限菌条件培养步骤：将番茄种子消毒，消毒方法：用70%的酒精浸泡 lmin，无菌水洗涤1次，再用3%的NaClO溶液浸泡5min，无菌水漂洗6次。将消毒好的种 子放入垫有无菌双蒸水浸湿滤纸的无菌平板中，在30°C的环境下催芽两天。将番茄芽再次 用以上方法消毒一次，即制备成无菌番茄芽。将消毒的番茄芽浸泡在上述混合菌液中处理 30min，以浸泡在无菌的磷酸缓冲液中的无菌番茄芽作对照。将消毒的番茄芽放入装有无菌 的营养液PNS及石英砂的组培瓶中培养。培养条件为25°C，12h光照，12h黑暗的光照培养 箱中培养7d。
[0037] 6)番茄根际定殖能力强的芽孢杆菌筛选。待番茄幼苗培养7d后，收集番茄根浸泡 于ImL磷酸缓冲液中，充分振荡混匀，然后将所得菌悬液稀释涂布于LB培养基上。待在黑 暗中30°C恒温培养48h后，将所得菌落用磷酸缓冲液（pH 7.0)冲洗得到菌悬液，重复上述 步骤4)和5)，重复3次，最后挑选数量最多且不同菌落形态的菌株为定殖能力强的芽孢杆 菌。
[0038] 7)平板对峙试验，采用点接喷雾法检测所筛选得到的番茄根际定殖能力强的芽孢 杆菌对番茄青枯菌的抑制能力。用无菌牙签挑取单菌落点接到NA平板上，培养12h后，用 装有病原菌QL-Rslll5菌悬液（10 1(lCFU/ml)喷瓶喷1次，30°C培养24h后测定抑菌圈直径。
[0039] 8)筛选得到在番茄根际定殖能力强且对番茄青枯病的病原菌青枯菌具有强烈抑 制作用的菌株T-5,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)，于2013年 12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 8547。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编 100101。
[0040] 本发明中，所述的解淀粉芽孢杆菌菌株T-5在LB平板上30°C培养24h后呈不规则 近圆形，不透明，边缘不光泽，表面干燥无褶皱，产芽孢，芽孢端生或近端生，细胞杆状，革兰 氏染色阳性。
[0041] 9)解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens) T-5菌株的生理生化特征：过 氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，甲基红试验阳性，V-P反应阳性，明胶水解阳性，纤维素分解 阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，不能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气， 能利用木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、D-果糖、D-木糖。
[0042] 上述LB培养基由以下成分组成：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸膏5g，水定容至 1L，调 pH 到 7. 0-7. 2。
[0043] 上述NA培养基由以下成分组成：葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏3g、酵母膏 〇· 5g、去离子水 lOOOmL，调节 pH 7. 2-7. 4。
[0044] 上述 PNS 营养液由以下成分组成：Imol L 1KNO3SmKlmol L 1Ca(NO3)2 · 4H20 2ml、 Imol T1MgSO4WH2O 2ml、20mmol EDTA-Fe 2.5ml、lmol Γ1 磷酸缓冲液（pH 5.5)2. 5ml、PNS microelements lml、加入到985ml去离子水中。
[0045] 实验例2
[0046] 实施例2用于说明利用本发明所述方法筛选获得的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)Τ_5产功能性物质的特性。
[0047] 1)产吲哚乙酸测定，菌株在含5mmol T1L-色氨酸的TSB培养基中摇床30°C培 养36h，菌悬液离心去除菌体，在ImL无菌滤液中加入2mL Salkawski显色剂，室温下显色 30min，如有粉色产生则说明有IAA产生。以培养基作为对照。
[0048] 2)产铁载体测定，将拮抗菌菌株点接于CAS平板上，待置30°C培养箱培养3-4d 后，观察是否有透明圈出现，如有则说明菌株具有产铁载体的能力。
[0049] 3)解磷能力测定，将拮抗菌接种到NBRIP培养基上，置30°C培养箱培养3d，看有无 透明圈出现，如有则说明菌株具有解磷能力。
[0050] 4)产氨测定
[0051] 分别将待测菌株接种于蛋白胨氨化培养基中，30°C培养24h。以不接种的蛋白胨 氨化培养基作对照。在培养液中加入3-5滴纳氏试剂，出现黄色或棕红色沉淀则为正反应。 未接种的培养基加入纳氏试剂后无黄色或棕红色沉淀出现。
[0052] 5)产 HCN 能力
[0053] 拮抗菌划线培养至含4. 4g Γ1氨基乙酸的TSA的培养基中，将在苦味酸溶液中浸 泡过的滤纸条放至平板中央，然后用封口膜将平板封严，平板置30°C培养箱培养3d。如滤 纸片由黄色变为褐色则说明菌株可以产生HCN。
[0054] 实验结果显示菌株T-5具备产吲哚乙酸、铁载体、氨以及解磷的能力，但不具备产 HCN的能力。
[0055] 上述TSB培养基由以下组分组成：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 5g、去离子水 lOOOmL、pH 7. 5。
[0056] 上述NBRIP培养基由以下组分组成：葡萄糖10g、AlP042g、（NH 4)2SO4O. 5g、NaCl 0· 2g、MgSO4O. lg、KCl 0· 2g、酵母浸膏 0· 5g、MnSO40.00 2g、FeSO40.00 2g、溴酚蓝（0· 4%，pH 6. 7)6mL、琼脂20g、去离子水1000 mUpH自然。
[0057] 上述纳氏试剂由以下组分组成：甲液（碘化钾10. 0g、蒸馏水100.0 mL、碘化汞 20.0 g)乙液（氢氧化钾20. 0g、蒸馏水100mL。）分别配制甲、乙两液，待冷却后混合，保存 于棕色瓶中。
[0058] 上述蛋白胨氨化培养基以下组分组成：蛋白胨5g、KH2PO4O. 5g、K2HPO4O. 5g、 MgSO4O. 5g、蒸馏水 1000 mUpH 7· 0-7. 2。
[0059] 上述CAS蓝色检测液以下组分组成：溶液Α:将0.07g的CAS(铬天青，Chrome azurol sulphonate)溶于 50mL 去离子水中，再加入 10mT, lmmol I71 的 FeCl 3(含有 IOmmol L-1的HC1);溶液B :将0. 06g的HDTMA (溴化十六碳烷基三甲铵）溶于40mL去离子水中；溶 液C :将A溶液沿着烧杯的壁缓缓加入到B溶液中，二者充分混合均匀即得CAS蓝色检测液。
[0060] 上述Salkowski显色液溶液以下组分组成：lmL 0· 5mol L4FeCl3加入到50mL 35%的HClO4溶液中；溶液B :I. 2%的FeCl 3加入到37%的H2S04中。
[0061] 上述苦味酸溶液以下组分组成：2. 5g苦味酸，12. 5g Na2CO3, 1000 mL蒸馏水。
[0062] 实验例3
[0063] 实施例3用于说明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)T_5对番前青 枯病的抑制。
[0064] 1)菌液准备，取本发明所述的解淀粉芽孢杆菌T-5菌株（利福平标记）在LB液体 培养基中30°C，180r mirT1振荡培养48h，7000Xg离心10min获得菌体，无菌水稀释，用平 板稀释涂布法测定菌悬液中菌体浓度，菌悬液中有效活菌数含量为l〇 1(lCFU/g，菌悬液4°C 保藏待用。
[0065] 挑取番茄青枯病病原菌青枯菌单 菌落接种至NA培养液中，于30°C，180r mirT1振 荡培养48h，5000 X g离心10min获得菌体，无菌水稀释，用平板稀释涂布法测定菌悬液中菌 体浓度，菌悬液4°C保藏待用。
[0066] 2)番茄种子及盆栽土壤准备，将番茄种子消毒，用70%的酒精浸泡lmin，无菌水 洗涤1次，再用3%的NaClO溶液浸泡5min，无菌水漂洗6次。将消毒好的种子放入垫有无 菌双蒸水浸湿滤纸的无菌平板中，在30°C的环境下催芽两天。将萌发的番茄幼苗做相应处 理后播种于装有3kg菜园土盆钵中，每盆4粒种子，待幼苗长出后间苗，每盆留两株长势一 致的幼苗。
[0067] 3)试验设计2个处理，Tl :不接种拮抗菌；T2 :每盆中浇灌拮抗菌菌悬液，使土壤 中含拮抗菌菌液浓度为IO8CFU g4干土；病原菌接种浓度为10 6CFU g4干土，每个处理重复 10盆，每盆2株苗。
[0068] 4)定期观察青枯病发病状况，统计发病率，最后采收后计算不同处理的生物量差 异。对利福平标记的T-5菌株在番茄根部的定殖数量进行测定。菌株T-5对番茄青枯病病 原菌的抑制效果图见图1。
[0069] 5)施用本发明的生防菌T-5能够显著降低番茄青枯病的发病率，接种了 T-5菌株 的处理T2发病率只有6. 7 %，而对照处理Tl的发病率高达65. 0 %，防治率达到82. 0 %。T-5 菌株在番茄根部的定殖数量多且较为稳定，达到l〇7CFU/g干重土（表1)。另外，T-5菌株 能够促进番茄的生长（表1T-5的定殖数量及对番茄的生物量的影响）。
[0070] 表 1
[0071]
[0072] 上述LB培养基由以下成分组成：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸膏5g，水定容至 1L，调 pH 到 7. 0-7. 2。
[0073] 上述NA培养基由以下成分组成：葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏3g、酵母膏 〇· 5g、去离子水 lOOOmL，调节 pH 7. 2-7. 4。
[0074] 实验例4
[0075] 实施例4用于说明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens) T-5对多种病 原菌的拮抗作用。
[0076] 采用对峙培养法，用直径为5mm的打孔器分别在培养好的6种植物病原真菌（马铃 薯立枯病病原菌 Rhizoctonia Solani Ktihn of potato (RP)、黄瓜立枯病菌 Rhizoctonia solani Kilhn of cucumber (RC)、油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bar (SR)、黄瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum (FC)、棉花黄萎病菌 Verticillium dahliae Kleb (VC)、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FB)) 的菌落边缘取菌块，将菌块接种到PDA培养基平板中央，然后把解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens) T-5接种至距离中央距离相等的位置，重复3次，之后置于温度为28°C 的恒温箱中培养，观察抑菌效果，计算病原菌生长的抑制率，结果如表2所示，表2为解淀粉 芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)T_5对多种病原菌的抑制作用。
[0077] 上述所用PDA培养液配置方法为（以配置IL培养基为例）：用200g 土豆削皮后切 成小块放入到500mL水中，加热煮沸30min，经过滤后滤液中加入20g鹿糖，定容至lOOOmL， pH 值调至 7. 0-7. 4,115°C灭菌 30min。
[0078] 表 2
[0079]
[0080] 结果表明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)T_5能够有效抑制马铃 薯立枯病病原菌、黄瓜立枯病菌、油菜菌核病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花黄萎病菌和香蕉枯萎 病菌。
[0081] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述方法包括菌株的植物根际定殖能力筛 选和菌株对病原微生物拮抗能力筛选。2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 芽孢杆菌的筛选：将采集的土壤样品稀释得到菌悬液，将菌悬液涂布于制备好的LB 培养基平板上，然后倒置于30°C培养箱中培养48h，挑取不同形态的、生长良好的单菌落反 复划线，纯化分离菌株，并将所获得的单菌落转接至LB培养基斜面上，30°C恒温培养48h， 筛选获得芽孢杆菌； 2) 植株根际定殖能力筛选及病原微生物拮抗能力筛选：将筛选出来的芽孢杆菌在LB 培养基上划线培养后用无菌的磷酸缓冲液冲洗获得芽孢杆菌的混合菌悬液1，然后再将混 合菌悬液1接种至限菌条件下培养的植株根际，在植株根际培养一周后再将植株根际的芽 孢杆菌分离培养，筛选出数量最多的芽孢杆菌获得植株根际定殖能力强的菌株；再将植株 根际定殖能力强的芽孢杆菌与病原微生物进行室内平板对峙试验，挑选抑菌圈大的菌株， 即为对病原微生物具有强拮抗能力的菌株。3. 根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述植株根际定植能力筛选包括 以下步骤： 将限菌条件下培养的植株芽浸泡在所述芽孢杆菌的混合菌悬液1中处理25-35min后 置于装有无菌营养液PNS及石英砂的组培瓶中培养，培养的条件为25°C下每天12h光照， 12h黑暗，连续培养6-8d获得植株幼苗；收集所述植株幼苗的根并浸泡于磷酸缓冲液中，充 分振荡混匀获得菌悬液2,然后将所得菌悬液2稀释涂布于LB培养基上，待在黑暗中30°C 恒温培养48h后，将所得菌落用磷酸缓冲液冲洗得到菌悬液3,最后挑选数量最多且不同菌 落形态的菌株为根部定殖能力强的芽孢杆菌。4. 根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述平板对峙实验包括以下步骤： 用无菌牙签挑取所述根际定植能力强的芽孢杆菌的单菌落点接到NA平板上，培养12h 后，用装有病原微生物菌悬液的喷瓶喷1次，30°C培养24h后测定抑菌圈直径，其中，在所述 病原微生物菌悬液中有效活菌数含量为l〇1(lCFU/ml。5. 利用权利要求1-4中任意一项所述的筛选方法筛选得到的芽孢杆菌菌株。6. 根据权利要求5所述的芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆 菌。7. 权利要求1-4中任意一项所述的筛选方法或权利要求5-6中任意一项所述的芽孢杆 菌菌株在植物病原菌抑制中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，包括制备含有所述芽孢杆菌菌株的菌剂，其中，所述菌 剂含有所述芽孢杆菌的培养液。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在所述菌剂中，芽孢杆菌的含量为 I.OXlO9-LOX101(lCFU/g〇10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述应用包括抑制番茄青枯菌、马铃 薯立枯病病原菌、黄瓜立枯病菌、油菜菌核病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花黄萎病菌或香蕉枯萎 病菌。
【专利摘要】本发明提供了一种芽孢杆菌的筛选方法，所述方法包括菌株的植物根际定殖能力筛选和菌株对病原微生物拮抗能力筛选。利用本发明所提供的方法筛选得到的芽孢杆菌菌株不仅在平板培养时可高效抑制微生物病原菌，而且在温室试验中其防治效果高达80％以上。筛选获得的芽孢杆菌作为作物病害的有效生物防治材料，可以用于开发新的生物农药或生物防治菌剂，具有广阔的应用前景。CGMCC No. 854720131206
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/07, C12Q1/04, A01P3/00
【公开号】CN104894035
【申请号】CN201510366238
【发明人】谭石勇, 谭武贵, 周亮, 余佳玲
【申请人】湖南泰谷生物科技股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌的筛选方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 番前（Lycopersicon esculentum Mill)为我国普遍栽培的果蔬之一。据农业部 统计，2001年我国番茄栽培面积位居亚洲首位，世界第二。到目前为止，我国每年的番茄栽 培面积都稳定在110万hm 2左右。因此发展我国番茄生产具有重要的战略意义。
[0003] 随着番茄栽培面积的不断扩大，栽培品种单一，栽培模式和栽培管理技术不当，番 茄病虫害也越来越严重，特别是在保护地栽培的番茄病虫害更为严重。其中番茄青枯病是 其中一种非常严重的病害之一，在我国南方各省市番茄种植区域均有严重发生。该病害是 由前科劳尔氏菌（R. solanacearum，EF smith，简称青枯菌）引起的一种世界范围的毁灭性 土传细菌病害，在高温、高湿的条件下容易爆发，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，并且 在部分低温地区同样发现青枯菌的存在，给全球的农作物生产带来极大的威胁。该病害一 旦发生就难以控制，往往造成作物大面积萎蔫死亡甚至绝收，导致番茄产量严重下降，严重 制约着番茄产业的发展和经济效益的提高。
[0004] 青枯菌是引起番茄、茄子、烟草、辣椒等多种经济作物青枯病的病原菌，但尚无有 效的方法控制其造成的危害。使用化学农药防治青枯病，不仅经济成本高，而且会污染环 境，危害人类健康。因此，利用具有环境友好、持续有效的生物防治技术对土传青枯病进行 防控，越来越受广大农业生产工作者的欢迎和关注。其中利用植物根际有益微生物防治土 传病害成为生物防治的重要研宄领域。利用植物根际有益微生物防治番茄青枯病，并且促 进番茄作物的生长，对番茄栽培乃至整个农作物栽培领域都具有十分重要的意义。
[0005] 生防菌防控植物病害的关键是其能够在植物根际竞争定殖，尤其是有病原微生物 的存在于土壤或植物根部时更显得非常重要。室内平板试验中筛选得到的产拮抗物质能力 强的拮抗菌因其根际定殖能力差同样未必能达到理想的生物防控效果。但同样有研宄指出 根际定殖能力强的生防菌株未必就能够能取得很好的生防效果，并且大部分定殖能力强的 根际微生物属于革兰氏阴性菌，不利于用于农业生产应用及商业产品的开发。芽孢杆菌因 其能耐热抗逆、产内生芽孢，并具有抗逆能力强、功能性强、易储藏运输、分布广泛、防病稳 定性高等特点，为其在农业生产中表现出非芽孢杆菌所没有的优势，基于其开发的生防菌 剂，以及微生物有机肥等生防产品已成功投入使用并取得了良好的生防效果。但是有些芽 孢杆菌在室内平板的拮抗效果很好，但是在土壤中却不能发挥相应的作用。因此，有必要开 发和筛选出在根际定殖能力强兼有较强拮抗能力的新的菌株资源，从而为生物防控菌剂的 开发提供新的微生物资源。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种具有较强根际定植能力和拮抗能力的微生物菌株的 筛选方法。
[0007] 为达到以上目的，本发明提供了一种芽孢杆菌的筛选方法，所述方法包括菌株的 植物根际定殖能力筛选和菌株对病原微生物诘抗能力筛选。
[0008] 可选的，所述方法包括以下步骤：
[0009] 1)芽孢杆菌的筛选：将采集的土壤样品稀释得到菌悬液，将菌悬液涂布于制备好 的LB培养基平板上，然后倒置于30°C培养箱中培养48h，挑取不同形态的、生长良好的单菌 落反复划线，纯化分离菌株，并将所获得的单菌落转接至LB培养基斜面上，30°C恒温培养 48h，筛选获得芽孢杆菌；
[0010] 2)植株根际定殖能力筛选及病原微生物拮抗能力筛选：将筛选出来的芽孢杆菌 在LB培养基上划线培养后用无菌的磷酸缓冲液冲洗获得芽孢杆菌的混合菌悬液1，然后再 将混合菌悬液1接种至限菌条件下培养的植株根际，在植株根际培养一周后再将植株根际 的芽孢杆菌分离培养，筛选出数量最多的芽孢杆菌获得植株根际定殖能力强的菌株；再将 植株根际定殖能力强的芽孢杆菌与病原微生物进行室内平板对峙试验，挑选抑菌圈大的菌 株，即为对病原微生物具有强拮抗能力的菌株。
[0011] 其中，所述土壤样品可以为生长在植物病原微生物病害严重的地区的健康作物植 株的根际土壤。例如，当所要筛选的芽孢杆菌为具有番茄青枯菌抑制能力的芽孢杆菌时，可 以取番茄青枯病连作障碍严重地区的健康番茄植株的根际土壤。
[0012] 可选的，所述植株根际定植能力筛选包括以下步骤：
[0013] 将限菌条件下培养的植株芽浸泡在所述芽孢杆菌的混合菌悬液1中处理 25-35min后置于装有无菌营养液PNS及石英砂的组培瓶中培养，培养的条件为25°C下每天 12h光照，12h黑暗，连续培养6-8d获得植株幼苗；收集所述植株幼苗的根并浸泡于磷酸缓 冲液中，充分振荡混匀获得菌悬液2,然后将所得菌悬液2稀释涂布于LB培养基上，待在黑 暗中30°C恒温培养48h后，将所得菌落用磷酸缓冲液冲洗得到菌悬液3,最后挑选数量最多 且不同菌落形态的菌株为根部定殖能力强的芽孢杆菌。
[0014] 其中，优选利用相同的方法对菌悬液3再进行1-3轮植株根际定植能力筛选获得 根际定植能力强的芽孢杆菌。
[0015] 其中，所述挑选数量最多的菌株指代挑选稀释涂布过程中，数量级最高的芽孢杆 菌。
[0016] 可选的，所述平板对峙实验包括以下步骤：
[0017] 用无菌牙签挑取所述根际定植能力强的芽孢杆菌的单菌落点接到NA平板上，培 养12h后，用装有病原微生物菌悬液的喷瓶喷1次，30°C培养24h后测定抑菌圈直径，其中， 在所述病原微生物菌悬液中有效活菌数含量为l〇 1(lCFU/ml。
[0018] 可选的，可以对所述根际定植能力强的菌株进行进一步菌学鉴定，从而进行分类 筛选，例如可以通过鉴定进一步获得解淀粉芽孢杆菌菌株。
[0019] 在本发明所提供的方法中，所述芽孢杆菌包括但不限于定植于作物根际的有病原 微生物拮抗能力的芽孢杆菌。
[0020] 本发明还提供了利用所述筛选方法筛选得到的芽孢杆菌菌株。
[0021] 可选的，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌。
[0022] 本发明还提供了所述芽孢杆菌菌株在植物病原菌抑制中的应用。
[0023] 可选的，所述应用包括制备含有所述芽孢杆菌菌株的菌剂，其中，所述菌剂含有所 述芽孢杆菌的培养液。
[0024] 可选的，在所述菌剂中，芽孢杆菌的含量为1.0X109-1.0X101(lCFU/g。
[0025] 可选的，所述应用包括抑制番茄青枯菌、马铃薯立枯病病原菌、黄瓜立枯病菌、油 菜菌核病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花黄萎病菌或香蕉枯萎病菌。
[0026] 可选的，所述应用为抑制番茄青枯菌，促进番茄生长。
[0027] 利用本发明所提供的方法筛选得到的芽孢杆菌菌株不仅在平板培养时可高效抑 制微生物病原菌，而且在温室试验中其防治效果高达80%以上。筛选获得的芽孢杆菌作为 作物病害的有效生物防治材料，可以用于开发新的生物农药或生物防治菌剂，具有广阔的 应用前景。
【附图说明】
[0028] 图1为菌株T-5对番茄青枯病病原菌的抑制效果图。
【具体实施方式】
[0029] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给 出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在 不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0030] 实施例1
[0031] 实施例1用于说明本发明所述的芽孢杆菌菌株的筛选方法。
[0032] 1)取江苏省南京市麒麟镇番茄青枯病连作障碍严重的农田中健康番茄植株的根 际土壤10g，加入到装有90ml无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分摇动30min，使得样品 与无菌水混和均匀，制得样品悬液。
[0033] 2)将制得的样品悬液置于温度为80°C的水浴中加热30min，以杀死不产芽孢的细 菌和其他微生物，然后在无菌条件吸取Iml的样品悬液加入到装有9ml无菌水的试管中，振 荡均匀，制得1〇_ 2样品稀释液， 并依次稀释制得10 _3、1〇_4、1〇_5、1〇_6、1〇_ 7的稀释液。
[0034] 3)分别取10-4、10-5、ΚΓ6、KT 7浓度梯度的各样品稀释液0.1 ml涂布至相应制备好 的LB培养基平板上，30°C倒置培养48h。根据菌落形态特征挑取形态等形状差异比较明显 的菌落分别点接至同一 LB平板中，30°C倒置培养48h。
[0035] 4)待点接至同一 LB平板上的芽孢杆菌长出之后，用无菌的磷酸缓冲液冲洗所有 菌体，制备成混合菌液。然后接种至番茄根部进行富集培养。
[0036] 5)番茄植株限菌条件培养步骤：将番茄种子消毒，消毒方法：用70%的酒精浸泡 lmin，无菌水洗涤1次，再用3%的NaClO溶液浸泡5min，无菌水漂洗6次。将消毒好的种 子放入垫有无菌双蒸水浸湿滤纸的无菌平板中，在30°C的环境下催芽两天。将番茄芽再次 用以上方法消毒一次，即制备成无菌番茄芽。将消毒的番茄芽浸泡在上述混合菌液中处理 30min，以浸泡在无菌的磷酸缓冲液中的无菌番茄芽作对照。将消毒的番茄芽放入装有无菌 的营养液PNS及石英砂的组培瓶中培养。培养条件为25°C，12h光照，12h黑暗的光照培养 箱中培养7d。
[0037] 6)番茄根际定殖能力强的芽孢杆菌筛选。待番茄幼苗培养7d后，收集番茄根浸泡 于ImL磷酸缓冲液中，充分振荡混匀，然后将所得菌悬液稀释涂布于LB培养基上。待在黑 暗中30°C恒温培养48h后，将所得菌落用磷酸缓冲液（pH 7.0)冲洗得到菌悬液，重复上述 步骤4)和5)，重复3次，最后挑选数量最多且不同菌落形态的菌株为定殖能力强的芽孢杆 菌。
[0038] 7)平板对峙试验，采用点接喷雾法检测所筛选得到的番茄根际定殖能力强的芽孢 杆菌对番茄青枯菌的抑制能力。用无菌牙签挑取单菌落点接到NA平板上，培养12h后，用 装有病原菌QL-Rslll5菌悬液（10 1(lCFU/ml)喷瓶喷1次，30°C培养24h后测定抑菌圈直径。
[0039] 8)筛选得到在番茄根际定殖能力强且对番茄青枯病的病原菌青枯菌具有强烈抑 制作用的菌株T-5,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)，于2013年 12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 8547。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编 100101。
[0040] 本发明中，所述的解淀粉芽孢杆菌菌株T-5在LB平板上30°C培养24h后呈不规则 近圆形，不透明，边缘不光泽，表面干燥无褶皱，产芽孢，芽孢端生或近端生，细胞杆状，革兰 氏染色阳性。
[0041] 9)解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens) T-5菌株的生理生化特征：过 氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，甲基红试验阳性，V-P反应阳性，明胶水解阳性，纤维素分解 阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，不能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气， 能利用木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、D-果糖、D-木糖。
[0042] 上述LB培养基由以下成分组成：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸膏5g，水定容至 1L，调 pH 到 7. 0-7. 2。
[0043] 上述NA培养基由以下成分组成：葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏3g、酵母膏 〇· 5g、去离子水 lOOOmL，调节 pH 7. 2-7. 4。
[0044] 上述 PNS 营养液由以下成分组成：Imol L 1KNO3SmKlmol L 1Ca(NO3)2 · 4H20 2ml、 Imol T1MgSO4WH2O 2ml、20mmol EDTA-Fe 2.5ml、lmol Γ1 磷酸缓冲液（pH 5.5)2. 5ml、PNS microelements lml、加入到985ml去离子水中。
[0045] 实验例2
[0046] 实施例2用于说明利用本发明所述方法筛选获得的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)Τ_5产功能性物质的特性。
[0047] 1)产吲哚乙酸测定，菌株在含5mmol T1L-色氨酸的TSB培养基中摇床30°C培 养36h，菌悬液离心去除菌体，在ImL无菌滤液中加入2mL Salkawski显色剂，室温下显色 30min，如有粉色产生则说明有IAA产生。以培养基作为对照。
[0048] 2)产铁载体测定，将拮抗菌菌株点接于CAS平板上，待置30°C培养箱培养3-4d 后，观察是否有透明圈出现，如有则说明菌株具有产铁载体的能力。
[0049] 3)解磷能力测定，将拮抗菌接种到NBRIP培养基上，置30°C培养箱培养3d，看有无 透明圈出现，如有则说明菌株具有解磷能力。
[0050] 4)产氨测定
[0051] 分别将待测菌株接种于蛋白胨氨化培养基中，30°C培养24h。以不接种的蛋白胨 氨化培养基作对照。在培养液中加入3-5滴纳氏试剂，出现黄色或棕红色沉淀则为正反应。 未接种的培养基加入纳氏试剂后无黄色或棕红色沉淀出现。
[0052] 5)产 HCN 能力
[0053] 拮抗菌划线培养至含4. 4g Γ1氨基乙酸的TSA的培养基中，将在苦味酸溶液中浸 泡过的滤纸条放至平板中央，然后用封口膜将平板封严，平板置30°C培养箱培养3d。如滤 纸片由黄色变为褐色则说明菌株可以产生HCN。
[0054] 实验结果显示菌株T-5具备产吲哚乙酸、铁载体、氨以及解磷的能力，但不具备产 HCN的能力。
[0055] 上述TSB培养基由以下组分组成：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 5g、去离子水 lOOOmL、pH 7. 5。
[0056] 上述NBRIP培养基由以下组分组成：葡萄糖10g、AlP042g、（NH 4)2SO4O. 5g、NaCl 0· 2g、MgSO4O. lg、KCl 0· 2g、酵母浸膏 0· 5g、MnSO40.00 2g、FeSO40.00 2g、溴酚蓝（0· 4%，pH 6. 7)6mL、琼脂20g、去离子水1000 mUpH自然。
[0057] 上述纳氏试剂由以下组分组成：甲液（碘化钾10. 0g、蒸馏水100.0 mL、碘化汞 20.0 g)乙液（氢氧化钾20. 0g、蒸馏水100mL。）分别配制甲、乙两液，待冷却后混合，保存 于棕色瓶中。
[0058] 上述蛋白胨氨化培养基以下组分组成：蛋白胨5g、KH2PO4O. 5g、K2HPO4O. 5g、 MgSO4O. 5g、蒸馏水 1000 mUpH 7· 0-7. 2。
[0059] 上述CAS蓝色检测液以下组分组成：溶液Α:将0.07g的CAS(铬天青，Chrome azurol sulphonate)溶于 50mL 去离子水中，再加入 10mT, lmmol I71 的 FeCl 3(含有 IOmmol L-1的HC1);溶液B :将0. 06g的HDTMA (溴化十六碳烷基三甲铵）溶于40mL去离子水中；溶 液C :将A溶液沿着烧杯的壁缓缓加入到B溶液中，二者充分混合均匀即得CAS蓝色检测液。
[0060] 上述Salkowski显色液溶液以下组分组成：lmL 0· 5mol L4FeCl3加入到50mL 35%的HClO4溶液中；溶液B :I. 2%的FeCl 3加入到37%的H2S04中。
[0061] 上述苦味酸溶液以下组分组成：2. 5g苦味酸，12. 5g Na2CO3, 1000 mL蒸馏水。
[0062] 实验例3
[0063] 实施例3用于说明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)T_5对番前青 枯病的抑制。
[0064] 1)菌液准备，取本发明所述的解淀粉芽孢杆菌T-5菌株（利福平标记）在LB液体 培养基中30°C，180r mirT1振荡培养48h，7000Xg离心10min获得菌体，无菌水稀释，用平 板稀释涂布法测定菌悬液中菌体浓度，菌悬液中有效活菌数含量为l〇 1(lCFU/g，菌悬液4°C 保藏待用。
[0065] 挑取番茄青枯病病原菌青枯菌单 菌落接种至NA培养液中，于30°C，180r mirT1振 荡培养48h，5000 X g离心10min获得菌体，无菌水稀释，用平板稀释涂布法测定菌悬液中菌 体浓度，菌悬液4°C保藏待用。
[0066] 2)番茄种子及盆栽土壤准备，将番茄种子消毒，用70%的酒精浸泡lmin，无菌水 洗涤1次，再用3%的NaClO溶液浸泡5min，无菌水漂洗6次。将消毒好的种子放入垫有无 菌双蒸水浸湿滤纸的无菌平板中，在30°C的环境下催芽两天。将萌发的番茄幼苗做相应处 理后播种于装有3kg菜园土盆钵中，每盆4粒种子，待幼苗长出后间苗，每盆留两株长势一 致的幼苗。
[0067] 3)试验设计2个处理，Tl :不接种拮抗菌；T2 :每盆中浇灌拮抗菌菌悬液，使土壤 中含拮抗菌菌液浓度为IO8CFU g4干土；病原菌接种浓度为10 6CFU g4干土，每个处理重复 10盆，每盆2株苗。
[0068] 4)定期观察青枯病发病状况，统计发病率，最后采收后计算不同处理的生物量差 异。对利福平标记的T-5菌株在番茄根部的定殖数量进行测定。菌株T-5对番茄青枯病病 原菌的抑制效果图见图1。
[0069] 5)施用本发明的生防菌T-5能够显著降低番茄青枯病的发病率，接种了 T-5菌株 的处理T2发病率只有6. 7 %，而对照处理Tl的发病率高达65. 0 %，防治率达到82. 0 %。T-5 菌株在番茄根部的定殖数量多且较为稳定，达到l〇7CFU/g干重土（表1)。另外，T-5菌株 能够促进番茄的生长（表1T-5的定殖数量及对番茄的生物量的影响）。
[0070] 表 1
[0071]
[0072] 上述LB培养基由以下成分组成：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸膏5g，水定容至 1L，调 pH 到 7. 0-7. 2。
[0073] 上述NA培养基由以下成分组成：葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏3g、酵母膏 〇· 5g、去离子水 lOOOmL，调节 pH 7. 2-7. 4。
[0074] 实验例4
[0075] 实施例4用于说明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens) T-5对多种病 原菌的拮抗作用。
[0076] 采用对峙培养法，用直径为5mm的打孔器分别在培养好的6种植物病原真菌（马铃 薯立枯病病原菌 Rhizoctonia Solani Ktihn of potato (RP)、黄瓜立枯病菌 Rhizoctonia solani Kilhn of cucumber (RC)、油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bar (SR)、黄瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum (FC)、棉花黄萎病菌 Verticillium dahliae Kleb (VC)、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FB)) 的菌落边缘取菌块，将菌块接种到PDA培养基平板中央，然后把解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens) T-5接种至距离中央距离相等的位置，重复3次，之后置于温度为28°C 的恒温箱中培养，观察抑菌效果，计算病原菌生长的抑制率，结果如表2所示，表2为解淀粉 芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)T_5对多种病原菌的抑制作用。
[0077] 上述所用PDA培养液配置方法为（以配置IL培养基为例）：用200g 土豆削皮后切 成小块放入到500mL水中，加热煮沸30min，经过滤后滤液中加入20g鹿糖，定容至lOOOmL， pH 值调至 7. 0-7. 4,115°C灭菌 30min。
[0078] 表 2
[0079]
[0080] 结果表明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquifaciens)T_5能够有效抑制马铃 薯立枯病病原菌、黄瓜立枯病菌、油菜菌核病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花黄萎病菌和香蕉枯萎 病菌。
[0081] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述方法包括菌株的植物根际定殖能力筛 选和菌株对病原微生物拮抗能力筛选。2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 芽孢杆菌的筛选：将采集的土壤样品稀释得到菌悬液，将菌悬液涂布于制备好的LB 培养基平板上，然后倒置于30°C培养箱中培养48h，挑取不同形态的、生长良好的单菌落反 复划线，纯化分离菌株，并将所获得的单菌落转接至LB培养基斜面上，30°C恒温培养48h， 筛选获得芽孢杆菌； 2) 植株根际定殖能力筛选及病原微生物拮抗能力筛选：将筛选出来的芽孢杆菌在LB 培养基上划线培养后用无菌的磷酸缓冲液冲洗获得芽孢杆菌的混合菌悬液1，然后再将混 合菌悬液1接种至限菌条件下培养的植株根际，在植株根际培养一周后再将植株根际的芽 孢杆菌分离培养，筛选出数量最多的芽孢杆菌获得植株根际定殖能力强的菌株；再将植株 根际定殖能力强的芽孢杆菌与病原微生物进行室内平板对峙试验，挑选抑菌圈大的菌株， 即为对病原微生物具有强拮抗能力的菌株。3. 根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述植株根际定植能力筛选包括 以下步骤： 将限菌条件下培养的植株芽浸泡在所述芽孢杆菌的混合菌悬液1中处理25-35min后 置于装有无菌营养液PNS及石英砂的组培瓶中培养，培养的条件为25°C下每天12h光照， 12h黑暗，连续培养6-8d获得植株幼苗；收集所述植株幼苗的根并浸泡于磷酸缓冲液中，充 分振荡混匀获得菌悬液2,然后将所得菌悬液2稀释涂布于LB培养基上，待在黑暗中30°C 恒温培养48h后，将所得菌落用磷酸缓冲液冲洗得到菌悬液3,最后挑选数量最多且不同菌 落形态的菌株为根部定殖能力强的芽孢杆菌。4. 根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述平板对峙实验包括以下步骤： 用无菌牙签挑取所述根际定植能力强的芽孢杆菌的单菌落点接到NA平板上，培养12h 后，用装有病原微生物菌悬液的喷瓶喷1次，30°C培养24h后测定抑菌圈直径，其中，在所述 病原微生物菌悬液中有效活菌数含量为l〇1(lCFU/ml。5. 利用权利要求1-4中任意一项所述的筛选方法筛选得到的芽孢杆菌菌株。6. 根据权利要求5所述的芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆 菌。7. 权利要求1-4中任意一项所述的筛选方法或权利要求5-6中任意一项所述的芽孢杆 菌菌株在植物病原菌抑制中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，包括制备含有所述芽孢杆菌菌株的菌剂，其中，所述菌 剂含有所述芽孢杆菌的培养液。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在所述菌剂中，芽孢杆菌的含量为 I.OXlO9-LOX101(lCFU/g〇10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述应用包括抑制番茄青枯菌、马铃 薯立枯病病原菌、黄瓜立枯病菌、油菜菌核病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花黄萎病菌或香蕉枯萎 病菌。
【专利摘要】本发明提供了一种芽孢杆菌的筛选方法，所述方法包括菌株的植物根际定殖能力筛选和菌株对病原微生物拮抗能力筛选。利用本发明所提供的方法筛选得到的芽孢杆菌菌株不仅在平板培养时可高效抑制微生物病原菌，而且在温室试验中其防治效果高达80％以上。筛选获得的芽孢杆菌作为作物病害的有效生物防治材料，可以用于开发新的生物农药或生物防治菌剂，具有广阔的应用前景。CGMCC No. 854720131206
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/07, C12Q1/04, A01P3/00
【公开号】CN104894035
【申请号】CN201510366238
【发明人】谭石勇, 谭武贵, 周亮, 余佳玲
【申请人】湖南泰谷生物科技股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月29日
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