一种干酪发酵剂与其制备方法和应用
一种干酪发酵剂与其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及乳制品领域，具体涉及一种干酪发酵剂与其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 干酪，又名奶酪，有各式各样的味道、口感和形式。干酪以奶类为原料，含有丰富的 蛋白质和脂质，具有很高的营养价值。随着我国人民生活水平的提高，对干酪的需求量越来 越多。在干酪生产和成熟过程中微生物菌群起着重要的作用，促进了产品的质构和风味的 形成。干酪的干酪发酵剂对干酪质构和特征风味的形成起了极其重要的作用。干酪发酵剂 在干酪生产过程中产酸，能够提高凝乳酶的活性，有助于排除乳清、抑制有害细菌生长，并 产生各种酶参与干酪特征风味与质构的形成。
[0003] 在干酪用乳酸菌的筛选过程中，由于筛选的菌群数量比较多，而为了达到对优良 特性菌株的有效筛选，需要优化筛选步骤，国际上一般是通过对大批量的菌进行筛选，选取 性能优异的菌种进行组合使用，通过会将2-6株菌进行组合，以弥补单株菌在产酸、产香等 方面的缺陷，同时这些菌必须共生性良好，才能用于开发成干酪发酵剂。由于干酪用菌的筛 选、组合、制备发酵剂等技术细节都被国外商业菌种公司所掌握。如何确定指标，确定方法， 筛选出优异的菌种，如何组合菌株，开发成优良的干酪发酵剂在国内基本处于空白。
[0004] 中国地大物博，菌种资源丰富，特色乳制品也异常丰富，从中筛选出适合干酪用的 菌株，并组合成发酵剂，可以用于开发中国化的干酪。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对目前缺乏用于干酪生产的嗜温性发酵剂，同 时难以结合将快速产酸型发酵剂和产香型发酵剂以应用于干酪制备中的不足，提供一种干 酪发酵剂与其制备方法和应用。所述的干酪发酵剂能够利用于干酪，尤其是高达干酪的制 备，兼顾了干酪制备中产酸快和产香的要求，蛋白水解能力强，风味物质各组分平衡结果 好。所述的制备方法操作简便易行，便于使所述干酪发酵剂应用于工业化大规模制备干酪 中。
[0006] 本发明提供一种干酪发酵剂，其包括乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp. lactis) CGMCC No. 10752 (BD401)、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) CGMCC No. 10749 (BD2263)、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)CGMCC No. 10751 (BD164)和肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)CGMCC No. 10750(LM79)，所述乳酸乳球菌乳酸亚种 CGMCC No. 10752、所述 乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和所述肠 膜明串珠菌CGMCC No. 10750的活菌数比例为（0· 5~I) : (1~L 5) : (1~2) : (1~2)。
[0007] 较佳地，所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述 乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠膜明串珠菌LM79的活菌数比例为1:1:1:1。
[0008] 较佳地，所述的干酪发酵剂还包括辅料。所述的辅料为本领域常规的辅料，用于干 酪发酵剂的制备即可。较佳地包括水、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、明胶、甘油、山梨醇、 海藻糖、酵母膏和β-环糊精中的一种或多种。
[0009] 所述的干酪发酵剂的形式为本领域常规的形式，较佳地为液体发酵剂、冷冻发酵 剂或直投式发酵剂，更佳地为直投式发酵剂，即所述的干酪发酵剂无需对其进行活化、扩大 培养等预处理步骤而直接投入发酵基质使用。
[0010] 本发明提供一种干酪发酵剂的制备方法，其包括以下的步骤：
[0011] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750接种于 培养基中，获得培养物；
[0012] (2)从步骤（1)所得的培养物中获得乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、乳酸 乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌 CGMCC No. 10750,按照乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750的活菌 数为（0. 5~I) : (1~1. 5) : (1~2) : (1~2)的比例混合。
[0013] 步骤（1)为：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750接种于 培养基中，获得培养物。其中，较佳地，所述的接种前包括活化的步骤。所述活化的代数为 本领域常规的代数，较佳地为2~3代。所述活化的培养基为本领域常规的培养基，能够生 长所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD164和所述肠膜明串珠菌LM79即可，较佳地为脱脂乳培养基，更佳地为10%脱脂 乳培养基，所述的脱脂乳培养基由乳粉溶解于水后混合获得，所述的百分比为所述乳粉占 所述乳粉和所述水的总质量的质量百分比。所述活化的温度为本领域常规的温度，较佳地 为28~32°C。所述活化的时间为本领域常规的时间，较佳地为16~24小时。所述的培养 基为本领域常规的培养基，能够扩大培养所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌 乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠膜明串珠菌LM79即可，较佳地 为脱脂乳培养基，更佳地为10%脱脂乳培养基，所述百分比为质量体积百分比。所述培养的 温度为本领域常规的温度，较佳地为28~32°C。所述培养的时间为本领域常规的时间，较 佳地为16~24小时。所述培养的次数为本领域常规的次数，较佳地为2~3次。
[0014] 步骤（2)为：从步骤（1)所得的培养物中获得乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和 肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750,按照乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌 乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750的活菌数为（0. 5~I) : (1~1. 5) : (1~2) : (1~2)的比例混合。其中，较佳地， 按照乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳 球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750的活菌数为1:1:1:1的比 例混合。
[0015] 较佳地，步骤（2)完成后还包括以下步骤：加入辅料，混合。
[0016] 其中，所述的辅料为本领域常规的辅料，较佳地包括水、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、谷 氨酸钠、明胶、甘油、山梨醇、海藻糖、酵母膏和环糊精中的一种或多种。
[0017] 本发明提供一种所述的干酪发酵剂在制备干酪中的应用。
[0018] 所述的干酪为本领域常规的干酪，较佳地为高达干酪、切达干酪和帕马森干酪。更 佳地为高达干酪。
[0019] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0020] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0021] 本发明的积极进步效果在于：本发明所述的干酪发酵剂能够制备干酪，其所制得 的干酪在感官评价、质构等方面与商业发酵剂所制得的干酪相差无几，令人满意。同时所述 的干酪发酵剂通过选择合适的发酵菌株（从41株乳酸乳球菌和47株肠膜明串珠菌菌株中 初选出8株适应于干酪成熟环境的乳酸乳球菌菌株，兼顾到与肠膜明串珠菌和其他乳酸乳 球菌菌株的共生，最终选择了所述干酪剂中的所涉及的菌株），以及发酵菌株之间的比例关 系，妥善地解决了现有技术中难以结合快速产酸型发酵剂和产香型发酵剂的不足，同时利 用发酵菌株之间良好的互生作用，使得所述的干酪发酵剂可用作加工干酪的发酵剂。此外， 所述的制备方法简便易行，能够大规模地批量生产干酪发酵剂，从而使干酪发酵剂运用于 乳制品的实际生产中。
[0022] 牛物材料保藏信息
[0023] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD164,已于2015年4月27日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10751，培养物名称是BD164,分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0024] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD401，已于2015年4月27日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10752,培养物名称是BD401，分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0025] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263,已于2015年4月27保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10749,培养物名称是BD2263,分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0026] 本发明的肠膜明串珠菌LM79,已于2015年4月27日保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮 编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10750,培养物名称是LM79肠膜明串珠菌，分类命名是 Leuconostoc mesenteroides。
【附图说明】
[0027] 图1为pH4. 6水不溶性蛋白的SDS-PAGE图谱，其中对照为对照组，2为实 施例7， 标记为标准Marker，a -CN和β -CN分别表示a -CN蛋白和β -CN蛋白所对应的条带。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0029] 实施例1干酪发酵剂的制备
[0030] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即 得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分 比）中，置于30°C恒温培养箱培养24小时，活化2代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳培养基中，置于30°C恒温培养箱培养24小 时进行扩大培养，重复3次，获得培养物。
[0031] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为1: 1: 1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0032] 实施例2干酪发酵剂的制备
[0033] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（购自新西兰Westland合作乳业有限公司）中，置于28°C恒温培养箱培养24小时， 活化3代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的 脱脂乳培养基中，置于28°C恒温培养箱培养24小时进行扩大培养，重复2次，获得培养物。
[0034] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为0. 5:1. 5:2:2的比例混合，得干酪发酵剂。
[0035] 实施例3干酪发酵剂的制备
[0036] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（购自新西兰Westland合作乳业有限公司）中，置于32°C恒温培养箱培养16小时， 活化3代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的 脱脂乳培养基中，置于32°C恒温培养箱培养16小时进行扩大培养，重复3次，获得培养物。
[0037] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为0. 5:1:1:2的比例混合，得干酪发酵剂。
[0038] 实施例4干酪发酵剂的制备
[0039] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（购自新西兰Westland合作乳业有限公司）中，置于32°C恒温培养箱培养16小时， 活化3代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的 脱脂乳培养基中，置于32°C恒温培养箱培养16小时进行扩大培养，重复3次，获得培养物。
[0040] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为0. 5:1:1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0041] 实施例5干酪发酵剂生产高达干酪
[0042] DlOOkg鲜牛乳（购自金山牧场）经过滤，添加0.01 %氯化钙，搅拌均匀，在72°C， 15s巴氏杀菌后冷却至30°C，所述百分比为质量百分比。将实施例1制得的干酪发酵剂倒 入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 7cfu/mL，缓慢搅拌 15min。静置28°C发酵至pH降低0. 1之后加入20mg/100L凝乳酶（购自丹尼斯克公司） (其中，凝乳酶在使用前用10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），30min后得 凝乳。
[0043] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长5mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后15min后排 出总体积35%的乳清；分2次加入50°C、体积为鲜牛乳总体积25%的水，搅拌20min至凝 块温度达到35°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水12°C盐渍20h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，10°C、湿度90% RH，成熟4周，即得年轻高达干酪。
[0044] 所得的年轻高达干酪质地光滑紧密，富有弹性，外壳色黄且随成熟期由薄变厚，切 面上可有不规则的小孔，气味温和，具有奶油熔化的香气，并伴随轻微坚果的风味。
[0045] 实施例6干酪发酵剂生产高达干酪
[0046] DlOOkg鲜牛乳（购自金山牧场）经过滤，添加0.02%氯化钙，搅拌均匀，在72°C， 15s巴氏杀菌后冷却至30°C，所述百分比为质量百分比。将实施例1制得的干酪发酵剂倒 入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 6cfu/mL，缓慢搅拌 lOmin。静置35°C发酵至pH降低0· 2之后加入20mg/100L凝乳酶（购自科汉森公司）（其 中，凝乳酶在使用前用10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），40min后得凝 乳。
[0047] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长15mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后20min后 排出总体积45%的乳清；一次加入60°C、体积为鲜牛乳总体积40%的水，搅拌30min至凝 块温度达到38°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水15°C盐渍18h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，15°C、湿度90% RH，成熟17周，即得成熟高达干酪。
[0048] 实施例7干酪发酵剂生产高达干酪
[0049] DlOOkg复原乳（15%牛奶奶粉加水获得，所述百分比为质量百分比，所述牛奶奶 粉购自光明乳业）经过滤，添加〇. 01%氯化钙，搅拌均匀，在72°c，15s巴氏杀菌后冷却至 30°C，所述百分比为质量百分比。将实施例1制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳 中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 7cfu/mL，缓慢搅拌15min。静置32°C发酵至 PH降低0· 2之后加入20mg/100L凝乳酶（购自丹尼斯克公司）（其中，凝乳酶在使用前用 10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），30min后得凝乳。
[0050] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长5mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后15min后排 出总体积35%的乳清；分2次加入50°C、体积为鲜牛乳总体积25%的水，搅拌20min至凝 块温度达到35°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水12°C盐渍20h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，10°C、湿度90% RH，成熟5周，即得年轻高达干酪。
[0051] 实施例8干酪发酵剂生产高达干酪
[0052] DlOOkg鲜牛乳（购自金山牧场）经过滤，添加0.01 %氯化钙，搅拌均匀，在72°C， 15s巴氏杀菌后冷却至30°C，所述百分比为质量百分比。将实施例1制得的干酪发酵剂倒 入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 7cfu/mL，缓慢搅拌 15min。静置30°C发酵至pH降低0. 1之后加入20mg/100L凝乳酶（购自丹尼斯克公司） (其中，凝乳酶在使用前用10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），30min后得 凝乳。
[0053] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长5mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后15min后排 出总体积35%的乳清；分2次加入50°C、体积为鲜牛乳总体积25%的水，搅拌20min至凝 块温度达到35°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水12°C盐渍20h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，l〇°C、湿度90% RH，成熟15周，即得成熟高达干酪。
[0054] 实施例9干酪发酵剂制备切达干酪
[0055] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0056] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长IOmm的立方体的凝块，放置，以1°C /5min速 率升温至38°C，在该温度保持至乳清酸度为0. 20%，排乳清；堆酿，翻转2次；切块，加食用 氯化钠细粒1.5%，所述百分比为占干酪总质量的质量百分比，之后装模，真空包装，7°C成 熟12周即可。
[0057] 实施例10干酪发酵剂制备切达干酪
[0058] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0059] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长8mm的立方体的凝块，放置，以1°C /5min速 率升温至40°C，在该温度保持至乳清酸度为0. 22%，排乳清；堆酿，翻转3次；切块，加食用 氯化钠细粒2%，所述百分比为占干酪总质量的质量百分比之后装模，真空包装，KTC成熟 3周即可。
[0060] 实施例11干酪发酵剂 制备切达干酪
[0061] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0062] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长12mm的立方体的凝块，放置，以1°C /5min速 率升温至38°C，在该温度保持至乳清酸度为0. 20%，排乳清，堆酿，翻转2次，切块加盐，之 后装模，真空包装，7°C成熟12周即可。
[0063] 实施例12干酪发酵剂制备帕马森干酪
[0064] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0065] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长3mm的立方体的凝块，搅拌lOmin。以 I°C /5min速率升温至44°C，保温lOmin，然后继续升温至54°C保温5min，搅拌20min，静置 20min，加盖。排乳清，立即进行装模压榨，25°C发酵24h。在KTC饱和盐水中浸16天。然 后在相对湿度40%条件下干燥1天。16°C成熟6个月，即可。
[0066] 实施例13干酪发酵剂制备帕马森干酪 [0067] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0068] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长4_的立方体的凝块，搅拌15min。以 2°C /5min速率升温至44°C，保温20min，然后继续升温至54°C保温lOmin，搅拌lOmin，静置 20min，加盖。排乳清，立即进行装模压榨，25°C发酵24h。在16°C饱和盐水中浸10天。然 后在相对湿度65%条件下干燥2天。KTC成熟6月，即可。
[0069] 对比例1
[0070] A、干酪发酵剂的制备
[0071] (1)与实施例1步骤（1)完全相同。
[0072] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为2:2:1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0073] B、干酪发酵剂生产高达干酪
[0074] 将对比例1步骤A制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，其余步骤与实 施例7完全相同。即得年轻高达干酪。
[0075] 对比例2
[0076] A、干酪发酵剂的制备
[0077] (1)与实施例1步骤（1)完全相同。
[0078] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为0. 5:1:3:3的比例混合，得干酪发酵剂。
[0079] B、干酪发酵剂生产高达干酪
[0080] 将对比例2步骤A制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，其余步骤与实 施例7完全相同。即得年轻高达干酪。
[0081] 对比例3
[0082] A、干酪发酵剂的制备
[0083] (1)与实施例1步骤（1)完全相同。
[0084] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为1: 1: 1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0085] B、干酪发酵剂生产高达干酪
[0086] 将对比例3步骤A制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，其余步骤与实 施例7完全相同。即得年轻高达干酪。
[0087] 对比例4
[0088] A、干酪发酵剂的制备
[0089] (1)与实施例1步骤（1)完全相同。
[0090] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD164、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和所述 肠膜明串珠菌LM79的活菌数为1: 1: 1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0091] B、干酪发酵剂生产高达干酪
[0092] 将对比例4步骤A制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，其余步骤与实 施例7完全相同。即得年轻高达干酪。
[0093] 效果实施例1干酪的理化成分分析
[0094] a)、pH
[0095] 在干酪成熟第1(1、7(1、14(1、21(1、28(1、35(1和42(1分别取1(^实施例7所制得的干酪， 加入IOmL水，匀浆（6000r/min)5min，使用pH计（购自瑞士 METTLER公司）测定混合物的 pH值，结果如表1所示。
[0096] 表1干酪在成熟期间的pH变化
[0097]
[0098] 表1说明，在成熟期1~4周内，干酪的pH值从第Id的5. 4开始平稳下降，在第4 周（第28d)时降到最低，随后缓慢上升。这是由于在干酪成熟过程中，乳酸菌分解乳糖产 生的乳酸逐渐被消耗，干酪的PH值呈现缓慢上升趋势，到达一定水平后趋于平稳。
[0099] b)、水分
[0100] 通过水分测定仪MB 45(购自Ohaus仪器（上海）有限公司）测定干酪中的水分 含量。在称量皿中准确称量第42d的实施例7所制得的干酪3g，切碎后置于样品盘中，关紧 封盖，样品的模式选项中设置为CHEESE模式，待屏幕显示样品初始重量后，表示可以运行， 按Start/Stop (开始/停止键），水分测定仪开始干燥与测量过程。待运行完成后，重复按 Display显示键，屏幕显示结果并记录数据，结果如表2所示。其中，对照组为使用直投式发 酵剂CH00ZIT RM 32 (购自丹尼克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制 得的干酪。
[0101] C)、盐度
[0102] 将干酪样品于研钵中研碎，准确称取5g实施例7所制得的干酪于分液漏斗中，用 热水反复洗涤干酪内的盐分，反复洗涤7次，每次加入热水25mL，将洗涤液收集在250mL的 容量瓶中并用蒸馏水定容，取IOOmL洗涤液置于250mL锥形瓶中，以铬酸钾（ImL)作为显色 指示剂，用硝酸银（〇. IN)溶液滴定至变为砖红色为止，记录消耗的体积V，重复3次，取平均 值，结果如表2所示。
[0103]
[0104] V - AgNO^消耗量（mL)
[0105] W-干酪样品的重量（g)
[0106] V1-洗涤液定容的总量（mL)
[0107] V2-滴定使用的洗液量（mL)
[0108] d)、脂肪
[0109] 准确称取1.0 Og研碎的实施例7所制得的干酪，加入IOmL 60°C温水，置于60°C水 浴中使其溶解，加入I. 25mL氨水，充分混匀后，于60°C水浴保持5min，振摇2min，加入IOmL 乙醇，充分摇勾，置于冷水中快速冷却后加入25mL乙醚，振摇0. 5min加入25mL石油醚，振 摇0.5min，静置30in，待上层液澄清时，读取醚层体积。将醚层放出至已恒重的烧杯中，置 于沸水浴中挥干醚类物质，于l〇〇°C烘箱中干燥Ih后称量，再次置于烘箱中干燥40min后称 量，前后两次质量差不得超过lmg。按如下的公式进行计算，结果如表2所示。
[0110] X-样品中脂肪含量，单位％
[0111] m。一烧杯质量，单位g
[0112] HI1-烧杯加脂肪的质量，单位g
[0113] m-样品质量，单位g
[0114] V-读取醚层的体积，单位mL
[0115] 表2干酪的理化成分测定结果
[0118] e)、蛋白质的含量及其水解程度
[0119] 总氮测定（TN):凯氏定氮法，参照GB5009. 5-2010,蛋白质的换算系数为6. 38。
[0120] 分别在第三周（21d)、第六周（42d)对实施例7所制得的干酪取样，测定实施例7 所制得的干酪中ρΗ4· 6可溶性氮含量（pH 4. 6 soluble nitrogen，即pH 4. 6SN)、12% TCA 可溶性氮含量（12% TCA soluble nitrogen，即 12% TCA-SN ;又称非蛋白氮，non protein nitrogen，即NPN)和5%磷钨酸可溶性氮（TCA-SN)的变化情况。
[0121] 具体操作如下：
[0122] 1)ρΗ4. 6可溶性氮（pH4. 6 SN)测定：取IOg实施例7所制得的干酪加入40mL去 离子水，用高速捣碎机进行匀浆，在55°C条件下温育Ih并调pH为4. 6。然后在3000g，4°C 下离心30min，去上层脂肪，收集离心沉淀于离心管中，-20°C保存用于SDS-PAGE分析，上清 液过滤（中速定量滤纸）后，再使用What man#42滤纸（购自Whatman公司）过滤，取IOmL 滤液进行定氮。
[0123] 2) 12%三氯乙酸可溶性氮（TCA-SN)测定：24%三氯乙酸溶液25mL和25mL pH4. 6 的步骤1)所得的滤液，室温静置lh，再通过Whatman#42滤纸过滤，取25mL滤液进行定氮。
[0124] 3) 5%磷钨酸可溶性氮（PTA-SN)测定：将5mL pH 4. 6步骤1)所得的滤液、3. 5mL 3. 95M硫酸溶液和I. 5mL 33. 3%磷鹤酸溶液混合均勾，置于4<€下过夜，通过11^1：1]^11#42滤 纸过滤，取IOmL滤液进行定氮。
[0125] 结果如表3所示，其中，对照组为使用直投式发酵剂CH00ZIT RM 32(购自丹尼克 斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得的干酪。
[0126] 表3干酪成熟过程中蛋白质水解程度的变化
[0127]
[0128] 其中，a、b、c和d表不存在着显著性差异（p < 0. 05)。
[0129] 表3说明，在干酪成熟过程中SN呈现明显增长的趋势，这说明随着成熟时间的进 行，干酪内的大分子多肽发生了强烈的降解；在干酪成熟过程中TCA-SN呈现明显增长的趋 势，并且成熟期第3周时均较对照组 干酪高，而在第6周时又趋于接近，无显著性差异（p > 0.05);在干酪成熟过程中PTA-SN呈现明显增长的趋势，这说明随着成熟时间的进行，干酪 内的多肽等逐渐降解为氨基酸，而对比对照组干酪，在第3和6周时，其PTA-SN/TN较高，并 且两者存在着显著性差异（P < 0. 05)。而对比例3、4在多项指标上均低于对照样，特别是 六周成熟的情况较差，蛋白分解缓慢，产生的风味物质不足。
[0130] f)、水不溶性蛋白SDS-PAGE
[0131] 取存放于-20°C的步骤e)获得的pH 4. 6不溶性蛋白（0. 2g)溶解于IOmL实施例7 所制得的干酪的溶解溶液中（即浓盐酸〇. 4mL、巯基乙醇0. 7mL、三羟甲基氨基甲烷0. 75g、 尿素49g和溴酚蓝0. 15g溶解于IOOmL超纯水中，将实施例7所制得的干酪溶解于上述溶 液），50°C温育40min，得温育液。然后取ImL所述的温育液，lOOOOr/min离心5min，取5 μ L 上清液作为上样液。分离胶和浓缩胶的浓度分别为15%和5%，具体见表4。电压条件先 设置为120V，直至蓝色条带跑到浓缩胶底部再将后电压调节IOOV至蓝色条带跑到胶底部。 用考马斯亮蓝R-250 (购自国药试剂）染色2h，然后在摇床中用脱色液浸泡，脱色过夜至背 景清晰为止，结果如附图1所示。其中，对照组为使用直投式发酵剂CHOOZIT RM 32(购自 丹尼克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得的干酪。
[0132] 表4分离胶和浓缩胶成分表
[0133]
[0134] 由图1可知，在干酪成熟过程中，蛋白的各种分解产物逐渐产生和积累。在干酪成 熟第6周（第42d)时实施例7与对照组的a -CN的电泳带无明显区别，实施例7与对照组 的β -CN电泳带颜色接近。
[0135] 效果实施例2干酪的挥发性风味物质分析
[0136] 固相微萃取SPME条件：取实施例7所制得的干酪5g，30°C恒温水浴lOmin，使用 IOOum的PDMS固相微萃取头（购自美国Supelco公司）吸附，吸附时间为30min。
[0137] 程序升温条件设置：进样后以60°C作为初始温度保持5min，以5°C /min升温至 120°C保持5min，以8°C /min升温至240°C保持lOmin，运行总时间为47min ;色谱柱型号 DB-5-MS，进样口温度250°C，离子源EI，四级杆温度150°C，传输线温度280°C，载气为He，进 样模式选择不分流进样，流速lmL/min，电离方式EI 70eV，质量扫描范围35~350m/z，结 果如表5所示，表5中数值的单位为丰度。其中，对照组为使用直投式发酵剂CHOOZIT RM 32(购自丹尼克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得的干酪。
[0138] 表5干酪主要挥发性风味物质的测定结果
[0139]
[0140] 由表5可知，酮、酸及酯类化合物是干酪风味的主要来源，其中对干酪特征风味组 分贡献最大的化合物有7种，即已烷、2-戊酮、丁酸乙酯、正丁醇、庚酮、草酰乙酸和丁酸。酮 类物质的风味阈值较低，且在实施例7所制得的干酪中具有相对较高的丰度，对干酪的风 味整体贡献较大。其中，3-羟基-2- 丁酮还赋予了高达干酪独特的奶香味和脂肪味，并且其 含量在本实施例中也高于对照组。
[0141] 效果实施例3干酪的感官评价
[0142] 本次感官评定人员包括12名从事食品研宄的人员，均熟悉感官评定注意事项和 评分标准。总分为50分，分数评定遵照表6。各评定员独立进行评定，每次更换样品时使用 清水漱口，结果如表7所示。其中，对照组为使用直投式发酵剂CH00ZIT RM 32(购自丹尼 克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得的干酪。
[0143] 表6干酪感官评定方法
[0144]
[0145] 表7干酪感官评定结果
[0146]
[0148] 表7的结果说明，在滋气味与质地的总评分中，效果实施例7所得的干酪比商业发 酵剂制作的高达干酪（对照组）都要略胜一筹。因此，效果实施例7所得的干酪具有良好 的质地以及更好的滋气味。
[0149] 效果实施例4干酪的质地
[0150] 干酪样品为成熟60d的实施例7所制得的干酪，采用TA-Hdi型质构分析仪（购 自英国Stable Micro Systems公司）。用取样器对干酪进行切割，形成直径和高度分别为 3cm、I. 5cm的圆柱体小块，置于lock盒内，于4°C冰箱中保存4h。
[0151] 测定参数：测量前探头下降速率lmm/s ;测试速率lmm/s ;测试后探头回程速率 lmm/s;下压距离6mm;下压变形：50%;触发力：5g;探头类型P/5。每组测定15次。干酪的 功能特性数据（硬度、弹性、凝聚性、黏着性和咀嚼性等）使用质构分析仪（TA-Hdi型）自 带数据处理软件E Xponent5. 0进行处理，结果如表8所示。其中，对照组为使用直投式发酵 剂CH00ZIT RM 32 (购自丹尼克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得 的干酪。
[0152] 表8干酪质构测试结果
[0153]
[0154]
[0155] 表8说明，实施例7所得的干酪在硬度、弹性、咀嚼性和黏着性等指标上与对照组 干酪无显著差异，仅硬度比对照干酪稍高，说明实施例1所述的干酪发酵剂所制作的干酪 (即实施例7所得的干酪）在质构方面符合高达干酪的要求，具有开发成干酪发酵剂的潜 力。
[0156] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种干酪发酵剂，其特征在于，其包括乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis)CGMCCNo. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种（LactococcusIactis subsp.lactis)CGMCCNo. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp. lactis)CGMCCNo. 10751 和肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides)CGMCCNo. 10750， 所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、所 述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10748和所述肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750的活菌数比 例为（0? 5 ~I) : (1~L5) : (1 ~2) : (1 ~2)。2. 如权利要求1所述的干酪发酵剂，其特征在于，所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和所述肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750的活菌数比例为1:1:1:1。3. 如权利要求1所述的干酪发酵剂，其特征在于，其还包括辅料。4. 一种干酪发酵剂的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤： (1) 将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、乳 酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10751和肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750接种于培养基中，获 得培养物； (2) 从步骤（1)所得的培养物中获得乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、乳酸乳 球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10748和肠膜明串珠菌 CGMCCNo. 10750,按照乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10751和肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750的活菌 数为（0. 5~I) : (1~1. 5) : (1~2) : (1~2)的比例混合。5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述的接种前包括活化的步 骤；所述活化的代数为2~3代；所述活化的培养基为脱脂乳培养基；所述活化的温度为 28~32°C;和/或，所述活化的时间为16~24小时。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述活化的培养基为10%脱 脂乳培养基，所述百分比为质量百分比。7. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述的培养基为脱脂乳培养 基；步骤⑴所述培养的温度为28~32°C;步骤⑴所述培养的时间为16~24小时；和 /或，步骤（1)所述培养的次数为2~3次。8. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中，按照乳酸乳球菌乳酸亚 种CGMCCNo. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750的活菌数为1:1:1:1的比例混合。9. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)完成后还包括以下步骤：加入 辅料，混合。10. -种如权利要求1~3任一项所述的干酪发酵剂在制备干酪中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种干酪发酵剂与其制备方法和应用。该干酪发酵剂包括乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10751和肠膜明串珠菌CGMCC No.10750，所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10751和肠膜明串珠菌CGMCC No.10750的活菌数比例为(0.5～1):(1～1.5):(1～2):(1～2)。该干酪发酵剂利用发酵菌株之间良好的互生作用，可用于加工干酪。该制备方法简便易行。CGMCC No.1075120150427CGMCC No.1075220150427CGMCC No.1074920150427CGMCC No.1075020150427
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/46, C12R1/01, A23C19/032
【公开号】CN104894036
【申请号】CN201510378605
【发明人】莫蓓红, 刘振民, 黄宜, 郑远荣, 石春权, 凌勇飚
【申请人】光明乳业股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月1日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及乳制品领域，具体涉及一种干酪发酵剂与其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 干酪，又名奶酪，有各式各样的味道、口感和形式。干酪以奶类为原料，含有丰富的 蛋白质和脂质，具有很高的营养价值。随着我国人民生活水平的提高，对干酪的需求量越来 越多。在干酪生产和成熟过程中微生物菌群起着重要的作用，促进了产品的质构和风味的 形成。干酪的干酪发酵剂对干酪质构和特征风味的形成起了极其重要的作用。干酪发酵剂 在干酪生产过程中产酸，能够提高凝乳酶的活性，有助于排除乳清、抑制有害细菌生长，并 产生各种酶参与干酪特征风味与质构的形成。
[0003] 在干酪用乳酸菌的筛选过程中，由于筛选的菌群数量比较多，而为了达到对优良 特性菌株的有效筛选，需要优化筛选步骤，国际上一般是通过对大批量的菌进行筛选，选取 性能优异的菌种进行组合使用，通过会将2-6株菌进行组合，以弥补单株菌在产酸、产香等 方面的缺陷，同时这些菌必须共生性良好，才能用于开发成干酪发酵剂。由于干酪用菌的筛 选、组合、制备发酵剂等技术细节都被国外商业菌种公司所掌握。如何确定指标，确定方法， 筛选出优异的菌种，如何组合菌株，开发成优良的干酪发酵剂在国内基本处于空白。
[0004] 中国地大物博，菌种资源丰富，特色乳制品也异常丰富，从中筛选出适合干酪用的 菌株，并组合成发酵剂，可以用于开发中国化的干酪。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对目前缺乏用于干酪生产的嗜温性发酵剂，同 时难以结合将快速产酸型发酵剂和产香型发酵剂以应用于干酪制备中的不足，提供一种干 酪发酵剂与其制备方法和应用。所述的干酪发酵剂能够利用于干酪，尤其是高达干酪的制 备，兼顾了干酪制备中产酸快和产香的要求，蛋白水解能力强，风味物质各组分平衡结果 好。所述的制备方法操作简便易行，便于使所述干酪发酵剂应用于工业化大规模制备干酪 中。
[0006] 本发明提供一种干酪发酵剂，其包括乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp. lactis) CGMCC No. 10752 (BD401)、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis) CGMCC No. 10749 (BD2263)、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)CGMCC No. 10751 (BD164)和肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)CGMCC No. 10750(LM79)，所述乳酸乳球菌乳酸亚种 CGMCC No. 10752、所述 乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和所述肠 膜明串珠菌CGMCC No. 10750的活菌数比例为（0· 5~I) : (1~L 5) : (1~2) : (1~2)。
[0007] 较佳地，所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述 乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠膜明串珠菌LM79的活菌数比例为1:1:1:1。
[0008] 较佳地，所述的干酪发酵剂还包括辅料。所述的辅料为本领域常规的辅料，用于干 酪发酵剂的制备即可。较佳地包括水、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、明胶、甘油、山梨醇、 海藻糖、酵母膏和β-环糊精中的一种或多种。
[0009] 所述的干酪发酵剂的形式为本领域常规的形式，较佳地为液体发酵剂、冷冻发酵 剂或直投式发酵剂，更佳地为直投式发酵剂，即所述的干酪发酵剂无需对其进行活化、扩大 培养等预处理步骤而直接投入发酵基质使用。
[0010] 本发明提供一种干酪发酵剂的制备方法，其包括以下的步骤：
[0011] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750接种于 培养基中，获得培养物；
[0012] (2)从步骤（1)所得的培养物中获得乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、乳酸 乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌 CGMCC No. 10750,按照乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750的活菌 数为（0. 5~I) : (1~1. 5) : (1~2) : (1~2)的比例混合。
[0013] 步骤（1)为：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750接种于 培养基中，获得培养物。其中，较佳地，所述的接种前包括活化的步骤。所述活化的代数为 本领域常规的代数，较佳地为2~3代。所述活化的培养基为本领域常规的培养基，能够生 长所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD164和所述肠膜明串珠菌LM79即可，较佳地为脱脂乳培养基，更佳地为10%脱脂 乳培养基，所述的脱脂乳培养基由乳粉溶解于水后混合获得，所述的百分比为所述乳粉占 所述乳粉和所述水的总质量的质量百分比。所述活化的温度为本领域常规的温度，较佳地 为28~32°C。所述活化的时间为本领域常规的时间，较佳地为16~24小时。所述的培养 基为本领域常规的培养基，能够扩大培养所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌 乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠膜明串珠菌LM79即可，较佳地 为脱脂乳培养基，更佳地为10%脱脂乳培养基，所述百分比为质量体积百分比。所述培养的 温度为本领域常规的温度，较佳地为28~32°C。所述培养的时间为本领域常规的时间，较 佳地为16~24小时。所述培养的次数为本领域常规的次数，较佳地为2~3次。
[0014] 步骤（2)为：从步骤（1)所得的培养物中获得乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和 肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750,按照乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌 乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750的活菌数为（0. 5~I) : (1~1. 5) : (1~2) : (1~2)的比例混合。其中，较佳地， 按照乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳 球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCC No. 10750的活菌数为1:1:1:1的比 例混合。
[0015] 较佳地，步骤（2)完成后还包括以下步骤：加入辅料，混合。
[0016] 其中，所述的辅料为本领域常规的辅料，较佳地包括水、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、谷 氨酸钠、明胶、甘油、山梨醇、海藻糖、酵母膏和环糊精中的一种或多种。
[0017] 本发明提供一种所述的干酪发酵剂在制备干酪中的应用。
[0018] 所述的干酪为本领域常规的干酪，较佳地为高达干酪、切达干酪和帕马森干酪。更 佳地为高达干酪。
[0019] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0020] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0021] 本发明的积极进步效果在于：本发明所述的干酪发酵剂能够制备干酪，其所制得 的干酪在感官评价、质构等方面与商业发酵剂所制得的干酪相差无几，令人满意。同时所述 的干酪发酵剂通过选择合适的发酵菌株（从41株乳酸乳球菌和47株肠膜明串珠菌菌株中 初选出8株适应于干酪成熟环境的乳酸乳球菌菌株，兼顾到与肠膜明串珠菌和其他乳酸乳 球菌菌株的共生，最终选择了所述干酪剂中的所涉及的菌株），以及发酵菌株之间的比例关 系，妥善地解决了现有技术中难以结合快速产酸型发酵剂和产香型发酵剂的不足，同时利 用发酵菌株之间良好的互生作用，使得所述的干酪发酵剂可用作加工干酪的发酵剂。此外， 所述的制备方法简便易行，能够大规模地批量生产干酪发酵剂，从而使干酪发酵剂运用于 乳制品的实际生产中。
[0022] 牛物材料保藏信息
[0023] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD164,已于2015年4月27日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10751，培养物名称是BD164,分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0024] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD401，已于2015年4月27日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10752,培养物名称是BD401，分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0025] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263,已于2015年4月27保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10749,培养物名称是BD2263,分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0026] 本发明的肠膜明串珠菌LM79,已于2015年4月27日保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮 编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10750,培养物名称是LM79肠膜明串珠菌，分类命名是 Leuconostoc mesenteroides。
【附图说明】
[0027] 图1为pH4. 6水不溶性蛋白的SDS-PAGE图谱，其中对照为对照组，2为实 施例7， 标记为标准Marker，a -CN和β -CN分别表示a -CN蛋白和β -CN蛋白所对应的条带。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0029] 实施例1干酪发酵剂的制备
[0030] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即 得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分 比）中，置于30°C恒温培养箱培养24小时，活化2代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳培养基中，置于30°C恒温培养箱培养24小 时进行扩大培养，重复3次，获得培养物。
[0031] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为1: 1: 1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0032] 实施例2干酪发酵剂的制备
[0033] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（购自新西兰Westland合作乳业有限公司）中，置于28°C恒温培养箱培养24小时， 活化3代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的 脱脂乳培养基中，置于28°C恒温培养箱培养24小时进行扩大培养，重复2次，获得培养物。
[0034] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为0. 5:1. 5:2:2的比例混合，得干酪发酵剂。
[0035] 实施例3干酪发酵剂的制备
[0036] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（购自新西兰Westland合作乳业有限公司）中，置于32°C恒温培养箱培养16小时， 活化3代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的 脱脂乳培养基中，置于32°C恒温培养箱培养16小时进行扩大培养，重复3次，获得培养物。
[0037] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为0. 5:1:1:2的比例混合，得干酪发酵剂。
[0038] 实施例4干酪发酵剂的制备
[0039] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（购自新西兰Westland合作乳业有限公司）中，置于32°C恒温培养箱培养16小时， 活化3代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的 脱脂乳培养基中，置于32°C恒温培养箱培养16小时进行扩大培养，重复3次，获得培养物。
[0040] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为0. 5:1:1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0041] 实施例5干酪发酵剂生产高达干酪
[0042] DlOOkg鲜牛乳（购自金山牧场）经过滤，添加0.01 %氯化钙，搅拌均匀，在72°C， 15s巴氏杀菌后冷却至30°C，所述百分比为质量百分比。将实施例1制得的干酪发酵剂倒 入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 7cfu/mL，缓慢搅拌 15min。静置28°C发酵至pH降低0. 1之后加入20mg/100L凝乳酶（购自丹尼斯克公司） (其中，凝乳酶在使用前用10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），30min后得 凝乳。
[0043] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长5mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后15min后排 出总体积35%的乳清；分2次加入50°C、体积为鲜牛乳总体积25%的水，搅拌20min至凝 块温度达到35°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水12°C盐渍20h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，10°C、湿度90% RH，成熟4周，即得年轻高达干酪。
[0044] 所得的年轻高达干酪质地光滑紧密，富有弹性，外壳色黄且随成熟期由薄变厚，切 面上可有不规则的小孔，气味温和，具有奶油熔化的香气，并伴随轻微坚果的风味。
[0045] 实施例6干酪发酵剂生产高达干酪
[0046] DlOOkg鲜牛乳（购自金山牧场）经过滤，添加0.02%氯化钙，搅拌均匀，在72°C， 15s巴氏杀菌后冷却至30°C，所述百分比为质量百分比。将实施例1制得的干酪发酵剂倒 入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 6cfu/mL，缓慢搅拌 lOmin。静置35°C发酵至pH降低0· 2之后加入20mg/100L凝乳酶（购自科汉森公司）（其 中，凝乳酶在使用前用10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），40min后得凝 乳。
[0047] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长15mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后20min后 排出总体积45%的乳清；一次加入60°C、体积为鲜牛乳总体积40%的水，搅拌30min至凝 块温度达到38°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水15°C盐渍18h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，15°C、湿度90% RH，成熟17周，即得成熟高达干酪。
[0048] 实施例7干酪发酵剂生产高达干酪
[0049] DlOOkg复原乳（15%牛奶奶粉加水获得，所述百分比为质量百分比，所述牛奶奶 粉购自光明乳业）经过滤，添加〇. 01%氯化钙，搅拌均匀，在72°c，15s巴氏杀菌后冷却至 30°C，所述百分比为质量百分比。将实施例1制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳 中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 7cfu/mL，缓慢搅拌15min。静置32°C发酵至 PH降低0· 2之后加入20mg/100L凝乳酶（购自丹尼斯克公司）（其中，凝乳酶在使用前用 10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），30min后得凝乳。
[0050] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长5mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后15min后排 出总体积35%的乳清；分2次加入50°C、体积为鲜牛乳总体积25%的水，搅拌20min至凝 块温度达到35°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水12°C盐渍20h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，10°C、湿度90% RH，成熟5周，即得年轻高达干酪。
[0051] 实施例8干酪发酵剂生产高达干酪
[0052] DlOOkg鲜牛乳（购自金山牧场）经过滤，添加0.01 %氯化钙，搅拌均匀，在72°C， 15s巴氏杀菌后冷却至30°C，所述百分比为质量百分比。将实施例1制得的干酪发酵剂倒 入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 7cfu/mL，缓慢搅拌 15min。静置30°C发酵至pH降低0. 1之后加入20mg/100L凝乳酶（购自丹尼斯克公司） (其中，凝乳酶在使用前用10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），30min后得 凝乳。
[0053] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长5mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后15min后排 出总体积35%的乳清；分2次加入50°C、体积为鲜牛乳总体积25%的水，搅拌20min至凝 块温度达到35°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水12°C盐渍20h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，l〇°C、湿度90% RH，成熟15周，即得成熟高达干酪。
[0054] 实施例9干酪发酵剂制备切达干酪
[0055] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0056] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长IOmm的立方体的凝块，放置，以1°C /5min速 率升温至38°C，在该温度保持至乳清酸度为0. 20%，排乳清；堆酿，翻转2次；切块，加食用 氯化钠细粒1.5%，所述百分比为占干酪总质量的质量百分比，之后装模，真空包装，7°C成 熟12周即可。
[0057] 实施例10干酪发酵剂制备切达干酪
[0058] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0059] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长8mm的立方体的凝块，放置，以1°C /5min速 率升温至40°C，在该温度保持至乳清酸度为0. 22%，排乳清；堆酿，翻转3次；切块，加食用 氯化钠细粒2%，所述百分比为占干酪总质量的质量百分比之后装模，真空包装，KTC成熟 3周即可。
[0060] 实施例11干酪发酵剂 制备切达干酪
[0061] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0062] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长12mm的立方体的凝块，放置，以1°C /5min速 率升温至38°C，在该温度保持至乳清酸度为0. 20%，排乳清，堆酿，翻转2次，切块加盐，之 后装模，真空包装，7°C成熟12周即可。
[0063] 实施例12干酪发酵剂制备帕马森干酪
[0064] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0065] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长3mm的立方体的凝块，搅拌lOmin。以 I°C /5min速率升温至44°C，保温lOmin，然后继续升温至54°C保温5min，搅拌20min，静置 20min，加盖。排乳清，立即进行装模压榨，25°C发酵24h。在KTC饱和盐水中浸16天。然 后在相对湿度40%条件下干燥1天。16°C成熟6个月，即可。
[0066] 实施例13干酪发酵剂制备帕马森干酪 [0067] 1)与实施例7的步骤1)完全相同。
[0068] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长4_的立方体的凝块，搅拌15min。以 2°C /5min速率升温至44°C，保温20min，然后继续升温至54°C保温lOmin，搅拌lOmin，静置 20min，加盖。排乳清，立即进行装模压榨，25°C发酵24h。在16°C饱和盐水中浸10天。然 后在相对湿度65%条件下干燥2天。KTC成熟6月，即可。
[0069] 对比例1
[0070] A、干酪发酵剂的制备
[0071] (1)与实施例1步骤（1)完全相同。
[0072] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为2:2:1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0073] B、干酪发酵剂生产高达干酪
[0074] 将对比例1步骤A制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，其余步骤与实 施例7完全相同。即得年轻高达干酪。
[0075] 对比例2
[0076] A、干酪发酵剂的制备
[0077] (1)与实施例1步骤（1)完全相同。
[0078] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为0. 5:1:3:3的比例混合，得干酪发酵剂。
[0079] B、干酪发酵剂生产高达干酪
[0080] 将对比例2步骤A制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，其余步骤与实 施例7完全相同。即得年轻高达干酪。
[0081] 对比例3
[0082] A、干酪发酵剂的制备
[0083] (1)与实施例1步骤（1)完全相同。
[0084] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD401、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为1: 1: 1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0085] B、干酪发酵剂生产高达干酪
[0086] 将对比例3步骤A制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，其余步骤与实 施例7完全相同。即得年轻高达干酪。
[0087] 对比例4
[0088] A、干酪发酵剂的制备
[0089] (1)与实施例1步骤（1)完全相同。
[0090] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD164、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD3170和所述 肠膜明串珠菌LM79的活菌数为1: 1: 1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0091] B、干酪发酵剂生产高达干酪
[0092] 将对比例4步骤A制得的干酪发酵剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，其余步骤与实 施例7完全相同。即得年轻高达干酪。
[0093] 效果实施例1干酪的理化成分分析
[0094] a)、pH
[0095] 在干酪成熟第1(1、7(1、14(1、21(1、28(1、35(1和42(1分别取1(^实施例7所制得的干酪， 加入IOmL水，匀浆（6000r/min)5min，使用pH计（购自瑞士 METTLER公司）测定混合物的 pH值，结果如表1所示。
[0096] 表1干酪在成熟期间的pH变化
[0097]
[0098] 表1说明，在成熟期1~4周内，干酪的pH值从第Id的5. 4开始平稳下降，在第4 周（第28d)时降到最低，随后缓慢上升。这是由于在干酪成熟过程中，乳酸菌分解乳糖产 生的乳酸逐渐被消耗，干酪的PH值呈现缓慢上升趋势，到达一定水平后趋于平稳。
[0099] b)、水分
[0100] 通过水分测定仪MB 45(购自Ohaus仪器（上海）有限公司）测定干酪中的水分 含量。在称量皿中准确称量第42d的实施例7所制得的干酪3g，切碎后置于样品盘中，关紧 封盖，样品的模式选项中设置为CHEESE模式，待屏幕显示样品初始重量后，表示可以运行， 按Start/Stop (开始/停止键），水分测定仪开始干燥与测量过程。待运行完成后，重复按 Display显示键，屏幕显示结果并记录数据，结果如表2所示。其中，对照组为使用直投式发 酵剂CH00ZIT RM 32 (购自丹尼克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制 得的干酪。
[0101] C)、盐度
[0102] 将干酪样品于研钵中研碎，准确称取5g实施例7所制得的干酪于分液漏斗中，用 热水反复洗涤干酪内的盐分，反复洗涤7次，每次加入热水25mL，将洗涤液收集在250mL的 容量瓶中并用蒸馏水定容，取IOOmL洗涤液置于250mL锥形瓶中，以铬酸钾（ImL)作为显色 指示剂，用硝酸银（〇. IN)溶液滴定至变为砖红色为止，记录消耗的体积V，重复3次，取平均 值，结果如表2所示。
[0103]
[0104] V - AgNO^消耗量（mL)
[0105] W-干酪样品的重量（g)
[0106] V1-洗涤液定容的总量（mL)
[0107] V2-滴定使用的洗液量（mL)
[0108] d)、脂肪
[0109] 准确称取1.0 Og研碎的实施例7所制得的干酪，加入IOmL 60°C温水，置于60°C水 浴中使其溶解，加入I. 25mL氨水，充分混匀后，于60°C水浴保持5min，振摇2min，加入IOmL 乙醇，充分摇勾，置于冷水中快速冷却后加入25mL乙醚，振摇0. 5min加入25mL石油醚，振 摇0.5min，静置30in，待上层液澄清时，读取醚层体积。将醚层放出至已恒重的烧杯中，置 于沸水浴中挥干醚类物质，于l〇〇°C烘箱中干燥Ih后称量，再次置于烘箱中干燥40min后称 量，前后两次质量差不得超过lmg。按如下的公式进行计算，结果如表2所示。
[0110] X-样品中脂肪含量，单位％
[0111] m。一烧杯质量，单位g
[0112] HI1-烧杯加脂肪的质量，单位g
[0113] m-样品质量，单位g
[0114] V-读取醚层的体积，单位mL
[0115] 表2干酪的理化成分测定结果
[0118] e)、蛋白质的含量及其水解程度
[0119] 总氮测定（TN):凯氏定氮法，参照GB5009. 5-2010,蛋白质的换算系数为6. 38。
[0120] 分别在第三周（21d)、第六周（42d)对实施例7所制得的干酪取样，测定实施例7 所制得的干酪中ρΗ4· 6可溶性氮含量（pH 4. 6 soluble nitrogen，即pH 4. 6SN)、12% TCA 可溶性氮含量（12% TCA soluble nitrogen，即 12% TCA-SN ;又称非蛋白氮，non protein nitrogen，即NPN)和5%磷钨酸可溶性氮（TCA-SN)的变化情况。
[0121] 具体操作如下：
[0122] 1)ρΗ4. 6可溶性氮（pH4. 6 SN)测定：取IOg实施例7所制得的干酪加入40mL去 离子水，用高速捣碎机进行匀浆，在55°C条件下温育Ih并调pH为4. 6。然后在3000g，4°C 下离心30min，去上层脂肪，收集离心沉淀于离心管中，-20°C保存用于SDS-PAGE分析，上清 液过滤（中速定量滤纸）后，再使用What man#42滤纸（购自Whatman公司）过滤，取IOmL 滤液进行定氮。
[0123] 2) 12%三氯乙酸可溶性氮（TCA-SN)测定：24%三氯乙酸溶液25mL和25mL pH4. 6 的步骤1)所得的滤液，室温静置lh，再通过Whatman#42滤纸过滤，取25mL滤液进行定氮。
[0124] 3) 5%磷钨酸可溶性氮（PTA-SN)测定：将5mL pH 4. 6步骤1)所得的滤液、3. 5mL 3. 95M硫酸溶液和I. 5mL 33. 3%磷鹤酸溶液混合均勾，置于4<€下过夜，通过11^1：1]^11#42滤 纸过滤，取IOmL滤液进行定氮。
[0125] 结果如表3所示，其中，对照组为使用直投式发酵剂CH00ZIT RM 32(购自丹尼克 斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得的干酪。
[0126] 表3干酪成熟过程中蛋白质水解程度的变化
[0127]
[0128] 其中，a、b、c和d表不存在着显著性差异（p < 0. 05)。
[0129] 表3说明，在干酪成熟过程中SN呈现明显增长的趋势，这说明随着成熟时间的进 行，干酪内的大分子多肽发生了强烈的降解；在干酪成熟过程中TCA-SN呈现明显增长的趋 势，并且成熟期第3周时均较对照组 干酪高，而在第6周时又趋于接近，无显著性差异（p > 0.05);在干酪成熟过程中PTA-SN呈现明显增长的趋势，这说明随着成熟时间的进行，干酪 内的多肽等逐渐降解为氨基酸，而对比对照组干酪，在第3和6周时，其PTA-SN/TN较高，并 且两者存在着显著性差异（P < 0. 05)。而对比例3、4在多项指标上均低于对照样，特别是 六周成熟的情况较差，蛋白分解缓慢，产生的风味物质不足。
[0130] f)、水不溶性蛋白SDS-PAGE
[0131] 取存放于-20°C的步骤e)获得的pH 4. 6不溶性蛋白（0. 2g)溶解于IOmL实施例7 所制得的干酪的溶解溶液中（即浓盐酸〇. 4mL、巯基乙醇0. 7mL、三羟甲基氨基甲烷0. 75g、 尿素49g和溴酚蓝0. 15g溶解于IOOmL超纯水中，将实施例7所制得的干酪溶解于上述溶 液），50°C温育40min，得温育液。然后取ImL所述的温育液，lOOOOr/min离心5min，取5 μ L 上清液作为上样液。分离胶和浓缩胶的浓度分别为15%和5%，具体见表4。电压条件先 设置为120V，直至蓝色条带跑到浓缩胶底部再将后电压调节IOOV至蓝色条带跑到胶底部。 用考马斯亮蓝R-250 (购自国药试剂）染色2h，然后在摇床中用脱色液浸泡，脱色过夜至背 景清晰为止，结果如附图1所示。其中，对照组为使用直投式发酵剂CHOOZIT RM 32(购自 丹尼克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得的干酪。
[0132] 表4分离胶和浓缩胶成分表
[0133]
[0134] 由图1可知，在干酪成熟过程中，蛋白的各种分解产物逐渐产生和积累。在干酪成 熟第6周（第42d)时实施例7与对照组的a -CN的电泳带无明显区别，实施例7与对照组 的β -CN电泳带颜色接近。
[0135] 效果实施例2干酪的挥发性风味物质分析
[0136] 固相微萃取SPME条件：取实施例7所制得的干酪5g，30°C恒温水浴lOmin，使用 IOOum的PDMS固相微萃取头（购自美国Supelco公司）吸附，吸附时间为30min。
[0137] 程序升温条件设置：进样后以60°C作为初始温度保持5min，以5°C /min升温至 120°C保持5min，以8°C /min升温至240°C保持lOmin，运行总时间为47min ;色谱柱型号 DB-5-MS，进样口温度250°C，离子源EI，四级杆温度150°C，传输线温度280°C，载气为He，进 样模式选择不分流进样，流速lmL/min，电离方式EI 70eV，质量扫描范围35~350m/z，结 果如表5所示，表5中数值的单位为丰度。其中，对照组为使用直投式发酵剂CHOOZIT RM 32(购自丹尼克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得的干酪。
[0138] 表5干酪主要挥发性风味物质的测定结果
[0139]
[0140] 由表5可知，酮、酸及酯类化合物是干酪风味的主要来源，其中对干酪特征风味组 分贡献最大的化合物有7种，即已烷、2-戊酮、丁酸乙酯、正丁醇、庚酮、草酰乙酸和丁酸。酮 类物质的风味阈值较低，且在实施例7所制得的干酪中具有相对较高的丰度，对干酪的风 味整体贡献较大。其中，3-羟基-2- 丁酮还赋予了高达干酪独特的奶香味和脂肪味，并且其 含量在本实施例中也高于对照组。
[0141] 效果实施例3干酪的感官评价
[0142] 本次感官评定人员包括12名从事食品研宄的人员，均熟悉感官评定注意事项和 评分标准。总分为50分，分数评定遵照表6。各评定员独立进行评定，每次更换样品时使用 清水漱口，结果如表7所示。其中，对照组为使用直投式发酵剂CH00ZIT RM 32(购自丹尼 克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得的干酪。
[0143] 表6干酪感官评定方法
[0144]
[0145] 表7干酪感官评定结果
[0146]
[0148] 表7的结果说明，在滋气味与质地的总评分中，效果实施例7所得的干酪比商业发 酵剂制作的高达干酪（对照组）都要略胜一筹。因此，效果实施例7所得的干酪具有良好 的质地以及更好的滋气味。
[0149] 效果实施例4干酪的质地
[0150] 干酪样品为成熟60d的实施例7所制得的干酪，采用TA-Hdi型质构分析仪（购 自英国Stable Micro Systems公司）。用取样器对干酪进行切割，形成直径和高度分别为 3cm、I. 5cm的圆柱体小块，置于lock盒内，于4°C冰箱中保存4h。
[0151] 测定参数：测量前探头下降速率lmm/s ;测试速率lmm/s ;测试后探头回程速率 lmm/s;下压距离6mm;下压变形：50%;触发力：5g;探头类型P/5。每组测定15次。干酪的 功能特性数据（硬度、弹性、凝聚性、黏着性和咀嚼性等）使用质构分析仪（TA-Hdi型）自 带数据处理软件E Xponent5. 0进行处理，结果如表8所示。其中，对照组为使用直投式发酵 剂CH00ZIT RM 32 (购自丹尼克斯添加剂（上海）有限公司），按照实施例7的步骤所制得 的干酪。
[0152] 表8干酪质构测试结果
[0153]
[0154]
[0155] 表8说明，实施例7所得的干酪在硬度、弹性、咀嚼性和黏着性等指标上与对照组 干酪无显著差异，仅硬度比对照干酪稍高，说明实施例1所述的干酪发酵剂所制作的干酪 (即实施例7所得的干酪）在质构方面符合高达干酪的要求，具有开发成干酪发酵剂的潜 力。
[0156] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种干酪发酵剂，其特征在于，其包括乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis)CGMCCNo. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种（LactococcusIactis subsp.lactis)CGMCCNo. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp. lactis)CGMCCNo. 10751 和肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides)CGMCCNo. 10750， 所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、所 述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10748和所述肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750的活菌数比 例为（0? 5 ~I) : (1~L5) : (1 ~2) : (1 ~2)。2. 如权利要求1所述的干酪发酵剂，其特征在于，所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10752、所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和所述肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750的活菌数比例为1:1:1:1。3. 如权利要求1所述的干酪发酵剂，其特征在于，其还包括辅料。4. 一种干酪发酵剂的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤： (1) 将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、乳 酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10751和肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750接种于培养基中，获 得培养物； (2) 从步骤（1)所得的培养物中获得乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、乳酸乳 球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10748和肠膜明串珠菌 CGMCCNo. 10750,按照乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10751和肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750的活菌 数为（0. 5~I) : (1~1. 5) : (1~2) : (1~2)的比例混合。5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述的接种前包括活化的步 骤；所述活化的代数为2~3代；所述活化的培养基为脱脂乳培养基；所述活化的温度为 28~32°C;和/或，所述活化的时间为16~24小时。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述活化的培养基为10%脱 脂乳培养基，所述百分比为质量百分比。7. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述的培养基为脱脂乳培养 基；步骤⑴所述培养的温度为28~32°C;步骤⑴所述培养的时间为16~24小时；和 /或，步骤（1)所述培养的次数为2~3次。8. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中，按照乳酸乳球菌乳酸亚 种CGMCCNo. 10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo. 10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751和肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10750的活菌数为1:1:1:1的比例混合。9. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)完成后还包括以下步骤：加入 辅料，混合。10. -种如权利要求1~3任一项所述的干酪发酵剂在制备干酪中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种干酪发酵剂与其制备方法和应用。该干酪发酵剂包括乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10751和肠膜明串珠菌CGMCC No.10750，所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10752、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10749、乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No.10751和肠膜明串珠菌CGMCC No.10750的活菌数比例为(0.5～1):(1～1.5):(1～2):(1～2)。该干酪发酵剂利用发酵菌株之间良好的互生作用，可用于加工干酪。该制备方法简便易行。CGMCC No.1075120150427CGMCC No.1075220150427CGMCC No.1074920150427CGMCC No.1075020150427
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/46, C12R1/01, A23C19/032
【公开号】CN104894036
【申请号】CN201510378605
【发明人】莫蓓红, 刘振民, 黄宜, 郑远荣, 石春权, 凌勇飚
【申请人】光明乳业股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月1日
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