一种乳酸乳球菌乳酸亚种及其在干酪生产中的应用
一种乳酸乳球菌乳酸亚种及其在干酪生产中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及一种乳酸乳球菌乳酸亚种及其在干酪生产中的 应用。
【背景技术】
[0002] 干酪，又名奶酪，有各式各样的味道、口感和形式。干酪以奶类为原料，含有丰富的 蛋白质和脂质，具有很高的营养价值。随着我国人民生活水平的提高，对干酪的需求量越来 越多。在干酪生产和成熟过程中微生物菌群起着重要的作用，促进了产品的质构和风味的 形成。干酪的主发酵剂对干酪质构和特征风味的形成起了极其重要的作用。主发酵剂在干 酪生产过程中产酸，能够提高凝乳酶的活性，有助于排除乳清、抑制有害细菌生长，并产生 各种酶参与干酪特征风味与质构的形成。
[0003] 大多数干酪的生产需要在凝乳前添加不同种类的乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB)，它们的主要作用是在干酪制作过程中产酸，干酪生产过程中一个关键点即 为乳酸菌乳糖代谢为乳酸，其酸化的速度和程度影响凝乳的效果和干酪得率并影响凝乳酶 的活性。LAB有时也能够产生乙酸、乙醛和双乙酰等风味物质。发酵剂一般可以分为两类，嗜 温性发酵剂（即最适培养温度为30°C )和嗜热性发酵剂（即最适培养温度为42°C )。嗜温性 发酵剂中通常包含乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus Iactis)和明串珠菌（Leuconostoc spp.)等，嗜热性发酵剂通常包括嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)和保加利亚 乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus)等。现今使用的大部分发酵剂直接由凝乳再次培养 而得，而这些凝乳本身是经过长期的大规模优质干酪的生产实践中挑选出来的，通常含有 2~6株菌，所以在某种程度上，目前大部分的发酵剂可被称为混合发酵剂。国内在发酵剂 方面的研宄主要集中于适用于酸奶的嗜热性发酵剂。
[0004] 目前，国内对嗜温新的发酵剂研宄很少，主要热衷于酸奶发酵剂（主要是嗜热性 乳酸菌）的筛选及制备的研宄，而对可用于干酪生产的嗜温性乳酸菌的筛选研宄较少，对 于干酪用菌体系的筛选标准方面更是空白。因此，利用中国丰富的菌种资源开发适用于全 新的干酪发酵剂的发酵菌株具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对目前缺乏用于干酪生产的、嗜中温的、从我 国国内菌种资源中获得的乳酸乳球菌乳酸亚种的不足，提供一种乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. Iactis)及其在干酪生产中的应用。所述的乳酸乳球菌乳酸 亚种可以用于制备用于干酪生产的嗜温型乳酸菌发酵剂。
[0006] 本发明的技术方案之一是：一种乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus Iactis subsp. lactis)，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为： CGMCC No. 10751。
[0007] 从我国西藏的奶疙瘩样品中分离而得，获得所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751。所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751在乳中生长良好，产酸速度适 中，用于生产干酪风味良好，得率高。对该菌株进行鉴定，结果为乳酸乳球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp.lactis，命名为 BD164。该菌株已于 2015 年 4 月 27 日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并收到保藏中心登记入册编号CGMCC No. 10751，其具有以下的微生物学特性：
[0008] 1、形态学的特性
[0009] 在Ml7agar培养基培养24小时后，菌落呈乳白色，菌落较小，圆形凸起，有光泽，菌 体呈卵圆形。之后迅速生长，2天后菌落大而紧密，呈乳白色略带黄色。
[0010] 2、培养学的特性
[0011] 在酸性（PH5.0)、高盐浓度（4% NaCl，所述百分比为质量百分比）环境下生长良 好；在15~30°C下生长良好；在40°C，2小时的干酪切割升温工艺条件下存活性良好。
[0012] 3、生理特性
[0013] 产酸能力强，产酸速度较快；凝乳速度快，凝乳黏度适中；发酵特征方面，能析出 乳清，凝乳组织状态好、香气浓郁；蛋白水解能力较强，能够将蛋白质分解为多肽、氨基酸或 其它无机、有机小分子物质；并具有噬菌体抗性。
[0014] 本发明的技术方案之二是：一种制备所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751 的方法，其包括以下的步骤，在培养基中培养所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751 即可。
[0015] 其中，所述的培养基为本领域常规的培养基，能够生长所述的乳酸乳球菌乳酸亚 种CGMCC No. 10751即可，较佳地为MRS培养基、M17agar培养基或脱脂乳培养基。所述的 MRS培养基为本领域常规的MRS培养基，较佳地，其包括如下的组成成分：蛋白胨8~12g/ L、牛肉膏9~12g/L、葡萄糖15~20g/L、酵母膏4~6g/L、朽1檬酸按1. 8~2g/L、磷酸氢 二钾L 8~2. 0g/L、乙酸钠4. 8~5. 2g/L、硫酸镁0· 5~0· 6g/L、硫酸锰0· 5~0· 55g/L 和吐温80~85g/L。更佳地，其包括如下的组成成分：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖 20g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰 0. 5g/L和吐温80g/L。所述脱脂乳培养基为本领域常规的脱脂乳培养基，较佳地为10 %脱 脂乳培养基。将脱脂乳粉溶解于水中混合即得所述脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂 乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比。所述的M17agar培养基为本领域常规 的M17agar培养基，较佳地，其包括如下的组成成分：植物蛋白胨4. 5~5. 5g/L、酵母提取 物4~5g/L、聚蛋白胨4~5g/L、β -甘油磷酸二钠18~20g/L、抗坏血酸0· 4~0· 5g/L、 牛肉浸膏2. 2~2. 8g/L、七水合硫酸镁1~I. 5g/L和琼脂粉2. 5~3g/L。更佳地，其包 括如下的组成成分：植物蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、聚蛋白胨5g/L、β -甘油磷酸二钠 19g/L、抗坏血酸0. 5g/L、牛肉浸膏2. 5g/L、七水合硫酸镁I. 2g/L和琼脂粉2. 5g/L。
[0016] 所述培养的温度为本领域常规的温度，能够生长所述的乳酸乳球菌乳酸亚种 CGMCC No. 10751即可，较佳地为25~35°C，更佳地为28~30°C。所述培养的时间为本领 域常规的时间，较佳地为24~72小时，更佳地为24~48小时。所述培养的pH为本领域 常规的pH，能够生长所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751，较佳地为4~6,更佳地 为4~5〇
[0017] 较佳地，所述的培养前还包括使用种子培养基进行种子培养的步骤。所述的种子 培养为本领域常规的种子培养。所述的种子培养基为本领域常规的种子培养基，较佳地为 脱脂乳培养基，更佳地为10~12%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。所述的脱 脂乳培养菌经过115°C、15~20min灭菌。所述种子培养的时间为本领域常规的时间，较佳 地为16~32小时，更佳地为16~24小时。所述种子培养的温度为本领域常规的温度，较 佳地为28~32°C。所述种子培养的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1~2%，所 述百分比为体积百分比。所述种子培养的活化的代数为本领域常规的代数，较佳地为2~ 4代，更佳地为2~3代。较佳地，所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751为冻存状 态，所述种子培养包括升温的步骤。所述升温的温度为本领域常规的温度，较佳地为10~ 34°C，更佳地为20~28°C。
[0018] 所述培养的方法为本领域常规的培养的方法，较佳地为摇瓶培养或发酵罐培养。
[0019] 本发明提供的技术方案之三是：所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751在 干酪生产中的应用。
[0020] 所述的干酪为本领域常规的干酪，较佳地为高达干酪、切达干酪和帕马森干酪。更 佳地为高达干酪。
[0021] 所制得的干酪质地紧密，弹性适中，色泽微黄且均匀，具有成熟干酪特征香味和滋 味，用该菌种制备的干酪得率高，可在冷藏情况下存放10~24个月无乳清析出或酸败。
[0022] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0023] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0024] 本发明的积极进步效果在于：本发明提供一种乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751，其在乳中生长性能良好，噬菌体抗性佳，产酸速度适中，用于生产干酪风味良好， 得率高。可用于制备干酪的发酵剂，并应用于干酪或者其他的发酵食品加工工艺中。
[0025] 牛物材料保藏信息
[0026] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD164,已于2015年4月27日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10751，培养物名称是BD164,分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0027] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD401，已于2015年4月27日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10752,培养物名称是BD401，分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0028] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263,已于2015年4月27保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10749,培养物名称是BD2263,分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0029] 本发明的肠膜明串珠菌LM79,已于2015年4月27日保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮 编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10750,培养物名称是LM79,分类命名是肠膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroides。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0031] 实施例1乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的获得
[0032] (1)、活化：将取自西藏的奶疙瘩样品从冻存管中取出，以2% (v/v)的接种量接 种于经过了 121°C、15分钟灭菌的M17肉汤培养基中（M17肉汤培养基为不含有琼脂的 M17Agar培养基，购自英国OXOID公司）30°C培养36小时，连续培养3代，获得活化的菌种。
[0033] (2)、模拟干酪成熟环境选择：将步骤⑴所得的活化的菌种以2% (v/v)的接种 量接种于氯化钠含量4 %、pH5的10 %脱脂乳培养基（脱脂乳粉购自新西兰Westland合 作乳业有限公司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂 乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比）中，30°C培养16小时得培养液。将 培养液按照GB4789. 2-2010所述的菌落总数测定方法进行平板计数。测得活菌总数达到 ^ 106cfu/mL。
[0034] 设对照组：将步骤⑴所得的生长良好的菌种以2% (v/v)的接种量接种于未添 加氯化钠、未调节pH的10%脱脂乳培养基中，30°C培养16小时，得培养液。将培养液按照 GB4789. 2-2010所述的步骤方法处理后，37°C培养48小时。
[0035] 48小时后，通过平板计数法测定，活菌总数达到多107cfu/mL。
[0036] (3)、按温度选择：
[0037] b)将步骤⑵所得的生长良好的菌株以2% (v/v)的接种量接种于未添加氯化 钠、未调节pH的10%脱脂乳培养基的三角瓶中，15°C培养16小时，得培养液b ;
[0038] c)将步骤（2)所得的生长良好的菌株以2% (v/v)的接种量接种于未添加氯化 钠、未调节pH的10%脱脂乳培养基的三角瓶中，30°C培养16小时，得培养液c ;
[0039] d)将步骤⑵所得的生长良好的菌株以2% (v/v)的接种量接种于未添加氯化 钠、未调节pH的10%脱脂乳培养基的三角瓶中，30°C培养14小时后，于40°C水浴2小时， 得培养液d。
[0040] 将培养液b、培养液C和培养液d按照GB4789. 2-2010所述的菌落总数测定方法进 行平板计数。
[0041] 选择满足b)中活菌总数达到彡105cfu/mL、c)中活菌总数达到彡10 7cfu/mL且 106cfu/mL彡d)中活菌总数达到彡104cfu/mL条件的菌株，命名为BD164。
[0042] 将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164于2015年4月27日在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，获得保藏编号为：CGMCC No. 10751，培养物名称是 BD164,分类命名是乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactis。
[0043] 实施例2乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的形态学和培养学特征
[0044] 培养特征：采用M17agar培养基30°C培养乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 107512 天后，观察培养特征。
[0045] 表1乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751在培养基上的培养特征
[0046]
[0047] 表1的结果说明，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751在M17agar培养基上生长 良好，培养24小时后，菌落呈乳白色，菌落较小，圆形凸起，有光泽，菌体卵圆形。之后迅速 生长，2天后菌落大而紧密，呈乳白色略带黄色。
[0048] 实施例3乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的生理生化特征
[0049] a)、产酸性能
[0050] 将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按1% (v/v)的接种量接种于装有灭菌 的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30°C恒温培养箱培养，每3小时取出一支三角瓶，以未接 种乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的脱脂乳培养基作为对照，测pH值，结果如表2所 不O
[0051] 表2乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的产酸速率
[0052]
[0053] 由表2可知，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751产酸速度较慢，24小时后，pH 仅为4. 68,产酸力较强，可以用于原料奶的预酸化速度，而酸的形成有利于强化凝乳酶的功 能作用和乳中钙的溶解，便于凝乳块的形成。
[0054] b)、在脱脂乳中的凝乳时间和凝乳黏度测定
[0055] 将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按1% (v/v)的接种量接种于装有灭菌 的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30°C恒温培养箱培养，直至其凝乳，4°C环境下保持24小 时。凝乳后用旋转黏度计（购自德国ProRheo公司）分别测定各发酵酸乳的黏度（m · Pa/ s)。测定时选用2号转子，速度为64r/s。测定时每15s取值一次，测定时间为3min，结果 如表3所示。由表3可知，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751凝乳速度快，凝乳黏度较 尚。
[0056] 表3乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的凝乳时间和凝乳黏度
[0057]
[0058] c)、发酵特性测试
[0059] 将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按1 % (v/v)的接种量接种于装有灭菌的 10%脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30°C恒温培养箱培养，直至其凝乳，考察其凝乳风味、 乳清析出状况和凝块的质地，结果如表4所示。
[0060] 表4乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵特性
[0061]
[0062] d)、蛋白水解能力测试
[0063] 福林（Folin)-酷试剂法测定菌株的蛋白水解能力：取ImL样品溶液，加入2. 5mL 0. 28M NaOH溶液，混匀，于25°C左右放置lOmin。再加入0. 75mL福林酚试剂（购自国药 试剂），立即摇勾，于35°C左右反应15min，在660nm下使用紫外分光光度计（购自上海天 美科学仪器有限公司）测定其吸光值。所述的样品溶液为：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按1% (v/v)的接种量接种于装有灭菌的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30°C恒 温培养箱培养24小时后的悬浮液。结果发现，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的OD66tl 为0. 82。说明乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751蛋白水解能力较强，而在干酪成熟过程 中，发酵剂菌株能够将蛋白质分解为多肽、氨基酸或其它无机、有机小分子物质，对干酪风 味的形成起着重要作用。
[0064] e)、噬菌体抗性
[0065] 将发酵异常（干酪用菌不产酸或产酸极为缓慢且凝乳异常即为发酵异常。）的干 酪用原料乳（从光明乳业研宄院中试车间处获得）作为样品，将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按2% (v/v)的接种量接种于装有样品的三角瓶中，置于30°C恒温培养箱发酵培 养12小时。测定发酵培养的发酵液的pH值，发现Λ pH多0. 5,说明乳酸乳球菌乳酸亚种 CGMCC No. 10751具有噬菌体抗性。
[0066] 由实施例2~3的数据说明，所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751具有以下 的微生物学特性：
[0067] 1、形态学的特性
[0068] 在Ml7agar培养基培养24小时后，菌落呈乳白色，菌落较小，圆形凸起，有光泽，菌 体卵圆形。之后迅速生长，2天后菌落大而紧密，呈乳白色略带黄色。
[0069] 2、培养学的特性
[0070] 在酸性（PH5.0)、高盐浓度（4% NaCl，所述百分比为质量百分比）环境下生长良 好；在15~30°C下生长良好；在40°C，2小时的干酪切割升温工艺条件下存活性良好。
[0071] 3、生理特性
[0072] 产酸能力强，产酸速度较慢；凝乳速度相对较快，凝乳黏度较高；发酵特征方面， 能析出乳清，凝乳组织状态好、香气浓郁；蛋白水解能力较强，能够将蛋白质分解为多肽、氨 基酸或其它无机、有机小分子物质；并具有噬菌体抗性。
[0073] 实施例4乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的16S rDNA序列分析
[0074] 16S rDNA序列分析：利用27F，1492R引物扩增乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的16S rDNA片段，纯化，回收，然后使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序（上海 派森诺生物科技有限公司）。结果发现，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751与乳酸乳球 菌乳酸亚种标准株Lactococcus lactis subsp. Iactis I11403strain IL1403 的 16S rDNA 序列的同源性为100%。由于当16S rDNA序列同源性高于97%时，可以认为是属内同种， 因此酸乳球菌CGMCC No. 10751属于乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)ο
[0075] 其中，如上所述的引物对序列为：27F :agagtttgat cctggctcag ;1492R : ctacggctaccttgttacga(核苷酸序列分别如序列表SEQIDN0·2和SEQIDN0·3所示）。 乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO. 1所示。
[0076] 实施例5乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0077] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至10 °C。
[0078] 种子培养基：10%脱脂乳培养基（脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公 司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱 脂乳粉和所述水总质量的质量百分比），所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经过 115°C、15min 灭菌。
[0079] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化2代。
[0080] 发酵培养基：蛋白胨8g/L、牛肉膏9g/L、葡萄糖15g/L、酵母膏4g/L、梓檬酸按 I. 8g/L、磷酸氢二钾I. 8g/L、乙酸钠4. 8g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 5g/L和吐温80g/L。
[0081] 培养温度为25°C，培养周期72h，培养pH为4。
[0082] 实施例6乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0083] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至20 °C。
[0084] 种子培养基：12%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、20min 灭菌。
[0085] 种子瓶中种子培养基的培养温度32°C，培养周期16h，接种量为2%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化4代。
[0086] 发酵培养基：蛋白胨12g/L、牛肉膏12g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏6g/L、柠檬酸铵 2g/L、磷酸氢二钾2. 0g/L、乙酸钠5. 2g/L、硫酸镁0. 6g/L、硫酸锰0. 55g/L和吐温85g/L。
[0087] 培养温度为35°C，培养周期24h，培养pH为6。
[0088] 实施例7乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0089] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至28 °C。
[0090] 种子培养基：12%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、20min 灭菌。
[0091] 种子瓶中种子培养基的培养温度32°C，培养周期16h，接种量为2%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化3代。
[0092] 发酵培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵 2g/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 5g/L和吐温80g/L。
[0093] 培养温度为28°C，培养周期48h，培养pH为5。
[0094] 实施例8乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0095] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至34°C。
[0096] 种子培养基：10%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、15min 灭菌。
[0097] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化2代。
[0098] 发酵培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵 2g/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 5g/L和吐温80g/L。
[0099] 培养温度为30°C，培养周期48h，培养pH为5。
[0100] 实施例9乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0101] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至20 °C。
[0102] 种子培养基：10%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、15min 灭菌。
[0103] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化4代。
[0104] 发酵培养基：植物蛋白胨4. 5g/L、酵母提取物4g/L、聚蛋白胨4g/L、β -甘油磷酸 二钠18g/L、抗坏血酸0. 4g/L、牛肉浸膏2. 2g/L和七水合硫酸镁lg/L以及琼脂粉2. 5g/L。
[0105] 培养温度为35°C，培养周期24h，培养pH为4。
[0106] 实施例10乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0107] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至28 °C。
[0108] 种子培养基：12%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、15min 灭菌。
[0109] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化2代。
[0110] 发酵培养基：植物蛋白胨5. 5g/L、酵母提取物5g/L、聚蛋白胨5g/L、β -甘油磷酸 二钠20g/L、抗坏血酸0. 5g/L、牛肉浸膏2. 8g/L和七水 合硫酸镁I. 5g/L以及琼脂粉3g/L。
[0111] 培养温度为30°C，培养周期48h，培养pH为4。
[0112] 实施例11乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0113] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至34°C。
[0114] 种子培养基：10%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、20min 灭菌。
[0115] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化3代。
[0116] 发酵培养基植物蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、聚蛋白胨5g/L、β -甘油磷酸二钠 19g/L、抗坏血酸0. 5g/L、牛肉浸膏2. 5g/L、七水合硫酸镁I. 2g/L和琼脂粉2. 5g/L。
[0117] 培养温度为28°C，培养周期24h，培养pH为5。
[0118] 效果实施例1
[0119] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD401和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（购自新西兰Westland合作乳业有限公司）中，置于30°C恒温培养箱培养24小时， 活化2代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的 脱脂乳培养基中，置于30°C恒温培养箱培养24小时进行扩大培养，重复3次，获得培养物。
[0120] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD401和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为1: 1: 1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0121] 效果实施例2干酪发酵剂生产高达干酪
[0122] DlOOkg鲜牛乳（购自金山牧场）经过滤，添加0.01 %氯化钙，搅拌均匀，在72°C， 15s巴氏杀菌后冷却至30°C，所述百分比为质量百分比。将效果实施例1制得的干酪发酵 剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 7cfu/mL，缓慢搅 拌15min。静置32°C发酵至pH降低0· 2之后加入20mg/100L凝乳酶（购自丹尼斯克公司） (其中，凝乳酶在使用前用10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），30min后得 凝乳。
[0123] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长5mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后15min后排 出总体积35%的乳清；分2次加入50°C、体积为鲜牛乳总体积25%的水，搅拌20min至凝 块温度达到35°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水12°C盐渍20h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，10°C、湿度90% RH，成熟5周，即得年轻高达干酪。
[0124] 效果实施例3干酪的感官评价
[0125] 本次感官评定人员包括12名从事食品研宄的人员，均熟悉感官评定注意事项和 评分标准。总分为50分，分数评定遵照表5。各评定员独立进行评定，每次更换样品时使用 清水漱口，结果如表6所示。其中，对照组为使用直投式干酪发酵剂CHOOZIT RM 32 (购自 丹尼克斯（中国）有限公司），按照效果实施例2的步骤所制得的干酪。
[0126] 表5干酪感官评定方法
[0127]
[0129] 表6干酪感官评定结果
[0130]
[0131] 表6的结果说明，商业发酵剂制作的高达干酪（对照组）在质地方面与效果实施 例2所得的干酪之间的差异并不显著；在滋气味评分中，效果实施例2所得的干酪在干酪特 有的干酪特征滋气味和苦味方面的评分以及总分都高于对照组。因此，效果实施例2所得 的干酪具有良好的质地以及更好的滋气味。
[0132] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)，其特征在于，其保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.10751。2. -种制备乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo.10751的方法，其特征在于，其包括以下的 步骤，在培养基中培养乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo.10751即可。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养基为MRS培养基、Ml7agar培养 基或脱脂乳培养基；所述的MRS培养基包括如下的组成成分：蛋白胨8~12g/L、牛肉膏9~ 12g/L、葡萄糖15~20g/L、酵母膏4~6g/L、朽1檬酸按1. 8~2g/L、磷酸氢二钾1. 8~2.Og/ L、乙酸钠4. 8~5. 2g/L、硫酸镁0? 5~0? 6g/L、硫酸锰0? 5~0? 55g/L和吐温80~85g/L; 和/或，所述的M17agar培养基包括如下的组成成分：植物蛋白胨4. 5~5. 5g/L、酵母提取 物4~5g/L、聚蛋白胨4~5g/L、|3 -甘油磷酸二钠18~20g/L、抗坏血酸0? 4~0? 5g/L、 牛肉浸膏2. 2~2. 8g/L、七水合硫酸镁1~I. 5g/L和琼脂粉2. 5~3g/L。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的MRS培养基包括如下的组成成分： 蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/ L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 5g/L和吐温80g/L;所述脱脂乳培养基为10%脱 脂乳培养基，所述百分比为质量百分比；和/或，所述的M17agar培养基包括如下的组成成 分：植物蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、聚蛋白胨5g/L、|3 -甘油磷酸二钠19g/L、抗坏血酸 0. 5g/L、牛肉浸膏2. 5g/L、七水合硫酸镁I. 2g/L和琼脂粉2. 5g/L。5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为25~35°C;所述培养的 时间为24~72小时；和/或，所述培养的pH为4~6。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为28~30°C;所述培养的 时间为24~48小时；和/或，所述培养的pH为4~5。7. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养前还包括使用种子培养基进行 种子培养的步骤，所述的种子培养基为脱脂乳培养基；所述的脱脂乳培养菌经过115°C、 15~20min灭菌；所述种子培养的时间为16~32小时；所述种子培养的温度为28~32°C; 所述种子培养的接种量为1~2%，所述百分比为体积百分比；和/或，所述种子培养的活 化的代数为2~4代。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基为10~12 %脱脂乳培养 基，所述的百分比为质量百分比；述种子培养的时间为16~24小时；和/或，所述种子培养 的活化的代数为2~3代。9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子培养包括升温的步骤；和/或，所 述升温的温度为10~34°C，较佳地为20~28°C。10. 如权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo.10751在干酪生产中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、制备方法及其在干酪生产中的应用。该乳酸乳球菌乳酸亚种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.10751。其在乳中生长性能良好，噬菌体抗性佳，产酸速度适中，用于生产干酪风味良好，得率高。可用于制备干酪的发酵剂，并应用于干酪或者其他的发酵食品加工工艺中。CGMCC No.1075120150427CGMCC No.1075220150427CGMCC No.1074920150427CGMCC No.1075020150427
【IPC分类】C12R1/01, C12N1/20, A23C19/032
【公开号】CN104894038
【申请号】CN201510379257
【发明人】黄宜, 焦晶凯, 刘振民, 莫蓓红, 韩瑨
【申请人】光明乳业股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月1日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及一种乳酸乳球菌乳酸亚种及其在干酪生产中的 应用。
【背景技术】
[0002] 干酪，又名奶酪，有各式各样的味道、口感和形式。干酪以奶类为原料，含有丰富的 蛋白质和脂质，具有很高的营养价值。随着我国人民生活水平的提高，对干酪的需求量越来 越多。在干酪生产和成熟过程中微生物菌群起着重要的作用，促进了产品的质构和风味的 形成。干酪的主发酵剂对干酪质构和特征风味的形成起了极其重要的作用。主发酵剂在干 酪生产过程中产酸，能够提高凝乳酶的活性，有助于排除乳清、抑制有害细菌生长，并产生 各种酶参与干酪特征风味与质构的形成。
[0003] 大多数干酪的生产需要在凝乳前添加不同种类的乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB)，它们的主要作用是在干酪制作过程中产酸，干酪生产过程中一个关键点即 为乳酸菌乳糖代谢为乳酸，其酸化的速度和程度影响凝乳的效果和干酪得率并影响凝乳酶 的活性。LAB有时也能够产生乙酸、乙醛和双乙酰等风味物质。发酵剂一般可以分为两类，嗜 温性发酵剂（即最适培养温度为30°C )和嗜热性发酵剂（即最适培养温度为42°C )。嗜温性 发酵剂中通常包含乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus Iactis)和明串珠菌（Leuconostoc spp.)等，嗜热性发酵剂通常包括嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)和保加利亚 乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus)等。现今使用的大部分发酵剂直接由凝乳再次培养 而得，而这些凝乳本身是经过长期的大规模优质干酪的生产实践中挑选出来的，通常含有 2~6株菌，所以在某种程度上，目前大部分的发酵剂可被称为混合发酵剂。国内在发酵剂 方面的研宄主要集中于适用于酸奶的嗜热性发酵剂。
[0004] 目前，国内对嗜温新的发酵剂研宄很少，主要热衷于酸奶发酵剂（主要是嗜热性 乳酸菌）的筛选及制备的研宄，而对可用于干酪生产的嗜温性乳酸菌的筛选研宄较少，对 于干酪用菌体系的筛选标准方面更是空白。因此，利用中国丰富的菌种资源开发适用于全 新的干酪发酵剂的发酵菌株具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对目前缺乏用于干酪生产的、嗜中温的、从我 国国内菌种资源中获得的乳酸乳球菌乳酸亚种的不足，提供一种乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcus lactis subsp. Iactis)及其在干酪生产中的应用。所述的乳酸乳球菌乳酸 亚种可以用于制备用于干酪生产的嗜温型乳酸菌发酵剂。
[0006] 本发明的技术方案之一是：一种乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus Iactis subsp. lactis)，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为： CGMCC No. 10751。
[0007] 从我国西藏的奶疙瘩样品中分离而得，获得所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751。所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751在乳中生长良好，产酸速度适 中，用于生产干酪风味良好，得率高。对该菌株进行鉴定，结果为乳酸乳球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp.lactis，命名为 BD164。该菌株已于 2015 年 4 月 27 日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并收到保藏中心登记入册编号CGMCC No. 10751，其具有以下的微生物学特性：
[0008] 1、形态学的特性
[0009] 在Ml7agar培养基培养24小时后，菌落呈乳白色，菌落较小，圆形凸起，有光泽，菌 体呈卵圆形。之后迅速生长，2天后菌落大而紧密，呈乳白色略带黄色。
[0010] 2、培养学的特性
[0011] 在酸性（PH5.0)、高盐浓度（4% NaCl，所述百分比为质量百分比）环境下生长良 好；在15~30°C下生长良好；在40°C，2小时的干酪切割升温工艺条件下存活性良好。
[0012] 3、生理特性
[0013] 产酸能力强，产酸速度较快；凝乳速度快，凝乳黏度适中；发酵特征方面，能析出 乳清，凝乳组织状态好、香气浓郁；蛋白水解能力较强，能够将蛋白质分解为多肽、氨基酸或 其它无机、有机小分子物质；并具有噬菌体抗性。
[0014] 本发明的技术方案之二是：一种制备所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751 的方法，其包括以下的步骤，在培养基中培养所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751 即可。
[0015] 其中，所述的培养基为本领域常规的培养基，能够生长所述的乳酸乳球菌乳酸亚 种CGMCC No. 10751即可，较佳地为MRS培养基、M17agar培养基或脱脂乳培养基。所述的 MRS培养基为本领域常规的MRS培养基，较佳地，其包括如下的组成成分：蛋白胨8~12g/ L、牛肉膏9~12g/L、葡萄糖15~20g/L、酵母膏4~6g/L、朽1檬酸按1. 8~2g/L、磷酸氢 二钾L 8~2. 0g/L、乙酸钠4. 8~5. 2g/L、硫酸镁0· 5~0· 6g/L、硫酸锰0· 5~0· 55g/L 和吐温80~85g/L。更佳地，其包括如下的组成成分：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖 20g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰 0. 5g/L和吐温80g/L。所述脱脂乳培养基为本领域常规的脱脂乳培养基，较佳地为10 %脱 脂乳培养基。将脱脂乳粉溶解于水中混合即得所述脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂 乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比。所述的M17agar培养基为本领域常规 的M17agar培养基，较佳地，其包括如下的组成成分：植物蛋白胨4. 5~5. 5g/L、酵母提取 物4~5g/L、聚蛋白胨4~5g/L、β -甘油磷酸二钠18~20g/L、抗坏血酸0· 4~0· 5g/L、 牛肉浸膏2. 2~2. 8g/L、七水合硫酸镁1~I. 5g/L和琼脂粉2. 5~3g/L。更佳地，其包 括如下的组成成分：植物蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、聚蛋白胨5g/L、β -甘油磷酸二钠 19g/L、抗坏血酸0. 5g/L、牛肉浸膏2. 5g/L、七水合硫酸镁I. 2g/L和琼脂粉2. 5g/L。
[0016] 所述培养的温度为本领域常规的温度，能够生长所述的乳酸乳球菌乳酸亚种 CGMCC No. 10751即可，较佳地为25~35°C，更佳地为28~30°C。所述培养的时间为本领 域常规的时间，较佳地为24~72小时，更佳地为24~48小时。所述培养的pH为本领域 常规的pH，能够生长所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751，较佳地为4~6,更佳地 为4~5〇
[0017] 较佳地，所述的培养前还包括使用种子培养基进行种子培养的步骤。所述的种子 培养为本领域常规的种子培养。所述的种子培养基为本领域常规的种子培养基，较佳地为 脱脂乳培养基，更佳地为10~12%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。所述的脱 脂乳培养菌经过115°C、15~20min灭菌。所述种子培养的时间为本领域常规的时间，较佳 地为16~32小时，更佳地为16~24小时。所述种子培养的温度为本领域常规的温度，较 佳地为28~32°C。所述种子培养的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1~2%，所 述百分比为体积百分比。所述种子培养的活化的代数为本领域常规的代数，较佳地为2~ 4代，更佳地为2~3代。较佳地，所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751为冻存状 态，所述种子培养包括升温的步骤。所述升温的温度为本领域常规的温度，较佳地为10~ 34°C，更佳地为20~28°C。
[0018] 所述培养的方法为本领域常规的培养的方法，较佳地为摇瓶培养或发酵罐培养。
[0019] 本发明提供的技术方案之三是：所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751在 干酪生产中的应用。
[0020] 所述的干酪为本领域常规的干酪，较佳地为高达干酪、切达干酪和帕马森干酪。更 佳地为高达干酪。
[0021] 所制得的干酪质地紧密，弹性适中，色泽微黄且均匀，具有成熟干酪特征香味和滋 味，用该菌种制备的干酪得率高，可在冷藏情况下存放10~24个月无乳清析出或酸败。
[0022] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0023] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0024] 本发明的积极进步效果在于：本发明提供一种乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751，其在乳中生长性能良好，噬菌体抗性佳，产酸速度适中，用于生产干酪风味良好， 得率高。可用于制备干酪的发酵剂，并应用于干酪或者其他的发酵食品加工工艺中。
[0025] 牛物材料保藏信息
[0026] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD164,已于2015年4月27日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10751，培养物名称是BD164,分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0027] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD401，已于2015年4月27日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10752,培养物名称是BD401，分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0028] 本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263,已于2015年4月27保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10749,培养物名称是BD2263,分类命名是乳酸乳 球菌乳酸亚种 Lactococcus lactis subsp. lactis。
[0029] 本发明的肠膜明串珠菌LM79,已于2015年4月27日保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮 编：100101，保藏编号为：CGMCC No. 10750,培养物名称是LM79,分类命名是肠膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroides。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0031] 实施例1乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的获得
[0032] (1)、活化：将取自西藏的奶疙瘩样品从冻存管中取出，以2% (v/v)的接种量接 种于经过了 121°C、15分钟灭菌的M17肉汤培养基中（M17肉汤培养基为不含有琼脂的 M17Agar培养基，购自英国OXOID公司）30°C培养36小时，连续培养3代，获得活化的菌种。
[0033] (2)、模拟干酪成熟环境选择：将步骤⑴所得的活化的菌种以2% (v/v)的接种 量接种于氯化钠含量4 %、pH5的10 %脱脂乳培养基（脱脂乳粉购自新西兰Westland合 作乳业有限公司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂 乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比）中，30°C培养16小时得培养液。将 培养液按照GB4789. 2-2010所述的菌落总数测定方法进行平板计数。测得活菌总数达到 ^ 106cfu/mL。
[0034] 设对照组：将步骤⑴所得的生长良好的菌种以2% (v/v)的接种量接种于未添 加氯化钠、未调节pH的10%脱脂乳培养基中，30°C培养16小时，得培养液。将培养液按照 GB4789. 2-2010所述的步骤方法处理后，37°C培养48小时。
[0035] 48小时后，通过平板计数法测定，活菌总数达到多107cfu/mL。
[0036] (3)、按温度选择：
[0037] b)将步骤⑵所得的生长良好的菌株以2% (v/v)的接种量接种于未添加氯化 钠、未调节pH的10%脱脂乳培养基的三角瓶中，15°C培养16小时，得培养液b ;
[0038] c)将步骤（2)所得的生长良好的菌株以2% (v/v)的接种量接种于未添加氯化 钠、未调节pH的10%脱脂乳培养基的三角瓶中，30°C培养16小时，得培养液c ;
[0039] d)将步骤⑵所得的生长良好的菌株以2% (v/v)的接种量接种于未添加氯化 钠、未调节pH的10%脱脂乳培养基的三角瓶中，30°C培养14小时后，于40°C水浴2小时， 得培养液d。
[0040] 将培养液b、培养液C和培养液d按照GB4789. 2-2010所述的菌落总数测定方法进 行平板计数。
[0041] 选择满足b)中活菌总数达到彡105cfu/mL、c)中活菌总数达到彡10 7cfu/mL且 106cfu/mL彡d)中活菌总数达到彡104cfu/mL条件的菌株，命名为BD164。
[0042] 将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164于2015年4月27日在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，获得保藏编号为：CGMCC No. 10751，培养物名称是 BD164,分类命名是乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactis。
[0043] 实施例2乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的形态学和培养学特征
[0044] 培养特征：采用M17agar培养基30°C培养乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 107512 天后，观察培养特征。
[0045] 表1乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751在培养基上的培养特征
[0046]
[0047] 表1的结果说明，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751在M17agar培养基上生长 良好，培养24小时后，菌落呈乳白色，菌落较小，圆形凸起，有光泽，菌体卵圆形。之后迅速 生长，2天后菌落大而紧密，呈乳白色略带黄色。
[0048] 实施例3乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的生理生化特征
[0049] a)、产酸性能
[0050] 将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按1% (v/v)的接种量接种于装有灭菌 的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30°C恒温培养箱培养，每3小时取出一支三角瓶，以未接 种乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的脱脂乳培养基作为对照，测pH值，结果如表2所 不O
[0051] 表2乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的产酸速率
[0052]
[0053] 由表2可知，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751产酸速度较慢，24小时后，pH 仅为4. 68,产酸力较强，可以用于原料奶的预酸化速度，而酸的形成有利于强化凝乳酶的功 能作用和乳中钙的溶解，便于凝乳块的形成。
[0054] b)、在脱脂乳中的凝乳时间和凝乳黏度测定
[0055] 将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按1% (v/v)的接种量接种于装有灭菌 的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30°C恒温培养箱培养，直至其凝乳，4°C环境下保持24小 时。凝乳后用旋转黏度计（购自德国ProRheo公司）分别测定各发酵酸乳的黏度（m · Pa/ s)。测定时选用2号转子，速度为64r/s。测定时每15s取值一次，测定时间为3min，结果 如表3所示。由表3可知，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751凝乳速度快，凝乳黏度较 尚。
[0056] 表3乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的凝乳时间和凝乳黏度
[0057]
[0058] c)、发酵特性测试
[0059] 将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按1 % (v/v)的接种量接种于装有灭菌的 10%脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30°C恒温培养箱培养，直至其凝乳，考察其凝乳风味、 乳清析出状况和凝块的质地，结果如表4所示。
[0060] 表4乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵特性
[0061]
[0062] d)、蛋白水解能力测试
[0063] 福林（Folin)-酷试剂法测定菌株的蛋白水解能力：取ImL样品溶液，加入2. 5mL 0. 28M NaOH溶液，混匀，于25°C左右放置lOmin。再加入0. 75mL福林酚试剂（购自国药 试剂），立即摇勾，于35°C左右反应15min，在660nm下使用紫外分光光度计（购自上海天 美科学仪器有限公司）测定其吸光值。所述的样品溶液为：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按1% (v/v)的接种量接种于装有灭菌的脱脂乳培养基的三角瓶中，置于30°C恒 温培养箱培养24小时后的悬浮液。结果发现，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的OD66tl 为0. 82。说明乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751蛋白水解能力较强，而在干酪成熟过程 中，发酵剂菌株能够将蛋白质分解为多肽、氨基酸或其它无机、有机小分子物质，对干酪风 味的形成起着重要作用。
[0064] e)、噬菌体抗性
[0065] 将发酵异常（干酪用菌不产酸或产酸极为缓慢且凝乳异常即为发酵异常。）的干 酪用原料乳（从光明乳业研宄院中试车间处获得）作为样品，将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751按2% (v/v)的接种量接种于装有样品的三角瓶中，置于30°C恒温培养箱发酵培 养12小时。测定发酵培养的发酵液的pH值，发现Λ pH多0. 5,说明乳酸乳球菌乳酸亚种 CGMCC No. 10751具有噬菌体抗性。
[0066] 由实施例2~3的数据说明，所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751具有以下 的微生物学特性：
[0067] 1、形态学的特性
[0068] 在Ml7agar培养基培养24小时后，菌落呈乳白色，菌落较小，圆形凸起，有光泽，菌 体卵圆形。之后迅速生长，2天后菌落大而紧密，呈乳白色略带黄色。
[0069] 2、培养学的特性
[0070] 在酸性（PH5.0)、高盐浓度（4% NaCl，所述百分比为质量百分比）环境下生长良 好；在15~30°C下生长良好；在40°C，2小时的干酪切割升温工艺条件下存活性良好。
[0071] 3、生理特性
[0072] 产酸能力强，产酸速度较慢；凝乳速度相对较快，凝乳黏度较高；发酵特征方面， 能析出乳清，凝乳组织状态好、香气浓郁；蛋白水解能力较强，能够将蛋白质分解为多肽、氨 基酸或其它无机、有机小分子物质；并具有噬菌体抗性。
[0073] 实施例4乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的16S rDNA序列分析
[0074] 16S rDNA序列分析：利用27F，1492R引物扩增乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的16S rDNA片段，纯化，回收，然后使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序（上海 派森诺生物科技有限公司）。结果发现，乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751与乳酸乳球 菌乳酸亚种标准株Lactococcus lactis subsp. Iactis I11403strain IL1403 的 16S rDNA 序列的同源性为100%。由于当16S rDNA序列同源性高于97%时，可以认为是属内同种， 因此酸乳球菌CGMCC No. 10751属于乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)ο
[0075] 其中，如上所述的引物对序列为：27F :agagtttgat cctggctcag ;1492R : ctacggctaccttgttacga(核苷酸序列分别如序列表SEQIDN0·2和SEQIDN0·3所示）。 乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO. 1所示。
[0076] 实施例5乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0077] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至10 °C。
[0078] 种子培养基：10%脱脂乳培养基（脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公 司，将脱脂乳粉溶解于水中混合即得脱脂乳培养基，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱 脂乳粉和所述水总质量的质量百分比），所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经过 115°C、15min 灭菌。
[0079] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化2代。
[0080] 发酵培养基：蛋白胨8g/L、牛肉膏9g/L、葡萄糖15g/L、酵母膏4g/L、梓檬酸按 I. 8g/L、磷酸氢二钾I. 8g/L、乙酸钠4. 8g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 5g/L和吐温80g/L。
[0081] 培养温度为25°C，培养周期72h，培养pH为4。
[0082] 实施例6乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0083] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至20 °C。
[0084] 种子培养基：12%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、20min 灭菌。
[0085] 种子瓶中种子培养基的培养温度32°C，培养周期16h，接种量为2%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化4代。
[0086] 发酵培养基：蛋白胨12g/L、牛肉膏12g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏6g/L、柠檬酸铵 2g/L、磷酸氢二钾2. 0g/L、乙酸钠5. 2g/L、硫酸镁0. 6g/L、硫酸锰0. 55g/L和吐温85g/L。
[0087] 培养温度为35°C，培养周期24h，培养pH为6。
[0088] 实施例7乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0089] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至28 °C。
[0090] 种子培养基：12%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、20min 灭菌。
[0091] 种子瓶中种子培养基的培养温度32°C，培养周期16h，接种量为2%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化3代。
[0092] 发酵培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵 2g/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 5g/L和吐温80g/L。
[0093] 培养温度为28°C，培养周期48h，培养pH为5。
[0094] 实施例8乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0095] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至34°C。
[0096] 种子培养基：10%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、15min 灭菌。
[0097] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化2代。
[0098] 发酵培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵 2g/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 5g/L和吐温80g/L。
[0099] 培养温度为30°C，培养周期48h，培养pH为5。
[0100] 实施例9乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0101] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至20 °C。
[0102] 种子培养基：10%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、15min 灭菌。
[0103] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化4代。
[0104] 发酵培养基：植物蛋白胨4. 5g/L、酵母提取物4g/L、聚蛋白胨4g/L、β -甘油磷酸 二钠18g/L、抗坏血酸0. 4g/L、牛肉浸膏2. 2g/L和七水合硫酸镁lg/L以及琼脂粉2. 5g/L。
[0105] 培养温度为35°C，培养周期24h，培养pH为4。
[0106] 实施例10乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0107] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至28 °C。
[0108] 种子培养基：12%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、15min 灭菌。
[0109] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化2代。
[0110] 发酵培养基：植物蛋白胨5. 5g/L、酵母提取物5g/L、聚蛋白胨5g/L、β -甘油磷酸 二钠20g/L、抗坏血酸0. 5g/L、牛肉浸膏2. 8g/L和七水 合硫酸镁I. 5g/L以及琼脂粉3g/L。
[0111] 培养温度为30°C，培养周期48h，培养pH为4。
[0112] 实施例11乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751的发酵
[0113] 将冻存的所述乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC No. 10751缓慢升温至34°C。
[0114] 种子培养基：10%脱脂乳培养基，所述的百分比为质量百分比。该脱脂乳培养菌经 过 115°C、20min 灭菌。
[0115] 种子瓶中种子培养基的培养温度28°C，培养周期32h，接种量为1%，所述的百分 比为占发酵培养基的体积百分比。在种子培养基中活化3代。
[0116] 发酵培养基植物蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、聚蛋白胨5g/L、β -甘油磷酸二钠 19g/L、抗坏血酸0. 5g/L、牛肉浸膏2. 5g/L、七水合硫酸镁I. 2g/L和琼脂粉2. 5g/L。
[0117] 培养温度为28°C，培养周期24h，培养pH为5。
[0118] 效果实施例1
[0119] (1)将乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、乳酸乳球菌乳酸 亚种BD401和肠膜明串珠菌LM79按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的脱脂乳 培养基（购自新西兰Westland合作乳业有限公司）中，置于30°C恒温培养箱培养24小时， 活化2代，得活化的菌株。将活化的菌株按2% (v/v)的接种量接种于10% (w/v)灭菌的 脱脂乳培养基中，置于30°C恒温培养箱培养24小时进行扩大培养，重复3次，获得培养物。
[0120] (2)将步骤（1)所得的培养物获得乳酸乳球菌乳酸亚种BD164、乳酸乳球菌乳酸亚 种BD2263、乳酸乳球菌乳酸亚种BD401和肠膜明串珠菌LM79,然后按照所述乳酸乳球菌乳 酸亚种BD401、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD2263、所述乳酸乳球菌乳酸亚种BD164和所述肠 膜明串珠菌LM79的活菌数为1: 1: 1:1的比例混合，得干酪发酵剂。
[0121] 效果实施例2干酪发酵剂生产高达干酪
[0122] DlOOkg鲜牛乳（购自金山牧场）经过滤，添加0.01 %氯化钙，搅拌均匀，在72°C， 15s巴氏杀菌后冷却至30°C，所述百分比为质量百分比。将效果实施例1制得的干酪发酵 剂倒入巴氏杀菌后的鲜牛乳中，使鲜牛乳中的干酪发酵剂的活菌数达到10 7cfu/mL，缓慢搅 拌15min。静置32°C发酵至pH降低0· 2之后加入20mg/100L凝乳酶（购自丹尼斯克公司） (其中，凝乳酶在使用前用10倍质量的无菌水溶解，搅拌2min使其溶解均匀），30min后得 凝乳。
[0123] 2)将步骤1)制得的凝乳切割成边长5mm的立方体的凝块，缓慢搅拌后15min后排 出总体积35%的乳清；分2次加入50°C、体积为鲜牛乳总体积25%的水，搅拌20min至凝 块温度达到35°C。继续搅拌至排出的乳清pH为6.1，排掉全部乳清。之后将凝块入模、压 榨成形、脱模取出。使用浓度为20%的盐水12°C盐渍20h，所述百分比为质量百分比。之后 真空包装，10°C、湿度90% RH，成熟5周，即得年轻高达干酪。
[0124] 效果实施例3干酪的感官评价
[0125] 本次感官评定人员包括12名从事食品研宄的人员，均熟悉感官评定注意事项和 评分标准。总分为50分，分数评定遵照表5。各评定员独立进行评定，每次更换样品时使用 清水漱口，结果如表6所示。其中，对照组为使用直投式干酪发酵剂CHOOZIT RM 32 (购自 丹尼克斯（中国）有限公司），按照效果实施例2的步骤所制得的干酪。
[0126] 表5干酪感官评定方法
[0127]
[0129] 表6干酪感官评定结果
[0130]
[0131] 表6的结果说明，商业发酵剂制作的高达干酪（对照组）在质地方面与效果实施 例2所得的干酪之间的差异并不显著；在滋气味评分中，效果实施例2所得的干酪在干酪特 有的干酪特征滋气味和苦味方面的评分以及总分都高于对照组。因此，效果实施例2所得 的干酪具有良好的质地以及更好的滋气味。
[0132] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis)，其特征在于，其保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.10751。2. -种制备乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo.10751的方法，其特征在于，其包括以下的 步骤，在培养基中培养乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo.10751即可。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养基为MRS培养基、Ml7agar培养 基或脱脂乳培养基；所述的MRS培养基包括如下的组成成分：蛋白胨8~12g/L、牛肉膏9~ 12g/L、葡萄糖15~20g/L、酵母膏4~6g/L、朽1檬酸按1. 8~2g/L、磷酸氢二钾1. 8~2.Og/ L、乙酸钠4. 8~5. 2g/L、硫酸镁0? 5~0? 6g/L、硫酸锰0? 5~0? 55g/L和吐温80~85g/L; 和/或，所述的M17agar培养基包括如下的组成成分：植物蛋白胨4. 5~5. 5g/L、酵母提取 物4~5g/L、聚蛋白胨4~5g/L、|3 -甘油磷酸二钠18~20g/L、抗坏血酸0? 4~0? 5g/L、 牛肉浸膏2. 2~2. 8g/L、七水合硫酸镁1~I. 5g/L和琼脂粉2. 5~3g/L。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的MRS培养基包括如下的组成成分： 蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/ L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 5g/L和吐温80g/L;所述脱脂乳培养基为10%脱 脂乳培养基，所述百分比为质量百分比；和/或，所述的M17agar培养基包括如下的组成成 分：植物蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、聚蛋白胨5g/L、|3 -甘油磷酸二钠19g/L、抗坏血酸 0. 5g/L、牛肉浸膏2. 5g/L、七水合硫酸镁I. 2g/L和琼脂粉2. 5g/L。5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为25~35°C;所述培养的 时间为24~72小时；和/或，所述培养的pH为4~6。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为28~30°C;所述培养的 时间为24~48小时；和/或，所述培养的pH为4~5。7. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养前还包括使用种子培养基进行 种子培养的步骤，所述的种子培养基为脱脂乳培养基；所述的脱脂乳培养菌经过115°C、 15~20min灭菌；所述种子培养的时间为16~32小时；所述种子培养的温度为28~32°C; 所述种子培养的接种量为1~2%，所述百分比为体积百分比；和/或，所述种子培养的活 化的代数为2~4代。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基为10~12 %脱脂乳培养 基，所述的百分比为质量百分比；述种子培养的时间为16~24小时；和/或，所述种子培养 的活化的代数为2~3代。9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子培养包括升温的步骤；和/或，所 述升温的温度为10~34°C，较佳地为20~28°C。10. 如权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCCNo.10751在干酪生产中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、制备方法及其在干酪生产中的应用。该乳酸乳球菌乳酸亚种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.10751。其在乳中生长性能良好，噬菌体抗性佳，产酸速度适中，用于生产干酪风味良好，得率高。可用于制备干酪的发酵剂，并应用于干酪或者其他的发酵食品加工工艺中。CGMCC No.1075120150427CGMCC No.1075220150427CGMCC No.1074920150427CGMCC No.1075020150427
【IPC分类】C12R1/01, C12N1/20, A23C19/032
【公开号】CN104894038
【申请号】CN201510379257
【发明人】黄宜, 焦晶凯, 刘振民, 莫蓓红, 韩瑨
【申请人】光明乳业股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月1日
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