可提升甘油代谢的菌株及其应用
可提升甘油代谢的菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明关于一种利用基因工程技术构建的菌株，且特别涉及一种可提升甘油代谢 的菌株、以及此菌株的应用。
【背景技术】
[0002] 当今全球环保意识当道，生质柴油便顺此潮流迅速发展，台湾更于2010年起全面 推动B2生质柴油。生质柴油的制造还伴随副产物的产生，鉴于生质柴油的发展，副产物的 数量亦急剧上升，于是产生大量待处理的废弃物。副产物中的甘油（为与后文提及的"纯净 的甘油"区别，特称之为"粗甘油"）因与其它物质混合，如甲醇、动植物脂肪、或盐类，须经 过精制来得到纯净的甘油，纯净的甘油始有经济价值，可用于化妆品、药品、或其它应用。目 前，粗甘油的精制大多是仰赖与添加的化学物质反应，甚至可能须于高温下作用，以分离出 纯净的甘油。生质柴油虽然诉求环保与低污染，但粗甘油的精制却需要如此不环保的过程， 这与生质柴油的诉求背道而驰。
[0003] 生物科技是二十一世纪发展的重点产业之一，其核心是在利用生物材料替代化学 物质。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli)因生长快速、培养基配方简单、且发酵操作容 易，为常见的生物材料之一。除此之外，大肠杆菌能代谢多种不同的碳源，如醣类或甘油，已 广泛取代与其等效的化学物质。然而，就粗甘油而言，因其所含的物质会对菌株构成逆境环 境，从而抑制菌株的生长与稳定性，甚至降低菌株的甘油代谢。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一构想关于一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含一 λ噬菌体Pk启动子、及一 Trc启动子。λ噬菌体Pk启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调 控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的表达，而Trc启动 子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。
[0005] 本发明的第二构想关于一种可抵抗粗甘油的菌株，其属于大肠杆菌，且为利用一 含以下步骤的方法制得的：培养上一构想的菌株于一第一培养液内；以及培养上一构想的 菌株于一第二培养液内，第二培养液的粗甘油浓度高于第一培养液的粗甘油浓度。
[0006] 本发明的第三构想关于一种可生产D型乳酸的菌株，其属于大肠杆菌，且为剔除 前一构想的菌株染色体上的Pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、pflB基因 、tdcDE 基因操纵组、PflEF基因操纵组、及did基因，并插入乳酸菌D-Idh基因至前一构想的菌株 染色体而制得的。
【附图说明】
[0007] 图1为大肠杆菌的甘油代谢的生化途径图，图中符号说明为：?，代表活化基因的 表达；_〇，代表抑制基因的表达。
[0008] 图2为质粒pLoxKm-PR的图谱，图中缩写说明为：Ap，抗氨苄青霉素基因 (ampicillin) ;flori，噬菌体 fl 复制起始点；PR promoter，λ 噬菌体？!^启动子；RE, Lox 位；EM7promoter，细菌EM7启动子；Neo (Km)，抗新霉素基因（抗卡纳霉素基因）；LE，Lox位； ColElori,大肠杆菌ColEl复制起始点。
[0009] 图3为质粒pTH19Cre_Cs的图谱，图中缩写说明为：Cm，抗氯霉素基因； pSClOlori，pSClOl复制起始点；Cre，编码Cre蛋白的基因 ；BAD promoter，BAD启动 子；Operator 11+12,操纵子 11+12 ;CAP site，CAP 结合位；Operatorl，操纵子 01 ;araC promoter，AraC启动子；Operator 02,操纵子02 ;ara C，编码AraC蛋白的基因。
[0010] 图4为质粒pLoxKm-Trc的图谱，图中缩写说明为：Ap，抗氨节青霉素基因 (ampicillin) 噬菌体 Π 复制起始点；Trc promoter, Trc 启动子；RE, Lox 位； EM7promoter,细菌EM7启动子；Neo (Km)，抗新霉素基因（抗卡纳霉素基因）；LE, Lox位； ColElori,大肠杆菌ColEl复制起始点。
[0011] 图5为使用分光光度计测量含菌株BLA-13的培养液在每次继代培养时菌体浓度 的结果，以显示菌株在每次继代培养的生长情况。
[0012] 图6为使用高效率液相层析测量含菌株BLA-13的培养液于每次继代培养时甘油 浓度的结果，以显示菌株于每次继代培养的甘油代谢情况。
[0013] 图7为菌株BLA-13及菌株BLA-13-G于培养后的生长情况与粗甘油代谢情况，图 中曲线说明为：实心方框的曲线，含菌株BLA-13的培养液的菌体浓度；空心方框的曲线，含 菌株BLA-13-G的培养液的菌体浓度；实心圆框的曲线，含菌株BLA-13的培养液的粗甘油浓 度；空心圆框的曲线，含菌株BLA-13-G的培养液的粗甘油浓度。
[0014] 图8为菌株BLA-13-G9于发酵后的的生长情况、粗甘油代谢情况、及D型乳酸 生产情况，图中曲线说明为：实心圆框的曲线，含菌株BLA-13-G9的发酵液的菌体浓度； 实心三角框的曲线，含菌株BLA-13-G9的发酵液的粗甘油浓度；实心方框的曲线，含菌株 BLA-13-G9的发酵液的D型乳酸浓度。 具体实施例
[0015] 如图1，大肠杆菌的甘油代谢的生化途径主要分为：有氧代谢与无氧代谢。在有氧 代谢途径中，菌株是将甘油先转化成甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G3P)，接着将 甘油-3-磷酸转化为二轻丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate, DHAP);然而，在无氧代 谢途径中，其是将甘油先转化为二羟基丙酮（dihydroxyacetone，DHA)，然后将二羟基丙酮 转化为二羟丙酮磷酸。而，有氧代谢途径与无氧代谢途径中的上述步骤的差异意味着涉及 这些不同步骤的酵素的基因可能与氧气的调控有关。换言之，gldA基因、或dhaKLM基因操 纵组的启动子可能为一缺氧（hypoxia)有关的调控组件，glpK基因、或glpD基因的启动子 可能为一有氧（hyperoxia)有关的调控组件。
[0016] 根据上述，本发明人推测若利用基因工程技术将一与氧气无关的启动子取代此二 代谢途径中不同步骤的酵素的基因启动子，则菌株不再受有氧或无氧的影响，可同时活化 甘油的有氧代谢途径与无氧代谢途径，双管齐下地提升甘油代谢。
[0017] 于是，本发明的第一实施方式提出一种可提升甘油代谢的菌株。此菌株属于大肠 杆菌，且含有一 λ噬菌体Pk启动子、及一 Trc启动子；其中，λ噬菌体Pk启动子为镶嵌于 菌株的染色体上，以调控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵 组的表达，而Trc启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。前 述基因名称的全名，如下：dhaKLM，二羟基丙酮激酶（dihydroxyacetone kinase);gldA，甘 油去氢!酶（glycerol dehydrogenase) ;glpD，甘油 _3_ 憐酸去氧酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase) ;glpF，传送甘油的辅助蛋白（glycerol uptake facilitator protein); glpK，甘油激酶（glycerolkinase )。
[0018] 在本实施方式中，λ噬菌体？,启动子可镶嵌于glpK基因、glpD基因、gldA基因、 及dhaKLM基因操纵组的上游区域，Trc启动子可镶嵌于glpF基因的上游区域。
[0019] 在本实施方式中，λ噬菌体Pk启动子可取代glpK基因、glpD基因、gldA基因、及 dhaKLM基因操纵组的上游区域的启动子，Trc启动子可取代glpF基因的上游区域的启动 子。
[0020] 再如图1，可调控glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组表达的 λ噬菌体Pk启动子、与可调控glpF基因表达的Trc启动子均属一与氧气无关的启动子。也 就是说，无论在有氧或无氧下，这些基因均为活化的，可大量地表现其产物酵素，从而使甘 油代谢的有氧代谢途径及无氧代谢途径可同时进行。通过这种方式，本实施方式的菌株可 大幅地提升甘油的代谢。此外，本实施方式的菌株的品系原则上不受到任何限制，而于本实 施方式中，其品系为BL21。
[0021] 本发明人更发现第一实施方式的菌株经设计过的演化导引法驯育后，驯育后的菌 株不仅保有提升甘油代谢的能力，还对粗甘油产生抵抗性。
[0022] 于是，本发明的第二实施方式提出一种可抵抗粗甘油的菌株。此菌株属于大肠杆 菌，且为利用一含以下步骤的方法制得的：培养第一实施方式的菌株于一第一培养液内； 以及培养第一实施方式的菌株于一第二培养液内，第二培养液的粗甘油浓度高于第一培养 液的粗甘油浓度。而，本实施方式的菌株已于2014年3月2日保藏于中国典型培养物保藏 中心（CCTCC)，保藏单位地址：武汉市武昌区珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心（邮 编：430072)，保藏号 CCTCCM2014055。
[0023] 在本实施方式中，第一培养液的粗甘油浓度可为30g/L，第二培养液的粗甘油浓度 可为70g/L。
[0024] 在本实施方式中，第一阶段培养步骤的时间可为24小时，第二阶段培养步骤的时 间可为70小时。
[0025] 在本实施方式中，第一培养液及第二培养液，除了粗甘油外，均还可包含一 NBS 培养基。而，NBS培养基的配方为：25. 7mM的磷酸二氢钠（NaH2P04)、28. 7mM的磷酸氢二 钾（K2HPO4)、26. 5mM 的磷酸氢二铵（（NH4) 2HP04)、ImM 的硫酸镁（MgSO4)、0.1 mM 的氯化钙 (CaCl2)、0. 015mM 的硫胺盐酸（thiaminehydrochloric acid)、ImM 的甜菜喊（betaine)、 5.9以]?的氯化铁^6(：13)、0.84]\1的氯化钴（(：〇(：12)、0.64]\1的氯化铜（(：11(：1 2)、1.54]\1的硫 酸锌（ZnS04)、0. 8 μ M 的钥酸钠（Na2Mo04)、及 0· 8 μ M 的硼酸（H3B03)。
[0026] 另外，S. Mazumdar 等人已于 Appl Environ Microbiol. 2010; 76 (13) : 4327-36 成 功地发表一株新颖大肠杆菌菌株，且菌株染色体上的frdA基因、pta基因、与adhE基因已 被剔除。发表的菌株能将40g/L的甘油发酵成32g/L的D型乳酸。据此，本发明人推测若 能部分地仿效此文献剔除第二实施方式的菌株染色体上的部分基因，则此菌株可能会有较 文献记载优异的甘油转化成D型乳酸的能力。
[0027] 于是，本发明的第三实施方式提出一种可生产D型乳酸的菌株。此菌株属于大肠 杆菌，且为剔除第二实施方式的菌株染色体上的Pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、 PflB基因、tdcDE基因操纵组、pfIEF基因操纵组、及did基因、并插入乳酸菌D-Idh基因至 第二实施方式的菌株染色体而制得的。前述基因名称的全名，如下：adhE，乙醛辅酶A/乙 醇去氢酶（acetaldehyde-coA/alcohol dehydrogenase) ;dld，D 型乳酸去氢酶（D-lactate dehydrogenase) ;frdA，富马酸还原酶（fumarate reductase) ;D_ldh，D 型乳酸去氢酶 (D-lactate dehydrogenase) ;mgsA，丙酮醒合成酶（methylglyoxal synthase) ;pflB，甲基 乙醜转移酶（formate acetyltransferase) ;pflEF，丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate fomate lyase) ;pta，憐酸乙醜转移酶（phosphate acetyltransferase) ;tdcDE，丙酮酸甲酸裂解酶 (pyruvate fornate lyase)。
[0028] 于本实施方式中，乳酸菌为Lactobacillus helveticus。
[0029] 又如图1，一方面，本实施方式的菌株的染色体缺少pta基因、adhE基因、frdA基 因、mgsA基因、pflB基因、tdcDE基因操纵组、pflEF基因操纵组、及did基因，因此这些基 因为不活化的，且菌株缺乏其产物酵素。如此，本实施方式的菌株的甘油代谢途径可引导至 D型乳酸的生产，而大量地制造 D型乳酸。
[0030] 另一方面，本实施方式的菌株的染色体还有外源性基因乳酸菌D-Idh基因，其产 物酵素可促进丙酮酸转化成D型乳酸，同样地可大量地制造 D型乳酸。
[0031] 现以下述具体例，详细说明本发明的实施方式。
[0032] 《实验方法与材料》
[0033] 下文实施例采用的实验方法与材料可参考本发明所属技术领域人士熟悉的工具 书：Sambrook J. , et al. , 2001, Molecular Cloning:a Laboratory Manual, 3rd ed·,如限 制酶剪切 DNA 片段（DNA cleavage by restriction enzyme)、T4DNA 连接酶连接 DNA 片段 (DNA ligation with T4DNA ligase)、及聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction, PCR)等均可通过上述工具书及所属技术领域人士本身的专业素养来实施。
[0034] 细菌培养液的菌体浓度是使用分光光度计（Thermo Co.)测得的，而测量使用的光 波长为550nm，测量结果纪录为0D550。细菌及噬菌体的染色体、质粒、及DNA片段的纯化是 各利用 Blood&Tissue Genomic Mini Kit (Viogene Co. )、Plasmid Extraction Mini Kit (Favorgen Co.)、及 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit (Geneaid Co.)等商业套组 完成的。限制酶购自New England Biolabs、及Thermo Co.。T4DNA连接酶、与Pfu DNA聚 合酶购自Promega Co.。聚合酶连锁反应使用的引物为委托明欣生物科技公司、及源资生物 科技公司合成的。转化使用的细胞为大肠杆菌DH5a (Statagene Co.)、与BL21 (Promega Co.)，而菌株培养于液态培养基。经转化后，菌株则培养于含抗生素的液态培养基，抗生 素的剂量如：1〇〇 μ g/mL的氨节青霉素（ampicillin)、50 μ g/mL的卡纳霉素（kanamycin)、 15 μ g/mL 的正大霉素（gentamycin)、或 50 μ g/mL 的氯霉素（chloramphenicol)。
[0035] 针对下述实施例使用的"化学转化法"、"电穿孔法（electroporation)"、"原位聚 合酶连锁反应"、及"高效率液相层析（high pressure liquid chromatography, HPLC)"于 下做详细介绍：
[0036] I、化学转化法
[0037] 从固态培养基中挑选单一菌落至液态培养基，并于适当温度下，以150rpm震荡培 养12至16小时。将菌液接种到新鲜液态培养基，其菌体起始浓度为0D550 = 0. 08,并在适 当温 度下，以150rpm震荡培养。直到菌体浓度0D550 = 0. 3至0. 5,取出4mL的菌液至无菌 试管中，冰浴10分钟，然后以4000rpm离心2分钟并移除上清液。将剩下的菌体与2mL的 0.1 M氯化镁均匀混合后，冰浴5分钟，再以4000rpm离心2分钟并移除上清液。将离心剩 余的菌体与I. 5mL的0. 05M氯化钙均匀混合后，冰浴20分钟，再以4000rpm离心2分钟并 移除上清液。加入300 μ L的0. 05M氯化钙与离心残存的菌体均匀混合后，则制得感受态细 胞（competentcell)〇
[0038] 接着，取2ng/mL的质粒与100 μ L的感受态细胞加入至无菌试管中并混合均匀。 冰浴30分钟后，将无菌试管移至42°C恒温水浴槽中2分钟，再冰浴5分钟。加入ImL的新 鲜液态培养基（4°C)至感受态细胞菌液后，置于适当温度中培养2小时，再以4000rpm离心 10分钟并移除上清液。将残存的液态培养基与离心下来的感受态细胞菌体混合均匀后，吸 取适量的感受态细胞菌液，均匀涂在含抗生素的固态培养基，并将其置于适当温度的恒温 培养箱中，隔夜培养至长出菌落。
[0039] II、电穿孔法
[0040] 从固态培养基中挑选单一菌落至含适当量的抗生素的液态培养基，并于适当温度 下，以150rpm震荡培养12至16小时。将菌液接种到新鲜液态培养基，其菌体起始浓度为 OD55tl = 0· 08,并在适当温度下，以150rpm震荡培养。直到菌体浓度OD55tl = 0· 3至0· 5,取 出20mL的菌液至无菌试管中，冰浴10分钟，然后以4000rpm离心2分钟并移除上清液。将 剩下的菌体与5mL的10%甘油均匀混合后，于4°C下以4000rpm离心10分钟并移除上清液。 将离心剩余的菌体与5mL的10%甘油均匀混合后，于4°C下以4000rpm离心10分钟并移除 上清液。加入240 μ L的10%甘油与离心残存的菌体均匀混合后，则制得感受态细胞。
[0041] 接着，取500ng/mL的线性DNA与40 μ L的感受态细胞加入至电穿管中并混合均 匀。冰浴1分钟后，以250奥姆、2500伏特的条件电击感受态细胞，接着迅速加入2mL的SOC 培养基（98mL的SOB培养基、ImL的2M硫酸镁、及ImL的2M葡萄糖，其中SOB培养基的配方 为：20g/L的胰蛋白（tryptone)、5g/L的酵母萃取物（yeast extract)、0. 584g/L的氯化钠、 0. 186g/L的氯化钾、及980mL的水)。于适当温度下培养SOC培养基2小时后，以4000rpm 离心10分钟并移除上清液。将残存的SOC培养基与离心下来的感受态细胞菌体混合均匀 后，吸取适量的感受态细胞菌液，均匀涂布在含抗生素的固态培养基，并将其置于适当温度 的恒温培养箱中，隔夜培养至长出菌落。
[0042] III、原位聚合酶连锁反应
[0043] 将50m μ L的反应物（Ix聚合酶连锁反应缓冲液、0. 2 μ M的dNTP、1 μ M的正向引 物、1 μ M的反向引物、I. 25U的聚合酶、及去离子水）加入至微量试管内。从固态LB培养基 挑选单一菌落，并与反应物混合。将微量试管置于热循环器内，对菌落进行聚合酶连锁反 应。
[0044] IV、高效率液相层析
[0045] 取500μ L的菌株发酵培养液后，离心并取上清液来进行高效率液相层析。 利用此层析测量发酵培养液的甘油浓度时，分析管柱尺寸为7. 8mmX300mm (ICSep ICE-C0REGEL87H3Column)，移动相为 0. 0085N 的硫酸，流速为 0. 6mL/min，温度为 80°C，分析 体积为20 μ L。利用此层析测量发酵培养液的有机酸浓度时，分析管柱尺寸为6. 5mmX300mm (ICS印 ICE-0RH-801Column)，移动相为 0. 0085N 的硫酸，流速为 0. 4mL/min，温度为 55°C， 紫外线波长为210nm，分析体积为20 μ L。
[0046] 《实施例1》
[0047] I、λ噬菌体Pr启动子取代glpK基因的启动子
[0048] 依美国国家生物科技信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因体数据库设计以下引物：
[0049] 正向引物：5，-attgggtaccacttcactttggt-3，（SEQ ID NO :1);
[0050] 反向引物：5，-ggtggcggccgctcgacttcgagcagactcatc-3，（SEQ ID NO :2)。
[0051] 正向引物设计有限制酶KpnI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 NotI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其 进行PCR，扩增出一含glpK基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约l.Okb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制酶 KpnI 及 NotI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+) (Stratagene Co.)后，使用限制酶KpnI及NotI剪切纯化的质粒。接着，利用 T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆 菌DH5 α内，而得到一含glpK基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-glpK。
[0052] 依质粒pBlue-glpK设计以下引物：
[0053] 正向引物：5，-agggggatccgtttaattgtcccgtagtca-3，（SEQ ID NO :3);
[0054] 反向引物：5，-gatccatatgactgaaaaaaaatatatcgt-3，（SEQ ID NO :4)。
[0055] 正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-glpK为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一含glpK基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约3. 8kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及NdeI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR(其 图谱如图2)后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合 剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得 到一质粒pBlue-glpK' -Iox,其依序含有glpK基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基 因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpK基因的部分区域。
[0056] 依质粒pBlue-glpK' -Iox设计以下引物：
[0057] 正向引物：5，-cgtcacgttttaaatgctcg-3，（SEQ ID NO :5);
[0058] 反向引物：5，-ccattgacgggttttgccatg-3，（SEQ ID NO :6)。
[0059] 以质粒pBlue-glpK' -Iox为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线 性DNA片段(约I. 76kb)，其依序含有glpK基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、 LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpK基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"将协助质粒pKD46 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97 (16) :6640-5)送至大肠杆菌 BL21 内，得到一转化菌 株BLA-8/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-8/pKD46。 培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ -Red蛋白质， 以协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度 提高至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态 LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，而其染色体依序含有glpK基 因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpK基因的 部分区域。
[0060] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As (其图谱如图3)至挑选的菌落内。 培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋 白质，以协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小 时后，将培养温度提高至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于 固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体 PR启动子但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-9。
[0061] II、λ噬菌体PR启动子取代glpD基因的启动子
[0062] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0063] 正向引物：5，-attgggtacccagaagtagcacgagtacgag-3，（SEQ ID NO :7);
[0064] 反向引物：5，-gtggcggccgctgccgtgataacacatcaccatc-3，（SEQ ID NO :8)。
[0065] 正向引物设计有限制酶KpnI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 NotI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其 进行PCR，扩增出一含glpD基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约0.9kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制酶 KpnI 及 NotI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶KpnI及NotI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切 的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一 含glpD基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-glpD。
[0066] 依质粒pBlue-glpD设计以下引物：
[0067] 正向引物：5，-tgggggatccgctgccctcattcactttc-3'（SEQ ID NO :9);
[0068] 反向引物：5，-gatccatatggaaaccaaagatctgattg-3，（SEQ ID NO :10)。
[0069] 正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-glpD为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一含glpD基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约3. 8kb)。利 用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及 NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR 后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质 粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒 pBlue-glpD' -Iox,此依序含有glpD基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因 、LoxP 位、λ噬菌体PR启动子、及glpD基因的部分区域。
[0070] 依质粒pBlue-glpD' -Iox设计以下引物：
[0071] 正向引物：5，-tcagtagcacttcacgttcag-3，（SEQ ID NO :11);
[0072] 反向引物：5，-atcgcgaatatcgaccagcac-3'（SEQ ID NO :12)。
[0073] 以质粒pBlue-glpD' -Iox为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线 性DNA片段(约I. 62kb)，其依序含有glpD基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、 LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpD基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46 至菌株BLA-9内，得到一转化菌株BLA-9/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片 段送至转化菌株BLA-9/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质 粒PKD46表达λ-Red蛋白质，以协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培 养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌 体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落， 其染色体依序含有glpD基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体 PR启动子、及glpD基因的部分区域。
[0074] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，以协助菌 株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述「原位聚合酶连锁反应」挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含 抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-10。
[0075] III、Trc启动子取代glpF基因的启动子
[0076] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0077] 正向引物：5，-gagcctcgagtgatgagtctgctcgaagtc-3，（SEQ ID NO :13);
[0078] 反向引物：5，-gagctctagagcttccagtttctcaaacacttc-3，（SEQ ID NO :14)。
[0079] 正向引物设计有限制酶XhoI剪切的位置（如底线标记处)，反向引物设计有限 制酶XbaI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二 引物对其进行PCR，扩增出一含glpF基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约 0.8kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制 酶XhoI及XbaI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒 pBluescript II KS(+)后，使用限制酶XhoI及XbaI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连 接酶 接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α 内，而得到一含glpF基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-glpF。
[0080] 依质粒pBlue-glpF设计以下引物：
[0081] 正向引物：5，-tgggggatcctgaagagttaatgtttgttg-3，（SEQ ID NO :1δ);
[0082] 反向引物：5，-gatccatatgagtcaaacatcaaccttga-3'（SEQ ID NO :16)。
[0083] 正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-glpF为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一含glpF基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约3. 7kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及NdeI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用PlasmidExtraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-Trc(其 图谱如图4)后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合 剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得 到一质粒pBlue-glpF' -Iox,此依序含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基 因、LoxP位、Trc启动子、及glpF基因的部分区域。
[0084] 依质粒pBlue-glpF' -Iox设计以下引物：
[0085] 正向引物：5，-ctttgcgcttgtcgaaacag-3，（SEQ ID NO :17);
[0086] 反向引物：5，-tcctgaattgcaaggcgttg-3，（SEQ ID NO :18)。
[0087] 以质粒pBlue-glpF' -Iox为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性 DNA片段(约I. 8kb)，其依序含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因 、LoxP 位、Trc启动子、及glpF基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯 化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46至菌株BLA-IO内， 得到一转化菌株BLA-10/pKD46。依上述「电穿孔法」，将纯化的线性DNA片段送至转化菌 株BLA-10/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表 达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小时 后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含 卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述的"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体 依序含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、Trc启动子、及glpF 基因的部分区域。
[0088] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体含有Trc启动子但未含抗抗生素 基因的菌落，并培育成菌株，命名为BLA-11。
[0089] IV、λ噬菌体PR启动子取代gldA基因的启动子
[0090] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0091] 正向引物：5，-ccggaggtaccatgaaatgtgccagtgc-3，（SEQ ID NO :19);
[0092] 反向引物：5，-gtactgagctcgtacggttcaggagctg-3，（SEQ ID NO :20)。
[0093] 正向引物设计有限制酶XhoI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 SacI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其 进行PCR，扩增出一含gldA基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约I. 8kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制酶 XhoI 及 SacI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶XhoI及SacI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切 的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一 含gldA基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-gldA。
[0094] 依质粒pBlue-gldA设计以下引物：
[0095] 正向引物：5，-accggatccttgctcctttagagatgagtagtgc-3，（SEQ ID NO :21);
[0096] 反向引物：5，-gagcacatatggaccgcattattcaatcac-3'（SEQ ID NO :22)。
[0097] 正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-gldA为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一含gldA基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约3. 4kb)。利 用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及 NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR 后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质 粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒 pBlue-gldA'-lox，此依序含有gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、 λ噬菌体PR启动子、及gldA基因的部分区域。
[0098] 依质粒pBlue-gldA' -Iox设计以下引物：
[0099] 正向引物：5，-ccatgaaatgtgccagtgc-3，（SEQ ID NO :23);
[0100] 以质粒pBlue-gldA'-lox为模板，并利用此引物与SEQ ID NO :20的引物对其进行 PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 7kb)，其依序含有gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗 抗生素基因、λ噬菌体PR启动子、LoxP位、及gldA基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质 粒PKD46至菌株BLA-Il内，得到一转化菌株BLA-ll/pKD46。依上述「电穿孔法」，将纯化的 线性DNA片段送至转化菌株BLA-I l/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿 拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ -Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。 于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清 液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑 选出一菌落，其染色体依序含有gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因 、LoxP 位、λ噬菌体PR启动子、及gldA基因的部分区域。
[0101] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-AS至挑选的菌落内。培养转化菌株于 SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的 染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提 升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使 用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含抗 抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-12。
[0102] V、λ噬菌体PR启动子取代dhaKLM基因操纵组的启动子
[0103] 依质粒pLoxKm-PR设计以下引物：
[0104] 正向引物：5，-catcattgatcaattttttcatatggatcaacctcctta_3，（SEQ ID NO :24);
[0105] 反向引物：5，-gtcgttgaacatcatccatgcccattaatgtcgacgatcc_3，（SEQ IDNO :25)。
[0106] 以质粒pLoxKm-PR为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段(约 1.17kb)，其依序含有LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子。
[0107] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0108] 正向引物：5，-ttgttcgtccagtacgtcttgcacatcattgatcaattttttcat-3，（SEQ ID NO :26);
[0109] 反向引物：5，-ttcatcggcagtcagtggtcgccgtgtcgttgaacatcatccatg-3，（SEQ ID NO :27)。
[0110] 以前述的DNA片段为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出另一 DNA片段(约 I. 2kb)，其依序含有dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、 λ噬菌体PR启动子、及dhaKLM基因操纵组的部分区域。
[0111] 以前述另一 DNA片段设计以下引物：
[0112] 正向引物：5，-gctttcgccagtcctgccagttgttcgtccagtacgtctt-3，（SEQ ID NO : 28)；
[0113] 反向引物：5，-ccttgcctgatgcacaatggattcatcggcagtcagtggt-3，（SEQ ID NO : 29)。
[0114] 以前述另一 DNA片段为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片 段(约I. 25kb)，其依序含有dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、 LoxP位、PR启动子、及dhaKLM基因操纵组的部分区域，再利用Ge I /PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46 至前述菌株BLA-12内，得到一转化菌株BLA-12/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性 DNA片段送至转化菌株BLA-12/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖 诱发质粒PKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C 下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残 存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一 菌落，其染色体依序含有dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP 位、λ噬菌体PR启动子、及dhaKLM基因操纵组的部分区域。
[0115] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含 抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13。
[0116] 《实施例2》
[0117] 本实施例主要是分析菌株BLA-13对纯净的甘油的代谢效果。首先，从固态培养基 中挑选菌株BLA-13的单一菌株后，培养于5mL的液态LB培养基，并于37°C下，以200rpm震 荡培养至隔夜。将菌液接种至含NBS培养基与35g/L的纯甘油的培养液中，其菌体起始浓 度为0D550 = 2.0。接种的菌液于37°C下以150rpm震荡培养，并于培养48小时后，重新接 种至另一含NBS培养基与35g/L的纯甘油的培养液中，其菌体起始浓度为0D550 = 2. 0。而 自第一次接种到第二次接种称为"一次继代培养"，并于第一次接种起每隔24小时取培养 液进行分析。
[0118] 如图5所示，为使用分光光度计测量菌液的菌体浓度的结果。从此图可看出：随着 继代培养的次数增加，菌体的浓度亦逐渐增加，而且当继代培养12次后，菌体的浓度可达 0D550=9. 07。
[0119] 如图6所示，为利用上文"高效率液相层析"测量菌液的甘油浓度的结果。从此 图可得到：随着继代培养的次数增加，菌株的甘油代谢速率亦逐渐增加，且当继代培养6次 后，菌株可于48小时内完全代谢培养液中35g/L的纯甘油。
[0120] 《实施例3》
[0121] 从固态培养基中挑选菌株BLA-13的单一菌落后，培养于5mL的液态LB培养基中， 并于37°C下，以200rpm震荡培养隔夜。将菌液接种至含NBS培养基与30g/L的粗甘油的培 养液中，其菌体初始浓度达到0D550 = 0. 2,并于37°C下，以200rpm震荡培养24小时。重 复以上培养步骤，直到细胞密度增加后，再菌液转至含NBS培养基与70g/L的粗甘油的培养 液中，其菌体初始浓度达到0D550 = 0. 2,并于37°C下，以200rpm震荡培养60小时。最后 自培养液中筛选出一菌株，命名为BLA-13-G。
[0122] 接着，将菌株BLA-13和BLA-13-G培养至含NBS培养基与110g/L的粗甘油的培养 液中。如图7所示，为利用上文"高效率液相层析"测量含菌株BLA-13与BLA-13-G的菌液 的粗甘油浓度的结果。由此可知，菌株BLA-13-G可随培养的时间生长并消耗粗甘油；反之， 菌株BLA-13的生长迟缓，且粗甘油的消耗十分缓慢。上述结果证实菌株BLA-13-G具有较 为优异的粗甘油耐受性。
[0123] 《实施例4》
[0124] I、剔除pta基因
[0125] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0126] 正向引物：5，-tgtccaagcttattatgctgatccctacc-3'（SEQ ID NO :30);
[0127] 反向引物：5，-gttcgactagtttagaaatgcgcgcgtc-3，（SEQ ID NO :31)。
[0128] 正向引物设计有限制酶HindIII剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限 制酶SpeI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引 物 对其进行PCR，扩增出一含pta基因的DNA片段(约0. 94kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶HindIII及SpeI剪切纯化的DNA片 段。另外，利用 Plasmid Extraction Mini Kit 纯化质粒 pMCS-5 (Mo Bi Tec.)后，使用限 制酶HindIII及SpeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片 段后，依上文"化学转化法'将接合产物送至大肠杆菌DH5ci内，而得到一含pta基因的质 粒 pMCS-pta。
[0129] 依质粒pMCS-pta设计以下引物：
[0130] 正向引物：5，-acgatgaattccatcagcacatctttctg-3，（SEQ ID NO :32);
[0131] 反向引物：5，-accgtgtcgacggtacctgatcgcgactcgtgc-3，（SEQ ID NO :33)。
[0132] 正向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶Sail剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pMCS-pta为模板，并利用此二引物对其进行 PCR，扩增出一含pta基因的5'端区域及其3'端区域的DNA片段(约3. 5kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及Sal I剪切纯 化的DNA片段。
[0133] 依质粒pLoxGm-PR设计以下引物：
[0134] 正向引物：5，-aagccatatggaattcattaccgttcgtataatgtatgc_3，（SEQ ID NO :34);
[0135] 反向引物：5，-tcgacgtcgacataccgttcgtatagcatacat-3'（SEQ ID NO :35);
[0136] 正向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶Sail剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一 DNA片段(约0. 73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制酶 EcoRI 及 Sal I 剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转 化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒pMCS-ptaGm，此依序含有pta基因 的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta基因的3'端区域。
[0137] 以质粒pMCS-ptaGm为模板，并利用SEQ ID NO :30及SEQ ID NO :31的引物对其进 行PCR，扩增出一线性DNA片段(约1. 3kb )，其依序含有pta基因的5 '端区域、LoxP位、抗抗 生素基因、LoxP位、及pta基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G 内，得到一转化菌株BLA-13-G/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转化 菌株BLA-13-G/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46 表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小 时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含 健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体依 序含有pta基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta基因的3'端区域。
[0138] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏Pta基因但未含抗抗生素基 因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G1。
[0139] II、剔除 adhE 基因
[0140] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0141] 正向引物：5，-gttctgtctgaagacgacac-3，（SEQ ID NO :36);
[0142] 反向引物：5，-ccggtgagctcagacccaagtggtcg-3，（SEQ ID NO :37)。
[0143] 反向引物设计有限制酶SacI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染 色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含adhE基因的DNA片段(约2. 08kb)。 利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶KpnI及 SacI剪切纯化的DNA片段。另外，利用PlasmidExtraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶KpnI及SacI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切 的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一 含adhE基因的质粒pBlue-adhE。
[0144] 依质粒pBlue-adhE设计以下引物：
[0145] 正向引物：5，-cgcagtaactcacgccatgg-3，（SEQ ID NO :38);
[0146] 反向引物：5，-tcagcgaattcatcgataacaactggag-3，（SEQ ID NO :39)。
[0147] 反向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-adhE 为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含adhE基因的5'端区域及其3'端区域的 DNA 片段(约 3. 7kb)。利用 Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后， 使用限制酶EcoRI及HindIII剪切纯化的DNA片段。以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 35的引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段（约(λ 73kb)，其依序 有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化 扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及HindIII剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA 连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内， 而得到一质粒pBlue-adhE-Gm，此依序含有adhE基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、 LoxP位、及adhE基因的3'端区域。
[0148] 依质粒pBlue-adhE-Gm设计以下引物：
[0149] 正向引物：5，-accatcactatcgctgaacc-3，（SEQ ID NO :40)。
[0150] 以质粒pBlue-adhE-Gm为模板，并利用此引物与SEQ ID NO :39的引物对其进行 PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 52kb)，其依序含有adhE基因的5'端区域、LoxP位、抗抗 生素基因、LoxP位、及adhE基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46至菌株 BLA-13-G1内，得到一转化菌株BLA-13-Gl/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA 片段送至转化菌株BLA-13-Gl/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖 诱发质粒PKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C 下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存 的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌 落，其染色体依序含有adhE基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及adhE基 因的3'端区域。
[0151] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏adhE基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G2。
[0152] 111、剔除仕(^基因
[0153] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0154] 正向引物：5，-gaaagtcgacgaatcccgcccagg-3，（SEQ ID NO :41);
[0155] 反向引物：5，-caagaaagcttgttgataagaaagg-3，（SEQ ID NO :42)。
[0156] 以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含 frdA 基因的 DNA 片段（约 3. 52kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment ExtractionKit 纯化扩 增的DNA片段后，使用限制酶PstI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶PstI剪切纯化的质粒。接着，利 用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠 杆菌DH5 α内，而得到一含frdA基因的质粒pBlue-frdA。
[0157] 依质粒pBlue-frdA设计以下引物：
[0158] 正向引物：5，-cacaccatatgttagaattcattaccgttcg-3，（SEQ ID NO :43);
[0159] 反向引物：5，-gatccaggccttaatgtcgacgatcctatacc-3，（SEQ ID NO :44)。
[0160] 正向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-frdA为 模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含frdA基因的5'端区域及其3'端区域的 DNA 片段（约 I. lkb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段 后，使用限制酶NdeI及StuI剪切纯化的DNA片段。以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用此SEQ ID NO :34及SEQ ID NO :35的引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段（约L lkb)，其依序有 LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩 增的DNA片段后，使用限制酶NdeI剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二 纯化的DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质 粒pBlue-frdA-Gm，此依序含有frdA基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及 frdA基因的3'端区域。
[0161] 依质粒质粒pBlue-frdA-Gm设计以下引物：
[0162] 正向引物：5，-ccatatctagactgcagaagggggctccg-3，（SEQ ID NO :45);
[0163] 反向引物：5，-tgaagggtacctgcagctctgccagcttg-3，（SEQ ID NO :46)。
[0164] 以质粒pBlue-frdA-Gm为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA 片段(约I. 9kb)，其依序含有frdA基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及 frdA基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA 片段。利用上述「化学转化法」转化协助质粒PKD46至菌株BLA-13-G2内，得到一转化菌株 BLA-13-G2/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G2/ PKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ -Red 蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小时后，将培养 温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的 固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体依序含有frdA 基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及frdA基因的3'端区域。
[0165] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏frdA基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G3。
[0166] IV、剔除 mgsA 基因
[0167] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0168] 正向引物：5，-taatgagctcttacttcagacggtccgcgag-3，（SEQ ID NO :47);
[0169] 反向引物：5，-taatggtaccctgacgactcgcactttacc-3'（SEQ ID NO :48)。
[0170] 正向引物设计有限制酶SacI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 KpnI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对 其进行PCR，扩增出一含mgsA基因的DNA片段（约0.47kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶SacI及KpnI剪切纯化的DNA片段。 另外，利用 Plasmid Extraction Mini Kit 纯化质粒 pBluescript II KS(+)后，使用限制 酶SacI及KpnI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段 后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一含mgsA基因的质粒 p Blue-mgsA〇
[0171] 依质粒pBlue-mgsA设计以下引物：
[0172] 正向引物：5，-tgattgtcgacaagctttgggatccactaaatgc-3，（SEQ ID NO :49);
[0173] 反向引物：5，-taactgaattctgagatcaatgcgccaac-3，（SEQ ID NO :5〇)。
[0174] 正向引物设计有限制酶Sail剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 EcoRI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-mgsA为模板，并利用此二引物对其进行 PCR，扩增出一含mgsA基因的5'端区域及其3'端区域的DNA片段(约3. 3kb)。利用Gel/ PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及Sal I剪 切纯化的DNA片段。
[0175] 以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO :34及SEQ ID NO :35的引物对其进 行PCR，扩增出一 DNA片段(约0. 73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及Sail 剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转 化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒pBlue-mgsAGm，此依序含有mgsA 基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA基因的3'端区域。
[0176] 以质粒pBlue-mgsAGm为模板，并利用SEQ ID N0:47及SEQ ID N0:48的引物 对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 19kb)，其依序含有mgsA基因的5'端区域、 LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46 至菌株BLA-13-G3内，得到一转化菌株BLA-13-G3/pKD46。依上述「电穿孔法」，将纯化的线 性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G3/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿 拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ -Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。 于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清 液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑 选出一菌落，其染色体依序含有mgsA基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及 mgsA基因的3'端区域。
[0177] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏mgsA基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G4。
[0178] V、剔除pflB基因
[0179] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0180] 正向引物：5，-gaacgatctagaaggtgtaggagataccatc-3，（SEQ ID NO :51);
[0181] 反向引物：5，-gagggtctcgagtccttcctggctgg-3，（SEQ ID NO :52)。
[0182] 以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含 pflB 基因的 DNA 片段(约 I. 9kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增 的DNA片段后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的质粒。接着， 利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大 肠杆菌DH5 α内，而得到一含pf IB基因的质粒pBlue-pf 1B。
[0183] 依质粒pBlue-pflB设计以下引物：
[0184] 正向引物：5，-catcaggtagtcgataccgtacagc-3，（SEQ ID NO :53);
[0185] 反向引物：5，-tgctgaaggcctgtctgcaatcaaatatgc-3，（SEQ ID NO :δ4)。
[0186] 以质粒pBlue-pflB为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pflB 基因的5'端区域及其3'端区域的DNA片段（约I. lkb)，再利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段。
[0187] 以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO :43及SEQ ID NO :44的引物对其进 行PCR，扩增出一 DNA片段(约I. lkb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位，再利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶 接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得 到一质粒pBlue-pflBGm，此依序含有pflB基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因 、LoxP 位、及PflB基因的3'端区域。
[0188] 以质粒pBlue-pflBGm为模板，并利用SEQ ID NO :51及SEQ ID NO :52的引物 对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段(约1.95kb)，其依序含有pflB基因的5'端区域、 LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflB基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46 至菌株BLA-13-G4内，得到一转化菌株BLA-13-G4/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线 性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G4/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿 拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ -Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。 于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清 液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑 选出一菌落，其染色体依序含有PflB基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及 PflB基因的3'端区域。
[0189] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏PflB基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G5。
[0190] VI、剔除tdcDE基因操纵组
[0191] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0192] 正向引物：5，-tgcaatctagaggtgacgatcgacacct-3，（SEQ ID NO :55);
[0193] 反向引物：5，-aacggctcgagtgttgatacctcaatggg-3，（SEQ ID NO :56)。
[0194] 正向引物设计有限制酶XbaI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶XhoI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物 对其进行PCR，扩增出一含tdcDE基因操纵组的DNA片段(约1.81kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶XbaI及XhoI剪切纯化的 DNA 片段。另外，利用 Plasmid Extraction Mini Kit 纯化质粒pBluescript II KS(+)后， 使用限制酶XbaI及XhoI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA 片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5ci内，而得到一含tdcDE基因 操纵组的质粒pBlue-tdcDE。
[0195] 使用限制酶EcoRI及EcoRV剪切质粒pBlue-tdcDE。另外，以质粒pLoxGm-PR为 模板，并利用SEQ ID NO :34及SEQ ID NO :35的引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段 (约0.73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI剪切纯化的DNA片段。接着，利 用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌 DH5 α内，而得到一质粒pBlue-tdcDEGm，此依序含有tdcDE基因操纵组的5'端区域、LoxP 位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE基因操纵组的3'端区域。
[0196] 以质粒pBlue-tdcDEGm为模板，并利用SEQ ID NO :55及SEQ ID NO :56的引物对 其进行PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 74kb)，其依序含有tdcDE基因操纵组的5'端区 域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE基因操纵组的3 '端区域，再利用Ge I /PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质 粒PKD46至菌株BLA-13-G5内，得到一转化菌株BLA-13-G5/pKD46。依上述"电穿孔法"，将 纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G5/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加 入ImM阿拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ -Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同 源重组。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并 移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁 反应"挑选出一菌落，其染色体依序含有tdcDE基因操纵组的5'端区域、LoxP位、抗抗生素 基因、LoxP位、及tdcDE基因操纵组的3'端区域。
[0197] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏tdcDE基因操纵组但未含抗 抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G6。
[0198] VII、剔除pflEF基因操纵组
[0199] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0200] 正向引物：5，-ctcatcctttagctcaggaaag-3，（SEQ ID NO :57);
[0201] 反向引物：5，-gcaactatgattttcaatattcagc-3，（SEQ ID NO :58)。
[0202] 以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含 pflEF 基因操纵组的 DNA 片段（约 3. 67kb)。利用 Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit 纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的DNA片段。另外，利用PIasmi d Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的 质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接 合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一含Pf IEF基因操纵组的质粒pBlue-pf 1EF。
[0203] 依质粒pMCS-patGm设计以下引物：
[0204] 正向引物：5，-gatgcatatgattaccgttcgtataatgtatgc-3，（SEQ ID NO :59);
[0205] 反向引物：5，-tcgacacgcgtataccgttcgtatagcatacat-3'（SEQ ID NO :6〇)。
[0206] 以质粒pMCS-patGm为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含LoxP位、抗 抗生素基因、及 IoxP 位的 DNA 片段（约 0.76kb)。利用 Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，使用限制酶NdeI 及HpaI剪切质粒pBlue-pflEF。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文 "化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒pBlue-pf IEFGm,此依序含 有PflEF基因操纵组的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflEF基因操纵组的 3'端区域。
[0207] 以质粒pBlue-pflEFGm为模板，并利用SEQ ID NO :57及SEQ ID NO :58的引物对 其进行PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 33kb)，其依序含有pflEF基因操纵组的5'端区 域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pf IEF基因操纵组的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质 粒PKD46至菌株BLA-13-G6内，得到一转化菌株BLA-13-G6/pKD46。依上述"电穿孔法"，将 纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G6/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并 加入ImM阿拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体 同源重组。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心 并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连 锁反应"挑选出一菌落，其染色体依序含有Pf IEF基因操纵组的5'端区域、LoxP位、抗抗生 素基因、LoxP位、及pflEF基因操纵组的3'端区域。
[0208] 利用上述「化学转 化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏PfIEF基因操纵组但未含抗 抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G7。
[0209] VIII、剔除 did 基因
[0210] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0211] 正向引物：5，-tgataaagcttgctcgtctggtgggttc-3，（SEQ ID NO :61);
[0212] 反向引物：5，-gtgtcggcttcaatatcacg-3，（SEQ ID NO :62)。
[0213] 正向引物设计有限制酶HindIII剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21 的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含did基因的DNA片段(约 0.68kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制 酶HindIII剪切纯化的DNA片段。另外，利用PlasmidExtraction Mini Kit纯化质粒pMCS5 后，使用限制酶HindIII及EcoRV剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质 粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一含did 基因的5'端区域及其3'端区域的质粒pMCS5-dld。
[0214] 依质粒pMCS5_dld设计以下引物：
[0215] 正向引物：5，-tcgagaattcggtcaggcctgtattgg-3，（SEQ ID NO :63);
[0216] 反向引物：5，-gtggcgtcgacggtaccgaaatgtcgttattcg-3，（SEQ ID NO :64)。
[0217] 正向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶Sail剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pMCS5-dld为模板，并利用此二引物对其进行 PCR，扩增出一含did基因的5'端区域及其3'端区域的DNA片段(约3. 3kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及Sail剪切纯 化的DNA片段。另外，以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用此SEQ ID NO :34及SEQ ID NO :35 的引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段(约0. 73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及 LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制 酶EcoRI及Sail剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片 段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒pMCS-dldGm， 此依序含有did基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及did基因的3'端区 域。
[0218] 以质粒pMCS-dldGm为模板，并利用SEQ ID NO :61及SEQ ID NO :62的引物对其进 行PCR，扩增出一线性DNA片段(约3. 3kb )，其依序含有dld基因的5 '端区域、LoxP位、抗抗 生素基因、LoxP位、及did基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G7 内，得到一转化菌株BLA-13-G7/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转 化菌株BLA-13-G7/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒 PKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌 株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂 抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染 色体依序含有did基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及did基因的3'端 区域。
[0219] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏did基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G8。
[0220] IX、插入乳酸菌 Lactobacillus helveticus 的 D-Idh 基因
[0221] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0222] 正向引物：5，-ctggacatatgacaaaggtttttgcttacg-3，（SEQ ID NO :65);
[0223] 反向引物：5，-ttggggcccaggcctttaaaacttgttcttgttcaaag_3，（SEQ ID NO :66)。
[0224] 正向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 StuI剪切的位置(如底线标记处)。以乳酸菌Lactobacillus helveticus CCRC12936(食品 工业发展研究所）的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含D-Idh基因 的 DNA 片段(约 LOkb)。利用 Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段 后，使用限制酶NdeI及StuI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR后，使用限制酶NdeI及StuI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连 接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α 内，而得到一质粒pLoxKm-D-ldh，其依序含有LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位及D-Idh基 因。
[0225] 依质粒pLoxKm-D-ldh设计以下引物：
[0226] 正向引物：5J -atcacttcccgttccagagcgtcaaggctgatatcgttaaaacttgttcttgttcaa agc-3'（SEQ ID NO :67);
[0227] 反向引物：5J -ggaaacgatggcggcaaactgcacagatgcccagcgtcggatcctataccgttcgta tag-3'（SEQ ID NO :68)。
[0228] 以质粒pLoxKm-D-ldh为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含LoxP位、 抗抗生素基因、LoxP位及D-Idh基因的DNA片段(约2. 2kb)。
[0229] 依DNA片段设计以下引物：
[0230] 正向引物：5' -gcgtgacgccgccgccggacgtgcgaaagaaaatgtcatctttcatcacttcccgtt ccag-3'（SEQ ID NO :69);
[0231] 反向引物：5> -aagcctcgcagaaacacattttgcgttacgccgaactggcggaacgatggcggcaaa ct-3'（SEQ ID NO :70)。
[0232] 以DNA片段为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pfl⑶基因操纵组 的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、D-Idh基因、及pfl⑶基因操纵组的3'端 区域的 DNA 片段（约 2. 28kb)。再利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增 的线性DNA片段。利用上述「化学转化法」转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G8内，得到 一转化菌株BLA-13-G8/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株 BLA-13-G8/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表 达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小 时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于 含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述「原位聚合酶连锁反应」挑选出一菌落，其染色体 依序含有Pfl⑶基因操纵组的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、D-Idh基因、及 Pfl⑶基因操纵组的3'端区域。
[0233] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体镶嵌D-Idh基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G9。
[0234] 《实施例5》
[0235] 本实施例主要为检测菌株BLA-13-G9的D型乳酸发酵能力。首先，从固态培养 基中分别选取菌株BLA-13-G9的单一菌落，培养于5mL的液态LB培养基，并于37°C下，以 200rpm震荡培养至隔夜。将菌液接种至50mL的NBS培养基(含5%的粗甘油)，并于37°C下， 以200印111震荡培养10小时。再将菌液接种至5001^的他3培养基(含5 (%的粗甘油)，并 于37°C下，以200rpm震荡培养10小时。又将菌液接种至含IL的NBS培养基(含5. 5% (约 67. 58g/L)的粗甘油）的发酵槽，其菌体起始浓度0D550 = 1. 33,并于30°C、溶氧度50%、利 用ION氢氧化钠控制的pH7. 0下，进行发酵。于发酵8小时后，将溶氧度控制于3%，并随发 酵时间，取样分析。
[0236] 如图8所示，为利用分光光度计测量发酵液的菌体浓度结果、以及利用上文"高效 率液相层析"测量菌液的甘油与D型乳酸浓度的结果。且根据此图，菌株BLA-13-G9于发酵 60小时后，可消耗60. 83g/L的粗甘油，并产生54. 79g/的D型乳酸，而可推估其D型乳酸的 重量转化率约为90%。
[0237] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，但不能以此限定本发明实施的范围；因此， 凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效改变与修饰，皆仍属本发明 专利涵盖的范围内。
【主权项】
1. 一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含： 一入噬菌体Pk启动子，其镶嵌于该菌株的染色体上，以调控该染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的表达；以及 一Trc启动子，其镶嵌于该菌株的染色体上，以调控该染色体上的glpF基因的表达。2. 如权利要求1所述的可提升甘油代谢的菌株，其品系是为BL21。3. 如权利要求1所述的可提升甘油代谢的菌株，其中该A噬菌体Pk启动子镶嵌于 glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的上游区域，且该Trc启动子镶嵌 于glpF基因的上游区域。4. 如权利要求3所述的可提升甘油代谢的菌株，其中该A噬菌体Pk启动子是取代 glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的上游区域的启动子，且该Trc启 动子是取代glpF基因的上游区域的启动子。5. -种可抵抗粗甘油的菌株，其属于大肠杆菌，且是利用一含以下步骤的方法制得 的： 培养如权利要求1所述的可提升甘油代谢的菌株于一第一培养液内；以及 培养如权利要求1所述的可提升甘油代谢的菌株于一第二培养液内，该第二培养液的 粗甘油浓度高于该第一培养液的粗甘油浓度。6. 如权利要求5所述的可抵抗粗甘油的菌株，其于2014年3月2日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏号CCTCCM2014055。7. 如权利要求5所述的可抵抗粗甘油的菌株，其中该第一培养液的粗甘油浓度是为 30g/L，而该第二培养液的粗甘油浓度是为70g/L。8. 如权利要求7所述的可抵抗粗甘油的菌株，其中该第一阶段培养步骤的时间是为24 小时，且该第二阶段培养步骤的时间是为70小时。9. 如权利要求7所述的可抵抗粗甘油的菌株，其中该第一培养液及该第二培养液均包 含一NBS培养基。10. 如权利要求9所述的可抵抗粗甘油的菌株，其中该NBS培养基的配方为：体积摩尔 浓度为25. 7mM的磷酸二氢钠（NaH2PO4X体积摩尔浓度为28. 7mM的磷酸氢二钾（K2HPO4)、体 积摩尔浓度为26. 5mM的磷酸氢二铵（（NH4)2HP04)、体积摩尔浓度为ImM的硫酸镁（MgS04)、 体积摩尔浓度为0.ImM的氯化I丐（CaCl2)、体积摩尔浓度为0. 015mM的硫胺盐酸（thiamine hydrochloricacid)、体积摩尔浓度为ImM的甜菜碱（betaine)、体积摩尔浓度为5.9iiM 的氯化铁（FeCl3)、体积摩尔浓度为0. 8iiM的氯化钴（CoCl2)、体积摩尔浓度为0. 6iiM的氯 化铜（CuCl2)、体积摩尔浓度为I. 5iiM的硫酸锌（ZnS04)、体积摩尔浓度为0. 8iiM的钥酸钠 (Na2MoO4)、及体积摩尔浓度为0? 8iiM的硼酸（H3BO3X11. 一种可生产D型乳酸的菌株，其属于大肠杆菌，且为剔除如权利要求5所述的可抵 抗粗甘油的菌株染色体上的Pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、pflB基因、tdcDE 基因操纵组、PflEF基因操纵组、及did基因、并插入乳酸菌D-Idh基因至如权利要求5所 述的可抵抗粗甘油的菌株染色体而制得的。12. 如权利要求11所述的可生产D型乳酸的菌株，其中该乳酸菌为 Lactobacillushelveticus〇
【专利摘要】本发明提出一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含一λ噬菌体PR启动子及一Trc启动子，其中λ噬菌体PR启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因及dhaKLM基因操纵组的表达，而Trc启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。本发明更利用此菌株衍生成一种可抵抗粗甘油的菌株、与一种可生产D型乳酸的菌株。CCTCC M201405520140302
【IPC分类】C12R1/225, C12R1/19, C12N1/21
【公开号】CN104894041
【申请号】CN201410075051
【发明人】赵云鹏, 王祉雯, 姜中人
【申请人】逢甲大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月3日
【技术领域】
[0001] 本发明关于一种利用基因工程技术构建的菌株，且特别涉及一种可提升甘油代谢 的菌株、以及此菌株的应用。
【背景技术】
[0002] 当今全球环保意识当道，生质柴油便顺此潮流迅速发展，台湾更于2010年起全面 推动B2生质柴油。生质柴油的制造还伴随副产物的产生，鉴于生质柴油的发展，副产物的 数量亦急剧上升，于是产生大量待处理的废弃物。副产物中的甘油（为与后文提及的"纯净 的甘油"区别，特称之为"粗甘油"）因与其它物质混合，如甲醇、动植物脂肪、或盐类，须经 过精制来得到纯净的甘油，纯净的甘油始有经济价值，可用于化妆品、药品、或其它应用。目 前，粗甘油的精制大多是仰赖与添加的化学物质反应，甚至可能须于高温下作用，以分离出 纯净的甘油。生质柴油虽然诉求环保与低污染，但粗甘油的精制却需要如此不环保的过程， 这与生质柴油的诉求背道而驰。
[0003] 生物科技是二十一世纪发展的重点产业之一，其核心是在利用生物材料替代化学 物质。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli)因生长快速、培养基配方简单、且发酵操作容 易，为常见的生物材料之一。除此之外，大肠杆菌能代谢多种不同的碳源，如醣类或甘油，已 广泛取代与其等效的化学物质。然而，就粗甘油而言，因其所含的物质会对菌株构成逆境环 境，从而抑制菌株的生长与稳定性，甚至降低菌株的甘油代谢。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一构想关于一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含一 λ噬菌体Pk启动子、及一 Trc启动子。λ噬菌体Pk启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调 控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的表达，而Trc启动 子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。
[0005] 本发明的第二构想关于一种可抵抗粗甘油的菌株，其属于大肠杆菌，且为利用一 含以下步骤的方法制得的：培养上一构想的菌株于一第一培养液内；以及培养上一构想的 菌株于一第二培养液内，第二培养液的粗甘油浓度高于第一培养液的粗甘油浓度。
[0006] 本发明的第三构想关于一种可生产D型乳酸的菌株，其属于大肠杆菌，且为剔除 前一构想的菌株染色体上的Pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、pflB基因 、tdcDE 基因操纵组、PflEF基因操纵组、及did基因，并插入乳酸菌D-Idh基因至前一构想的菌株 染色体而制得的。
【附图说明】
[0007] 图1为大肠杆菌的甘油代谢的生化途径图，图中符号说明为：?，代表活化基因的 表达；_〇，代表抑制基因的表达。
[0008] 图2为质粒pLoxKm-PR的图谱，图中缩写说明为：Ap，抗氨苄青霉素基因 (ampicillin) ;flori，噬菌体 fl 复制起始点；PR promoter，λ 噬菌体？!^启动子；RE, Lox 位；EM7promoter，细菌EM7启动子；Neo (Km)，抗新霉素基因（抗卡纳霉素基因）；LE，Lox位； ColElori,大肠杆菌ColEl复制起始点。
[0009] 图3为质粒pTH19Cre_Cs的图谱，图中缩写说明为：Cm，抗氯霉素基因； pSClOlori，pSClOl复制起始点；Cre，编码Cre蛋白的基因 ；BAD promoter，BAD启动 子；Operator 11+12,操纵子 11+12 ;CAP site，CAP 结合位；Operatorl，操纵子 01 ;araC promoter，AraC启动子；Operator 02,操纵子02 ;ara C，编码AraC蛋白的基因。
[0010] 图4为质粒pLoxKm-Trc的图谱，图中缩写说明为：Ap，抗氨节青霉素基因 (ampicillin) 噬菌体 Π 复制起始点；Trc promoter, Trc 启动子；RE, Lox 位； EM7promoter,细菌EM7启动子；Neo (Km)，抗新霉素基因（抗卡纳霉素基因）；LE, Lox位； ColElori,大肠杆菌ColEl复制起始点。
[0011] 图5为使用分光光度计测量含菌株BLA-13的培养液在每次继代培养时菌体浓度 的结果，以显示菌株在每次继代培养的生长情况。
[0012] 图6为使用高效率液相层析测量含菌株BLA-13的培养液于每次继代培养时甘油 浓度的结果，以显示菌株于每次继代培养的甘油代谢情况。
[0013] 图7为菌株BLA-13及菌株BLA-13-G于培养后的生长情况与粗甘油代谢情况，图 中曲线说明为：实心方框的曲线，含菌株BLA-13的培养液的菌体浓度；空心方框的曲线，含 菌株BLA-13-G的培养液的菌体浓度；实心圆框的曲线，含菌株BLA-13的培养液的粗甘油浓 度；空心圆框的曲线，含菌株BLA-13-G的培养液的粗甘油浓度。
[0014] 图8为菌株BLA-13-G9于发酵后的的生长情况、粗甘油代谢情况、及D型乳酸 生产情况，图中曲线说明为：实心圆框的曲线，含菌株BLA-13-G9的发酵液的菌体浓度； 实心三角框的曲线，含菌株BLA-13-G9的发酵液的粗甘油浓度；实心方框的曲线，含菌株 BLA-13-G9的发酵液的D型乳酸浓度。 具体实施例
[0015] 如图1，大肠杆菌的甘油代谢的生化途径主要分为：有氧代谢与无氧代谢。在有氧 代谢途径中，菌株是将甘油先转化成甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G3P)，接着将 甘油-3-磷酸转化为二轻丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate, DHAP);然而，在无氧代 谢途径中，其是将甘油先转化为二羟基丙酮（dihydroxyacetone，DHA)，然后将二羟基丙酮 转化为二羟丙酮磷酸。而，有氧代谢途径与无氧代谢途径中的上述步骤的差异意味着涉及 这些不同步骤的酵素的基因可能与氧气的调控有关。换言之，gldA基因、或dhaKLM基因操 纵组的启动子可能为一缺氧（hypoxia)有关的调控组件，glpK基因、或glpD基因的启动子 可能为一有氧（hyperoxia)有关的调控组件。
[0016] 根据上述，本发明人推测若利用基因工程技术将一与氧气无关的启动子取代此二 代谢途径中不同步骤的酵素的基因启动子，则菌株不再受有氧或无氧的影响，可同时活化 甘油的有氧代谢途径与无氧代谢途径，双管齐下地提升甘油代谢。
[0017] 于是，本发明的第一实施方式提出一种可提升甘油代谢的菌株。此菌株属于大肠 杆菌，且含有一 λ噬菌体Pk启动子、及一 Trc启动子；其中，λ噬菌体Pk启动子为镶嵌于 菌株的染色体上，以调控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵 组的表达，而Trc启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。前 述基因名称的全名，如下：dhaKLM，二羟基丙酮激酶（dihydroxyacetone kinase);gldA，甘 油去氢!酶（glycerol dehydrogenase) ;glpD，甘油 _3_ 憐酸去氧酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase) ;glpF，传送甘油的辅助蛋白（glycerol uptake facilitator protein); glpK，甘油激酶（glycerolkinase )。
[0018] 在本实施方式中，λ噬菌体？,启动子可镶嵌于glpK基因、glpD基因、gldA基因、 及dhaKLM基因操纵组的上游区域，Trc启动子可镶嵌于glpF基因的上游区域。
[0019] 在本实施方式中，λ噬菌体Pk启动子可取代glpK基因、glpD基因、gldA基因、及 dhaKLM基因操纵组的上游区域的启动子，Trc启动子可取代glpF基因的上游区域的启动 子。
[0020] 再如图1，可调控glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组表达的 λ噬菌体Pk启动子、与可调控glpF基因表达的Trc启动子均属一与氧气无关的启动子。也 就是说，无论在有氧或无氧下，这些基因均为活化的，可大量地表现其产物酵素，从而使甘 油代谢的有氧代谢途径及无氧代谢途径可同时进行。通过这种方式，本实施方式的菌株可 大幅地提升甘油的代谢。此外，本实施方式的菌株的品系原则上不受到任何限制，而于本实 施方式中，其品系为BL21。
[0021] 本发明人更发现第一实施方式的菌株经设计过的演化导引法驯育后，驯育后的菌 株不仅保有提升甘油代谢的能力，还对粗甘油产生抵抗性。
[0022] 于是，本发明的第二实施方式提出一种可抵抗粗甘油的菌株。此菌株属于大肠杆 菌，且为利用一含以下步骤的方法制得的：培养第一实施方式的菌株于一第一培养液内； 以及培养第一实施方式的菌株于一第二培养液内，第二培养液的粗甘油浓度高于第一培养 液的粗甘油浓度。而，本实施方式的菌株已于2014年3月2日保藏于中国典型培养物保藏 中心（CCTCC)，保藏单位地址：武汉市武昌区珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心（邮 编：430072)，保藏号 CCTCCM2014055。
[0023] 在本实施方式中，第一培养液的粗甘油浓度可为30g/L，第二培养液的粗甘油浓度 可为70g/L。
[0024] 在本实施方式中，第一阶段培养步骤的时间可为24小时，第二阶段培养步骤的时 间可为70小时。
[0025] 在本实施方式中，第一培养液及第二培养液，除了粗甘油外，均还可包含一 NBS 培养基。而，NBS培养基的配方为：25. 7mM的磷酸二氢钠（NaH2P04)、28. 7mM的磷酸氢二 钾（K2HPO4)、26. 5mM 的磷酸氢二铵（（NH4) 2HP04)、ImM 的硫酸镁（MgSO4)、0.1 mM 的氯化钙 (CaCl2)、0. 015mM 的硫胺盐酸（thiaminehydrochloric acid)、ImM 的甜菜喊（betaine)、 5.9以]?的氯化铁^6(：13)、0.84]\1的氯化钴（(：〇(：12)、0.64]\1的氯化铜（(：11(：1 2)、1.54]\1的硫 酸锌（ZnS04)、0. 8 μ M 的钥酸钠（Na2Mo04)、及 0· 8 μ M 的硼酸（H3B03)。
[0026] 另外，S. Mazumdar 等人已于 Appl Environ Microbiol. 2010; 76 (13) : 4327-36 成 功地发表一株新颖大肠杆菌菌株，且菌株染色体上的frdA基因、pta基因、与adhE基因已 被剔除。发表的菌株能将40g/L的甘油发酵成32g/L的D型乳酸。据此，本发明人推测若 能部分地仿效此文献剔除第二实施方式的菌株染色体上的部分基因，则此菌株可能会有较 文献记载优异的甘油转化成D型乳酸的能力。
[0027] 于是，本发明的第三实施方式提出一种可生产D型乳酸的菌株。此菌株属于大肠 杆菌，且为剔除第二实施方式的菌株染色体上的Pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、 PflB基因、tdcDE基因操纵组、pfIEF基因操纵组、及did基因、并插入乳酸菌D-Idh基因至 第二实施方式的菌株染色体而制得的。前述基因名称的全名，如下：adhE，乙醛辅酶A/乙 醇去氢酶（acetaldehyde-coA/alcohol dehydrogenase) ;dld，D 型乳酸去氢酶（D-lactate dehydrogenase) ;frdA，富马酸还原酶（fumarate reductase) ;D_ldh，D 型乳酸去氢酶 (D-lactate dehydrogenase) ;mgsA，丙酮醒合成酶（methylglyoxal synthase) ;pflB，甲基 乙醜转移酶（formate acetyltransferase) ;pflEF，丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate fomate lyase) ;pta，憐酸乙醜转移酶（phosphate acetyltransferase) ;tdcDE，丙酮酸甲酸裂解酶 (pyruvate fornate lyase)。
[0028] 于本实施方式中，乳酸菌为Lactobacillus helveticus。
[0029] 又如图1，一方面，本实施方式的菌株的染色体缺少pta基因、adhE基因、frdA基 因、mgsA基因、pflB基因、tdcDE基因操纵组、pflEF基因操纵组、及did基因，因此这些基 因为不活化的，且菌株缺乏其产物酵素。如此，本实施方式的菌株的甘油代谢途径可引导至 D型乳酸的生产，而大量地制造 D型乳酸。
[0030] 另一方面，本实施方式的菌株的染色体还有外源性基因乳酸菌D-Idh基因，其产 物酵素可促进丙酮酸转化成D型乳酸，同样地可大量地制造 D型乳酸。
[0031] 现以下述具体例，详细说明本发明的实施方式。
[0032] 《实验方法与材料》
[0033] 下文实施例采用的实验方法与材料可参考本发明所属技术领域人士熟悉的工具 书：Sambrook J. , et al. , 2001, Molecular Cloning:a Laboratory Manual, 3rd ed·,如限 制酶剪切 DNA 片段（DNA cleavage by restriction enzyme)、T4DNA 连接酶连接 DNA 片段 (DNA ligation with T4DNA ligase)、及聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction, PCR)等均可通过上述工具书及所属技术领域人士本身的专业素养来实施。
[0034] 细菌培养液的菌体浓度是使用分光光度计（Thermo Co.)测得的，而测量使用的光 波长为550nm，测量结果纪录为0D550。细菌及噬菌体的染色体、质粒、及DNA片段的纯化是 各利用 Blood&Tissue Genomic Mini Kit (Viogene Co. )、Plasmid Extraction Mini Kit (Favorgen Co.)、及 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit (Geneaid Co.)等商业套组 完成的。限制酶购自New England Biolabs、及Thermo Co.。T4DNA连接酶、与Pfu DNA聚 合酶购自Promega Co.。聚合酶连锁反应使用的引物为委托明欣生物科技公司、及源资生物 科技公司合成的。转化使用的细胞为大肠杆菌DH5a (Statagene Co.)、与BL21 (Promega Co.)，而菌株培养于液态培养基。经转化后，菌株则培养于含抗生素的液态培养基，抗生 素的剂量如：1〇〇 μ g/mL的氨节青霉素（ampicillin)、50 μ g/mL的卡纳霉素（kanamycin)、 15 μ g/mL 的正大霉素（gentamycin)、或 50 μ g/mL 的氯霉素（chloramphenicol)。
[0035] 针对下述实施例使用的"化学转化法"、"电穿孔法（electroporation)"、"原位聚 合酶连锁反应"、及"高效率液相层析（high pressure liquid chromatography, HPLC)"于 下做详细介绍：
[0036] I、化学转化法
[0037] 从固态培养基中挑选单一菌落至液态培养基，并于适当温度下，以150rpm震荡培 养12至16小时。将菌液接种到新鲜液态培养基，其菌体起始浓度为0D550 = 0. 08,并在适 当温 度下，以150rpm震荡培养。直到菌体浓度0D550 = 0. 3至0. 5,取出4mL的菌液至无菌 试管中，冰浴10分钟，然后以4000rpm离心2分钟并移除上清液。将剩下的菌体与2mL的 0.1 M氯化镁均匀混合后，冰浴5分钟，再以4000rpm离心2分钟并移除上清液。将离心剩 余的菌体与I. 5mL的0. 05M氯化钙均匀混合后，冰浴20分钟，再以4000rpm离心2分钟并 移除上清液。加入300 μ L的0. 05M氯化钙与离心残存的菌体均匀混合后，则制得感受态细 胞（competentcell)〇
[0038] 接着，取2ng/mL的质粒与100 μ L的感受态细胞加入至无菌试管中并混合均匀。 冰浴30分钟后，将无菌试管移至42°C恒温水浴槽中2分钟，再冰浴5分钟。加入ImL的新 鲜液态培养基（4°C)至感受态细胞菌液后，置于适当温度中培养2小时，再以4000rpm离心 10分钟并移除上清液。将残存的液态培养基与离心下来的感受态细胞菌体混合均匀后，吸 取适量的感受态细胞菌液，均匀涂在含抗生素的固态培养基，并将其置于适当温度的恒温 培养箱中，隔夜培养至长出菌落。
[0039] II、电穿孔法
[0040] 从固态培养基中挑选单一菌落至含适当量的抗生素的液态培养基，并于适当温度 下，以150rpm震荡培养12至16小时。将菌液接种到新鲜液态培养基，其菌体起始浓度为 OD55tl = 0· 08,并在适当温度下，以150rpm震荡培养。直到菌体浓度OD55tl = 0· 3至0· 5,取 出20mL的菌液至无菌试管中，冰浴10分钟，然后以4000rpm离心2分钟并移除上清液。将 剩下的菌体与5mL的10%甘油均匀混合后，于4°C下以4000rpm离心10分钟并移除上清液。 将离心剩余的菌体与5mL的10%甘油均匀混合后，于4°C下以4000rpm离心10分钟并移除 上清液。加入240 μ L的10%甘油与离心残存的菌体均匀混合后，则制得感受态细胞。
[0041] 接着，取500ng/mL的线性DNA与40 μ L的感受态细胞加入至电穿管中并混合均 匀。冰浴1分钟后，以250奥姆、2500伏特的条件电击感受态细胞，接着迅速加入2mL的SOC 培养基（98mL的SOB培养基、ImL的2M硫酸镁、及ImL的2M葡萄糖，其中SOB培养基的配方 为：20g/L的胰蛋白（tryptone)、5g/L的酵母萃取物（yeast extract)、0. 584g/L的氯化钠、 0. 186g/L的氯化钾、及980mL的水)。于适当温度下培养SOC培养基2小时后，以4000rpm 离心10分钟并移除上清液。将残存的SOC培养基与离心下来的感受态细胞菌体混合均匀 后，吸取适量的感受态细胞菌液，均匀涂布在含抗生素的固态培养基，并将其置于适当温度 的恒温培养箱中，隔夜培养至长出菌落。
[0042] III、原位聚合酶连锁反应
[0043] 将50m μ L的反应物（Ix聚合酶连锁反应缓冲液、0. 2 μ M的dNTP、1 μ M的正向引 物、1 μ M的反向引物、I. 25U的聚合酶、及去离子水）加入至微量试管内。从固态LB培养基 挑选单一菌落，并与反应物混合。将微量试管置于热循环器内，对菌落进行聚合酶连锁反 应。
[0044] IV、高效率液相层析
[0045] 取500μ L的菌株发酵培养液后，离心并取上清液来进行高效率液相层析。 利用此层析测量发酵培养液的甘油浓度时，分析管柱尺寸为7. 8mmX300mm (ICSep ICE-C0REGEL87H3Column)，移动相为 0. 0085N 的硫酸，流速为 0. 6mL/min，温度为 80°C，分析 体积为20 μ L。利用此层析测量发酵培养液的有机酸浓度时，分析管柱尺寸为6. 5mmX300mm (ICS印 ICE-0RH-801Column)，移动相为 0. 0085N 的硫酸，流速为 0. 4mL/min，温度为 55°C， 紫外线波长为210nm，分析体积为20 μ L。
[0046] 《实施例1》
[0047] I、λ噬菌体Pr启动子取代glpK基因的启动子
[0048] 依美国国家生物科技信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因体数据库设计以下引物：
[0049] 正向引物：5，-attgggtaccacttcactttggt-3，（SEQ ID NO :1);
[0050] 反向引物：5，-ggtggcggccgctcgacttcgagcagactcatc-3，（SEQ ID NO :2)。
[0051] 正向引物设计有限制酶KpnI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 NotI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其 进行PCR，扩增出一含glpK基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约l.Okb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制酶 KpnI 及 NotI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+) (Stratagene Co.)后，使用限制酶KpnI及NotI剪切纯化的质粒。接着，利用 T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆 菌DH5 α内，而得到一含glpK基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-glpK。
[0052] 依质粒pBlue-glpK设计以下引物：
[0053] 正向引物：5，-agggggatccgtttaattgtcccgtagtca-3，（SEQ ID NO :3);
[0054] 反向引物：5，-gatccatatgactgaaaaaaaatatatcgt-3，（SEQ ID NO :4)。
[0055] 正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-glpK为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一含glpK基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约3. 8kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及NdeI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR(其 图谱如图2)后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合 剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得 到一质粒pBlue-glpK' -Iox,其依序含有glpK基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基 因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpK基因的部分区域。
[0056] 依质粒pBlue-glpK' -Iox设计以下引物：
[0057] 正向引物：5，-cgtcacgttttaaatgctcg-3，（SEQ ID NO :5);
[0058] 反向引物：5，-ccattgacgggttttgccatg-3，（SEQ ID NO :6)。
[0059] 以质粒pBlue-glpK' -Iox为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线 性DNA片段(约I. 76kb)，其依序含有glpK基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、 LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpK基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"将协助质粒pKD46 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97 (16) :6640-5)送至大肠杆菌 BL21 内，得到一转化菌 株BLA-8/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-8/pKD46。 培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ -Red蛋白质， 以协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度 提高至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态 LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，而其染色体依序含有glpK基 因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpK基因的 部分区域。
[0060] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As (其图谱如图3)至挑选的菌落内。 培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋 白质，以协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小 时后，将培养温度提高至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于 固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体 PR启动子但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-9。
[0061] II、λ噬菌体PR启动子取代glpD基因的启动子
[0062] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0063] 正向引物：5，-attgggtacccagaagtagcacgagtacgag-3，（SEQ ID NO :7);
[0064] 反向引物：5，-gtggcggccgctgccgtgataacacatcaccatc-3，（SEQ ID NO :8)。
[0065] 正向引物设计有限制酶KpnI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 NotI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其 进行PCR，扩增出一含glpD基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约0.9kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制酶 KpnI 及 NotI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶KpnI及NotI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切 的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一 含glpD基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-glpD。
[0066] 依质粒pBlue-glpD设计以下引物：
[0067] 正向引物：5，-tgggggatccgctgccctcattcactttc-3'（SEQ ID NO :9);
[0068] 反向引物：5，-gatccatatggaaaccaaagatctgattg-3，（SEQ ID NO :10)。
[0069] 正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-glpD为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一含glpD基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约3. 8kb)。利 用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及 NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR 后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质 粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒 pBlue-glpD' -Iox,此依序含有glpD基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因 、LoxP 位、λ噬菌体PR启动子、及glpD基因的部分区域。
[0070] 依质粒pBlue-glpD' -Iox设计以下引物：
[0071] 正向引物：5，-tcagtagcacttcacgttcag-3，（SEQ ID NO :11);
[0072] 反向引物：5，-atcgcgaatatcgaccagcac-3'（SEQ ID NO :12)。
[0073] 以质粒pBlue-glpD' -Iox为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线 性DNA片段(约I. 62kb)，其依序含有glpD基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、 LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpD基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46 至菌株BLA-9内，得到一转化菌株BLA-9/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片 段送至转化菌株BLA-9/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质 粒PKD46表达λ-Red蛋白质，以协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培 养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌 体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落， 其染色体依序含有glpD基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体 PR启动子、及glpD基因的部分区域。
[0074] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，以协助菌 株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述「原位聚合酶连锁反应」挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含 抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-10。
[0075] III、Trc启动子取代glpF基因的启动子
[0076] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0077] 正向引物：5，-gagcctcgagtgatgagtctgctcgaagtc-3，（SEQ ID NO :13);
[0078] 反向引物：5，-gagctctagagcttccagtttctcaaacacttc-3，（SEQ ID NO :14)。
[0079] 正向引物设计有限制酶XhoI剪切的位置（如底线标记处)，反向引物设计有限 制酶XbaI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二 引物对其进行PCR，扩增出一含glpF基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约 0.8kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制 酶XhoI及XbaI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒 pBluescript II KS(+)后，使用限制酶XhoI及XbaI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连 接酶 接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α 内，而得到一含glpF基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-glpF。
[0080] 依质粒pBlue-glpF设计以下引物：
[0081] 正向引物：5，-tgggggatcctgaagagttaatgtttgttg-3，（SEQ ID NO :1δ);
[0082] 反向引物：5，-gatccatatgagtcaaacatcaaccttga-3'（SEQ ID NO :16)。
[0083] 正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-glpF为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一含glpF基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约3. 7kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及NdeI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用PlasmidExtraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-Trc(其 图谱如图4)后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合 剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得 到一质粒pBlue-glpF' -Iox,此依序含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基 因、LoxP位、Trc启动子、及glpF基因的部分区域。
[0084] 依质粒pBlue-glpF' -Iox设计以下引物：
[0085] 正向引物：5，-ctttgcgcttgtcgaaacag-3，（SEQ ID NO :17);
[0086] 反向引物：5，-tcctgaattgcaaggcgttg-3，（SEQ ID NO :18)。
[0087] 以质粒pBlue-glpF' -Iox为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性 DNA片段(约I. 8kb)，其依序含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因 、LoxP 位、Trc启动子、及glpF基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯 化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46至菌株BLA-IO内， 得到一转化菌株BLA-10/pKD46。依上述「电穿孔法」，将纯化的线性DNA片段送至转化菌 株BLA-10/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表 达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小时 后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含 卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述的"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体 依序含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、Trc启动子、及glpF 基因的部分区域。
[0088] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体含有Trc启动子但未含抗抗生素 基因的菌落，并培育成菌株，命名为BLA-11。
[0089] IV、λ噬菌体PR启动子取代gldA基因的启动子
[0090] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0091] 正向引物：5，-ccggaggtaccatgaaatgtgccagtgc-3，（SEQ ID NO :19);
[0092] 反向引物：5，-gtactgagctcgtacggttcaggagctg-3，（SEQ ID NO :20)。
[0093] 正向引物设计有限制酶XhoI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 SacI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其 进行PCR，扩增出一含gldA基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约I. 8kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制酶 XhoI 及 SacI 剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶XhoI及SacI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切 的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一 含gldA基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-gldA。
[0094] 依质粒pBlue-gldA设计以下引物：
[0095] 正向引物：5，-accggatccttgctcctttagagatgagtagtgc-3，（SEQ ID NO :21);
[0096] 反向引物：5，-gagcacatatggaccgcattattcaatcac-3'（SEQ ID NO :22)。
[0097] 正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-gldA为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一含gldA基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段(约3. 4kb)。利 用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及 NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR 后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质 粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒 pBlue-gldA'-lox，此依序含有gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、 λ噬菌体PR启动子、及gldA基因的部分区域。
[0098] 依质粒pBlue-gldA' -Iox设计以下引物：
[0099] 正向引物：5，-ccatgaaatgtgccagtgc-3，（SEQ ID NO :23);
[0100] 以质粒pBlue-gldA'-lox为模板，并利用此引物与SEQ ID NO :20的引物对其进行 PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 7kb)，其依序含有gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗 抗生素基因、λ噬菌体PR启动子、LoxP位、及gldA基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质 粒PKD46至菌株BLA-Il内，得到一转化菌株BLA-ll/pKD46。依上述「电穿孔法」，将纯化的 线性DNA片段送至转化菌株BLA-I l/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿 拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ -Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。 于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清 液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑 选出一菌落，其染色体依序含有gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因 、LoxP 位、λ噬菌体PR启动子、及gldA基因的部分区域。
[0101] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-AS至挑选的菌落内。培养转化菌株于 SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的 染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提 升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使 用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含抗 抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-12。
[0102] V、λ噬菌体PR启动子取代dhaKLM基因操纵组的启动子
[0103] 依质粒pLoxKm-PR设计以下引物：
[0104] 正向引物：5，-catcattgatcaattttttcatatggatcaacctcctta_3，（SEQ ID NO :24);
[0105] 反向引物：5，-gtcgttgaacatcatccatgcccattaatgtcgacgatcc_3，（SEQ IDNO :25)。
[0106] 以质粒pLoxKm-PR为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段(约 1.17kb)，其依序含有LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子。
[0107] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0108] 正向引物：5，-ttgttcgtccagtacgtcttgcacatcattgatcaattttttcat-3，（SEQ ID NO :26);
[0109] 反向引物：5，-ttcatcggcagtcagtggtcgccgtgtcgttgaacatcatccatg-3，（SEQ ID NO :27)。
[0110] 以前述的DNA片段为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出另一 DNA片段(约 I. 2kb)，其依序含有dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、 λ噬菌体PR启动子、及dhaKLM基因操纵组的部分区域。
[0111] 以前述另一 DNA片段设计以下引物：
[0112] 正向引物：5，-gctttcgccagtcctgccagttgttcgtccagtacgtctt-3，（SEQ ID NO : 28)；
[0113] 反向引物：5，-ccttgcctgatgcacaatggattcatcggcagtcagtggt-3，（SEQ ID NO : 29)。
[0114] 以前述另一 DNA片段为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片 段(约I. 25kb)，其依序含有dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、 LoxP位、PR启动子、及dhaKLM基因操纵组的部分区域，再利用Ge I /PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46 至前述菌株BLA-12内，得到一转化菌株BLA-12/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性 DNA片段送至转化菌株BLA-12/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖 诱发质粒PKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C 下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残 存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一 菌落，其染色体依序含有dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP 位、λ噬菌体PR启动子、及dhaKLM基因操纵组的部分区域。
[0115] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含 抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13。
[0116] 《实施例2》
[0117] 本实施例主要是分析菌株BLA-13对纯净的甘油的代谢效果。首先，从固态培养基 中挑选菌株BLA-13的单一菌株后，培养于5mL的液态LB培养基，并于37°C下，以200rpm震 荡培养至隔夜。将菌液接种至含NBS培养基与35g/L的纯甘油的培养液中，其菌体起始浓 度为0D550 = 2.0。接种的菌液于37°C下以150rpm震荡培养，并于培养48小时后，重新接 种至另一含NBS培养基与35g/L的纯甘油的培养液中，其菌体起始浓度为0D550 = 2. 0。而 自第一次接种到第二次接种称为"一次继代培养"，并于第一次接种起每隔24小时取培养 液进行分析。
[0118] 如图5所示，为使用分光光度计测量菌液的菌体浓度的结果。从此图可看出：随着 继代培养的次数增加，菌体的浓度亦逐渐增加，而且当继代培养12次后，菌体的浓度可达 0D550=9. 07。
[0119] 如图6所示，为利用上文"高效率液相层析"测量菌液的甘油浓度的结果。从此 图可得到：随着继代培养的次数增加，菌株的甘油代谢速率亦逐渐增加，且当继代培养6次 后，菌株可于48小时内完全代谢培养液中35g/L的纯甘油。
[0120] 《实施例3》
[0121] 从固态培养基中挑选菌株BLA-13的单一菌落后，培养于5mL的液态LB培养基中， 并于37°C下，以200rpm震荡培养隔夜。将菌液接种至含NBS培养基与30g/L的粗甘油的培 养液中，其菌体初始浓度达到0D550 = 0. 2,并于37°C下，以200rpm震荡培养24小时。重 复以上培养步骤，直到细胞密度增加后，再菌液转至含NBS培养基与70g/L的粗甘油的培养 液中，其菌体初始浓度达到0D550 = 0. 2,并于37°C下，以200rpm震荡培养60小时。最后 自培养液中筛选出一菌株，命名为BLA-13-G。
[0122] 接着，将菌株BLA-13和BLA-13-G培养至含NBS培养基与110g/L的粗甘油的培养 液中。如图7所示，为利用上文"高效率液相层析"测量含菌株BLA-13与BLA-13-G的菌液 的粗甘油浓度的结果。由此可知，菌株BLA-13-G可随培养的时间生长并消耗粗甘油；反之， 菌株BLA-13的生长迟缓，且粗甘油的消耗十分缓慢。上述结果证实菌株BLA-13-G具有较 为优异的粗甘油耐受性。
[0123] 《实施例4》
[0124] I、剔除pta基因
[0125] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0126] 正向引物：5，-tgtccaagcttattatgctgatccctacc-3'（SEQ ID NO :30);
[0127] 反向引物：5，-gttcgactagtttagaaatgcgcgcgtc-3，（SEQ ID NO :31)。
[0128] 正向引物设计有限制酶HindIII剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限 制酶SpeI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引 物 对其进行PCR，扩增出一含pta基因的DNA片段(约0. 94kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶HindIII及SpeI剪切纯化的DNA片 段。另外，利用 Plasmid Extraction Mini Kit 纯化质粒 pMCS-5 (Mo Bi Tec.)后，使用限 制酶HindIII及SpeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片 段后，依上文"化学转化法'将接合产物送至大肠杆菌DH5ci内，而得到一含pta基因的质 粒 pMCS-pta。
[0129] 依质粒pMCS-pta设计以下引物：
[0130] 正向引物：5，-acgatgaattccatcagcacatctttctg-3，（SEQ ID NO :32);
[0131] 反向引物：5，-accgtgtcgacggtacctgatcgcgactcgtgc-3，（SEQ ID NO :33)。
[0132] 正向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶Sail剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pMCS-pta为模板，并利用此二引物对其进行 PCR，扩增出一含pta基因的5'端区域及其3'端区域的DNA片段(约3. 5kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及Sal I剪切纯 化的DNA片段。
[0133] 依质粒pLoxGm-PR设计以下引物：
[0134] 正向引物：5，-aagccatatggaattcattaccgttcgtataatgtatgc_3，（SEQ ID NO :34);
[0135] 反向引物：5，-tcgacgtcgacataccgttcgtatagcatacat-3'（SEQ ID NO :35);
[0136] 正向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶Sail剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用此二引物对其进 行PCR，扩增出一 DNA片段(约0. 73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制酶 EcoRI 及 Sal I 剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转 化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒pMCS-ptaGm，此依序含有pta基因 的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta基因的3'端区域。
[0137] 以质粒pMCS-ptaGm为模板，并利用SEQ ID NO :30及SEQ ID NO :31的引物对其进 行PCR，扩增出一线性DNA片段(约1. 3kb )，其依序含有pta基因的5 '端区域、LoxP位、抗抗 生素基因、LoxP位、及pta基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G 内，得到一转化菌株BLA-13-G/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转化 菌株BLA-13-G/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46 表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小 时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含 健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体依 序含有pta基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta基因的3'端区域。
[0138] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏Pta基因但未含抗抗生素基 因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G1。
[0139] II、剔除 adhE 基因
[0140] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0141] 正向引物：5，-gttctgtctgaagacgacac-3，（SEQ ID NO :36);
[0142] 反向引物：5，-ccggtgagctcagacccaagtggtcg-3，（SEQ ID NO :37)。
[0143] 反向引物设计有限制酶SacI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染 色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含adhE基因的DNA片段(约2. 08kb)。 利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶KpnI及 SacI剪切纯化的DNA片段。另外，利用PlasmidExtraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶KpnI及SacI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切 的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一 含adhE基因的质粒pBlue-adhE。
[0144] 依质粒pBlue-adhE设计以下引物：
[0145] 正向引物：5，-cgcagtaactcacgccatgg-3，（SEQ ID NO :38);
[0146] 反向引物：5，-tcagcgaattcatcgataacaactggag-3，（SEQ ID NO :39)。
[0147] 反向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-adhE 为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含adhE基因的5'端区域及其3'端区域的 DNA 片段(约 3. 7kb)。利用 Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后， 使用限制酶EcoRI及HindIII剪切纯化的DNA片段。以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 35的引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段（约(λ 73kb)，其依序 有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化 扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及HindIII剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA 连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内， 而得到一质粒pBlue-adhE-Gm，此依序含有adhE基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、 LoxP位、及adhE基因的3'端区域。
[0148] 依质粒pBlue-adhE-Gm设计以下引物：
[0149] 正向引物：5，-accatcactatcgctgaacc-3，（SEQ ID NO :40)。
[0150] 以质粒pBlue-adhE-Gm为模板，并利用此引物与SEQ ID NO :39的引物对其进行 PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 52kb)，其依序含有adhE基因的5'端区域、LoxP位、抗抗 生素基因、LoxP位、及adhE基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46至菌株 BLA-13-G1内，得到一转化菌株BLA-13-Gl/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA 片段送至转化菌株BLA-13-Gl/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖 诱发质粒PKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C 下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存 的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌 落，其染色体依序含有adhE基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及adhE基 因的3'端区域。
[0151] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏adhE基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G2。
[0152] 111、剔除仕(^基因
[0153] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0154] 正向引物：5，-gaaagtcgacgaatcccgcccagg-3，（SEQ ID NO :41);
[0155] 反向引物：5，-caagaaagcttgttgataagaaagg-3，（SEQ ID NO :42)。
[0156] 以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含 frdA 基因的 DNA 片段（约 3. 52kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment ExtractionKit 纯化扩 增的DNA片段后，使用限制酶PstI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶PstI剪切纯化的质粒。接着，利 用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠 杆菌DH5 α内，而得到一含frdA基因的质粒pBlue-frdA。
[0157] 依质粒pBlue-frdA设计以下引物：
[0158] 正向引物：5，-cacaccatatgttagaattcattaccgttcg-3，（SEQ ID NO :43);
[0159] 反向引物：5，-gatccaggccttaatgtcgacgatcctatacc-3，（SEQ ID NO :44)。
[0160] 正向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-frdA为 模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含frdA基因的5'端区域及其3'端区域的 DNA 片段（约 I. lkb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段 后，使用限制酶NdeI及StuI剪切纯化的DNA片段。以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用此SEQ ID NO :34及SEQ ID NO :35的引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段（约L lkb)，其依序有 LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩 增的DNA片段后，使用限制酶NdeI剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二 纯化的DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质 粒pBlue-frdA-Gm，此依序含有frdA基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及 frdA基因的3'端区域。
[0161] 依质粒质粒pBlue-frdA-Gm设计以下引物：
[0162] 正向引物：5，-ccatatctagactgcagaagggggctccg-3，（SEQ ID NO :45);
[0163] 反向引物：5，-tgaagggtacctgcagctctgccagcttg-3，（SEQ ID NO :46)。
[0164] 以质粒pBlue-frdA-Gm为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA 片段(约I. 9kb)，其依序含有frdA基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及 frdA基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA 片段。利用上述「化学转化法」转化协助质粒PKD46至菌株BLA-13-G2内，得到一转化菌株 BLA-13-G2/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G2/ PKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ -Red 蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小时后，将培养 温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的 固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体依序含有frdA 基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及frdA基因的3'端区域。
[0165] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏frdA基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G3。
[0166] IV、剔除 mgsA 基因
[0167] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0168] 正向引物：5，-taatgagctcttacttcagacggtccgcgag-3，（SEQ ID NO :47);
[0169] 反向引物：5，-taatggtaccctgacgactcgcactttacc-3'（SEQ ID NO :48)。
[0170] 正向引物设计有限制酶SacI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 KpnI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对 其进行PCR，扩增出一含mgsA基因的DNA片段（约0.47kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶SacI及KpnI剪切纯化的DNA片段。 另外，利用 Plasmid Extraction Mini Kit 纯化质粒 pBluescript II KS(+)后，使用限制 酶SacI及KpnI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段 后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一含mgsA基因的质粒 p Blue-mgsA〇
[0171] 依质粒pBlue-mgsA设计以下引物：
[0172] 正向引物：5，-tgattgtcgacaagctttgggatccactaaatgc-3，（SEQ ID NO :49);
[0173] 反向引物：5，-taactgaattctgagatcaatgcgccaac-3，（SEQ ID NO :5〇)。
[0174] 正向引物设计有限制酶Sail剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 EcoRI剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pBlue-mgsA为模板，并利用此二引物对其进行 PCR，扩增出一含mgsA基因的5'端区域及其3'端区域的DNA片段(约3. 3kb)。利用Gel/ PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及Sal I剪 切纯化的DNA片段。
[0175] 以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO :34及SEQ ID NO :35的引物对其进 行PCR，扩增出一 DNA片段(约0. 73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及Sail 剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转 化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒pBlue-mgsAGm，此依序含有mgsA 基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA基因的3'端区域。
[0176] 以质粒pBlue-mgsAGm为模板，并利用SEQ ID N0:47及SEQ ID N0:48的引物 对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 19kb)，其依序含有mgsA基因的5'端区域、 LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46 至菌株BLA-13-G3内，得到一转化菌株BLA-13-G3/pKD46。依上述「电穿孔法」，将纯化的线 性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G3/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿 拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ -Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。 于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清 液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑 选出一菌落，其染色体依序含有mgsA基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及 mgsA基因的3'端区域。
[0177] 利用上述"化学转化法"转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏mgsA基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G4。
[0178] V、剔除pflB基因
[0179] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0180] 正向引物：5，-gaacgatctagaaggtgtaggagataccatc-3，（SEQ ID NO :51);
[0181] 反向引物：5，-gagggtctcgagtccttcctggctgg-3，（SEQ ID NO :52)。
[0182] 以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含 pflB 基因的 DNA 片段(约 I. 9kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增 的DNA片段后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的质粒。接着， 利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大 肠杆菌DH5 α内，而得到一含pf IB基因的质粒pBlue-pf 1B。
[0183] 依质粒pBlue-pflB设计以下引物：
[0184] 正向引物：5，-catcaggtagtcgataccgtacagc-3，（SEQ ID NO :53);
[0185] 反向引物：5，-tgctgaaggcctgtctgcaatcaaatatgc-3，（SEQ ID NO :δ4)。
[0186] 以质粒pBlue-pflB为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pflB 基因的5'端区域及其3'端区域的DNA片段（约I. lkb)，再利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段。
[0187] 以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO :43及SEQ ID NO :44的引物对其进 行PCR，扩增出一 DNA片段(约I. lkb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位，再利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶 接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得 到一质粒pBlue-pflBGm，此依序含有pflB基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因 、LoxP 位、及PflB基因的3'端区域。
[0188] 以质粒pBlue-pflBGm为模板，并利用SEQ ID NO :51及SEQ ID NO :52的引物 对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段(约1.95kb)，其依序含有pflB基因的5'端区域、 LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflB基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46 至菌株BLA-13-G4内，得到一转化菌株BLA-13-G4/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线 性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G4/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿 拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ -Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。 于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清 液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑 选出一菌落，其染色体依序含有PflB基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及 PflB基因的3'端区域。
[0189] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏PflB基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G5。
[0190] VI、剔除tdcDE基因操纵组
[0191] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0192] 正向引物：5，-tgcaatctagaggtgacgatcgacacct-3，（SEQ ID NO :55);
[0193] 反向引物：5，-aacggctcgagtgttgatacctcaatggg-3，（SEQ ID NO :56)。
[0194] 正向引物设计有限制酶XbaI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶XhoI剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物 对其进行PCR，扩增出一含tdcDE基因操纵组的DNA片段(约1.81kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶XbaI及XhoI剪切纯化的 DNA 片段。另外，利用 Plasmid Extraction Mini Kit 纯化质粒pBluescript II KS(+)后， 使用限制酶XbaI及XhoI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA 片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5ci内，而得到一含tdcDE基因 操纵组的质粒pBlue-tdcDE。
[0195] 使用限制酶EcoRI及EcoRV剪切质粒pBlue-tdcDE。另外，以质粒pLoxGm-PR为 模板，并利用SEQ ID NO :34及SEQ ID NO :35的引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段 (约0.73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI剪切纯化的DNA片段。接着，利 用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌 DH5 α内，而得到一质粒pBlue-tdcDEGm，此依序含有tdcDE基因操纵组的5'端区域、LoxP 位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE基因操纵组的3'端区域。
[0196] 以质粒pBlue-tdcDEGm为模板，并利用SEQ ID NO :55及SEQ ID NO :56的引物对 其进行PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 74kb)，其依序含有tdcDE基因操纵组的5'端区 域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE基因操纵组的3 '端区域，再利用Ge I /PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质 粒PKD46至菌株BLA-13-G5内，得到一转化菌株BLA-13-G5/pKD46。依上述"电穿孔法"，将 纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G5/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加 入ImM阿拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ -Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同 源重组。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并 移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁 反应"挑选出一菌落，其染色体依序含有tdcDE基因操纵组的5'端区域、LoxP位、抗抗生素 基因、LoxP位、及tdcDE基因操纵组的3'端区域。
[0197] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏tdcDE基因操纵组但未含抗 抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G6。
[0198] VII、剔除pflEF基因操纵组
[0199] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0200] 正向引物：5，-ctcatcctttagctcaggaaag-3，（SEQ ID NO :57);
[0201] 反向引物：5，-gcaactatgattttcaatattcagc-3，（SEQ ID NO :58)。
[0202] 以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含 pflEF 基因操纵组的 DNA 片段（约 3. 67kb)。利用 Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit 纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的DNA片段。另外，利用PIasmi d Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS (+)后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的 质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接 合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一含Pf IEF基因操纵组的质粒pBlue-pf 1EF。
[0203] 依质粒pMCS-patGm设计以下引物：
[0204] 正向引物：5，-gatgcatatgattaccgttcgtataatgtatgc-3，（SEQ ID NO :59);
[0205] 反向引物：5，-tcgacacgcgtataccgttcgtatagcatacat-3'（SEQ ID NO :6〇)。
[0206] 以质粒pMCS-patGm为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含LoxP位、抗 抗生素基因、及 IoxP 位的 DNA 片段（约 0.76kb)。利用 Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，使用限制酶NdeI 及HpaI剪切质粒pBlue-pflEF。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文 "化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒pBlue-pf IEFGm,此依序含 有PflEF基因操纵组的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflEF基因操纵组的 3'端区域。
[0207] 以质粒pBlue-pflEFGm为模板，并利用SEQ ID NO :57及SEQ ID NO :58的引物对 其进行PCR，扩增出一线性DNA片段(约I. 33kb)，其依序含有pflEF基因操纵组的5'端区 域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pf IEF基因操纵组的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质 粒PKD46至菌株BLA-13-G6内，得到一转化菌株BLA-13-G6/pKD46。依上述"电穿孔法"，将 纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G6/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并 加入ImM阿拉伯糖诱发质粒PKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体 同源重组。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心 并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连 锁反应"挑选出一菌落，其染色体依序含有Pf IEF基因操纵组的5'端区域、LoxP位、抗抗生 素基因、LoxP位、及pflEF基因操纵组的3'端区域。
[0208] 利用上述「化学转 化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏PfIEF基因操纵组但未含抗 抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G7。
[0209] VIII、剔除 did 基因
[0210] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0211] 正向引物：5，-tgataaagcttgctcgtctggtgggttc-3，（SEQ ID NO :61);
[0212] 反向引物：5，-gtgtcggcttcaatatcacg-3，（SEQ ID NO :62)。
[0213] 正向引物设计有限制酶HindIII剪切的位置(如底线标记处)。以大肠杆菌BL21 的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含did基因的DNA片段(约 0.68kb)。利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段后，使用限制 酶HindIII剪切纯化的DNA片段。另外，利用PlasmidExtraction Mini Kit纯化质粒pMCS5 后，使用限制酶HindIII及EcoRV剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质 粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一含did 基因的5'端区域及其3'端区域的质粒pMCS5-dld。
[0214] 依质粒pMCS5_dld设计以下引物：
[0215] 正向引物：5，-tcgagaattcggtcaggcctgtattgg-3，（SEQ ID NO :63);
[0216] 反向引物：5，-gtggcgtcgacggtaccgaaatgtcgttattcg-3，（SEQ ID NO :64)。
[0217] 正向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制 酶Sail剪切的位置(如底线标记处)。以质粒pMCS5-dld为模板，并利用此二引物对其进行 PCR，扩增出一含did基因的5'端区域及其3'端区域的DNA片段(约3. 3kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及Sail剪切纯 化的DNA片段。另外，以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用此SEQ ID NO :34及SEQ ID NO :35 的引物对其进行PCR，扩增出一 DNA片段(约0. 73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及 LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制 酶EcoRI及Sail剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片 段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α内，而得到一质粒pMCS-dldGm， 此依序含有did基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及did基因的3'端区 域。
[0218] 以质粒pMCS-dldGm为模板，并利用SEQ ID NO :61及SEQ ID NO :62的引物对其进 行PCR，扩增出一线性DNA片段(约3. 3kb )，其依序含有dld基因的5 '端区域、LoxP位、抗抗 生素基因、LoxP位、及did基因的3'端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增的线性DNA片段。利用上述"化学转化法"转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G7 内，得到一转化菌株BLA-13-G7/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转 化菌株BLA-13-G7/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒 PKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌 株2小时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂 抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染 色体依序含有did基因的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及did基因的3'端 区域。
[0219] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre_As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体缺乏did基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G8。
[0220] IX、插入乳酸菌 Lactobacillus helveticus 的 D-Idh 基因
[0221] 依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：
[0222] 正向引物：5，-ctggacatatgacaaaggtttttgcttacg-3，（SEQ ID NO :65);
[0223] 反向引物：5，-ttggggcccaggcctttaaaacttgttcttgttcaaag_3，（SEQ ID NO :66)。
[0224] 正向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置(如底线标记处)，反向引物设计有限制酶 StuI剪切的位置(如底线标记处)。以乳酸菌Lactobacillus helveticus CCRC12936(食品 工业发展研究所）的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含D-Idh基因 的 DNA 片段(约 LOkb)。利用 Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit 纯化扩增的 DNA 片段 后，使用限制酶NdeI及StuI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR后，使用限制酶NdeI及StuI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连 接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文"化学转化法"将接合产物送至大肠杆菌DH5 α 内，而得到一质粒pLoxKm-D-ldh，其依序含有LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位及D-Idh基 因。
[0225] 依质粒pLoxKm-D-ldh设计以下引物：
[0226] 正向引物：5J -atcacttcccgttccagagcgtcaaggctgatatcgttaaaacttgttcttgttcaa agc-3'（SEQ ID NO :67);
[0227] 反向引物：5J -ggaaacgatggcggcaaactgcacagatgcccagcgtcggatcctataccgttcgta tag-3'（SEQ ID NO :68)。
[0228] 以质粒pLoxKm-D-ldh为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含LoxP位、 抗抗生素基因、LoxP位及D-Idh基因的DNA片段(约2. 2kb)。
[0229] 依DNA片段设计以下引物：
[0230] 正向引物：5' -gcgtgacgccgccgccggacgtgcgaaagaaaatgtcatctttcatcacttcccgtt ccag-3'（SEQ ID NO :69);
[0231] 反向引物：5> -aagcctcgcagaaacacattttgcgttacgccgaactggcggaacgatggcggcaaa ct-3'（SEQ ID NO :70)。
[0232] 以DNA片段为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pfl⑶基因操纵组 的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、D-Idh基因、及pfl⑶基因操纵组的3'端 区域的 DNA 片段（约 2. 28kb)。再利用 Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit 纯化扩增 的线性DNA片段。利用上述「化学转化法」转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G8内，得到 一转化菌株BLA-13-G8/pKD46。依上述"电穿孔法"，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株 BLA-13-G8/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入ImM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表 达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30°C下培养菌株2小 时后，将培养温度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于 含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述「原位聚合酶连锁反应」挑选出一菌落，其染色体 依序含有Pfl⑶基因操纵组的5'端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、D-Idh基因、及 Pfl⑶基因操纵组的3'端区域。
[0233] 利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株 于SOC培养基内，并加入0. 3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株 的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30°C下培养菌株2小时后，将培养温 度提升至42°C持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。 使用上述"原位聚合酶连锁反应"挑选出一菌落，其染色体镶嵌D-Idh基因但未含抗抗生素 基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G9。
[0234] 《实施例5》
[0235] 本实施例主要为检测菌株BLA-13-G9的D型乳酸发酵能力。首先，从固态培养 基中分别选取菌株BLA-13-G9的单一菌落，培养于5mL的液态LB培养基，并于37°C下，以 200rpm震荡培养至隔夜。将菌液接种至50mL的NBS培养基(含5%的粗甘油)，并于37°C下， 以200印111震荡培养10小时。再将菌液接种至5001^的他3培养基(含5 (%的粗甘油)，并 于37°C下，以200rpm震荡培养10小时。又将菌液接种至含IL的NBS培养基(含5. 5% (约 67. 58g/L)的粗甘油）的发酵槽，其菌体起始浓度0D550 = 1. 33,并于30°C、溶氧度50%、利 用ION氢氧化钠控制的pH7. 0下，进行发酵。于发酵8小时后，将溶氧度控制于3%，并随发 酵时间，取样分析。
[0236] 如图8所示，为利用分光光度计测量发酵液的菌体浓度结果、以及利用上文"高效 率液相层析"测量菌液的甘油与D型乳酸浓度的结果。且根据此图，菌株BLA-13-G9于发酵 60小时后，可消耗60. 83g/L的粗甘油，并产生54. 79g/的D型乳酸，而可推估其D型乳酸的 重量转化率约为90%。
[0237] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，但不能以此限定本发明实施的范围；因此， 凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效改变与修饰，皆仍属本发明 专利涵盖的范围内。
【主权项】
1. 一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含： 一入噬菌体Pk启动子，其镶嵌于该菌株的染色体上，以调控该染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的表达；以及 一Trc启动子，其镶嵌于该菌株的染色体上，以调控该染色体上的glpF基因的表达。2. 如权利要求1所述的可提升甘油代谢的菌株，其品系是为BL21。3. 如权利要求1所述的可提升甘油代谢的菌株，其中该A噬菌体Pk启动子镶嵌于 glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的上游区域，且该Trc启动子镶嵌 于glpF基因的上游区域。4. 如权利要求3所述的可提升甘油代谢的菌株，其中该A噬菌体Pk启动子是取代 glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的上游区域的启动子，且该Trc启 动子是取代glpF基因的上游区域的启动子。5. -种可抵抗粗甘油的菌株，其属于大肠杆菌，且是利用一含以下步骤的方法制得 的： 培养如权利要求1所述的可提升甘油代谢的菌株于一第一培养液内；以及 培养如权利要求1所述的可提升甘油代谢的菌株于一第二培养液内，该第二培养液的 粗甘油浓度高于该第一培养液的粗甘油浓度。6. 如权利要求5所述的可抵抗粗甘油的菌株，其于2014年3月2日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏号CCTCCM2014055。7. 如权利要求5所述的可抵抗粗甘油的菌株，其中该第一培养液的粗甘油浓度是为 30g/L，而该第二培养液的粗甘油浓度是为70g/L。8. 如权利要求7所述的可抵抗粗甘油的菌株，其中该第一阶段培养步骤的时间是为24 小时，且该第二阶段培养步骤的时间是为70小时。9. 如权利要求7所述的可抵抗粗甘油的菌株，其中该第一培养液及该第二培养液均包 含一NBS培养基。10. 如权利要求9所述的可抵抗粗甘油的菌株，其中该NBS培养基的配方为：体积摩尔 浓度为25. 7mM的磷酸二氢钠（NaH2PO4X体积摩尔浓度为28. 7mM的磷酸氢二钾（K2HPO4)、体 积摩尔浓度为26. 5mM的磷酸氢二铵（（NH4)2HP04)、体积摩尔浓度为ImM的硫酸镁（MgS04)、 体积摩尔浓度为0.ImM的氯化I丐（CaCl2)、体积摩尔浓度为0. 015mM的硫胺盐酸（thiamine hydrochloricacid)、体积摩尔浓度为ImM的甜菜碱（betaine)、体积摩尔浓度为5.9iiM 的氯化铁（FeCl3)、体积摩尔浓度为0. 8iiM的氯化钴（CoCl2)、体积摩尔浓度为0. 6iiM的氯 化铜（CuCl2)、体积摩尔浓度为I. 5iiM的硫酸锌（ZnS04)、体积摩尔浓度为0. 8iiM的钥酸钠 (Na2MoO4)、及体积摩尔浓度为0? 8iiM的硼酸（H3BO3X11. 一种可生产D型乳酸的菌株，其属于大肠杆菌，且为剔除如权利要求5所述的可抵 抗粗甘油的菌株染色体上的Pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、pflB基因、tdcDE 基因操纵组、PflEF基因操纵组、及did基因、并插入乳酸菌D-Idh基因至如权利要求5所 述的可抵抗粗甘油的菌株染色体而制得的。12. 如权利要求11所述的可生产D型乳酸的菌株，其中该乳酸菌为 Lactobacillushelveticus〇
【专利摘要】本发明提出一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含一λ噬菌体PR启动子及一Trc启动子，其中λ噬菌体PR启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因及dhaKLM基因操纵组的表达，而Trc启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。本发明更利用此菌株衍生成一种可抵抗粗甘油的菌株、与一种可生产D型乳酸的菌株。CCTCC M201405520140302
【IPC分类】C12R1/225, C12R1/19, C12N1/21
【公开号】CN104894041
【申请号】CN201410075051
【发明人】赵云鹏, 王祉雯, 姜中人
【申请人】逢甲大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月3日
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