一种产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用
一种产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产Y-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用，属生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA)是广泛分布于动物体内的一种重要 的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，在大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑起重 要作用，并对机体的多种功能具有调节作用，包括参与产生镇静、镇痛效应、抗焦虑、防治惊 厥、舒缓血管和降血压、防止动脉硬化调节心律失常以及调节生殖生理激素的分泌的功能。 正是由于具有的多种生理功能，γ-氨基丁酸在医药、保健品、食品、饲料添加剂等领域具有 广泛的应用。2009年，卫生部更是批准 γ-氨基丁酸为新资源食品。
[0003] γ -氨基丁酸的生产主要是通过L-谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸形成。目前常用 的生产γ -氨基丁酸的菌是大肠杆菌和乳酸菌，其中大肠杆菌遗传操作成熟，发酵密度高， 表达量高，因此用于生产γ-氨基丁酸的工艺产量高，生产成本低。但大肠杆菌在发酵过程 中会产生内毒素，在生产过程中会带入到最终产品中，因此用大肠杆菌生产的γ-氨基丁 酸在食品和保健品中的应用受到很大限制。乳酸菌是安全级别的细菌，早已应用于乳制品 等食品工业中，因此用乳酸菌生产的γ-氨基丁酸安全级别高，在食品和保健品领域中应 用很受欢迎。但乳酸菌发酵的生物量少，产生的L-谷氨酸脱羧酶活性低，最终产生的γ-氨 基丁酸浓度低，生产成本很高，导致其最终产品的市场售价居高不下，不利于其进一步的推 广应用。
[0004] 枯草芽孢杆菌是一种食品安全的微生物，在食品领域的应用已持续了几千年，其 安全性早已被大家所公认。但野生型的枯草杆菌自身的L-谷氨酸脱羧酶表达量很低，发 酵产生的酶不足以用于工业化生产，因此需要将L-谷氨酸脱羧酶基因在枯草杆菌中进行 外源表达。中国专利文献CN103409457A公开了一种新型枯草杆菌表达系统，并且公开了利 用所述新型的枯草杆菌表达系统构建重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌，并将此工程菌用于 γ -氨基丁酸的生产。所述的新型枯草杆菌表达系统，包括基因工程菌株BS-T710与表达载 体pBT-23a。表达载体pBT-23a是将Τ7启动子基因插入枯草杆菌表达载体ρΗΤ43的KpnI/ XbaI酶切位点间所得。基因工程菌株BS-T710通过如下方法构建：将Pgrac基因，T7RNA 聚合酶基因 T7plo,及枯草杆菌色氨酸终止子Ter融合，构成T7pol的完整表达元件，并将 T7pol的完整表达元件插入到枯草杆菌整合载体pDG1730的EcoRI酶切位点，得到T7RNA 聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol ;将T7RNA聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol转化 入枯草杆菌168菌株得到基因工程菌株BS-T710。产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌是将 来源于Streptococcus thermophilus Y2的谷氨酸脱羧酶基因 gadB插入至上述表达载体 pBT_23a，获得重组表达载体pBT-23a_gad，利用化学转化法，将pBT-23a_gad转化入上述基 因工程菌株BS-T710,获得产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌BS-T710-gadB。上述枯草杆 菌表基因工程菌是为了克服枯草芽孢杆菌表达系统缺乏高效转录外源基因的启动子的缺 陷，提供一种具有高效转录谷氨酸脱羧酶基因的启动子的基因工程菌。
[0005] 而上述基因工程菌利用质粒表达载体表达外源基因，存在两个缺陷，一是质粒在 枯草芽孢杆菌中复制尤其是在大规模发酵时，传代不稳定，会导致发酵后期蛋白表达的减 少；二是枯草芽孢杆菌的表达质粒为了筛选方便，都存在编码抗生素抗性酶的基因，这导致 在发酵过程中细菌会额外表达无用的酶，尤其是抗生素抗性酶，在安全要求很严格的食品 工业中，其应用受到限制。
【发明内容】
[0006] 为此，本发明针对于现有技术中枯草芽孢杆菌表达系统利用质粒表达外源基因传 代不稳定导致后期蛋白表达减少、存在抗生素、抗性酶的基因导致资源浪费和安全性低的 缺陷提供一种不利用质粒表达外源基因、遗传稳定、安全性高、高效表达表达L-谷氨酸脱 羧酶的产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建方法。
[0007] 进一步的，本发明针对于现有技术中枯草芽孢杆菌野生型自身的L-谷氨酸脱羧 酶表达量很低，提供一种产γ -氨基丁酸的工程菌及其构建方法，其通过引入grac启动子， 将L-谷氨酸脱羧酶编码基因的表达元件整合到枯草芽孢杆菌的染色体上，并通过上述整 合同时敲除γ-氨基丁酸转氨酶基因来提高L-谷氨酸脱羧酶表达量和减少γ-氨基丁酸 代谢，使γ-氨基丁酸的产量提高。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
[0009] -种产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其通过将编码L-谷氨酸脱羧酶的 基因（gadB)及其启动子整合到宿主菌的染色体上得到的。
[0010] 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，整合的位点为γ-氨基丁 酸转氨酶基因（gabT)中，整合后使γ-氨基丁酸转氨酶基因失活。
[0011] 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，将所述编码L-谷氨酸脱 羧酶的基因整合到宿主菌的染色体是通过PMAD整合载体实现的。
[0012] 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，所述启动子为grac启动 子，来源于ΡΗΤΟΙ表达载体。
[0013] 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，所述宿主菌为枯草芽孢 杆菌，优选为枯草芽孢杆菌168菌株。
[0014] 所述的产Y-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，所述编码L-谷氨酸脱羧 酶的基因来源于微生物，可为大肠杆菌或其他能表达相同功能酶的微生物。
[0015] L-谷氨酸脱羧酶基因的获得可根据GenBank No:M84025. 1中gadB基因序列全基 因合成，或利用大肠杆菌（如菌株DH5a)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。
[0016] 本发明还提供了利用上述产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法构建的基因 工程菌以及所述基因工程菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。
[0017] -个实施例中，所述基因工程菌的构建方法可以是将L-谷氨酸脱羧酶基因先克 隆到大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭表达载体PHTOl (德国MoBiTec公司）上，然后将包含 了启动子和L-谷氨酸脱羧酶编码基因在内的DNA片段和枯草芽孢杆菌待整合位点上下游 各1000 bp左右的同源臂片段通过overlap-PCR融合成一个长片段，再将该片段克隆到质粒 pMD上得到整合用的载体，最后将该载体转化枯草芽孢杆菌，并通过实验操作和验证，完成 L-谷氨酸脱羧酶编码基因的表达元件整合到枯草芽孢杆菌的染色体上，实现在枯草芽孢杆 菌中的高效稳定表达。
[0018] 所述穿梭表达载体pHTOl，系德国MoBiTec公司产品，大小为8kb，大肠杆菌和枯草 芽孢杆菌双复制起始位点的穿梭表达载体，含有氨苄青霉素抗性基因（大肠杆菌中）和氯 霉素抗性基因（芽孢杆菌中），乳糖抑制子IacI基因，启动子是grac，需要IPTG诱导外源 基因表达，并具有多个限制性内切酶位点。
[0019] 所述的基因工程菌在生产Y-氨基丁酸中的应用，其中，所述基因工程菌作为生 产γ-氨基丁酸的酶源。
[0020] 所述的基因工程菌在生产γ-氨基丁酸中的应用，其中，生产γ-氨基丁酸的方法 为：
[0021] 1)活化培养工程菌种子，并将培养好的种子逐级放大，并在发酵罐中进行好气培 养，培养温度30°C，控制pH为6. 8-7. 0,溶氧20 %以上，发酵时间24-30小时；
[0022] 2)离心或膜浓缩得到菌体，加水稀释到合适浓度，然后加磷酸吡哆醛，逐步添加 L-谷氨酸，控制反应液pH在4. 0-5. 0之间，至反应体系pH不再上升为止结束反应。
[0023] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下特点：
[0024] 本发明通过将L-谷氨酸脱羧酶编码基因的表达元件整合到宿主菌的染色体上构 建工程菌，使其可以高效稳定表达L-谷氨酸脱羧酶，所构建的工程菌遗传稳定性好，表达 的L-谷氨酸脱羧酶活性高，没有多余蛋白尤其是抗生素抗性蛋白表达，安全性高。同时工 程菌中失活了降解产物γ-氨基丁酸的γ-氨基丁酸转氨酶，避免了生产过程中产物的分 解，提高了产品的收率。同时本发明在采用枯草芽孢杆菌作为生产γ- 氨基丁酸的宿主菌 的时候，所生产的γ-氨基丁酸没有内毒素污染的威胁，安全可靠，可用于食品保健品领 域。整体生产工艺简单，环境友好，成本低廉。
[0025] 在枯草芽孢杆菌中存在有γ -氨基丁酸转氨酶（EC2. 6. 1. 19)，该酶能催化γ -氨 基丁酸和α-酮戊二酸反应生成琥珀酸半醛和L-谷氨酸，这会导致γ-氨基丁酸的降解， 不利于产物的积累。为克服此酶的副作用，需要将工程菌中编码γ-氨基丁酸转氨酶的基 因 gabT敲除，以失活该酶，避免产物的降解。而上述L-谷氨酸脱羧酶表达元件往枯草芽孢 杆菌基因组整合时，也需要选择合适的位点。本发明选择将上述表达元件整合到gabT基因 中，既达到整合的目的、实现L-谷氨酸脱羧酶高效表达，同时实现γ -氨基丁酸转氨酶的失 活。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明中谷氨酸脱羧酶整合表达框在染色体上的排列结构。
[0027] 图2为L-谷氨酸钠和γ -氨基丁酸的HPLC检测结果。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。
[0029] 应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。使用的质粒 抽提、基因组抽提、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实 验操作按照《分子克隆实验指南第三版》（[美]J.莎姆布鲁克黄培堂译）操作方法进行。
[0030] 枯草芽孢杆菌实验操作及pMAD基因敲除原理和方法见文献：Maryvonne Arnaud et al, New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformab le, low-GC-content, gram-positive bacteria, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOG Υ,Νον. 2004, p.6887 - 6891。
[0031] 枯草芽孢杆菌电转化方法参照文献：Meddeb Mouelhi F et al，High transformation efficiency of Bacillus subtilis with integrative DNA using glycine betaine as osmoprotectant, Anal Biochem. 2012 May 15 ；424 (2) :127_9〇
[0032] 本发明公开了的一种产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，以枯草芽孢杆菌 宿主菌为例，选择枯草芽孢杆菌168菌株，构建方法如下：
[0033] (1)先将来源于大肠杆菌的gadB基因克隆于枯草芽孢杆菌表达载体pHTOl上。
[0034] (2)设计三对引物，分别扩增gabT上游1000 bp片段、gadB基因和启动子片段、 gabT下游1000 bp片段，然后通过overlap-PCR将三个片段融合到一起。
[0035] (3)将上述融合后的大片段克隆到敲除载体pMAD上，然后转化入枯草芽孢杆菌 中；
[0036] (4)通过一系列不同的培养操作，完成表达元件的无痕整合到枯草芽孢杆菌gabT 位点，同时实现整合表达和gabT的失活，即可获得高表达L-谷氨酸脱羧酶的枯草芽孢杆 菌。
[0037] 具体实验方法见以下实施例。
[0038] 实施例1L-谷氨酸脱羧酶枯草芽孢杆菌表达载体pHTOl-gadB的构建
[0039] L 根据大肠杆菌 gadB 基因序列 GenBank No :M84025. 1 设计引物，F-gadB-Bglll : CATAGATCTATGGATAAGAAGCAAGTAAC (SEQ ID NO. 1 所示）和 R-gadB-Xbal ：CGATCTAGATCAGGT AGCTTTAAAGCTGTTC(SEQ ID NO. 2所示）该引物中的两端增加了 BglII和XbaI位点；
[0040] 2.以大肠杆菌DH5a菌株的总DNA为模板，以上述引物（SEQ ID NO. 1-2所示）PCR 扩增得到gadB基因片段，反应体系包括：模板1 μ L DNA，1 μ L dNTP (lOmmol/L)，2 μ mol/L MgCl2,0.5ymol/L primers，5yL 10XPCR buffer，2.5 U KOD DNA聚合酶（Τ0Υ0Β0公司）。 PCR反应条件包括：94°C预变性4min ;94°C变性30s，53°C退火30s，68°C延伸2min，共30个 循环；72°C，10min。扩增片段进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，回收I. 4kb的DNA条带。
[0041] 3.用Bgl II和XbaI双酶切上述扩增得到的gadB DNA片段。酶切体系：DNA 43 yL，buffer R 5 yL，Bgl II和XbaI各lyL，37°C保温3小时。电泳检测并回收备用。
[0042] 4.培养含有pHTOl质粒的大肠杆菌，并抽提质粒，提取方法按照试剂盒说明书操 作。用BamHI和XbaI双酶切质粒，电泳检测并回收备用。
[0043] 5.用T4连接酶连接gadB和载体DNA片段，连接体系如下：gadB 7. 5 μ L，pHTOl载 体1. 5 μ L，buffer 1 μ L，T4连接酶1 μ L，保温16°C过夜，连接产物采用热激法转化至大肠 杆菌宿主菌DH5a中。涂布到含有1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化钠及1.5%琼脂粉氨 节青霉素的LB固体培养基上。
[0044] 6. LB平板在37°C培养至生长出转化子，挑取单菌落，做菌落PCR验证，PCR引物根 据 pHTOl 质粒序列设计，分别为 F-pHT01-seq :TTATAAGAATTGTGGAATTG(SEQ ID NO. 3 所示） 和 R-pHT01-seq :ATCTCCATGGACGCGTGACG(SEQ ID NO. 4 所示），能扩增出 I. 5kb 左右条带的 菌落为阳性克隆。
[0045] 7.挑取阳性克隆单菌落，培养后抽提质粒，并用引物（SEQ ID N0.3,4所示） 测序验证，序列符合预期的即为正确的L-谷氨酸脱羧酶表达载体，在本发明中命名为 "pHTOl-gadB"。
[0046] 实施例2整合敲除载体的构建
[0047] 1.根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： 上游引物F-gabTup-BamHI:GCGGGATCCATGACA?TTTGAAAACGGTCGAGG(SEQIDN0·5所示）和 下游引物 R-OlgabTup :GATTATGTTACAATAGCTGGTACCGTGAATATCCCCCTGTCGGTA(SEQ ID NO. 6 所示）。以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到gabT基因簇上游 1000 bp片段，PCR条件同实施例1中扩增gadB基因片段的条件。
[0048] 2.根据实施例1中构建的载体pHTOl-gadB序列设计引物，上游引物F-gabTup01 : TACCGACAGGGGGATATTCACGGTACCAGCTATTGTAACATAATC(SEQ ID NO. 7 所示）和下游引物卩-01gabTdn:GTCACGCGTCCATGGAGATCTTTCATTGGAAAGAAAATGGCCG(SEQ ID NO. 8 所示）。以 pHTOl-gadB为模板，经PCR扩增得到含有gadB表达框（包括启动子和编码区）的DNA片 段，PCR条件同实施例1中扩增gadB基因片段的条件。
[0049] 3.根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： 上游引物 R-gabTdn01: CGGCCATTTTCTTTCCAATGAAAGATCTCCATGGACGCGTGAC (SEQ ID NO. 9 所 示）和下游引物R-gabTdn-XhoI :TATCTCGAGAAGCCTCGTTTGTTGATAATC(SEQ ID NO. 10所示）。 以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到gabT基因下游1000 bp片段， PCR条件同实施例1中扩增gadB基因片段的条件。
[0050] 4.将上述三种PCR产物纯化后各取5 μ 1作为模板，以引物F-gabTup-BamHI (SEQ ID NO . 5 所示）和 R-gabTdn-XhoI (SEQ ID NO. 10 所示）做 overlap PCR 扩增，延伸时间为 5min，其他条件同实施例1中扩增gadB基因片段的条件。获得gabT基因中上下游各1000 bp 及包含gadB表达框的DNA片段，整个片段中间缺失了 gabT的编码区。
[0051] 5.纯化上述片段，利用常规分子克隆技术将其插入载体pMAD，得到整合载体，本 发明中命名为pMAD- Δ gabT: : gadB。
[0052] 实施例3 L-谷氨酸脱羧酶往枯草芽孢杆菌基因组的整合
[0053] 1.将pMAD- Δ gabT: : gadB质粒转化进枯草芽孢杆菌168菌株，涂布含有50 μ g/mL 的X-gal (5-溴-4-氯-3- Π 引噪-β -D-半乳糖苷）和红霉素平板，30度过夜培养；
[0054] 2.挑取显蓝色转化子，30度过夜培养，涂布含有X-gal和红霉素的平板，42°C过夜 培养；
[0055] 3.挑取蓝色单菌落于42°C和LB培养基中孵育3小时，涂布含有X-gal的无抗性 LB平板，42 °C过夜培养；
[0056] 4.挑取显白斑的单菌落分别在红霉素和无抗LB培养基过夜培养，选择无红 霉素抗性的单菌落做菌落PCR验证，引物选择F-gabTup-BamHI (SEQ ID NO. 5所示）和 R-gabTdn-XhoI (SEQ ID NO. 10所示），能扩增出大小为3. 7kb的菌落即为将gadB表达框整 合进基因组且同时失活了 gabT基因的阳性菌落Bsl68/Λ gabT: : gadB，图1为谷氨酸脱羧酶 整合表达框在染色体上的排列结构，本发明中将该菌命名为Bs 168- Λ gabT: : gadB。
[0057] 实施例4 Bsl68_ Δ gabT: : gadB工程菌的发酵
[0058] 1.种子和发酵培养基：
[0059] 种子培养基为LB培养基（成分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠 lOg/L)。
[0060] 发酵培养基为TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，磷酸盐缓冲液 KH2PO4浓度17mM，K ,04浓度72mM。将前三者按比例配好后，高压蒸汽灭菌，与后面配的经 高压蒸汽灭菌后的磷酸盐缓冲液按10 :1的比例混合即可。
[0061] 2.发酵过程：
[0062] 先过夜培养种子培养基，按2-5%的接种量后转接至发酵培养基，33-37°C好气培 养，培养至发酵结束，离心收集菌体，测定酶活或进行生物催化。
[0063] 3. L-谷氨酸脱羧酶的活性测定
[0064] 反应体系中加入各物质至终浓度如下：浓度为50mM的pH 4. 2磷酸氢二钠-柠檬 酸缓冲液，l〇g/L的湿菌体，0· 2mM磷酸吡卩多醛（Pyridoxalphosphate, PLP)，0· 5M谷氨酸钠。 转化体系10mL，温度30°C，200r/min震荡，30分钟后立即沸水浴10min，终止反应。离心取 上清液，过滤后，高效液相色谱（HPLC)进行检测（其中，检测过程见图2)。
[0065] 酶活力单位定义：在反应液中，每分钟催化底物生成I ymoLy-氨基丁酸所需的 酶量为1个活力单位（U)。
[0066] 4. HPLC 检测条件：
[0067] 1)流动相的制备：流动相A为醋酸钠缓冲液（醋酸钠2.72g，三乙胺0.2mL，加水 至lOOOmL，调节pH为7. 3)，流动相B为乙腈，二者比例为80 % :20%。
[0068] 2)衍生试剂的制备：称取邻苯二甲醛（OPA) 20mg，加入巯基乙醇20 μ L，乙腈5mL， 混合均匀，即得OPA衍生试剂。
[0069] 3)硼酸缓冲液：称取硼酸24. 7g，加水lOOOmL，调pH值为KX 4。
[0070] 4)衍生反应：吸取硼酸缓冲液80 μ L，OPA衍生试剂40 μ L，样品20 μ L，混合均匀 后室温反应5min。
[0071] 5)GABA测定：衍生结束后，进样测定GABA含量。色谱柱采用安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱（4. 6X250mm)，流速为 lmL/min，检测波长 338nm，柱温 40°C。以 GABA 的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，测定样品GABA含量。
[0072] 经检测，TB培养基发酵24小时后，每克湿菌体中L-谷氨酸脱羧酶活性可达136U。
[0073] 实施例5 γ -氨基丁酸的生物催化生产
[0074] 分别选择原始枯草芽孢杆菌168和改造后的基因工程菌发酵，并利用上述发酵获 得的菌体进行催化生产γ-氨基丁酸，转化反应器中加入各物质至终浓度如下：30g/L的湿 菌体，0. 2mM磷酸吡卩多醛（Pyridoxalphosphate，PLP)，加入无菌水至1L，控制温度30°C，搅 拌转数150r/min，逐渐加入L-谷氨酸粉末，pH逐渐降至4. 2为止，随着反应的进行，pH会 逐渐升高，至PH达到5. 0开始再次添加 L-谷氨酸粉末。通过上述添加 L-谷氨酸的方式控 制反应体系pH在4. 2-5. 0范围，至反应体系不再上升，反应结束。
[0075] 离心取上清液，过滤后，HPLC检测，原始菌生成生成的γ-氨基丁酸3. 5g/L，改造 后的工程菌生成γ-氨基丁酸达到121g/L。
[0076] 以上结果表明，经遗传技术构建的枯草芽孢杆菌具有表达高活性L-谷氨酸脱羧 酶的能力，以发酵获得的菌体可转化生成γ-氨基丁酸。兼具了大肠杆菌生产γ-氨基丁 酸产量高成本低和乳酸菌生产γ -氨基丁酸安全性高的优点，具备了工业化的潜力。
【主权项】
1. 一种产Y-氨基丁酸的工程菌的构建方法，其特征在于，其通过将编码L-谷氨酸脱 羧酶的基因及其启动子整合到宿主菌的染色体上得到的。2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，整合的位点为Y_氨基丁酸转氨酶基 因中，整合后使Y-氨基丁酸转氨酶基因失活。3. 根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，将所述编码L-谷氨酸脱羧酶的 基因整合到宿主菌的染色体是通过PMAD整合载体实现的。4. 根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述启动子为grac启动子， 来源于PHTOl表达载体。5. 根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述宿主菌为枯草芽孢杆 菌。6. 根据权利要求1-5任一项所述的构建方法，其特征在于，所述编码L-谷氨酸脱羧酶 的基因来源于微生物。7. 利用权利要求1-6任一所述的构建方法构建的产y-氨基丁酸的工程菌。8. 权利要求7所述的工程菌在生产Y_氨基丁酸中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述工程菌作为生产Y_氨基丁酸的酶 源。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，生产Y-氨基丁酸的方法为： 1) 活化培养工程菌种子，并将培养好的种子逐级放大，并在发酵罐中进行好气培养，培 养温度30°C，控制pH为6. 8-7. 0,溶氧20%以上，发酵时间24-30小时； 2) 离心或膜浓缩得到菌体，加水稀释，然后加磷酸吡哆醛，逐步添加L-谷氨酸，控制反 应液pH在4. 0-5. 0之间，至反应体系pH不再上升为止结束反应。
【专利摘要】本发明公开了属于生物工程技术领域的一种产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用，所述工程菌是通过将编码L-谷氨酸脱羧酶的基因及其启动子整合到宿主菌的染色体上得到的，整合的位点为γ-氨基丁酸转氨酶基因中。本发明构建的工程菌遗传稳定性好，表达的L-谷氨酸脱羧酶活性高，没有多余蛋白尤其是抗生素抗性蛋白表达，安全性高，同时工程菌中失活了降解产物γ-氨基丁酸的γ-氨基丁酸转氨酶，避免了生产过程中产物的分解，提高了产品的收率。本发明的工程菌以L-谷氨酸为原料，生物转化法高效生产γ-氨基丁酸，所生产的γ-氨基丁酸没有内毒素污染的威胁，安全可靠，可用于食品保健品领域。
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/113, C12N15/75, C12R1/125, C12P13/00
【公开号】CN104894043
【申请号】CN201510198433
【发明人】史吉平, 柳鹏福
【申请人】南京本贝德生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月23日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产Y-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用，属生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA)是广泛分布于动物体内的一种重要 的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，在大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑起重 要作用，并对机体的多种功能具有调节作用，包括参与产生镇静、镇痛效应、抗焦虑、防治惊 厥、舒缓血管和降血压、防止动脉硬化调节心律失常以及调节生殖生理激素的分泌的功能。 正是由于具有的多种生理功能，γ-氨基丁酸在医药、保健品、食品、饲料添加剂等领域具有 广泛的应用。2009年，卫生部更是批准 γ-氨基丁酸为新资源食品。
[0003] γ -氨基丁酸的生产主要是通过L-谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸形成。目前常用 的生产γ -氨基丁酸的菌是大肠杆菌和乳酸菌，其中大肠杆菌遗传操作成熟，发酵密度高， 表达量高，因此用于生产γ-氨基丁酸的工艺产量高，生产成本低。但大肠杆菌在发酵过程 中会产生内毒素，在生产过程中会带入到最终产品中，因此用大肠杆菌生产的γ-氨基丁 酸在食品和保健品中的应用受到很大限制。乳酸菌是安全级别的细菌，早已应用于乳制品 等食品工业中，因此用乳酸菌生产的γ-氨基丁酸安全级别高，在食品和保健品领域中应 用很受欢迎。但乳酸菌发酵的生物量少，产生的L-谷氨酸脱羧酶活性低，最终产生的γ-氨 基丁酸浓度低，生产成本很高，导致其最终产品的市场售价居高不下，不利于其进一步的推 广应用。
[0004] 枯草芽孢杆菌是一种食品安全的微生物，在食品领域的应用已持续了几千年，其 安全性早已被大家所公认。但野生型的枯草杆菌自身的L-谷氨酸脱羧酶表达量很低，发 酵产生的酶不足以用于工业化生产，因此需要将L-谷氨酸脱羧酶基因在枯草杆菌中进行 外源表达。中国专利文献CN103409457A公开了一种新型枯草杆菌表达系统，并且公开了利 用所述新型的枯草杆菌表达系统构建重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌，并将此工程菌用于 γ -氨基丁酸的生产。所述的新型枯草杆菌表达系统，包括基因工程菌株BS-T710与表达载 体pBT-23a。表达载体pBT-23a是将Τ7启动子基因插入枯草杆菌表达载体ρΗΤ43的KpnI/ XbaI酶切位点间所得。基因工程菌株BS-T710通过如下方法构建：将Pgrac基因，T7RNA 聚合酶基因 T7plo,及枯草杆菌色氨酸终止子Ter融合，构成T7pol的完整表达元件，并将 T7pol的完整表达元件插入到枯草杆菌整合载体pDG1730的EcoRI酶切位点，得到T7RNA 聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol ;将T7RNA聚合酶整合表达载体pDG1730-T7pol转化 入枯草杆菌168菌株得到基因工程菌株BS-T710。产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌是将 来源于Streptococcus thermophilus Y2的谷氨酸脱羧酶基因 gadB插入至上述表达载体 pBT_23a，获得重组表达载体pBT-23a_gad，利用化学转化法，将pBT-23a_gad转化入上述基 因工程菌株BS-T710,获得产重组谷氨酸脱羧酶的基因工程菌BS-T710-gadB。上述枯草杆 菌表基因工程菌是为了克服枯草芽孢杆菌表达系统缺乏高效转录外源基因的启动子的缺 陷，提供一种具有高效转录谷氨酸脱羧酶基因的启动子的基因工程菌。
[0005] 而上述基因工程菌利用质粒表达载体表达外源基因，存在两个缺陷，一是质粒在 枯草芽孢杆菌中复制尤其是在大规模发酵时，传代不稳定，会导致发酵后期蛋白表达的减 少；二是枯草芽孢杆菌的表达质粒为了筛选方便，都存在编码抗生素抗性酶的基因，这导致 在发酵过程中细菌会额外表达无用的酶，尤其是抗生素抗性酶，在安全要求很严格的食品 工业中，其应用受到限制。
【发明内容】
[0006] 为此，本发明针对于现有技术中枯草芽孢杆菌表达系统利用质粒表达外源基因传 代不稳定导致后期蛋白表达减少、存在抗生素、抗性酶的基因导致资源浪费和安全性低的 缺陷提供一种不利用质粒表达外源基因、遗传稳定、安全性高、高效表达表达L-谷氨酸脱 羧酶的产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建方法。
[0007] 进一步的，本发明针对于现有技术中枯草芽孢杆菌野生型自身的L-谷氨酸脱羧 酶表达量很低，提供一种产γ -氨基丁酸的工程菌及其构建方法，其通过引入grac启动子， 将L-谷氨酸脱羧酶编码基因的表达元件整合到枯草芽孢杆菌的染色体上，并通过上述整 合同时敲除γ-氨基丁酸转氨酶基因来提高L-谷氨酸脱羧酶表达量和减少γ-氨基丁酸 代谢，使γ-氨基丁酸的产量提高。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
[0009] -种产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其通过将编码L-谷氨酸脱羧酶的 基因（gadB)及其启动子整合到宿主菌的染色体上得到的。
[0010] 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，整合的位点为γ-氨基丁 酸转氨酶基因（gabT)中，整合后使γ-氨基丁酸转氨酶基因失活。
[0011] 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，将所述编码L-谷氨酸脱 羧酶的基因整合到宿主菌的染色体是通过PMAD整合载体实现的。
[0012] 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，所述启动子为grac启动 子，来源于ΡΗΤΟΙ表达载体。
[0013] 所述的产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，所述宿主菌为枯草芽孢 杆菌，优选为枯草芽孢杆菌168菌株。
[0014] 所述的产Y-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，其中，所述编码L-谷氨酸脱羧 酶的基因来源于微生物，可为大肠杆菌或其他能表达相同功能酶的微生物。
[0015] L-谷氨酸脱羧酶基因的获得可根据GenBank No:M84025. 1中gadB基因序列全基 因合成，或利用大肠杆菌（如菌株DH5a)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。
[0016] 本发明还提供了利用上述产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法构建的基因 工程菌以及所述基因工程菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。
[0017] -个实施例中，所述基因工程菌的构建方法可以是将L-谷氨酸脱羧酶基因先克 隆到大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭表达载体PHTOl (德国MoBiTec公司）上，然后将包含 了启动子和L-谷氨酸脱羧酶编码基因在内的DNA片段和枯草芽孢杆菌待整合位点上下游 各1000 bp左右的同源臂片段通过overlap-PCR融合成一个长片段，再将该片段克隆到质粒 pMD上得到整合用的载体，最后将该载体转化枯草芽孢杆菌，并通过实验操作和验证，完成 L-谷氨酸脱羧酶编码基因的表达元件整合到枯草芽孢杆菌的染色体上，实现在枯草芽孢杆 菌中的高效稳定表达。
[0018] 所述穿梭表达载体pHTOl，系德国MoBiTec公司产品，大小为8kb，大肠杆菌和枯草 芽孢杆菌双复制起始位点的穿梭表达载体，含有氨苄青霉素抗性基因（大肠杆菌中）和氯 霉素抗性基因（芽孢杆菌中），乳糖抑制子IacI基因，启动子是grac，需要IPTG诱导外源 基因表达，并具有多个限制性内切酶位点。
[0019] 所述的基因工程菌在生产Y-氨基丁酸中的应用，其中，所述基因工程菌作为生 产γ-氨基丁酸的酶源。
[0020] 所述的基因工程菌在生产γ-氨基丁酸中的应用，其中，生产γ-氨基丁酸的方法 为：
[0021] 1)活化培养工程菌种子，并将培养好的种子逐级放大，并在发酵罐中进行好气培 养，培养温度30°C，控制pH为6. 8-7. 0,溶氧20 %以上，发酵时间24-30小时；
[0022] 2)离心或膜浓缩得到菌体，加水稀释到合适浓度，然后加磷酸吡哆醛，逐步添加 L-谷氨酸，控制反应液pH在4. 0-5. 0之间，至反应体系pH不再上升为止结束反应。
[0023] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下特点：
[0024] 本发明通过将L-谷氨酸脱羧酶编码基因的表达元件整合到宿主菌的染色体上构 建工程菌，使其可以高效稳定表达L-谷氨酸脱羧酶，所构建的工程菌遗传稳定性好，表达 的L-谷氨酸脱羧酶活性高，没有多余蛋白尤其是抗生素抗性蛋白表达，安全性高。同时工 程菌中失活了降解产物γ-氨基丁酸的γ-氨基丁酸转氨酶，避免了生产过程中产物的分 解，提高了产品的收率。同时本发明在采用枯草芽孢杆菌作为生产γ- 氨基丁酸的宿主菌 的时候，所生产的γ-氨基丁酸没有内毒素污染的威胁，安全可靠，可用于食品保健品领 域。整体生产工艺简单，环境友好，成本低廉。
[0025] 在枯草芽孢杆菌中存在有γ -氨基丁酸转氨酶（EC2. 6. 1. 19)，该酶能催化γ -氨 基丁酸和α-酮戊二酸反应生成琥珀酸半醛和L-谷氨酸，这会导致γ-氨基丁酸的降解， 不利于产物的积累。为克服此酶的副作用，需要将工程菌中编码γ-氨基丁酸转氨酶的基 因 gabT敲除，以失活该酶，避免产物的降解。而上述L-谷氨酸脱羧酶表达元件往枯草芽孢 杆菌基因组整合时，也需要选择合适的位点。本发明选择将上述表达元件整合到gabT基因 中，既达到整合的目的、实现L-谷氨酸脱羧酶高效表达，同时实现γ -氨基丁酸转氨酶的失 活。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明中谷氨酸脱羧酶整合表达框在染色体上的排列结构。
[0027] 图2为L-谷氨酸钠和γ -氨基丁酸的HPLC检测结果。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。
[0029] 应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。使用的质粒 抽提、基因组抽提、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实 验操作按照《分子克隆实验指南第三版》（[美]J.莎姆布鲁克黄培堂译）操作方法进行。
[0030] 枯草芽孢杆菌实验操作及pMAD基因敲除原理和方法见文献：Maryvonne Arnaud et al, New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformab le, low-GC-content, gram-positive bacteria, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOG Υ,Νον. 2004, p.6887 - 6891。
[0031] 枯草芽孢杆菌电转化方法参照文献：Meddeb Mouelhi F et al，High transformation efficiency of Bacillus subtilis with integrative DNA using glycine betaine as osmoprotectant, Anal Biochem. 2012 May 15 ；424 (2) :127_9〇
[0032] 本发明公开了的一种产γ-氨基丁酸的基因工程菌的构建方法，以枯草芽孢杆菌 宿主菌为例，选择枯草芽孢杆菌168菌株，构建方法如下：
[0033] (1)先将来源于大肠杆菌的gadB基因克隆于枯草芽孢杆菌表达载体pHTOl上。
[0034] (2)设计三对引物，分别扩增gabT上游1000 bp片段、gadB基因和启动子片段、 gabT下游1000 bp片段，然后通过overlap-PCR将三个片段融合到一起。
[0035] (3)将上述融合后的大片段克隆到敲除载体pMAD上，然后转化入枯草芽孢杆菌 中；
[0036] (4)通过一系列不同的培养操作，完成表达元件的无痕整合到枯草芽孢杆菌gabT 位点，同时实现整合表达和gabT的失活，即可获得高表达L-谷氨酸脱羧酶的枯草芽孢杆 菌。
[0037] 具体实验方法见以下实施例。
[0038] 实施例1L-谷氨酸脱羧酶枯草芽孢杆菌表达载体pHTOl-gadB的构建
[0039] L 根据大肠杆菌 gadB 基因序列 GenBank No :M84025. 1 设计引物，F-gadB-Bglll : CATAGATCTATGGATAAGAAGCAAGTAAC (SEQ ID NO. 1 所示）和 R-gadB-Xbal ：CGATCTAGATCAGGT AGCTTTAAAGCTGTTC(SEQ ID NO. 2所示）该引物中的两端增加了 BglII和XbaI位点；
[0040] 2.以大肠杆菌DH5a菌株的总DNA为模板，以上述引物（SEQ ID NO. 1-2所示）PCR 扩增得到gadB基因片段，反应体系包括：模板1 μ L DNA，1 μ L dNTP (lOmmol/L)，2 μ mol/L MgCl2,0.5ymol/L primers，5yL 10XPCR buffer，2.5 U KOD DNA聚合酶（Τ0Υ0Β0公司）。 PCR反应条件包括：94°C预变性4min ;94°C变性30s，53°C退火30s，68°C延伸2min，共30个 循环；72°C，10min。扩增片段进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，回收I. 4kb的DNA条带。
[0041] 3.用Bgl II和XbaI双酶切上述扩增得到的gadB DNA片段。酶切体系：DNA 43 yL，buffer R 5 yL，Bgl II和XbaI各lyL，37°C保温3小时。电泳检测并回收备用。
[0042] 4.培养含有pHTOl质粒的大肠杆菌，并抽提质粒，提取方法按照试剂盒说明书操 作。用BamHI和XbaI双酶切质粒，电泳检测并回收备用。
[0043] 5.用T4连接酶连接gadB和载体DNA片段，连接体系如下：gadB 7. 5 μ L，pHTOl载 体1. 5 μ L，buffer 1 μ L，T4连接酶1 μ L，保温16°C过夜，连接产物采用热激法转化至大肠 杆菌宿主菌DH5a中。涂布到含有1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化钠及1.5%琼脂粉氨 节青霉素的LB固体培养基上。
[0044] 6. LB平板在37°C培养至生长出转化子，挑取单菌落，做菌落PCR验证，PCR引物根 据 pHTOl 质粒序列设计，分别为 F-pHT01-seq :TTATAAGAATTGTGGAATTG(SEQ ID NO. 3 所示） 和 R-pHT01-seq :ATCTCCATGGACGCGTGACG(SEQ ID NO. 4 所示），能扩增出 I. 5kb 左右条带的 菌落为阳性克隆。
[0045] 7.挑取阳性克隆单菌落，培养后抽提质粒，并用引物（SEQ ID N0.3,4所示） 测序验证，序列符合预期的即为正确的L-谷氨酸脱羧酶表达载体，在本发明中命名为 "pHTOl-gadB"。
[0046] 实施例2整合敲除载体的构建
[0047] 1.根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： 上游引物F-gabTup-BamHI:GCGGGATCCATGACA?TTTGAAAACGGTCGAGG(SEQIDN0·5所示）和 下游引物 R-OlgabTup :GATTATGTTACAATAGCTGGTACCGTGAATATCCCCCTGTCGGTA(SEQ ID NO. 6 所示）。以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到gabT基因簇上游 1000 bp片段，PCR条件同实施例1中扩增gadB基因片段的条件。
[0048] 2.根据实施例1中构建的载体pHTOl-gadB序列设计引物，上游引物F-gabTup01 : TACCGACAGGGGGATATTCACGGTACCAGCTATTGTAACATAATC(SEQ ID NO. 7 所示）和下游引物卩-01gabTdn:GTCACGCGTCCATGGAGATCTTTCATTGGAAAGAAAATGGCCG(SEQ ID NO. 8 所示）。以 pHTOl-gadB为模板，经PCR扩增得到含有gadB表达框（包括启动子和编码区）的DNA片 段，PCR条件同实施例1中扩增gadB基因片段的条件。
[0049] 3.根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： 上游引物 R-gabTdn01: CGGCCATTTTCTTTCCAATGAAAGATCTCCATGGACGCGTGAC (SEQ ID NO. 9 所 示）和下游引物R-gabTdn-XhoI :TATCTCGAGAAGCCTCGTTTGTTGATAATC(SEQ ID NO. 10所示）。 以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到gabT基因下游1000 bp片段， PCR条件同实施例1中扩增gadB基因片段的条件。
[0050] 4.将上述三种PCR产物纯化后各取5 μ 1作为模板，以引物F-gabTup-BamHI (SEQ ID NO . 5 所示）和 R-gabTdn-XhoI (SEQ ID NO. 10 所示）做 overlap PCR 扩增，延伸时间为 5min，其他条件同实施例1中扩增gadB基因片段的条件。获得gabT基因中上下游各1000 bp 及包含gadB表达框的DNA片段，整个片段中间缺失了 gabT的编码区。
[0051] 5.纯化上述片段，利用常规分子克隆技术将其插入载体pMAD，得到整合载体，本 发明中命名为pMAD- Δ gabT: : gadB。
[0052] 实施例3 L-谷氨酸脱羧酶往枯草芽孢杆菌基因组的整合
[0053] 1.将pMAD- Δ gabT: : gadB质粒转化进枯草芽孢杆菌168菌株，涂布含有50 μ g/mL 的X-gal (5-溴-4-氯-3- Π 引噪-β -D-半乳糖苷）和红霉素平板，30度过夜培养；
[0054] 2.挑取显蓝色转化子，30度过夜培养，涂布含有X-gal和红霉素的平板，42°C过夜 培养；
[0055] 3.挑取蓝色单菌落于42°C和LB培养基中孵育3小时，涂布含有X-gal的无抗性 LB平板，42 °C过夜培养；
[0056] 4.挑取显白斑的单菌落分别在红霉素和无抗LB培养基过夜培养，选择无红 霉素抗性的单菌落做菌落PCR验证，引物选择F-gabTup-BamHI (SEQ ID NO. 5所示）和 R-gabTdn-XhoI (SEQ ID NO. 10所示），能扩增出大小为3. 7kb的菌落即为将gadB表达框整 合进基因组且同时失活了 gabT基因的阳性菌落Bsl68/Λ gabT: : gadB，图1为谷氨酸脱羧酶 整合表达框在染色体上的排列结构，本发明中将该菌命名为Bs 168- Λ gabT: : gadB。
[0057] 实施例4 Bsl68_ Δ gabT: : gadB工程菌的发酵
[0058] 1.种子和发酵培养基：
[0059] 种子培养基为LB培养基（成分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠 lOg/L)。
[0060] 发酵培养基为TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，磷酸盐缓冲液 KH2PO4浓度17mM，K ,04浓度72mM。将前三者按比例配好后，高压蒸汽灭菌，与后面配的经 高压蒸汽灭菌后的磷酸盐缓冲液按10 :1的比例混合即可。
[0061] 2.发酵过程：
[0062] 先过夜培养种子培养基，按2-5%的接种量后转接至发酵培养基，33-37°C好气培 养，培养至发酵结束，离心收集菌体，测定酶活或进行生物催化。
[0063] 3. L-谷氨酸脱羧酶的活性测定
[0064] 反应体系中加入各物质至终浓度如下：浓度为50mM的pH 4. 2磷酸氢二钠-柠檬 酸缓冲液，l〇g/L的湿菌体，0· 2mM磷酸吡卩多醛（Pyridoxalphosphate, PLP)，0· 5M谷氨酸钠。 转化体系10mL，温度30°C，200r/min震荡，30分钟后立即沸水浴10min，终止反应。离心取 上清液，过滤后，高效液相色谱（HPLC)进行检测（其中，检测过程见图2)。
[0065] 酶活力单位定义：在反应液中，每分钟催化底物生成I ymoLy-氨基丁酸所需的 酶量为1个活力单位（U)。
[0066] 4. HPLC 检测条件：
[0067] 1)流动相的制备：流动相A为醋酸钠缓冲液（醋酸钠2.72g，三乙胺0.2mL，加水 至lOOOmL，调节pH为7. 3)，流动相B为乙腈，二者比例为80 % :20%。
[0068] 2)衍生试剂的制备：称取邻苯二甲醛（OPA) 20mg，加入巯基乙醇20 μ L，乙腈5mL， 混合均匀，即得OPA衍生试剂。
[0069] 3)硼酸缓冲液：称取硼酸24. 7g，加水lOOOmL，调pH值为KX 4。
[0070] 4)衍生反应：吸取硼酸缓冲液80 μ L，OPA衍生试剂40 μ L，样品20 μ L，混合均匀 后室温反应5min。
[0071] 5)GABA测定：衍生结束后，进样测定GABA含量。色谱柱采用安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱（4. 6X250mm)，流速为 lmL/min，检测波长 338nm，柱温 40°C。以 GABA 的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，测定样品GABA含量。
[0072] 经检测，TB培养基发酵24小时后，每克湿菌体中L-谷氨酸脱羧酶活性可达136U。
[0073] 实施例5 γ -氨基丁酸的生物催化生产
[0074] 分别选择原始枯草芽孢杆菌168和改造后的基因工程菌发酵，并利用上述发酵获 得的菌体进行催化生产γ-氨基丁酸，转化反应器中加入各物质至终浓度如下：30g/L的湿 菌体，0. 2mM磷酸吡卩多醛（Pyridoxalphosphate，PLP)，加入无菌水至1L，控制温度30°C，搅 拌转数150r/min，逐渐加入L-谷氨酸粉末，pH逐渐降至4. 2为止，随着反应的进行，pH会 逐渐升高，至PH达到5. 0开始再次添加 L-谷氨酸粉末。通过上述添加 L-谷氨酸的方式控 制反应体系pH在4. 2-5. 0范围，至反应体系不再上升，反应结束。
[0075] 离心取上清液，过滤后，HPLC检测，原始菌生成生成的γ-氨基丁酸3. 5g/L，改造 后的工程菌生成γ-氨基丁酸达到121g/L。
[0076] 以上结果表明，经遗传技术构建的枯草芽孢杆菌具有表达高活性L-谷氨酸脱羧 酶的能力，以发酵获得的菌体可转化生成γ-氨基丁酸。兼具了大肠杆菌生产γ-氨基丁 酸产量高成本低和乳酸菌生产γ -氨基丁酸安全性高的优点，具备了工业化的潜力。
【主权项】
1. 一种产Y-氨基丁酸的工程菌的构建方法，其特征在于，其通过将编码L-谷氨酸脱 羧酶的基因及其启动子整合到宿主菌的染色体上得到的。2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，整合的位点为Y_氨基丁酸转氨酶基 因中，整合后使Y-氨基丁酸转氨酶基因失活。3. 根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，将所述编码L-谷氨酸脱羧酶的 基因整合到宿主菌的染色体是通过PMAD整合载体实现的。4. 根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述启动子为grac启动子， 来源于PHTOl表达载体。5. 根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述宿主菌为枯草芽孢杆 菌。6. 根据权利要求1-5任一项所述的构建方法，其特征在于，所述编码L-谷氨酸脱羧酶 的基因来源于微生物。7. 利用权利要求1-6任一所述的构建方法构建的产y-氨基丁酸的工程菌。8. 权利要求7所述的工程菌在生产Y_氨基丁酸中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述工程菌作为生产Y_氨基丁酸的酶 源。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，生产Y-氨基丁酸的方法为： 1) 活化培养工程菌种子，并将培养好的种子逐级放大，并在发酵罐中进行好气培养，培 养温度30°C，控制pH为6. 8-7. 0,溶氧20%以上，发酵时间24-30小时； 2) 离心或膜浓缩得到菌体，加水稀释，然后加磷酸吡哆醛，逐步添加L-谷氨酸，控制反 应液pH在4. 0-5. 0之间，至反应体系pH不再上升为止结束反应。
【专利摘要】本发明公开了属于生物工程技术领域的一种产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用，所述工程菌是通过将编码L-谷氨酸脱羧酶的基因及其启动子整合到宿主菌的染色体上得到的，整合的位点为γ-氨基丁酸转氨酶基因中。本发明构建的工程菌遗传稳定性好，表达的L-谷氨酸脱羧酶活性高，没有多余蛋白尤其是抗生素抗性蛋白表达，安全性高，同时工程菌中失活了降解产物γ-氨基丁酸的γ-氨基丁酸转氨酶，避免了生产过程中产物的分解，提高了产品的收率。本发明的工程菌以L-谷氨酸为原料，生物转化法高效生产γ-氨基丁酸，所生产的γ-氨基丁酸没有内毒素污染的威胁，安全可靠，可用于食品保健品领域。
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/113, C12N15/75, C12R1/125, C12P13/00
【公开号】CN104894043
【申请号】CN201510198433
【发明人】史吉平, 柳鹏福
【申请人】南京本贝德生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月23日
最新回复(0)