一种共表达口蹄疫病毒vp1基因与免疫佐剂牛il-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用
一种共表达口蹄疫病毒vp1基因与免疫佐剂牛il-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，特别涉及一种共表达口蹄疫 病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 黏膜免疫系统是一种局部免疫系统，主要由局部黏膜组织及免疫活性细胞组成。 黏膜免疫即黏膜免疫系统在病原体等抗原的刺激下，诱导的免疫应答反应。机体与外界抗 原接触机会最多，面积最广的就是机体的黏膜表面，因此，黏膜免疫系统是机体的第一道免 疫屏障。口蹄疫引起的黏膜免疫主要特征是在感染早期就产生分泌型IgA，在口蹄疫病毒感 染最初的几天内，机体尚不能产生特异性的体液免疫反应，此时机体的主要保护能力就是 黏膜免疫系统分泌的SlgA以及起屏障作用的上皮细胞和内皮细胞，机体是发病还是隐性 感染很大程度上取决于黏膜免疫保护能力的高低。由于口蹄疫可通过呼吸道传播，因而研 宄黏膜免疫对于预防口蹄疫有潜在的重要意义。
[0003] 研宄者对猪进行试验，发现免疫后的猪在与自然毒接触时，IgA含量高的猪实验组 有较好的保护率（Eble，etal，2007)。有研宄报道，构建口蹄疫VPl表达载体，与CTB结合， 通过黏膜免疫途径免疫猪和小鼠，结果发现，黏膜免疫能够诱导产生IgA，试验猪感染半数 致死量的毒，发现保护率可以达到80% (Song，etal，2005)。对于通过消化道和呼吸道感染 的传染病而言，黏膜免疫具有重要的意义：能够诱导局部黏膜免疫应答的发生和SlgA的分 泌，在入侵和感染部位抵抗病原菌，同时也能诱导体液免疫和细胞免疫。研宄表明，黏膜免 疫应答产生的抗体比血清中的抗体出现的时间早，持续时间长，在预防和抵抗病原微生物 方面起到非常重要的作用。
[0004] 黏膜免疫的研宄发展，使活菌载体疫苗成为疫苗研宄中的热点。活细菌载体疫苗 能在黏膜表层诱导黏膜免疫应答的发生，刺激SlgA的产生，将病原菌阻挡在体外。乳酸菌 作为机体内的正常菌群，能长期的定植于机体内发挥其促进营养物质分子降解和吸收、维 持肠道内菌落平衡、调节免疫系统作用等益生作用和免疫佐剂作用，这使得其成为细菌活 载体疫苗研宄中载体的有力候选菌株。近年来，随着分子生物学的发展和对乳酸菌认识的 加深，乳酸菌用于活载体疫苗的研宄取得很大进展。乳酸菌表达系统已经成功用于猪流行 性腹泻、新城疫、破伤风、轮状病毒等活载体疫苗的研宄。
[0005] Akinobu Kajikawa等构建了两株重组嗜酸乳杆菌，通过不同销定结构，来展示沙 门氏菌鞭毛蛋白（FliC)。其中一个例子，沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC)融合到细胞被膜蛋白 酶的C-末端区域，静电结合到细胞壁。另一个例子中，沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC)与与粘液 结合蛋白的锚定区共轭连接，通过LPXTG结构域与细胞壁连接。这两种重组乳酸杆菌的菌 体表面展示方式导致了髓样树突状细胞的不同成熟情况以及髓样树突状细胞的细胞因子 分泌。表面展示的抗原对模拟的胃和小肠液环境非常敏感。将重组乳酸杆菌与碳酸氢盐缓 冲液以及大豆胰酶抑制剂混合，细胞壁表面抗原可以抵抗体外胃环境模拟实验时的酶解作 用。保护试剂的使用可以提高乳酸杆菌在模模拟消化液的生存能力。这些结果证明了在口 服黏膜免疫的过程中，保护菌体及其表面展示抗原的重要性。
[0006] Xu等构建了共表达经典猪瘟⑶8+CTL表位290和猪细小病毒VP2抗原的基因工程 乳酸杆菌并分析其作为猪口服疫苗的免疫效果。研宄数据表明，在没有任何佐剂的情况下， 重组乳酸杆菌能有效的诱导黏膜和系统免疫应答来预防经典猪瘟。同时，重组乳酸杆菌也 能诱导抗ppv_vp2的血清抗体IgG和黏膜抗体IgA的产生。这些结果暗示了，在未来经典 猪瘟和猪细小病毒病疫苗的发展中，重组乳酸杆菌微生态制剂是一种有价值的策略。
[0007] Tae-Young Lee等成功构建表达人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原的基因工程干酪 乳酸杆菌L. caSei-PgSA-E6, 口服接种小鼠，结果表明该基因工程干酪乳酸杆菌在小鼠体内 引起T细胞介导的细胞免疫和抗癌抗菌素效应。
[0008] IL-6有促进浆细胞分化和B细胞产生抗体的作用，还有促进鼠原生细胞和人骨髓 瘤细胞的生长的作用。在抗感染过程中，IL-6是主要的促炎症细胞因子，可促进CD4细胞 分化的作用。IL-6是多功能细胞因子，由抗原递呈细胞表达如DC细胞、吞噬细胞、B细胞和 其它造血系统的细胞，但也包括一些非造血系统的细胞如角蛋白细胞、成纤维细胞、上皮细 胞、星形细胞。本研宄中，我们成功克隆了牛的IL-6基因，从而为牛IL-6作为疫苗分子佐 剂提供了理论依据。
[0009] 因此，本申请通过构建共表达Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6 的重组乳酸杆菌表达载体pSIP/Asial/VPl/IL-6,并将该重组载体电转化导入到乳酸杆菌 NC8中，利用导入成功的乳酸杆菌NC8表达Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6 基因，免疫学检测证实外源基因在乳酸菌中获得了表达，并且具用反应原性，而且重组基因 工程乳酸菌可以在黏膜表层诱导黏膜免疫应答的发生，刺激SlgA的产生，将病原菌阻挡在 体外。本申请旨在利用乳酸菌构建共表达Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6 的活载体疫苗，通过黏膜免疫途径免疫实验动物，研宄该疫苗的黏膜免疫情况，为下一步研 制Asial型口蹄疫病毒口服基因工程疫苗提供理论基础和实验依据。
【发明内容】
[0010] 相对于大肠杆菌原核表达系统，乳酸菌表达系统还不够成熟，主要表现在外源蛋 白的表达量较低、乳酸菌的某些遗传背景不够清楚，操作比较繁琐，表达条件相对不够稳定 等，本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种高效表达Asial型口蹄疫病毒 VPl基因与免疫佐剂牛IL-6的重组乳酸杆菌载体系统，提高外源基因表达量，而实现口服 免疫的效果。
[0011] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0012] 一种共表达口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌，其特征 在于，所述重组乳酸杆菌含有由在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因的口蹄疫病毒VPl 基因序列与免疫佐剂牛IL-6基因序列连接在一起而得到的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示。
[0013] 含有该核苷酸序列的表达载体pSIP/Asial/VPl/IL-6也当然属于本发明的保护 范畴之内。
[0014] 在本发明中，优选的，改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与口蹄 疫病毒VPl基因进行连接，连接后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合。
[0015] 在本发明中，优选的，所述的口蹄疫病毒为Asial型口蹄疫病毒。
[0016] 制备所述的重组乳酸杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0017] (1)利用提高N端正电荷和H区疏水性的方法，对乳酸杆菌信号肽的结构进行改 造，将改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VPl基因进行连接， 连接后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示；
[0018] (2)将融合后的基因序列插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒 pSIP/Asial/VPl/IL-6 ；
[0019] (3)将pSIP/Asial/VPl/IL-6重组质粒转化至乳酸杆菌。
[0020] 在本发明中，优选的，采用反转录PCR方法扩增牛IL-6基因，所用引物序列为：
[0021] 上游引物：5' -AAGCTTATGAATTCTAGATTTACTTCCGCTTTCACC-3' ；
[0022] 下游引物：5 ' - CTCGAGCTTCATCCTGATGGCCCTCAACGAG-3 '。
[0023] 在本发明中，优选的，步骤（3)将重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VPl电转化导入 到乳酸杆菌NC8中，电转化后的乳酸杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37°C培养箱中培 养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别于MRS液体培养基中过夜培养，将上述菌液 以 1:100的接种率接种于50mL MRS液体培养基中，37°C培养至OD值为0. 6-0. 8,并以浓度为 50-100ng/mL乳杆菌肽（SppIP)为诱导物，诱导表达4-7h得到重组蛋白。
[0024] 在本发明中，优选的，所述的重组蛋白在信号肽的引导下分泌到胞外，具有较好的 免疫原性，分子量为35kD。
[0025] 在本发明中，优选的，所述电转化的电压参数为2500V，5ms。
[0026] 本发明设计并合成了在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因并融合Asial型口蹄 疫病毒VP1基因与免疫佐剂牛IL-6基因，利用该基因构建了分泌性表达口蹄疫病毒VP1基 因和免疫佐剂牛IL-6的乳酸杆菌重组表达载体pSIP/Asial/VPl/IL-6。通过电转化导入 到乳酸杆菌NC8中，对转化过程中电转化参数进行优化，经乳杆菌肽SppIP诱导，目的基因 在乳酸杆菌中得到了稳定的、高效的表达，SDS-PAGE分析表明融合蛋白分子量约为35kD， 光密度扫描分析可知表达的重组蛋白占菌体总蛋白的15%。菌液上清经SDS-PAGE电泳和 Western-blot检测有少量目的蛋白表达，初步证明目的蛋白能够有效地表达并在信号肽的 引导下分泌到胞外。最终获得高效表达口蹄疫病毒VPl基因的重组乳酸杆菌NC8,本发明通 过对表达过程中诱导物浓度、诱导剂加入时间和诱导时间等多个影响表达的关键因素的探 索，提供了一种高效表达外源基因的乳酸杆菌载体系统。
[0027] 重组乳酸菌在动物攻毒后都发挥了很好的保护作用，含有空载体的对照组也表现 了一定的保护力证明了乳酸菌能够调节机体免疫的益生作用。重组乳酸菌免疫组的抗病毒 能力远远大于空白对照组，空白对照组豚鼠全部发病。
[0028] 因此进一步的，本发明提供了所述的重组乳酸杆菌在制备Asial型口蹄疫黏膜免 疫疫苗中的应用。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0030] (1)本发明表达的目的蛋白能够有效地表达，并在信号肽的引导下分泌到胞外。因 此我们可以在培养上清中获得可溶性的表达产物。既可以用纯化的表达产物进行免疫，也 可以直接用重组菌进行口服免疫，这样就省去了常规原核表达系统表达后的复杂的纯化过 程和复性过程，口服免疫则更适合于规模化养殖。
[0031] (2)动物免疫试验也证实本发明制备的重组乳酸杆菌NC8表达的抗原具有较好 的免疫原性；乳酸杆菌属于肠道益生菌，作为食品安全级微生物，是动物和人体内的正常菌 群，具有益生作用和免疫佐剂作用，这使得其成为细菌活载体疫苗研宄中载体的有力候选 菌株，对人畜安全，无病原污染；用乳酸菌表达蛋白后无需经过提取纯化过程，具有工艺简 单、免疫效果好和对动物保护力强等优点，适用于家畜的免疫使用。
【附图说明】
[0032] 图1是重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6的构建路线图；
[0033] 图2是重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6的酶切鉴定图；其中，M为DNA分子质量标 准；1 为质粒 pSIP/Asial/VPl/IL-6 经 Nco I /HindIII 双酶切后；2 为质粒 pSIP/Asial/ VP1/IL-6 经 Hindlll/Xhol I 双酶切后；
[0034] 图3是重组乳酸杆菌NC8目的基因的PCR分析图；其中，M为DNA分子量标准；1、 2分别为重组乳酸杆菌NC8经PCR扩增的VP1、IL-6基因；
[0035] 图4是重组乳酸杆菌NC8表达蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，M为预染marker ;6 为空载体PSIP411在NC8中诱导7h后的表达产物；7为重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6在 NC8中未经诱导7h后的表达产物；8为重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6在NC8中经诱导7h 后的表达产物；9-10为重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6在NC8中经诱导7h后的表达产物 经过超声处理后的上清和菌体沉淀；
[0036] 图5是重组乳酸杆菌NC8表达蛋白的Western-blot检测图；其中，1 :经SppIP 诱导的含重组载体pSIP/Asial/VPl/IL-6的乳酸杆菌NC8表达目的蛋白；2 :含空载体 PSIP411的乳酸杆菌NC8表达蛋白；3 :未经诱导的含重组载体pSIP/Asial/VPl/IL-6的乳 酸杆菌NC8 ;4为蛋白分子量标准。
[0037] 图6是豚鼠血液中IgA抗体水平的动态变化图；
[0038] 图7是豚鼠血液中IgG抗体水平的动态变化图；
[0039] 图8是豚鼠血液中IgM抗体水平的动态变化图；
[0040] 图9是中和抗体滴度图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0042] 实施例1重组表达载体pSIP/Asial/VPl/IL-6的获得
[0043] 1材料与方法
[0044] I. 1材料及来源
[0045] 口蹄疫Asial型病毒江苏株（Asial/JS/China/2005)为本实验室保存。大肠杆 菌-乳酸菌穿梭质粒表达载体PSIP411及乳酸杆菌NC8购自北京毕特博生物技术有限公 司，克隆载体PUC57由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。限制性内切酶NC〇I、HindIII、 Xhol 及 T4 连接酶均购自 NEB 公司，Taq 酶、dNTP、DNA Marker DL2,000、DL15,000、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit 购自大连宝生物公司。 克隆载体PUC57由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。
[0046] 1. 2 方法
[0047] I. 2. 1基因的改造及合成
[0048] 乳酸杆菌信号肽SP310原始序列为EMBL(smart. embl-heidelberg. de)数据库在 线工具检索的基因序列，序列号为AJ238086,利用增加 SP310信号肽N端正电荷和H区疏 水性的方法，以及C端氨基酸残基的缺失使H区更靠近切割位点等方法，最终设计出全长 81bp的改造后的SP310信号肽结构；Asial型FMDV VPl基因的原始序列全长633bp，根据 Genebank 中 Asial/JS/China/2005 株的 VPl 基因序列（序列号为 EF149009)，将 VPl 基因 与SP310基因借一连接短肽（GSGGSGG)连接到一起，两端分别带有Nco I和HindIII酶切 位点，序列由南京金斯瑞生物技术有限公司全基因合成，克隆到载体PUC57上，受体菌为大 肠杆菌DH5 α，命名为pUC/FMDV-Asial/VPl，序列送上海桑尼公司进行序列测定。
[0049] 1. 2. 2免疫佐剂牛IL-6基因的克隆与序列分析
[0050] 分离并培养牛淋巴细胞，用PHA刺激后提取总RNA，以OligodT(IS)为下游引物 进行反转录，根据Genebank中牛IL-6基因序列（序列号为X57317)，设计出带有HindIII 和 Xho I I 酶切位点的一对引物（上游引物：5 ' -AAGCTTATGAATTCTAGATTTACTTCCGCTTTCA CC-3'，下游引物：5' -CTCGAGCTTCATCCTGATGGCCCTCAACGAG-3'），反转录产物用 PCR 方法 扩增出牛IL-6基因，并将其克隆至pUC57载体中（命名为pUC57/IL-6)，进行核苷酸序列分 析。
[0051] I. 2. 3Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6的重组表达载体pSIP/ Asial/VPl/IL-6 的构建
[0052] 分别用Nco I和Xhol I双酶切质粒pSIP411，Nco I和HindIII双酶切质粒 PUC57/VP1，HindIII和Xhol I双酶切质粒pUC57/IL- 6,将纯化回收的VPl基因与牛IL-6 基因与双酶切后的表达载体PSIP411大片段连接、转化、碱裂解法提质粒，用电泳、酶切方 法鉴定转化子，构建Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6的重组表达载体 pSIP/Asial/VPl/IL-6(图 1)。
[0053] 2试验结果
[0054] 2. 1获得的带有信号肽的Asial型口蹄疫病毒VPl基因与牛IL-6基因的融合基因 序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0055] 2. 2重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6经酶切的片段与预计大小相符，说明乳酸杆 菌表达载体 pSIP/Asial/VPl/IL-6 构建正确（图 2)。在 pSIP/Asial/VPl/IL-6 载体中，Nco I酶切位点、起始密码子、SP310信号肽基因、连接短肽、VPl基因、终止密码子、Xhol酶切位 点等共1383个核苷酸，编码461个氨基酸。
[0056] 实施例2 Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6在乳酸杆菌NC8重组 菌株中的表达及检测
[0057] 1材料与方法
[0058] I. 1材料及来源
[0059] (1)诱导物：杆菌肽（SppIP) (10ng/mL)由上海生工生物工程有限公司合成。
[0060] (2)抗生素：氨苄（Amr)、红霉素（Emr)购自拜尔迪生物技术有限公司。
[0061] 1.2 方法
[0062] 1. 2. 1目的基因在乳酸杆菌NC8中的电转化与抗性菌株的筛选：电转化后的乳酸 杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37°C培养箱中培养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别 于MRS液体培养基中过夜培养；
[0063] 1. 2. 2重组乳酸杆菌NC8的PCR检测：取5mL过夜培养菌液进行质粒的提取，PCR 扩增检测目的基因，同时以未转基因的载体PSIP411做阴性对照；
[0064] 1. 2. 3不同浓度诱导物浓度、诱导时间对目的基因诱导表达的影响：将上述菌液 以1:100的接种率接种于50mL MRS液体培养基中，37°C培养至OD值为0. 6-0. 8 (约3h)，此 时记为Oh诱导，在培养基中加入诱导物SppIP，诱导物的终浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、 30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、100ng/mL，确定诱导物的浓度后每隔 Ih 取 菌液，至7h。同样诱导含有空载体pSIP411的重组乳酸杆菌，作为对照组，诱导结束后分别 处理菌体沉淀和培养液上清做电泳分析，通过光密度扫描对表达产物进行定量分析，得出 最佳诱导物浓度。
[0065] 1. 2. 4表达产物的SDS-PAGE分析：由于乳酸杆菌pSIP/Asial/VPl/IL-6为细胞外 表达，可将蛋白分泌到培养基中，因此取37°C过夜培养的菌液离心后，保留上清分别进行 4°C透析和冷冻干燥以50倍浓缩蛋白，浓缩后加入I X SDS凝胶加样缓冲液（含DTT)，充分 混勾，煮沸lOmin，1000 g离心10min，取上清IOul上样。同时将的菌液离心后所得菌体沉淀 也进行SDS-PAGE电泳分析。
[0066] 1. 2. 5重组蛋白表达效率分析：脱色后的凝胶用干胶膜作成干胶片保存，对干胶 片用dual wavelength TCL scanner (shimadzu CS-930)分析，可定量分析表达蛋白的含量
[0067] L 2. 6重组乳酸杆菌NC8的Western-blot检测：取IOmL经SppIP诱导的重组乳 酸杆菌上清，加入一定体积的上样缓冲液，煮沸lOmin，按常规法电泳、转印、封闭、漂洗，FMD 阳性猪血清37°C孵育lh，漂洗后以辣根过氧化物酶（HRP)标记的山羊抗猪IgG于37°C孵育 lh，漂洗后进行ECL显色。
[0068] 2试验结果
[0069] 2. 1重组乳酸杆菌NC8的获得：电转化涂板后所长的菌落在液体培养基中培养物 经提取质粒后双酶切鉴定，条带大小合适；实验证明2500V，5ms的电压参数是最合适的，电 转化效率最高。
[0070] 2. 2重组乳酸杆菌NC8的PCR检测：提取重组乳酸杆菌质粒进行PCR检测，重组质 粒可扩增出目的片段，空质粒没有扩增出任何条带（图3)。
[0071] 2. 3不同浓度诱导物浓度、诱导时间对目的基因诱导表达的影响：活化的种子菌 以1 %接种于改良的MRS液体培养基，初始培养基pH值在6. 0~7. 0之间，37°C培养至OD 值为0. 6-0. 8,并以SppIP为诱导物，诱导物浓度在50-100ng/mL时诱导表达蛋白量最高； 加入诱导物后乳酸菌在4h左右表达蛋白量开始较高，在7h达到最高水平且趋于稳定；通过 光密度扫描分析可知表达的重组蛋白占菌体总蛋白的15%。（图4)。
[0072] 2. 4分泌性表达：诱导的菌液上清分别经4°C透析和冷冻干燥浓缩50倍后， SDS-PAGE电泳和Western-blot检测有少量目的蛋白表达，初步证明目的蛋白能够有效地 表达并在信号肽的引导下分泌到胞外（图4)。因此我们可以在培养上清中获得可溶性的表 达产物。既可以用纯化的表达产物进行免疫，也可以直接用重组菌进行口服免疫，这样就省 去了常规原核表达系统表达后的复杂的纯化过程和复性过程，口服免疫则更适合于规模化 养殖。试验通过对乳酸杆菌PSIP411质粒表达系统理想表达条件的探索为更好利用该系统 表达活性蛋白奠定了基础。
[0073] 2. 5重组乳酸杆菌NC8的Western-blot检测：重组乳酸杆菌蛋白提取液经电泳和 转膜杂交后，结果显示：表达蛋白能被口蹄疫病毒阳性猪血清抗体识别，经诱导的重组菌株 在约35KD处可见较微弱的特异性免疫反应条带，而未诱导的菌株和和含空载体的菌株无 此杂交带（图5)。说明VPl基因在转基因重组乳酸杆菌中已表达，且所表达的蛋白具有免 疫反应活性。
[0074] 实施例3动物免疫试验
[0075] 1材料与方法
[0076] I. 1材料及来源
[0077] 健康豚鼠（300_500g)由本所实验动物养殖场提供。包被抗原、辣根过氧化物酶 (HRP)标记的兔抗豚鼠 IgG、0PD、双氧水等试剂为ELISA诊断试剂盒所配备。
[0078] 1. 2试验方法
[0079] I. 2. 1动物分组及免疫与攻毒
[0080] 将豚鼠随机分为5组，每组6只，分别为含重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6的 NC8 (A 组）、含质粒 pSIP411 的 NC8 (B 组）、含重组质粒 pSIP/Asial/VPl/IL-6 的 WCFSl (C 组）、含质粒PSIP411的WCFSl (D组）和阴性对照（只灌服奶，E组），免疫三次，免疫时间 每次间隔为一周，每次连续免疫三天，每天一次，第四周攻毒，第五周杀死豚鼠，检测各项指 标。
[0081] 表 1
[0082]
[0083] 免疫程序
[0084] 0123456789
[0085] ★ ★ ★
[0086] 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
[0087] ★ ★ ★
[0088] 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
[0089] ★ ★ ★
[0090] 将7h诱导的重组乳酸杆菌收菌后离心获得菌体沉淀，用PBS清洗后重悬于鲜奶 中；分每只豚鼠注射〇. 2ml ;分别于0d、9d、19d、29d采血，间接ELISA法测定血清抗体；第 三次免疫后28d攻毒，豚鼠后妬部皮内穿刺攻毒，每只豚鼠接种100ID50/0. 2mL的Asial型 FMDV，连续观察7d，以病变出现的严重程度作为保护效果的判定：完全保护为不出现任何 病变；部分保护为病变仅发生于攻毒接种的单只脚；不保护为两只及以上脚均出现病变。
[0091] 1. 2. 2血液中IgA、IgM的检测
[0092] 于免疫前（Od)及初次免疫后第 5(1、7(1、10(1、15(1、17(1、20(1、25(1、27(1、30(1分别采集 免疫豚鼠的粪便样品和唾液样品 检测IgA、IgM水平。方法如下：
[0093] A型口蹄疫兔抗血清用PBST 1:1000稀释，96孔板每孔50 μ L，室温封板8h。用 PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，加入A型口蹄疫病毒灭活抗原（PBST 1:6稀释）每孔 100 μ L，37°C培养Ih。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，每孔加入100 μ L的待检样品 (血清1:10稀释，唾液1:2稀释，粪便上清液不稀释），设立阴性孔、阳性孔和空白对照孔， 37°C培养lh。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，加入HRP标记的兔抗豚鼠 IgA二抗 (1:1000PBST稀释）每孔100 μ L，37°C培养50min。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后， 每孔加入50 μ L的OPD显色剂（H202每mLlOO μ L)，37°C培养15min后加入终止液（稀硫 酸），15min内在492nm波长下读取OD值。
[0094] L 2. 3血液中IgG的检测
[0095] 于免疫前（Od)及初次免疫后第10d、20d、30d采集免疫豚鼠心脏血液检测IgG。方 法如下：
[0096] 96孔板每孔IOOyL 口蹄疫A型灭活抗原（用PBST以1:6稀释），4°C孵育8h。用 PBST洗板5次并拍板后，每孔加入200 μ L含1 %脱脂奶粉的PBST溶液，37°C培养2h。PBST 洗板5次并拍板后，每孔加入100 μ L的待检血清（1:8稀释，依次倍比稀释）。同时设立阴 性、阳性和空白对照孔，37°C培养lh。PBST洗板5次并拍板后，每孔加入100 μ L的HRP标 记的兔抗豚鼠 IgG二抗（1:1000稀释），37°C培养50min。PBST洗板5次并拍板后，每孔加 入50 μ L的OPD显色剂，37°C 15min。每孔加入50 μ L终止液（稀硫酸），492nm下读取OD 值。
[0097] L 2. 4细胞中和试验
[0098] 用含2% FBS的DMEM将各组豚鼠血清（过滤除菌56°C灭活30min)按1:4, 1:8,… 1:32,…稀释；96孔板中每孔加入50 μ L稀释好的病毒液（用含有2% FBS的DMEM将病毒 稀释成200TCID50/0.1 mL)，分别加入50 μ L不同稀释度的待检血清和阴性血清，每一稀释 度设立3个重复孔，将刚长成单层的BHK细胞制成细胞悬液，每孔加入100 μ L。37°C培养 5-7天，连续观察CPE (cytopathic effect，致细胞病变效应）。结果判定，阴性和空白对照 孔均未出现CPE时结果成立。然后按照Read-Muench公式计算出中和抗体效价。
[0099] 2试验结果
[0100] 2. 1血液中IgA、IgG和IgM的检测结果
[0101] 以各实验组的血清样品OD值的平均值绘制IgA、IgG、IgM抗体水平的动态变化曲 线（图6、图7和图8)。从图中可以清楚看出抗体的变化，在一免后三种抗体都被诱导产生 并在三免时含量达到最高，但IgG上升水平较IgA、IgM高。
[0102] 2. 2细胞中和试验结果分析
[0103] 通过细胞中和试验检测出两个重组乳酸杆菌免疫组都产生了中和抗体，而含有空 载体的对照组和空白对照组并未产生中和抗体（图9)。
[0104] 2. 3攻毒保护试验结果
[0105] 表 2
[0106]
[0107] 在初免后第30天对每组4只豚鼠进行攻毒实验。从上表中可分析出两组重组乳 酸菌在动物攻毒后都发挥了很好的保护作用，说明重组乳酸杆菌表达的抗原蛋白具有良好 的免疫原性。重组乳酸杆菌免疫组的抗病毒能力远远大于阴性对照组，而空载体免疫组豚 鼠部分发病，也说明乳酸杆菌具有免疫佐剂的作用。
[0108] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以 对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡 在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。
【主权项】
1. 一种共表达口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌，其特征在 于，所述重组乳酸杆菌含有由在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因的口蹄疫病毒VPl基 因序列与免疫佐剂牛IL-6基因序列连接在一起而得到的融合基因，其核苷酸序列如SEQID NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的重组乳酸杆菌，其特征在于，改造的乳酸杆菌信号肽基因借 一连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VPl基因进行连接，连接后的基因序列再与免疫佐剂牛 IL-6基因序列进行融合。3. 根据权利要求1所述的重组乳酸杆菌，其特征在于，所述的口蹄疫病毒为Asial型口 蹄疫病毒。4. 一种重组载体pSIP/Asial/VPl/IL-6,其特征在于，它包含权利要求1所述的核苷酸 序列。5. 制备权利要求1-3任一项所述的重组乳酸杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 利用提高N端正电荷和H区疏水性的方法，对乳酸杆菌信号肽的结构进行改造，将 改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VPl基因进行连接，连接 后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所 示； (2) 将融合后的基因序列插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒pSIP/ Asial/VPl/IL-6 ； (3) 将pSIP/Asial/VPl/IL-6重组质粒转化至乳酸杆菌。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3)将重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/ VPl电转化导入到乳酸杆菌NC8中，电转化后的乳酸杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37°C 培养箱中培养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别于MRS液体培养基中过夜培养，将上述 菌液以1:100的接种率接种于50mLMRS液体培养基中，37°C培养至OD值为0. 6-0. 8,并以 浓度为50-100ng/mL乳杆菌肽（SppIP)为诱导物，诱导表达4-7h得到重组蛋白。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用反转录PCR方法扩增牛IL-6基因，所 用引物序列为： 上游引物：5' -AAGCTTATGAAITCTAGAITTACTTCCGCTITCACC-3' ； 下游引物：5 ' -CTCGAGCTTCATCCTGATGGCCCTCAACGAG-3 '。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的重组蛋白在信号肽的引导下分泌 到胞外，具有较好的免疫原性，分子量为35kD。9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述电转化的电压参数为2500V，5ms。10. 权利要求1-3任一项所述的重组乳酸杆菌在制备Asial型口蹄疫黏膜免疫疫苗中 的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种共表达口蹄疫病毒VP1基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明对乳酸杆菌信号肽的结构进行改造，将改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VP1基因进行连接，连接后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合，融合后的基因序列插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒pSIP/Asia1/VP1/IL-6，将pSIP/Asia1/VP1/IL-6重组质粒转化至乳酸杆菌。本发明针对重组乳酸杆菌表达系统，适当改造信号肽结构以提高乳酸杆菌中外源蛋白的分泌效率，通过黏膜免疫途径免疫实验动物，研究该疫苗的黏膜免疫情况，为研发新型口蹄疫黏膜免疫疫苗提供实验基础。
【IPC分类】C12N15/42, A61K39/135, A61P31/14, C12N15/62, A61K48/00, A61K39/39, C12N15/74, C12N15/24, C12N1/21
【公开号】CN104894045
【申请号】CN201510258195
【发明人】潘丽, 张永光, 张中旺, 吕建亮, 王永录, 方玉珍, 周鹏, 刘新生
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，特别涉及一种共表达口蹄疫 病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 黏膜免疫系统是一种局部免疫系统，主要由局部黏膜组织及免疫活性细胞组成。 黏膜免疫即黏膜免疫系统在病原体等抗原的刺激下，诱导的免疫应答反应。机体与外界抗 原接触机会最多，面积最广的就是机体的黏膜表面，因此，黏膜免疫系统是机体的第一道免 疫屏障。口蹄疫引起的黏膜免疫主要特征是在感染早期就产生分泌型IgA，在口蹄疫病毒感 染最初的几天内，机体尚不能产生特异性的体液免疫反应，此时机体的主要保护能力就是 黏膜免疫系统分泌的SlgA以及起屏障作用的上皮细胞和内皮细胞，机体是发病还是隐性 感染很大程度上取决于黏膜免疫保护能力的高低。由于口蹄疫可通过呼吸道传播，因而研 宄黏膜免疫对于预防口蹄疫有潜在的重要意义。
[0003] 研宄者对猪进行试验，发现免疫后的猪在与自然毒接触时，IgA含量高的猪实验组 有较好的保护率（Eble，etal，2007)。有研宄报道，构建口蹄疫VPl表达载体，与CTB结合， 通过黏膜免疫途径免疫猪和小鼠，结果发现，黏膜免疫能够诱导产生IgA，试验猪感染半数 致死量的毒，发现保护率可以达到80% (Song，etal，2005)。对于通过消化道和呼吸道感染 的传染病而言，黏膜免疫具有重要的意义：能够诱导局部黏膜免疫应答的发生和SlgA的分 泌，在入侵和感染部位抵抗病原菌，同时也能诱导体液免疫和细胞免疫。研宄表明，黏膜免 疫应答产生的抗体比血清中的抗体出现的时间早，持续时间长，在预防和抵抗病原微生物 方面起到非常重要的作用。
[0004] 黏膜免疫的研宄发展，使活菌载体疫苗成为疫苗研宄中的热点。活细菌载体疫苗 能在黏膜表层诱导黏膜免疫应答的发生，刺激SlgA的产生，将病原菌阻挡在体外。乳酸菌 作为机体内的正常菌群，能长期的定植于机体内发挥其促进营养物质分子降解和吸收、维 持肠道内菌落平衡、调节免疫系统作用等益生作用和免疫佐剂作用，这使得其成为细菌活 载体疫苗研宄中载体的有力候选菌株。近年来，随着分子生物学的发展和对乳酸菌认识的 加深，乳酸菌用于活载体疫苗的研宄取得很大进展。乳酸菌表达系统已经成功用于猪流行 性腹泻、新城疫、破伤风、轮状病毒等活载体疫苗的研宄。
[0005] Akinobu Kajikawa等构建了两株重组嗜酸乳杆菌，通过不同销定结构，来展示沙 门氏菌鞭毛蛋白（FliC)。其中一个例子，沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC)融合到细胞被膜蛋白 酶的C-末端区域，静电结合到细胞壁。另一个例子中，沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC)与与粘液 结合蛋白的锚定区共轭连接，通过LPXTG结构域与细胞壁连接。这两种重组乳酸杆菌的菌 体表面展示方式导致了髓样树突状细胞的不同成熟情况以及髓样树突状细胞的细胞因子 分泌。表面展示的抗原对模拟的胃和小肠液环境非常敏感。将重组乳酸杆菌与碳酸氢盐缓 冲液以及大豆胰酶抑制剂混合，细胞壁表面抗原可以抵抗体外胃环境模拟实验时的酶解作 用。保护试剂的使用可以提高乳酸杆菌在模模拟消化液的生存能力。这些结果证明了在口 服黏膜免疫的过程中，保护菌体及其表面展示抗原的重要性。
[0006] Xu等构建了共表达经典猪瘟⑶8+CTL表位290和猪细小病毒VP2抗原的基因工程 乳酸杆菌并分析其作为猪口服疫苗的免疫效果。研宄数据表明，在没有任何佐剂的情况下， 重组乳酸杆菌能有效的诱导黏膜和系统免疫应答来预防经典猪瘟。同时，重组乳酸杆菌也 能诱导抗ppv_vp2的血清抗体IgG和黏膜抗体IgA的产生。这些结果暗示了，在未来经典 猪瘟和猪细小病毒病疫苗的发展中，重组乳酸杆菌微生态制剂是一种有价值的策略。
[0007] Tae-Young Lee等成功构建表达人乳头瘤病毒16型E6蛋白抗原的基因工程干酪 乳酸杆菌L. caSei-PgSA-E6, 口服接种小鼠，结果表明该基因工程干酪乳酸杆菌在小鼠体内 引起T细胞介导的细胞免疫和抗癌抗菌素效应。
[0008] IL-6有促进浆细胞分化和B细胞产生抗体的作用，还有促进鼠原生细胞和人骨髓 瘤细胞的生长的作用。在抗感染过程中，IL-6是主要的促炎症细胞因子，可促进CD4细胞 分化的作用。IL-6是多功能细胞因子，由抗原递呈细胞表达如DC细胞、吞噬细胞、B细胞和 其它造血系统的细胞，但也包括一些非造血系统的细胞如角蛋白细胞、成纤维细胞、上皮细 胞、星形细胞。本研宄中，我们成功克隆了牛的IL-6基因，从而为牛IL-6作为疫苗分子佐 剂提供了理论依据。
[0009] 因此，本申请通过构建共表达Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6 的重组乳酸杆菌表达载体pSIP/Asial/VPl/IL-6,并将该重组载体电转化导入到乳酸杆菌 NC8中，利用导入成功的乳酸杆菌NC8表达Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6 基因，免疫学检测证实外源基因在乳酸菌中获得了表达，并且具用反应原性，而且重组基因 工程乳酸菌可以在黏膜表层诱导黏膜免疫应答的发生，刺激SlgA的产生，将病原菌阻挡在 体外。本申请旨在利用乳酸菌构建共表达Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6 的活载体疫苗，通过黏膜免疫途径免疫实验动物，研宄该疫苗的黏膜免疫情况，为下一步研 制Asial型口蹄疫病毒口服基因工程疫苗提供理论基础和实验依据。
【发明内容】
[0010] 相对于大肠杆菌原核表达系统，乳酸菌表达系统还不够成熟，主要表现在外源蛋 白的表达量较低、乳酸菌的某些遗传背景不够清楚，操作比较繁琐，表达条件相对不够稳定 等，本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种高效表达Asial型口蹄疫病毒 VPl基因与免疫佐剂牛IL-6的重组乳酸杆菌载体系统，提高外源基因表达量，而实现口服 免疫的效果。
[0011] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0012] 一种共表达口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌，其特征 在于，所述重组乳酸杆菌含有由在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因的口蹄疫病毒VPl 基因序列与免疫佐剂牛IL-6基因序列连接在一起而得到的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示。
[0013] 含有该核苷酸序列的表达载体pSIP/Asial/VPl/IL-6也当然属于本发明的保护 范畴之内。
[0014] 在本发明中，优选的，改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与口蹄 疫病毒VPl基因进行连接，连接后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合。
[0015] 在本发明中，优选的，所述的口蹄疫病毒为Asial型口蹄疫病毒。
[0016] 制备所述的重组乳酸杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0017] (1)利用提高N端正电荷和H区疏水性的方法，对乳酸杆菌信号肽的结构进行改 造，将改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VPl基因进行连接， 连接后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示；
[0018] (2)将融合后的基因序列插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒 pSIP/Asial/VPl/IL-6 ；
[0019] (3)将pSIP/Asial/VPl/IL-6重组质粒转化至乳酸杆菌。
[0020] 在本发明中，优选的，采用反转录PCR方法扩增牛IL-6基因，所用引物序列为：
[0021] 上游引物：5' -AAGCTTATGAATTCTAGATTTACTTCCGCTTTCACC-3' ；
[0022] 下游引物：5 ' - CTCGAGCTTCATCCTGATGGCCCTCAACGAG-3 '。
[0023] 在本发明中，优选的，步骤（3)将重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/VPl电转化导入 到乳酸杆菌NC8中，电转化后的乳酸杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37°C培养箱中培 养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别于MRS液体培养基中过夜培养，将上述菌液 以 1:100的接种率接种于50mL MRS液体培养基中，37°C培养至OD值为0. 6-0. 8,并以浓度为 50-100ng/mL乳杆菌肽（SppIP)为诱导物，诱导表达4-7h得到重组蛋白。
[0024] 在本发明中，优选的，所述的重组蛋白在信号肽的引导下分泌到胞外，具有较好的 免疫原性，分子量为35kD。
[0025] 在本发明中，优选的，所述电转化的电压参数为2500V，5ms。
[0026] 本发明设计并合成了在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因并融合Asial型口蹄 疫病毒VP1基因与免疫佐剂牛IL-6基因，利用该基因构建了分泌性表达口蹄疫病毒VP1基 因和免疫佐剂牛IL-6的乳酸杆菌重组表达载体pSIP/Asial/VPl/IL-6。通过电转化导入 到乳酸杆菌NC8中，对转化过程中电转化参数进行优化，经乳杆菌肽SppIP诱导，目的基因 在乳酸杆菌中得到了稳定的、高效的表达，SDS-PAGE分析表明融合蛋白分子量约为35kD， 光密度扫描分析可知表达的重组蛋白占菌体总蛋白的15%。菌液上清经SDS-PAGE电泳和 Western-blot检测有少量目的蛋白表达，初步证明目的蛋白能够有效地表达并在信号肽的 引导下分泌到胞外。最终获得高效表达口蹄疫病毒VPl基因的重组乳酸杆菌NC8,本发明通 过对表达过程中诱导物浓度、诱导剂加入时间和诱导时间等多个影响表达的关键因素的探 索，提供了一种高效表达外源基因的乳酸杆菌载体系统。
[0027] 重组乳酸菌在动物攻毒后都发挥了很好的保护作用，含有空载体的对照组也表现 了一定的保护力证明了乳酸菌能够调节机体免疫的益生作用。重组乳酸菌免疫组的抗病毒 能力远远大于空白对照组，空白对照组豚鼠全部发病。
[0028] 因此进一步的，本发明提供了所述的重组乳酸杆菌在制备Asial型口蹄疫黏膜免 疫疫苗中的应用。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0030] (1)本发明表达的目的蛋白能够有效地表达，并在信号肽的引导下分泌到胞外。因 此我们可以在培养上清中获得可溶性的表达产物。既可以用纯化的表达产物进行免疫，也 可以直接用重组菌进行口服免疫，这样就省去了常规原核表达系统表达后的复杂的纯化过 程和复性过程，口服免疫则更适合于规模化养殖。
[0031] (2)动物免疫试验也证实本发明制备的重组乳酸杆菌NC8表达的抗原具有较好 的免疫原性；乳酸杆菌属于肠道益生菌，作为食品安全级微生物，是动物和人体内的正常菌 群，具有益生作用和免疫佐剂作用，这使得其成为细菌活载体疫苗研宄中载体的有力候选 菌株，对人畜安全，无病原污染；用乳酸菌表达蛋白后无需经过提取纯化过程，具有工艺简 单、免疫效果好和对动物保护力强等优点，适用于家畜的免疫使用。
【附图说明】
[0032] 图1是重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6的构建路线图；
[0033] 图2是重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6的酶切鉴定图；其中，M为DNA分子质量标 准；1 为质粒 pSIP/Asial/VPl/IL-6 经 Nco I /HindIII 双酶切后；2 为质粒 pSIP/Asial/ VP1/IL-6 经 Hindlll/Xhol I 双酶切后；
[0034] 图3是重组乳酸杆菌NC8目的基因的PCR分析图；其中，M为DNA分子量标准；1、 2分别为重组乳酸杆菌NC8经PCR扩增的VP1、IL-6基因；
[0035] 图4是重组乳酸杆菌NC8表达蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，M为预染marker ;6 为空载体PSIP411在NC8中诱导7h后的表达产物；7为重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6在 NC8中未经诱导7h后的表达产物；8为重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6在NC8中经诱导7h 后的表达产物；9-10为重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6在NC8中经诱导7h后的表达产物 经过超声处理后的上清和菌体沉淀；
[0036] 图5是重组乳酸杆菌NC8表达蛋白的Western-blot检测图；其中，1 :经SppIP 诱导的含重组载体pSIP/Asial/VPl/IL-6的乳酸杆菌NC8表达目的蛋白；2 :含空载体 PSIP411的乳酸杆菌NC8表达蛋白；3 :未经诱导的含重组载体pSIP/Asial/VPl/IL-6的乳 酸杆菌NC8 ;4为蛋白分子量标准。
[0037] 图6是豚鼠血液中IgA抗体水平的动态变化图；
[0038] 图7是豚鼠血液中IgG抗体水平的动态变化图；
[0039] 图8是豚鼠血液中IgM抗体水平的动态变化图；
[0040] 图9是中和抗体滴度图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0042] 实施例1重组表达载体pSIP/Asial/VPl/IL-6的获得
[0043] 1材料与方法
[0044] I. 1材料及来源
[0045] 口蹄疫Asial型病毒江苏株（Asial/JS/China/2005)为本实验室保存。大肠杆 菌-乳酸菌穿梭质粒表达载体PSIP411及乳酸杆菌NC8购自北京毕特博生物技术有限公 司，克隆载体PUC57由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。限制性内切酶NC〇I、HindIII、 Xhol 及 T4 连接酶均购自 NEB 公司，Taq 酶、dNTP、DNA Marker DL2,000、DL15,000、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit 购自大连宝生物公司。 克隆载体PUC57由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。
[0046] 1. 2 方法
[0047] I. 2. 1基因的改造及合成
[0048] 乳酸杆菌信号肽SP310原始序列为EMBL(smart. embl-heidelberg. de)数据库在 线工具检索的基因序列，序列号为AJ238086,利用增加 SP310信号肽N端正电荷和H区疏 水性的方法，以及C端氨基酸残基的缺失使H区更靠近切割位点等方法，最终设计出全长 81bp的改造后的SP310信号肽结构；Asial型FMDV VPl基因的原始序列全长633bp，根据 Genebank 中 Asial/JS/China/2005 株的 VPl 基因序列（序列号为 EF149009)，将 VPl 基因 与SP310基因借一连接短肽（GSGGSGG)连接到一起，两端分别带有Nco I和HindIII酶切 位点，序列由南京金斯瑞生物技术有限公司全基因合成，克隆到载体PUC57上，受体菌为大 肠杆菌DH5 α，命名为pUC/FMDV-Asial/VPl，序列送上海桑尼公司进行序列测定。
[0049] 1. 2. 2免疫佐剂牛IL-6基因的克隆与序列分析
[0050] 分离并培养牛淋巴细胞，用PHA刺激后提取总RNA，以OligodT(IS)为下游引物 进行反转录，根据Genebank中牛IL-6基因序列（序列号为X57317)，设计出带有HindIII 和 Xho I I 酶切位点的一对引物（上游引物：5 ' -AAGCTTATGAATTCTAGATTTACTTCCGCTTTCA CC-3'，下游引物：5' -CTCGAGCTTCATCCTGATGGCCCTCAACGAG-3'），反转录产物用 PCR 方法 扩增出牛IL-6基因，并将其克隆至pUC57载体中（命名为pUC57/IL-6)，进行核苷酸序列分 析。
[0051] I. 2. 3Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6的重组表达载体pSIP/ Asial/VPl/IL-6 的构建
[0052] 分别用Nco I和Xhol I双酶切质粒pSIP411，Nco I和HindIII双酶切质粒 PUC57/VP1，HindIII和Xhol I双酶切质粒pUC57/IL- 6,将纯化回收的VPl基因与牛IL-6 基因与双酶切后的表达载体PSIP411大片段连接、转化、碱裂解法提质粒，用电泳、酶切方 法鉴定转化子，构建Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6的重组表达载体 pSIP/Asial/VPl/IL-6(图 1)。
[0053] 2试验结果
[0054] 2. 1获得的带有信号肽的Asial型口蹄疫病毒VPl基因与牛IL-6基因的融合基因 序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0055] 2. 2重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6经酶切的片段与预计大小相符，说明乳酸杆 菌表达载体 pSIP/Asial/VPl/IL-6 构建正确（图 2)。在 pSIP/Asial/VPl/IL-6 载体中，Nco I酶切位点、起始密码子、SP310信号肽基因、连接短肽、VPl基因、终止密码子、Xhol酶切位 点等共1383个核苷酸，编码461个氨基酸。
[0056] 实施例2 Asial型口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6在乳酸杆菌NC8重组 菌株中的表达及检测
[0057] 1材料与方法
[0058] I. 1材料及来源
[0059] (1)诱导物：杆菌肽（SppIP) (10ng/mL)由上海生工生物工程有限公司合成。
[0060] (2)抗生素：氨苄（Amr)、红霉素（Emr)购自拜尔迪生物技术有限公司。
[0061] 1.2 方法
[0062] 1. 2. 1目的基因在乳酸杆菌NC8中的电转化与抗性菌株的筛选：电转化后的乳酸 杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37°C培养箱中培养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别 于MRS液体培养基中过夜培养；
[0063] 1. 2. 2重组乳酸杆菌NC8的PCR检测：取5mL过夜培养菌液进行质粒的提取，PCR 扩增检测目的基因，同时以未转基因的载体PSIP411做阴性对照；
[0064] 1. 2. 3不同浓度诱导物浓度、诱导时间对目的基因诱导表达的影响：将上述菌液 以1:100的接种率接种于50mL MRS液体培养基中，37°C培养至OD值为0. 6-0. 8 (约3h)，此 时记为Oh诱导，在培养基中加入诱导物SppIP，诱导物的终浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、 30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、100ng/mL，确定诱导物的浓度后每隔 Ih 取 菌液，至7h。同样诱导含有空载体pSIP411的重组乳酸杆菌，作为对照组，诱导结束后分别 处理菌体沉淀和培养液上清做电泳分析，通过光密度扫描对表达产物进行定量分析，得出 最佳诱导物浓度。
[0065] 1. 2. 4表达产物的SDS-PAGE分析：由于乳酸杆菌pSIP/Asial/VPl/IL-6为细胞外 表达，可将蛋白分泌到培养基中，因此取37°C过夜培养的菌液离心后，保留上清分别进行 4°C透析和冷冻干燥以50倍浓缩蛋白，浓缩后加入I X SDS凝胶加样缓冲液（含DTT)，充分 混勾，煮沸lOmin，1000 g离心10min，取上清IOul上样。同时将的菌液离心后所得菌体沉淀 也进行SDS-PAGE电泳分析。
[0066] 1. 2. 5重组蛋白表达效率分析：脱色后的凝胶用干胶膜作成干胶片保存，对干胶 片用dual wavelength TCL scanner (shimadzu CS-930)分析，可定量分析表达蛋白的含量
[0067] L 2. 6重组乳酸杆菌NC8的Western-blot检测：取IOmL经SppIP诱导的重组乳 酸杆菌上清，加入一定体积的上样缓冲液，煮沸lOmin，按常规法电泳、转印、封闭、漂洗，FMD 阳性猪血清37°C孵育lh，漂洗后以辣根过氧化物酶（HRP)标记的山羊抗猪IgG于37°C孵育 lh，漂洗后进行ECL显色。
[0068] 2试验结果
[0069] 2. 1重组乳酸杆菌NC8的获得：电转化涂板后所长的菌落在液体培养基中培养物 经提取质粒后双酶切鉴定，条带大小合适；实验证明2500V，5ms的电压参数是最合适的，电 转化效率最高。
[0070] 2. 2重组乳酸杆菌NC8的PCR检测：提取重组乳酸杆菌质粒进行PCR检测，重组质 粒可扩增出目的片段，空质粒没有扩增出任何条带（图3)。
[0071] 2. 3不同浓度诱导物浓度、诱导时间对目的基因诱导表达的影响：活化的种子菌 以1 %接种于改良的MRS液体培养基，初始培养基pH值在6. 0~7. 0之间，37°C培养至OD 值为0. 6-0. 8,并以SppIP为诱导物，诱导物浓度在50-100ng/mL时诱导表达蛋白量最高； 加入诱导物后乳酸菌在4h左右表达蛋白量开始较高，在7h达到最高水平且趋于稳定；通过 光密度扫描分析可知表达的重组蛋白占菌体总蛋白的15%。（图4)。
[0072] 2. 4分泌性表达：诱导的菌液上清分别经4°C透析和冷冻干燥浓缩50倍后， SDS-PAGE电泳和Western-blot检测有少量目的蛋白表达，初步证明目的蛋白能够有效地 表达并在信号肽的引导下分泌到胞外（图4)。因此我们可以在培养上清中获得可溶性的表 达产物。既可以用纯化的表达产物进行免疫，也可以直接用重组菌进行口服免疫，这样就省 去了常规原核表达系统表达后的复杂的纯化过程和复性过程，口服免疫则更适合于规模化 养殖。试验通过对乳酸杆菌PSIP411质粒表达系统理想表达条件的探索为更好利用该系统 表达活性蛋白奠定了基础。
[0073] 2. 5重组乳酸杆菌NC8的Western-blot检测：重组乳酸杆菌蛋白提取液经电泳和 转膜杂交后，结果显示：表达蛋白能被口蹄疫病毒阳性猪血清抗体识别，经诱导的重组菌株 在约35KD处可见较微弱的特异性免疫反应条带，而未诱导的菌株和和含空载体的菌株无 此杂交带（图5)。说明VPl基因在转基因重组乳酸杆菌中已表达，且所表达的蛋白具有免 疫反应活性。
[0074] 实施例3动物免疫试验
[0075] 1材料与方法
[0076] I. 1材料及来源
[0077] 健康豚鼠（300_500g)由本所实验动物养殖场提供。包被抗原、辣根过氧化物酶 (HRP)标记的兔抗豚鼠 IgG、0PD、双氧水等试剂为ELISA诊断试剂盒所配备。
[0078] 1. 2试验方法
[0079] I. 2. 1动物分组及免疫与攻毒
[0080] 将豚鼠随机分为5组，每组6只，分别为含重组质粒pSIP/Asial/VPl/IL-6的 NC8 (A 组）、含质粒 pSIP411 的 NC8 (B 组）、含重组质粒 pSIP/Asial/VPl/IL-6 的 WCFSl (C 组）、含质粒PSIP411的WCFSl (D组）和阴性对照（只灌服奶，E组），免疫三次，免疫时间 每次间隔为一周，每次连续免疫三天，每天一次，第四周攻毒，第五周杀死豚鼠，检测各项指 标。
[0081] 表 1
[0082]
[0083] 免疫程序
[0084] 0123456789
[0085] ★ ★ ★
[0086] 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
[0087] ★ ★ ★
[0088] 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
[0089] ★ ★ ★
[0090] 将7h诱导的重组乳酸杆菌收菌后离心获得菌体沉淀，用PBS清洗后重悬于鲜奶 中；分每只豚鼠注射〇. 2ml ;分别于0d、9d、19d、29d采血，间接ELISA法测定血清抗体；第 三次免疫后28d攻毒，豚鼠后妬部皮内穿刺攻毒，每只豚鼠接种100ID50/0. 2mL的Asial型 FMDV，连续观察7d，以病变出现的严重程度作为保护效果的判定：完全保护为不出现任何 病变；部分保护为病变仅发生于攻毒接种的单只脚；不保护为两只及以上脚均出现病变。
[0091] 1. 2. 2血液中IgA、IgM的检测
[0092] 于免疫前（Od)及初次免疫后第 5(1、7(1、10(1、15(1、17(1、20(1、25(1、27(1、30(1分别采集 免疫豚鼠的粪便样品和唾液样品 检测IgA、IgM水平。方法如下：
[0093] A型口蹄疫兔抗血清用PBST 1:1000稀释，96孔板每孔50 μ L，室温封板8h。用 PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，加入A型口蹄疫病毒灭活抗原（PBST 1:6稀释）每孔 100 μ L，37°C培养Ih。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，每孔加入100 μ L的待检样品 (血清1:10稀释，唾液1:2稀释，粪便上清液不稀释），设立阴性孔、阳性孔和空白对照孔， 37°C培养lh。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后，加入HRP标记的兔抗豚鼠 IgA二抗 (1:1000PBST稀释）每孔100 μ L，37°C培养50min。用PBST洗96孔板清洗5次并拍板后， 每孔加入50 μ L的OPD显色剂（H202每mLlOO μ L)，37°C培养15min后加入终止液（稀硫 酸），15min内在492nm波长下读取OD值。
[0094] L 2. 3血液中IgG的检测
[0095] 于免疫前（Od)及初次免疫后第10d、20d、30d采集免疫豚鼠心脏血液检测IgG。方 法如下：
[0096] 96孔板每孔IOOyL 口蹄疫A型灭活抗原（用PBST以1:6稀释），4°C孵育8h。用 PBST洗板5次并拍板后，每孔加入200 μ L含1 %脱脂奶粉的PBST溶液，37°C培养2h。PBST 洗板5次并拍板后，每孔加入100 μ L的待检血清（1:8稀释，依次倍比稀释）。同时设立阴 性、阳性和空白对照孔，37°C培养lh。PBST洗板5次并拍板后，每孔加入100 μ L的HRP标 记的兔抗豚鼠 IgG二抗（1:1000稀释），37°C培养50min。PBST洗板5次并拍板后，每孔加 入50 μ L的OPD显色剂，37°C 15min。每孔加入50 μ L终止液（稀硫酸），492nm下读取OD 值。
[0097] L 2. 4细胞中和试验
[0098] 用含2% FBS的DMEM将各组豚鼠血清（过滤除菌56°C灭活30min)按1:4, 1:8,… 1:32,…稀释；96孔板中每孔加入50 μ L稀释好的病毒液（用含有2% FBS的DMEM将病毒 稀释成200TCID50/0.1 mL)，分别加入50 μ L不同稀释度的待检血清和阴性血清，每一稀释 度设立3个重复孔，将刚长成单层的BHK细胞制成细胞悬液，每孔加入100 μ L。37°C培养 5-7天，连续观察CPE (cytopathic effect，致细胞病变效应）。结果判定，阴性和空白对照 孔均未出现CPE时结果成立。然后按照Read-Muench公式计算出中和抗体效价。
[0099] 2试验结果
[0100] 2. 1血液中IgA、IgG和IgM的检测结果
[0101] 以各实验组的血清样品OD值的平均值绘制IgA、IgG、IgM抗体水平的动态变化曲 线（图6、图7和图8)。从图中可以清楚看出抗体的变化，在一免后三种抗体都被诱导产生 并在三免时含量达到最高，但IgG上升水平较IgA、IgM高。
[0102] 2. 2细胞中和试验结果分析
[0103] 通过细胞中和试验检测出两个重组乳酸杆菌免疫组都产生了中和抗体，而含有空 载体的对照组和空白对照组并未产生中和抗体（图9)。
[0104] 2. 3攻毒保护试验结果
[0105] 表 2
[0106]
[0107] 在初免后第30天对每组4只豚鼠进行攻毒实验。从上表中可分析出两组重组乳 酸菌在动物攻毒后都发挥了很好的保护作用，说明重组乳酸杆菌表达的抗原蛋白具有良好 的免疫原性。重组乳酸杆菌免疫组的抗病毒能力远远大于阴性对照组，而空载体免疫组豚 鼠部分发病，也说明乳酸杆菌具有免疫佐剂的作用。
[0108] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以 对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡 在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。
【主权项】
1. 一种共表达口蹄疫病毒VPl基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌，其特征在 于，所述重组乳酸杆菌含有由在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因的口蹄疫病毒VPl基 因序列与免疫佐剂牛IL-6基因序列连接在一起而得到的融合基因，其核苷酸序列如SEQID NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的重组乳酸杆菌，其特征在于，改造的乳酸杆菌信号肽基因借 一连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VPl基因进行连接，连接后的基因序列再与免疫佐剂牛 IL-6基因序列进行融合。3. 根据权利要求1所述的重组乳酸杆菌，其特征在于，所述的口蹄疫病毒为Asial型口 蹄疫病毒。4. 一种重组载体pSIP/Asial/VPl/IL-6,其特征在于，它包含权利要求1所述的核苷酸 序列。5. 制备权利要求1-3任一项所述的重组乳酸杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 利用提高N端正电荷和H区疏水性的方法，对乳酸杆菌信号肽的结构进行改造，将 改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VPl基因进行连接，连接 后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所 示； (2) 将融合后的基因序列插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒pSIP/ Asial/VPl/IL-6 ； (3) 将pSIP/Asial/VPl/IL-6重组质粒转化至乳酸杆菌。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3)将重组质粒pSIP/opti-FMDV-A/ VPl电转化导入到乳酸杆菌NC8中，电转化后的乳酸杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37°C 培养箱中培养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别于MRS液体培养基中过夜培养，将上述 菌液以1:100的接种率接种于50mLMRS液体培养基中，37°C培养至OD值为0. 6-0. 8,并以 浓度为50-100ng/mL乳杆菌肽（SppIP)为诱导物，诱导表达4-7h得到重组蛋白。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用反转录PCR方法扩增牛IL-6基因，所 用引物序列为： 上游引物：5' -AAGCTTATGAAITCTAGAITTACTTCCGCTITCACC-3' ； 下游引物：5 ' -CTCGAGCTTCATCCTGATGGCCCTCAACGAG-3 '。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的重组蛋白在信号肽的引导下分泌 到胞外，具有较好的免疫原性，分子量为35kD。9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述电转化的电压参数为2500V，5ms。10. 权利要求1-3任一项所述的重组乳酸杆菌在制备Asial型口蹄疫黏膜免疫疫苗中 的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种共表达口蹄疫病毒VP1基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明对乳酸杆菌信号肽的结构进行改造，将改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VP1基因进行连接，连接后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合，融合后的基因序列插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒pSIP/Asia1/VP1/IL-6，将pSIP/Asia1/VP1/IL-6重组质粒转化至乳酸杆菌。本发明针对重组乳酸杆菌表达系统，适当改造信号肽结构以提高乳酸杆菌中外源蛋白的分泌效率，通过黏膜免疫途径免疫实验动物，研究该疫苗的黏膜免疫情况，为研发新型口蹄疫黏膜免疫疫苗提供实验基础。
【IPC分类】C12N15/42, A61K39/135, A61P31/14, C12N15/62, A61K48/00, A61K39/39, C12N15/74, C12N15/24, C12N1/21
【公开号】CN104894045
【申请号】CN201510258195
【发明人】潘丽, 张永光, 张中旺, 吕建亮, 王永录, 方玉珍, 周鹏, 刘新生
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
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