一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法
一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方 法。
【背景技术】
[0002] 随着石油能源的枯竭，生物丁醇作为第二代能源成为研宄热点。传统的丙酮-丁 醇-乙醇发酵（ABE发酵）底物原料直接采用葡萄糖、木糖等，消耗成本高。利用廉价的废 弃可再生的木质纤维素原料（玉米芯、甘蔗渣、秸杆等），通过微生物发酵法生产丁醇的成 为研宄重点之一。然而木质纤维素原料在预处理成为微生物可利用的糖的同时也降解出大 量的有机酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、酚类化合物等抑制物，然而在去除该抑制物的工艺上，成 本消耗高，因此，提高微生物自身的抗逆性尤其重要。
[0003]目前，生物丁醇的抗逆性研宄主要集中在拜氏梭菌利用木质纤维素水解液方面， 其酚类化合物的毒害作用尤为显著。高浓度酚类物质能够改变细胞膜疏水性，破坏细胞 膜，导致菌体死亡。Thaddeus Ezeji 等（Biotechnol.Bioeng.2007,97, 1460-1469.)报 道拜氏梭菌突变株BAlOl在2g/L阿魏酸胁迫下完全不生长；此外，Thaddeus Ezeji等 (Bioresource Technol. 2008, 99:5915-5922)利用 BAlOl，以 XAD-4 树脂脱毒的玉米芯稀 硫酸水解和酶解液为发酵底物，得到总溶剂产量为9. 3g/L ;然而，BAlOl在未脱毒的稀酸 水解液中几乎不产丁醇。郭亭等（J and Microbiol Biotechnol. ,2012, 39 (3) ,401-407) 研宄发现，当玉米芯和甘蔗渣水解液中的酚类化合物的浓度提升到〇. 5g/L时，拜氏梭 菌（Clostridium beijerinckii)8052 基本不生长。Richmond 等发现丁香酸抑制 CoAT 的表达，阻断了乙酸和丁酸的转化，而导致溶剂量的降低。Tomas等（Appl Environ Microbiol, 2003, 69 (8) :4951-4965)在丙酮丁醇梭菌中过表达编码热激蛋白groESL基因， 使丁醇对菌体细胞的抑制作用降低了 85%，并最终使产物浓度提高了 33%。模式酚类化合 物对菌体的抑制具体机制尚未明确，然而通过基因工程手段获的重组菌来提高产溶剂菌的 抗逆性，提高丁醇得率问题将得到重视。
[0004] 由此可见，提高拜氏梭菌对廉价的木质纤维素原料水解液中酚类化合物等毒素的 抗逆性，将是木质纤维素原料生产丁醇产业化必须解决的关键问题之一。
【发明内容】
[0005] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，该方法是将拜氏梭菌中编码依赖于 NADPH的FMN还原酶基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达。
[0008] 其中，所述的拜氏梭菌为拜氏梭菌NCMB 8052,所述的编码依赖于NADPH的FMN还 原酶基因为Cbei_4693,其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0009] 其中，所述将拜氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，是通过二型内 含子基因敲除技术使编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活。
[0010] 其中，所述的通过二型内含子基因敲除技术使编码依赖于NADPH的FMN还原酶基 因失活，包括如下步骤：
[0011] (1)利用软件分析SEQ ID No :1所示的序列，得到内含子的核苷酸序列和基因的 插入位点；
[0012] (2)将得到的内含子序列构建到二型内含子基因敲除质粒中，得到重组质粒；
[0013] (3)将步骤⑵得到的重组质粒转化拜氏梭菌，筛选得到编码依赖于NADPH的FMN 还原酶基因失活的菌株。
[0014] 步骤（1)中，所述内含子的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示，所述基因的插入位点 为SEQ ID No :1中第335bp和第336bp之间。
[0015] 步骤⑵中，所述二型内含子基因敲除质粒为pWJ质粒，该质粒的核苷酸序列如 SEQ ID No : 5 所示。
[0016] 上述提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法构建得到的拜氏梭菌在本发明的保护范 围之内。
[0017] 上述拜氏梭菌在发酵制备丁醇中的应用也在本发明的保护范围之内。：
[0018] 本发明的高抗逆拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)重组菌，对阿魏酸具有较 强抗逆性，能够在含有该酚类化合物的发酵培养基中发酵生产丁醇。（阿魏酸是酚类物质比 较有代表性的一种化合物，
[0019] 其中，所述的发酵生产丁醇的方法包含如下步骤：
[0020] 1)平板培养：将本发明的高抗阿魏酸重组拜氏梭菌接种至平板培养基厌氧培养， 培养温度37°c，培养时间12~18h ;
[0021] 2)种子培养：将平板培养的高抗阿魏酸重组拜氏梭菌接种到种子培养基中， IOOmL厌氧瓶装液量50mL，充N23min，培养温度37°C，培养时间12~18h ;
[0022] 3)发酵产丁醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量10(v/v) %，充 N23min，发酵温度37°C，发酵培养时间为60~72h。
[0023] 所述的平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3%~1%、氮源0.5%~ 1%、无机盐0.5%~0.8%、琼脂1.5%~2%、其余为水；其中，所述碳源为淀粉或葡萄糖； 所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多 种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁 盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。平板培养基优选为：酵母粉 3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸按2g/L，氯化钠3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸 二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，琼脂15g/L，其余为水，pH 6。
[0024] 所述的种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0. 5%~1%、氮源0. 5%~ 1%、无机盐0. 5%~0. 8%、其余为水；所述的碳源为淀粉或葡萄糖；所述氮源为有机或无 机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮 化合物为蛋白胨、酵母粉和玉米浆中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钾盐、镁盐、钙 盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。种子培养基优选为：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性 淀粉l〇g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾 lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，其余为水，pH 6。
[0025] 所述的发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源3%~6%、氮源0.1 %~ 0. 3%、无机盐0. 1 %~0. 2%、生长因子0. 05%~0. 1 %、阿魏酸0. 05%、其余为水；所述的 碳源为葡萄糖；所述的氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为 钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维 生素 B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。发酵培养基优选为：葡萄糖30g/L，乙酸 按2. 2g/L，磷酸二氢钾0. 5g/L，磷酸氢二钾0. 5g/L，氯化钠0. 01g/L，七水合硫酸镁0. 2g/L， 七水合硫酸亚铁〇. 〇lg/L，一水合硫酸猛0. 01g/L，玉米衆0. l(v/v) %，阿魏酸0. 5g/L，其余 为水，pH 6. 6。
[0026] 有益效果：
[0027] (1)本发明将拜氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因 Cbei_4693进行插 入失活后，使得此基因不能正常表达，获得Cbei_4693基因插入失活的重组菌株。
[0028] (2)本发明提供了一种简单、高效的提高拜氏梭菌抗逆性的方法，借助此方法得到 的重组菌株对阿魏酸具有较高抗逆性，当以葡萄糖为碳源，在100mL厌氧瓶中含有阿魏酸 的发酵培养基培养时，丁醇产量达到5. 6g/L，而同等条件培养的出发菌株基本不产醇。
[0029] (3)利用本发明方法构建的重组菌株，其阿魏酸抗逆性强、丁醇产量高。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明二型内含子基因敲除质粒PWJ的质粒图谱。
[0031] 图2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图。
[0032] 图3为转化子菌落PCR电泳图。
[0033] 图4为重组菌和出发菌株对阿魏酸的抗逆性考察。
【具体实施方式】
[0034] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0035] 实施例1 :拜氏梭菌Cbei_4693基因失活突变株的构建方法。
[0036] 1.设计内含子：
[0037] 根据NCBI数据库收录的拜氏梭菌的Cbei_4693基因序列（如SEQ ID No :1所示）， 借助软件设计合适的插入基因位点(http://www. clost:ron. com),选择插入在第335-336 个碱基之间，并生成内含子序列，合成内含子序列S-335其序列如SEQ ID NO :2所示。
[0038] 2. Cbei_4693插入失活载体的构建：
[0039] 用Xho I和BsrG I分别双酶切载体pWJ (上海生科院杨晟老师提供，其序列如SEQ ID NO :5所示）和DNA片段S-335。酶切产物经纯化试剂盒（Takara)纯化后，通过T4连接 酶（Takara)过夜连接。将连接的重组质粒转化到大肠杆菌E. coli DH5a (本实验室），涂布 到含有50ug/ml氨苄霉素抗性LB平板，37°C培养12-16h，挑取转化子，接到液体含有50ug/ ml氨苄霉素 LB培养基中，37°C、200rpm培养12h，提取重组质粒（AXYGEN质粒提取试剂 盒）， 测序验证，获得Cbei_4693基因的二型内含子基因敲除载体pWJ-335。
[0040] 3.载体 pWJ-335 甲基化：
[0041] 制备E. coli Top 10/pAN2(本实验室）的化学感受态，将测序成功的Cbei_4693插 入失活载体PWJ-335转化到大肠杆菌E. coli Top 10,由于pAN2质粒具有四环素抗性，故涂 布到含有50ug/ml氨苄霉素和10ug/ml四环素双抗性LB平板，37°C培养12-16h，挑取转化 子，接到液体含有50ug/ml氨苄霉素和10ug/ml四环素 LB培养基中，37°C、200r培养12h， 提取甲基化缺失载体pWJ-335 (pAN2质粒含有一个枯草芽孢杆菌噬菌体基因，能编码甲基 转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化）。
[0042] 4.电转化甲基化的敲除质粒至拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)：
[0043] 1)将 Clostridium beijerinckii NCMB 8052 (本实验室）接种至 YPS 种子培养 基（酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl 3g/L，MgSO4 WH2CBg/ L，KH2P04lg/L，K2HP04lg/L，FeSO 4 · 7H20 0· lg/L)37°C过夜培养，次日以 5% 比例接种到 YPS 培养基，37°C培养6-8h，以10%接种到2XYTG培养基（酵母粉16g/L，蛋白胨10g/L，葡萄 糖 5g/L，氯化钠 5g/L) 37°C培养 3h，0D600 = 1。
[0044] 2)取50ml菌液，5000rpm，4°C离心10min，弃上清。再用ETM缓冲液（270mM鹿糖， 0.6mM Na2HPO4,4. 4mM Na2HPO4, IOmM MgCl2 ·7Η20)重悬；同上离心，去上清，再次以 ETM 缓冲 液重悬，同上离心，彻底取上清。
[0045] 3)取Iug甲基化的pWJ-335质粒加入到0. 2cm预冷的电转杯；再用ImL ET缓冲 液（270mM蔗糖，0. 6mM Na2HP04,4. 4mM Na2HPO4)重悬步骤2)菌泥，取200ul加入到电转杯， 轻轻混匀。
[0046] 4)使用MicroPulserTM电转仪电转，条件为电压L 8kV，电阻200 Ω，电容2. 5uF， 电击后立刻加入ImL 2XYTG培养基，转移到无菌离心管中复苏2-3h。
[0047] 5)取200ul上述菌液，涂布到含有10ug/ml红霉素的YPS固体培养基，培养2-3 天。
[0048] 5.筛选Cbei_4693插入失活突变株：
[0049] 挑取转化子，使用引物Cbei-4693-T-S (其序列如SEQ ID NO :3所示）和 Cbei-4693-T-A (其序列如SEQ ID N0:4所示），对转化子进行菌落PCR验证，筛选出内含子 插入基因组的突变株（插入后，PCR扩增出基因条带电泳图上比野生型大约IKbp)。将正确 插入的突变株传代三次，同时涂布在含有红霉素抗性和没有红霉素抗性的YPS固体培养基 上，筛选出敲除质粒丢失的突变株（在红霉素抗性平板上不能生长的突变株）。
[0050] 实施例2 :Cbei_4693基因失活的重组菌的传代稳定性。
[0051] 本实施例所述的培养基配方：
[0052] 平板培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，琼 脂15g/L，其余为水，pH 6。
[0053] 种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，其 余为水，pH 6。
[0054] 发酵培养基：葡萄糖30g/L，乙酸铵2. 2g/L，磷酸二氢钾0. 5g/L，磷酸氢二钾0. 5g/ L，氯化钠 0. 01g/L，七水合硫酸镁0. 2g/L，七水合硫酸亚铁0. 01g/L，一水合硫酸锰0.0 lg/ L，玉米衆0.1 % (v/v)，其余为水，pH 6.6。
[0055] 将实施例1中构建的Cbei_4693基因插入失活的拜氏梭菌重组菌接种至平板培养 基厌氧培养，培养温度37°C，培养时间12h。将平板培养的重组菌接种到种子培养基中，培 养温度37°C，25mL肖特厌氧瓶装液量15mL，充N 23min，培养温度37°C，培养时间12h ;将种 子接种到发酵培养基中，接种量10 % (v/v)，发酵温度37°C，IOOmL肖特厌氧瓶装液量50mL， 充队311^11，发酵培养72h。
[0056] 实施例1中构建的Cbei_4693基因失活的拜氏梭菌重组菌在固体培养基上连续转 接7次，发现所得菌株与出发菌株在形态特征和培养特征上相同，生长状态良好。在以葡萄 糖为碳源的发酵培养基中，检测重组菌的传代稳定性，重组菌传代发酵试验结果如表1所 不O
[0057] 表 1
[0058]
[0060] 从实验结果可知，经过7次连续传代，重组菌的总溶剂产量和丁醇产量较稳定，具 有较好的传代稳定性，可作为进一步研宄和开发的生产菌株。
[0061] 实施例3 :重组菌和出发菌株对阿魏酸抗逆性考察。
[0062] 平板培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，琼 脂15g/L，其余为水，pH 6。
[0063] 种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，其 余为水，pH 6。
[0064] 发酵培养基：葡萄糖30g/L，乙酸铵2. 2g/L，磷酸二氢钾0. 5g/L，磷酸氢二钾0. 5g/ L，氯化钠0. 01g/L，七水合硫酸镁0. 2g/L，七水合硫酸亚铁0. 01g/L，一水合硫酸锰0.0 lg/ L，玉米衆0. l(v/v) %，阿魏酸0. 5g/L，其余为水，pH 6. 6。
[0065] 将实施例1中构建的Cbei_4693基因插入失活的拜氏梭菌重组菌和出发菌株8052 接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37°C，培养时间12h。将平板培养的重组菌接种到种 子培养基中，培养温度37°C，25mL肖特厌氧瓶装液量15mL，充N23min，培养温度37°C，培养 时间12h ;将种子接种到发酵培养基中，接种量10(v/v) %，发酵温度37°C，IOOmL肖特厌氧 瓶装液量50mL，充N23min，发酵培养72h。进行气相检测，最终结果见图4,明显突出了本发 明重组菌对阿魏酸高抗逆性，丁醇产量达5. 6g/L，而出发菌株8052 丁醇产量为0. 7g/L (几 乎不产醇）。
【主权项】
1. 一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，该方法是将拜氏梭菌中编码 依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达。2. 根据权利要求1所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，所述的拜 氏梭菌为拜氏梭菌NCMB8052,所述的编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因为Cbei_4693， 其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3. 根据权利要求1所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，所述将拜 氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，是通过二型内含子基因敲除技术使编 码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活。4. 根据权利要求3所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，所述的通 过二型内含子基因敲除技术使编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，包括如下步骤： (1) 利用软件分析SEQIDNo:1所示的序列，得到内含子的核苷酸序列和基因的插入 位点； (2) 将得到的内含子序列构建到二型内含子基因敲除质粒中，得到重组质粒； (3) 将步骤（2)得到的重组质粒转化拜氏梭菌，筛选得到编码依赖于NADPH的FMN还原 酶基因失活的菌株。5. 根据权利要求4所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，步骤（1) 中，所述内含子的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示，所述基因的插入位点为SEQIDNo:1中 第335bp和第336bp之间。6. 根据权利要求4所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，步骤（2) 中，所述二型内含子基因敲除质粒为PWJ质粒，该质粒的核苷酸序列如SEQIDNo:5所示。7. 权利要求1~6任一项所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法构建得到的拜氏梭 菌。8. 权利要求7所述的拜氏梭菌在发酵制备丁醇中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，属于基因工程技术领域。该方法是将拜氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达，所述的拜氏梭菌为拜氏梭菌NCIMB 8052，所述的编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因为Cbei_4693，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过二型内含子基因敲除技术使拜氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活。该重组菌株具有较好的传代稳定性，当培养基中阿魏酸的浓度为0.5g/L时，出发菌株8052丁醇产量为0.7g/L，本发明构建重组菌丁醇产量达5.6g/L，说明通过本发明的方法提高了拜氏梭菌对阿魏酸的抗逆性。
【IPC分类】C12P7/16, C12N1/21
【公开号】CN104894048
【申请号】CN201510323508
【发明人】应汉杰, 刘俊, 郭亭, 沈晓宁, 许佳慧, 柳东, 牛欢青, 陈勇, 吴菁岚, 朱晨杰, 庄伟
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月12日
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方 法。
【背景技术】
[0002] 随着石油能源的枯竭，生物丁醇作为第二代能源成为研宄热点。传统的丙酮-丁 醇-乙醇发酵（ABE发酵）底物原料直接采用葡萄糖、木糖等，消耗成本高。利用廉价的废 弃可再生的木质纤维素原料（玉米芯、甘蔗渣、秸杆等），通过微生物发酵法生产丁醇的成 为研宄重点之一。然而木质纤维素原料在预处理成为微生物可利用的糖的同时也降解出大 量的有机酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、酚类化合物等抑制物，然而在去除该抑制物的工艺上，成 本消耗高，因此，提高微生物自身的抗逆性尤其重要。
[0003]目前，生物丁醇的抗逆性研宄主要集中在拜氏梭菌利用木质纤维素水解液方面， 其酚类化合物的毒害作用尤为显著。高浓度酚类物质能够改变细胞膜疏水性，破坏细胞 膜，导致菌体死亡。Thaddeus Ezeji 等（Biotechnol.Bioeng.2007,97, 1460-1469.)报 道拜氏梭菌突变株BAlOl在2g/L阿魏酸胁迫下完全不生长；此外，Thaddeus Ezeji等 (Bioresource Technol. 2008, 99:5915-5922)利用 BAlOl，以 XAD-4 树脂脱毒的玉米芯稀 硫酸水解和酶解液为发酵底物，得到总溶剂产量为9. 3g/L ;然而，BAlOl在未脱毒的稀酸 水解液中几乎不产丁醇。郭亭等（J and Microbiol Biotechnol. ,2012, 39 (3) ,401-407) 研宄发现，当玉米芯和甘蔗渣水解液中的酚类化合物的浓度提升到〇. 5g/L时，拜氏梭 菌（Clostridium beijerinckii)8052 基本不生长。Richmond 等发现丁香酸抑制 CoAT 的表达，阻断了乙酸和丁酸的转化，而导致溶剂量的降低。Tomas等（Appl Environ Microbiol, 2003, 69 (8) :4951-4965)在丙酮丁醇梭菌中过表达编码热激蛋白groESL基因， 使丁醇对菌体细胞的抑制作用降低了 85%，并最终使产物浓度提高了 33%。模式酚类化合 物对菌体的抑制具体机制尚未明确，然而通过基因工程手段获的重组菌来提高产溶剂菌的 抗逆性，提高丁醇得率问题将得到重视。
[0004] 由此可见，提高拜氏梭菌对廉价的木质纤维素原料水解液中酚类化合物等毒素的 抗逆性，将是木质纤维素原料生产丁醇产业化必须解决的关键问题之一。
【发明内容】
[0005] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，该方法是将拜氏梭菌中编码依赖于 NADPH的FMN还原酶基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达。
[0008] 其中，所述的拜氏梭菌为拜氏梭菌NCMB 8052,所述的编码依赖于NADPH的FMN还 原酶基因为Cbei_4693,其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0009] 其中，所述将拜氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，是通过二型内 含子基因敲除技术使编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活。
[0010] 其中，所述的通过二型内含子基因敲除技术使编码依赖于NADPH的FMN还原酶基 因失活，包括如下步骤：
[0011] (1)利用软件分析SEQ ID No :1所示的序列，得到内含子的核苷酸序列和基因的 插入位点；
[0012] (2)将得到的内含子序列构建到二型内含子基因敲除质粒中，得到重组质粒；
[0013] (3)将步骤⑵得到的重组质粒转化拜氏梭菌，筛选得到编码依赖于NADPH的FMN 还原酶基因失活的菌株。
[0014] 步骤（1)中，所述内含子的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示，所述基因的插入位点 为SEQ ID No :1中第335bp和第336bp之间。
[0015] 步骤⑵中，所述二型内含子基因敲除质粒为pWJ质粒，该质粒的核苷酸序列如 SEQ ID No : 5 所示。
[0016] 上述提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法构建得到的拜氏梭菌在本发明的保护范 围之内。
[0017] 上述拜氏梭菌在发酵制备丁醇中的应用也在本发明的保护范围之内。：
[0018] 本发明的高抗逆拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)重组菌，对阿魏酸具有较 强抗逆性，能够在含有该酚类化合物的发酵培养基中发酵生产丁醇。（阿魏酸是酚类物质比 较有代表性的一种化合物，
[0019] 其中，所述的发酵生产丁醇的方法包含如下步骤：
[0020] 1)平板培养：将本发明的高抗阿魏酸重组拜氏梭菌接种至平板培养基厌氧培养， 培养温度37°c，培养时间12~18h ;
[0021] 2)种子培养：将平板培养的高抗阿魏酸重组拜氏梭菌接种到种子培养基中， IOOmL厌氧瓶装液量50mL，充N23min，培养温度37°C，培养时间12~18h ;
[0022] 3)发酵产丁醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量10(v/v) %，充 N23min，发酵温度37°C，发酵培养时间为60~72h。
[0023] 所述的平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3%~1%、氮源0.5%~ 1%、无机盐0.5%~0.8%、琼脂1.5%~2%、其余为水；其中，所述碳源为淀粉或葡萄糖； 所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多 种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁 盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。平板培养基优选为：酵母粉 3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸按2g/L，氯化钠3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸 二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，琼脂15g/L，其余为水，pH 6。
[0024] 所述的种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0. 5%~1%、氮源0. 5%~ 1%、无机盐0. 5%~0. 8%、其余为水；所述的碳源为淀粉或葡萄糖；所述氮源为有机或无 机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮 化合物为蛋白胨、酵母粉和玉米浆中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钾盐、镁盐、钙 盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。种子培养基优选为：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性 淀粉l〇g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾 lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，其余为水，pH 6。
[0025] 所述的发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源3%~6%、氮源0.1 %~ 0. 3%、无机盐0. 1 %~0. 2%、生长因子0. 05%~0. 1 %、阿魏酸0. 05%、其余为水；所述的 碳源为葡萄糖；所述的氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为 钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维 生素 B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。发酵培养基优选为：葡萄糖30g/L，乙酸 按2. 2g/L，磷酸二氢钾0. 5g/L，磷酸氢二钾0. 5g/L，氯化钠0. 01g/L，七水合硫酸镁0. 2g/L， 七水合硫酸亚铁〇. 〇lg/L，一水合硫酸猛0. 01g/L，玉米衆0. l(v/v) %，阿魏酸0. 5g/L，其余 为水，pH 6. 6。
[0026] 有益效果：
[0027] (1)本发明将拜氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因 Cbei_4693进行插 入失活后，使得此基因不能正常表达，获得Cbei_4693基因插入失活的重组菌株。
[0028] (2)本发明提供了一种简单、高效的提高拜氏梭菌抗逆性的方法，借助此方法得到 的重组菌株对阿魏酸具有较高抗逆性，当以葡萄糖为碳源，在100mL厌氧瓶中含有阿魏酸 的发酵培养基培养时，丁醇产量达到5. 6g/L，而同等条件培养的出发菌株基本不产醇。
[0029] (3)利用本发明方法构建的重组菌株，其阿魏酸抗逆性强、丁醇产量高。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明二型内含子基因敲除质粒PWJ的质粒图谱。
[0031] 图2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图。
[0032] 图3为转化子菌落PCR电泳图。
[0033] 图4为重组菌和出发菌株对阿魏酸的抗逆性考察。
【具体实施方式】
[0034] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0035] 实施例1 :拜氏梭菌Cbei_4693基因失活突变株的构建方法。
[0036] 1.设计内含子：
[0037] 根据NCBI数据库收录的拜氏梭菌的Cbei_4693基因序列（如SEQ ID No :1所示）， 借助软件设计合适的插入基因位点(http://www. clost:ron. com),选择插入在第335-336 个碱基之间，并生成内含子序列，合成内含子序列S-335其序列如SEQ ID NO :2所示。
[0038] 2. Cbei_4693插入失活载体的构建：
[0039] 用Xho I和BsrG I分别双酶切载体pWJ (上海生科院杨晟老师提供，其序列如SEQ ID NO :5所示）和DNA片段S-335。酶切产物经纯化试剂盒（Takara)纯化后，通过T4连接 酶（Takara)过夜连接。将连接的重组质粒转化到大肠杆菌E. coli DH5a (本实验室），涂布 到含有50ug/ml氨苄霉素抗性LB平板，37°C培养12-16h，挑取转化子，接到液体含有50ug/ ml氨苄霉素 LB培养基中，37°C、200rpm培养12h，提取重组质粒（AXYGEN质粒提取试剂 盒）， 测序验证，获得Cbei_4693基因的二型内含子基因敲除载体pWJ-335。
[0040] 3.载体 pWJ-335 甲基化：
[0041] 制备E. coli Top 10/pAN2(本实验室）的化学感受态，将测序成功的Cbei_4693插 入失活载体PWJ-335转化到大肠杆菌E. coli Top 10,由于pAN2质粒具有四环素抗性，故涂 布到含有50ug/ml氨苄霉素和10ug/ml四环素双抗性LB平板，37°C培养12-16h，挑取转化 子，接到液体含有50ug/ml氨苄霉素和10ug/ml四环素 LB培养基中，37°C、200r培养12h， 提取甲基化缺失载体pWJ-335 (pAN2质粒含有一个枯草芽孢杆菌噬菌体基因，能编码甲基 转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化）。
[0042] 4.电转化甲基化的敲除质粒至拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)：
[0043] 1)将 Clostridium beijerinckii NCMB 8052 (本实验室）接种至 YPS 种子培养 基（酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl 3g/L，MgSO4 WH2CBg/ L，KH2P04lg/L，K2HP04lg/L，FeSO 4 · 7H20 0· lg/L)37°C过夜培养，次日以 5% 比例接种到 YPS 培养基，37°C培养6-8h，以10%接种到2XYTG培养基（酵母粉16g/L，蛋白胨10g/L，葡萄 糖 5g/L，氯化钠 5g/L) 37°C培养 3h，0D600 = 1。
[0044] 2)取50ml菌液，5000rpm，4°C离心10min，弃上清。再用ETM缓冲液（270mM鹿糖， 0.6mM Na2HPO4,4. 4mM Na2HPO4, IOmM MgCl2 ·7Η20)重悬；同上离心，去上清，再次以 ETM 缓冲 液重悬，同上离心，彻底取上清。
[0045] 3)取Iug甲基化的pWJ-335质粒加入到0. 2cm预冷的电转杯；再用ImL ET缓冲 液（270mM蔗糖，0. 6mM Na2HP04,4. 4mM Na2HPO4)重悬步骤2)菌泥，取200ul加入到电转杯， 轻轻混匀。
[0046] 4)使用MicroPulserTM电转仪电转，条件为电压L 8kV，电阻200 Ω，电容2. 5uF， 电击后立刻加入ImL 2XYTG培养基，转移到无菌离心管中复苏2-3h。
[0047] 5)取200ul上述菌液，涂布到含有10ug/ml红霉素的YPS固体培养基，培养2-3 天。
[0048] 5.筛选Cbei_4693插入失活突变株：
[0049] 挑取转化子，使用引物Cbei-4693-T-S (其序列如SEQ ID NO :3所示）和 Cbei-4693-T-A (其序列如SEQ ID N0:4所示），对转化子进行菌落PCR验证，筛选出内含子 插入基因组的突变株（插入后，PCR扩增出基因条带电泳图上比野生型大约IKbp)。将正确 插入的突变株传代三次，同时涂布在含有红霉素抗性和没有红霉素抗性的YPS固体培养基 上，筛选出敲除质粒丢失的突变株（在红霉素抗性平板上不能生长的突变株）。
[0050] 实施例2 :Cbei_4693基因失活的重组菌的传代稳定性。
[0051] 本实施例所述的培养基配方：
[0052] 平板培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，琼 脂15g/L，其余为水，pH 6。
[0053] 种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，其 余为水，pH 6。
[0054] 发酵培养基：葡萄糖30g/L，乙酸铵2. 2g/L，磷酸二氢钾0. 5g/L，磷酸氢二钾0. 5g/ L，氯化钠 0. 01g/L，七水合硫酸镁0. 2g/L，七水合硫酸亚铁0. 01g/L，一水合硫酸锰0.0 lg/ L，玉米衆0.1 % (v/v)，其余为水，pH 6.6。
[0055] 将实施例1中构建的Cbei_4693基因插入失活的拜氏梭菌重组菌接种至平板培养 基厌氧培养，培养温度37°C，培养时间12h。将平板培养的重组菌接种到种子培养基中，培 养温度37°C，25mL肖特厌氧瓶装液量15mL，充N 23min，培养温度37°C，培养时间12h ;将种 子接种到发酵培养基中，接种量10 % (v/v)，发酵温度37°C，IOOmL肖特厌氧瓶装液量50mL， 充队311^11，发酵培养72h。
[0056] 实施例1中构建的Cbei_4693基因失活的拜氏梭菌重组菌在固体培养基上连续转 接7次，发现所得菌株与出发菌株在形态特征和培养特征上相同，生长状态良好。在以葡萄 糖为碳源的发酵培养基中，检测重组菌的传代稳定性，重组菌传代发酵试验结果如表1所 不O
[0057] 表 1
[0058]
[0060] 从实验结果可知，经过7次连续传代，重组菌的总溶剂产量和丁醇产量较稳定，具 有较好的传代稳定性，可作为进一步研宄和开发的生产菌株。
[0061] 实施例3 :重组菌和出发菌株对阿魏酸抗逆性考察。
[0062] 平板培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，琼 脂15g/L，其余为水，pH 6。
[0063] 种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠 3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，七水合硫酸亚铁0. lg/L，其 余为水，pH 6。
[0064] 发酵培养基：葡萄糖30g/L，乙酸铵2. 2g/L，磷酸二氢钾0. 5g/L，磷酸氢二钾0. 5g/ L，氯化钠0. 01g/L，七水合硫酸镁0. 2g/L，七水合硫酸亚铁0. 01g/L，一水合硫酸锰0.0 lg/ L，玉米衆0. l(v/v) %，阿魏酸0. 5g/L，其余为水，pH 6. 6。
[0065] 将实施例1中构建的Cbei_4693基因插入失活的拜氏梭菌重组菌和出发菌株8052 接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37°C，培养时间12h。将平板培养的重组菌接种到种 子培养基中，培养温度37°C，25mL肖特厌氧瓶装液量15mL，充N23min，培养温度37°C，培养 时间12h ;将种子接种到发酵培养基中，接种量10(v/v) %，发酵温度37°C，IOOmL肖特厌氧 瓶装液量50mL，充N23min，发酵培养72h。进行气相检测，最终结果见图4,明显突出了本发 明重组菌对阿魏酸高抗逆性，丁醇产量达5. 6g/L，而出发菌株8052 丁醇产量为0. 7g/L (几 乎不产醇）。
【主权项】
1. 一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，该方法是将拜氏梭菌中编码 依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达。2. 根据权利要求1所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，所述的拜 氏梭菌为拜氏梭菌NCMB8052,所述的编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因为Cbei_4693， 其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3. 根据权利要求1所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，所述将拜 氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，是通过二型内含子基因敲除技术使编 码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活。4. 根据权利要求3所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，所述的通 过二型内含子基因敲除技术使编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，包括如下步骤： (1) 利用软件分析SEQIDNo:1所示的序列，得到内含子的核苷酸序列和基因的插入 位点； (2) 将得到的内含子序列构建到二型内含子基因敲除质粒中，得到重组质粒； (3) 将步骤（2)得到的重组质粒转化拜氏梭菌，筛选得到编码依赖于NADPH的FMN还原 酶基因失活的菌株。5. 根据权利要求4所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，步骤（1) 中，所述内含子的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示，所述基因的插入位点为SEQIDNo:1中 第335bp和第336bp之间。6. 根据权利要求4所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，其特征在于，步骤（2) 中，所述二型内含子基因敲除质粒为PWJ质粒，该质粒的核苷酸序列如SEQIDNo:5所示。7. 权利要求1~6任一项所述的提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法构建得到的拜氏梭 菌。8. 权利要求7所述的拜氏梭菌在发酵制备丁醇中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，属于基因工程技术领域。该方法是将拜氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达，所述的拜氏梭菌为拜氏梭菌NCIMB 8052，所述的编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因为Cbei_4693，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过二型内含子基因敲除技术使拜氏梭菌中编码依赖于NADPH的FMN还原酶基因失活。该重组菌株具有较好的传代稳定性，当培养基中阿魏酸的浓度为0.5g/L时，出发菌株8052丁醇产量为0.7g/L，本发明构建重组菌丁醇产量达5.6g/L，说明通过本发明的方法提高了拜氏梭菌对阿魏酸的抗逆性。
【IPC分类】C12P7/16, C12N1/21
【公开号】CN104894048
【申请号】CN201510323508
【发明人】应汉杰, 刘俊, 郭亭, 沈晓宁, 许佳慧, 柳东, 牛欢青, 陈勇, 吴菁岚, 朱晨杰, 庄伟
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月12日
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