基于三维细胞培养的3d细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法
基于三维细胞培养的3d细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种细胞遗传检测的技术领域，尤其涉及的是一种基于三维细胞 培养的3D细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法。
【背景技术】
[0002] A#田胞是人成纤维细胞与中国仓鼠卵巢细胞（CHO)杂交后所得到的永生化细胞， 包含一条单拷贝的人11号染色体和整套中国仓鼠染色体。该细胞作为一种遗传毒性检测 体系对诱变剂种类没有选择特异性，且相比于其他突变检测体系更加灵敏（Hei TK，Piao CQ,He ZY1Vannais D1Waldren CA. Chrysotile fiber is a strong mutagen in mammalian cells[J]· Cancer Res, 1992, 52(22) :6305-6309)。然而，该遗传毒性检测体系是在二维 (2D)培养条件下进行实验，难以准确反映诱变剂对体内细胞突变的影响。
[0003] 随着细胞培养技术的发展，研宄发现由于体外培养条件与体内环境差异较大，细 胞在体外培养时，形态和功能会发生一定程度的改变，导致以2D细胞培养为基础的药物或 生物学研宄出现偏差，并且难以预测细胞在体内的真实活动信息。为了减少这种差异性，三 维（3D)细胞培养技术得以提出。使用这种培养技术可以让细胞聚集生长，形成组织样结 构，这样有助于细胞之间紧密连接，促进细胞间的信息交流，可以为研宄提供更真实的细胞 信息。
[0004] 判断3D细胞的构建情况，可通过检测细胞团形态、数目、直径、干性相关基因的表 达量来确定。其中检测细胞干性相关基因是由于多能干细胞倾向于形成团块或集落形态， 并且细胞团块的形成可能与细胞干性有关，相关研宄也证明了这点。例如，悬浮培养的神经 祖细胞（NPCs)会形成神经球，培养成细胞团状的间充质干细胞（MSC)能够保持干性标记基 因的表达。而3D细胞在培养期间会聚集成团，影响有关细胞干性相关基因（Nanog、0ct4、 Klf4、Sox2、Lin28等）的表达，因此通过检测细胞干性相关基因，可以帮助判断3D细胞的 构建情况。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于三维细胞培养的3D细 胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法，以解决二维（2D)培养条件下，细胞的形态和 功能会发生一定程度的改变，导致以2D细胞培养为基础的药物或生物学研宄出现偏差，并 且难以预测细胞在体内的真实活动信息。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种基于三维细胞培养的3D细胞培养基，所述3D培养基为由预热的无菌的 2XHam' s F12培养液与预热的无菌的质量比为1 %的琼脂糖溶液按照1 :1体积比混合制 成。
[0008] -种利用上述的基于三维细胞培养的3D细胞培养基建立遗传毒性检测体系的方 法，包括以下步骤：
[0009] (1)制备3D细胞培养基
[0010] 将预热的无菌的2XHam' s F12培养液与预热的无菌的质量比为1%的琼脂糖溶 液按照1 :1体积比混合，铺在培养皿中，待冷却后，获得胶状Ham' S F12培养基，即为3D细 胞培养基；
[0011] (2)AL3D细胞的培养
[0012] 步骤一、将\细胞接种于3D细胞培养基中，置于CO2细胞培养箱中培养；
[0013] 步骤二、每2天换液一次，具体步骤为：将培养的\细胞离心，去上清，加入新鲜的 无菌的Ham' s F12完全培养液混匀，重新接种在3D细胞培养基上；
[0014] 步骤三、培养若干天后，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。
[0015] 所述步骤⑴中，胶状Ham' s F12培养基在培养皿中的铺设厚度为4mm。
[0016] 所述步骤一中，Ajffl胞的接种量为3X 10 6个。
[0017] 所述步骤一中，置于CO2细胞培养箱中培养的条件为：37°C，C02含量为5%体积比。
[0018] 所述步骤二中，A1细胞离心的条件为：1000 g下离心3min。
[0019] 所述步骤三中，培养5~7天，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。
[0020] 所述基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法中，所述步骤（2)之后还包括 步骤（3) 3D细胞的遗传毒性检测体系的检测步骤，所述检测步骤包括3D细胞特性指标检测 和体系灵敏性检测。
[0021] 所述3D细胞特性指标检测包括3D细胞形态、直径、细胞数、细胞活性、本底基因突 变率和基因表达量检测，所述体系灵敏性检测包括诱变剂处理的基因突变率检测。
[0022] 本发明的原理是：贴壁细胞在培养皿中生长，会紧紧贴在细胞培养皿上，细胞呈现 二维生长，这种培养方法的培养环境与体内环境差异较大，但通过琼脂糖胶培养皿培养后， 细胞并不贴壁，而是悬浮在培养液中，细胞在培养液中聚集生长，形成组织样结构，这样有 助于细胞间紧密连接，促进细胞间的信息交流，从而减小培养环境与体内环境的差异性，模 拟体内细胞生长环境。
[0023] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种基于三维细胞培养的3D 细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法，该方法将二维生长的\细胞培养成三维生 长的\3D细胞团，这种3D细胞培养技术既能模拟体内细胞微环境的生长条件基础，又能体 现传统2D细胞培养的条件可控制性及直观性，可以将2D细胞培养体系与组织器官研宄联 系起来，从而有效模拟诱变剂对体内细胞突变的影响，对诱变试验的评价更加准确；同时， 利用本发明所述的方法培养数天的细胞，其细胞团结构更加紧密，培养期间，通过检测3D 细胞的形态、3D细胞的直径大小、每个细胞团内的细胞数目、3D细胞的细胞活性、CD59基因 突变数、3D细胞基因的表达量等来观察3D细胞构建情况，与其它3D细胞构建方法相比，本 发明既不需特殊的3D细胞培养装置，也不需要昂贵的生长因子等添加剂，3D细胞培养的生 物反应装置简单，极大地降低了实验的成本，同时实验易于操作，适合小规模3D细胞培养 用。
【附图说明】
[0024] 图1为3D细胞遗传毒性检测体系的结构示意图；
[0025] 图2为经过培养后得到的\3D细胞的DIC显微镜观察图；
[0026] 图3为不同培养天数下\3D细胞团的直径大小结果图；
[0027] 图4为不同培养天数下每个\30细胞团中含有的细胞数统计结果图；
[0028] 图5为不同培养天数下\3D细胞中⑶59基因突变率柱状图；
[0029] 图6为不同培养天数下\3D细胞活性柱状图；
[0030] 图7为不同培养天数下\3D细胞的基因表达量结果柱状图；
[0031] 图8为不同培养天数下\3D细胞的突变灵敏度结果柱状图。
【具体实施方式】
[0032] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0033] 实施例1
[0034] 1、试验材料
[0035] 1. 1、无菌的 2 倍浓度的 Ham' s F12(2XHam' s F12)培养液：10. 63g 的 F12 培养 基粉末（购于上海科兴商贸有限公司）溶于500ml CldH2O中，加入I. 176g的NaHCO3粉末， 并调节培养基pH值至7. 0~7. 2,在搅拌器上加转子，边加热边搅拌溶解，过滤灭菌。；
[0036] 1. 2、无菌的Ham's F12完全培养液：10. 63g的Ham's F12培养基粉末溶于1000 ml 的CldH2O中，加入I. 176g的NaHCO3粉末，并调节培养基pH值至7. 0~7. 2,在搅拌器上加转 子，边加热边搅拌溶解，过滤灭菌；再加入体积比为8%的胎牛血清，2 X KT4M的甘氨酸（将 4. 5ml的甘氨酸溶于1000 ml的CldH2O中配制获得），25ug/ml的庆大霉素（将625ul的庆大 霉素溶于1000 ml的CldH 2O中配制获得），混匀。
[0037] 1. 3、无菌的质量比为1 %的琼脂糖溶液；
[0038] 1. 4、CD59突变体系的\细胞：参见Τ. T. PUCK等人1971年11月在PNAS杂志上 发表的论文（Τ· T. PUCK，et. Genetics of Somatic Mammalian Cells: Lethal Antigens as Genetic Markers for Study of Human Linkage Groups? Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 6 8, No. 12, pp. 3102-3106, Decemberl971)
[0039] 2、试验方法：
[0040] 2. I、制备3D细胞培养皿
[0041] 将预热的无菌的2XHam' s F12培养液与预热的无菌的质量比为1%的琼脂糖溶 液按照I : 1体积比混合，铺在直径为60mm的培养皿中，待冷却后，获得4_厚的胶状Ham'S F12培养基，即为3D细胞培养皿。
[0042] 2. 2、AJD细胞的培养
[0043] 步骤一、将3X IO6个A #田胞接种于3D细胞培养皿中，置于37°C含5% (体积比） 的CO2的细胞培养箱中培养2天；
[0044] 步骤二、每2天换液一次，具体步骤为：将培养的\细胞离心，去上清，加入新鲜的 无菌的Ham' s F12培养液混匀，重新接种在3D细胞培养基上；
[0045] 步骤三、培养5~7天后，获得如图1所示的3D细胞的遗传毒性检测体系，图中， 1为培养皿，2为Ham's F12培养液，3为培养皿底层形成的胶状物质，41为\30细胞团，42 为未成团的\单细胞。
[0046] 2. 3、AJD细胞团直径的测量
[0047] 将\3D细胞通过孔径为40 μ m的筛网，筛去未成团的单细胞，获得\3D细胞团，在 DIC显微镜（微分干涉差显微镜）下，采集细胞图像，结果如图2所示，图中，细胞在培养液 中聚集生长，形成细胞团块状结构，这样有助于细胞间紧密连接，促进细胞间的信息交流， 从而减小培养环境与体内环境的差异性，模拟体内细胞生长环境。
[0048] 利用奥林巴斯的Cellsens Standard软件测量不同培养天数下，细胞团的直径大 小，结果如图3所示，图中可看出，随着培养时间的延长，细胞团直径开始逐渐增大，培养到 第7天时达到最大，平均为106. 09 μ m，随后细胞团直径开始降低。
[0049] 2. 4、AL3D细胞团计数[0050] 本实施例中，从被筛网滤过的\3D细胞团中，挑选若干细胞团，统计细胞团的数量 为N。
[0051] 加入胰酶充分酶解细胞团，在显微镜下统计单细胞数为M。
[0052] 计算M/N的值，即为每个细胞团中含有的细胞数，获得如图4所示的结果，图中可 看出，随着培养时间的延长，每个细胞团中含有的细胞数开始逐渐增大，培养到第7天时达 到最大，平均约为2500个，随后细胞数开始降低。
[0053] 2. 5、CD59基因突变检测
[0054] ⑶59基因突变检测的基本原理是：在野生型的\细胞中，⑶59基因会在细胞的表 面形成CD59抗原，在兔血清补体存在情况下，该CD59抗原与特异性抗体发生结合后，导致 野生型细胞裂解而无法生存；然而，突变细胞因不能表达CD59抗原，无法和抗体补体结合 从而得以存活；存活的突变细胞经过培养后，形成肉眼可见的克隆，由此筛选到突变细胞， 计算突变率。CD59基因突变检测的具体步骤包括：
[0055] (1)将经筛网筛选后的\3D细胞团中加入胰酶进行充分酶解，获得单细胞，1000 g 下离心3min，去除酶液，加入Ham's F12完全培养液，收集细胞并计数，计三次取平均值后， 用Ham's F12完全培养液配成浓度为2. 5 X IO4个/mL的细胞悬液，取6mL细胞悬液分别种 于3个60mm的细胞培养皿中，每皿2mL，每皿细胞计数为5 X IO4个。
[0056] (2)另取42 μ 1的细胞悬液置于6958 μ 1的Ham' s F12完全培养液中，吹打混匀 后，取6ml分装于3个直径为60mm的细胞培养皿中，每皿2ml，每皿细胞计数为300个。
[0057] (3)将步骤⑴和⑵的共6个细胞培养皿置于CO2培养箱中孵育a后，细胞贴 壁生长；给细胞计数为5 X IO4个的3个细胞培养皿中分别加入60 μ L的抗⑶59的抗体和 32 μ 1的补体；细胞计数为300个的3个细胞培养皿中，给其中2皿中加入32 μ 1补体，另1 皿作为空白对照；然后，晃动细胞培养皿使抗体补体混合均匀。
[0058] (4)连续培养7~10天，出现肉眼可见克隆时，终止培养。
[0059] (5)弃去培养液，用PBS缓冲液漂洗一遍，用体积比为9 :1的甲醇：冰醋酸溶液作 为固定液固定20min，再用PBS缓冲液漂洗一遍，然后用结晶紫染色液染色3h，再用流水洗 去染色液，最后置于空气中干燥。
[0060] (6)统计细胞克隆数，按照下式计算细胞致突变率：
[0061] 值板数 PE = (a+b)八2 X 300)
[0062] 突变率 Y = [ (d+e+f) X IO5]八3 X 5 X IO4 X PE)
[0063] 式中：a，b为只加补体的细胞计数为300个的细胞培养皿中长出的克隆数；d，e，f 为加抗体和补体的细胞计数为5 X IO4个的3个细胞培养皿中长出的克隆数；突变率Y为每 IO5个细胞中有Y个细胞发生突变。
[0064] 结果如图5所示，图中可以看出，随着培养时间的延长，CD59基因突变率先上升， 到第7天时，突变率达到最大，每IO 5个细胞中有119个细胞发生突变。
[0065] 2.6细胞活性
[0066] 细胞活性细胞克隆形成法，其基本原理是单细胞在培养增殖6代以上，其后代细 胞群体会形成肉眼可见的克隆，此时，每个克隆可含有50个以上细胞。活性良好的细胞可 在体外培养成克隆，而活性较差的细胞不能形成克隆，因此可通过计数克隆形成来判断细 胞活性。
[0067] 统计2. 5中空白对照的细胞培养皿中的细胞克隆数c，计算细胞活性A = c/300， 将2D细胞克隆形成数比作1，比较不同培养天数下3D细胞克隆形成数与2D细胞克隆形成 数相比，得结果如图6所示的细胞活性柱状图，图中可以看出，3D细胞在培养期间一直保持 良好的活性。
[0068] 2. 7、AJD细胞基因表达的测定
[0069] (1)将经筛网筛选后的\3D细胞团中加入胰酶进行充分酶解，获得单细胞，1000 g 下离心3min，去除酶液，利用Trizol法提取\3D细胞的总RNA，测定RNA浓度。
[0070] (2)按照 Transgene 的反转录试剂盒（TransScript One-Step gDNA RemovaL and cDNA Synthesis SuperMix)的操作说明书将RNA反转录成cDNA。
[0071] (3)按照TAKARA公司的荧光定量PCR试剂盒（SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNase H Plus))说明书操作，以如下所示的NANOG引物对和GAPDH引物对为引物进行荧光定量 PCR，检测Nanog基因的表达量；反应体系为：10μ1的SYBR Premix Ex Taq(2X)，不超过 IOOng的cDNA溶液，0· 4 μ 1的20 μ mol/L的正向引物，0· 4 μ 1的20 μ mol/1的反向引物，补 加无菌水至20 μ 1 ;反应程序为：95°C预变性30s，95°C变性5s，60°C退火20s，循环50次。
[0072] SEQ ID N0：1 ：NAN0G-MF1 ：TGTGACTTAGGACTCTGCGT
[0073] SEQ ID NO ：2 ：NAN0G-MR1 ：GCTTGCTCCATGTTGTGTTG
[0074] SEQ ID NO ：3 ：GAPDH-MF1 ：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA
[0075] SEQ ID NO ：4 ：GAPDH-MR1 ：GTGGGGGTTATTGGACAGGG
[0076] 结果如图7所示，图中可以看出，随着培养时间的延长，Nanog基因表达出来的 mRNA含量逐渐增加，当培养到第7天时达到最大，约是2D细胞（Control组）的9倍，随后 mRNA含量开始降低。
[0077] 综上所述，根据数据结果的统计图可以得出结论：在3D细胞模型中培养\细胞活 性保持良好，而其他几项指标有着相同的变化趋势：随着培养时间的不断延长，3D细胞直 径、细胞数目、CD59基因突变率以及Nanog基因表达量4项指标先是不断增加，第7天时达 到最大，随后又开始下降。这种趋势与形态学观察结果相类似，细胞在前期培养中，不断生 长聚集，形成了巨大的、无极性的细胞团块，在培养后期中，细胞团开始减小。
[0078] 2. 8、AJD细胞作为遗传毒性检测体系模拟诱变剂对体内细胞突变的试验
[0079] 试验采用γ射线作为诱变剂照射处理细胞，步骤如下：
[0080] (1)将培养5天的经过筛网筛选后的\3D细胞等量分装于3个小皿中，照射γ射 线，剂量分别为lGy、3Gy、5Gy。
[0081] ⑵照射处理后酶解细胞团，接种于2D细胞培养皿中，连续培养7天，使存活的\ 细胞有足够长的时间从生长暂停状态中恢复，CD59基因得以稳定表达。
[0082] (3)随后检测⑶59基因突变，检测结果如图8所示，图中可以看出，经过γ射线 处理后，2D细胞与3D细胞突变率均有上升，且存在一定的剂量-效应关系，但与2D细胞相 比，3D细胞更为灵敏。
【主权项】
1. 一种基于三维细胞培养的3D细胞培养基，其特征在于，所述3D培养基为由预热的无 菌的2XHam'sF12培养液与预热的无菌的质量比为1%的琼脂糖溶液按照1 :1体积比混 合制成。2. -种利用如权利要求1所述的基于三维细胞培养的3D细胞培养基建立遗传毒性检 测体系的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备3D细胞培养基 将预热的无菌的2XHam'sF12培养液与预热的无菌的质量比为1%的琼脂糖溶液按 照1 :1体积比混合，铺在培养皿中，待冷却后，获得胶状Ham'sF12培养基，即为3D细胞培 养基； (2)AL3D细胞的培养 步骤一、将\细胞接种于3D细胞培养基中，置于CO2细胞培养箱中培养； 步骤二、每2天换液一次，具体步骤为：将培养的\细胞离心，去上清，加入新鲜的无菌 的Ham'sF12完全培养液混匀，重新接种在3D细胞培养基上； 步骤三、培养若干天后，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。3. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤（1)中，胶状Ham'sF12培养基在培养皿中的铺设厚度为4mm。4. 根据权利要求1所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤一中，Aj田胞的接种量为3X10 6个。5. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤一中，置于CO2细胞培养箱中培养的条件为：37°C，CO2含量为5%体积比。6. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤二中，Aj田胞离心的条件为：1000g下离心3min。7. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤三中，培养5~7天，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。8. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤（2)之后还包括步骤（3)3D细胞的遗传毒性检测体系的检测步骤，所述检测 步骤包括3D细胞特性指标检测和体系灵敏性检测。9. 根据权利要求8所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述3D细胞特性指标检测包括3D细胞形态、直径、细胞数、细胞活性、本底基因突变 率和基因表达量检测，所述体系灵敏性检测包括诱变剂处理的基因突变率检测。
【专利摘要】本发明公开了一种基于三维细胞培养的3D细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法，步骤包括：首先制备3D细胞培养基，然后将AL细胞接种于3D细胞培养基中，置于CO2细胞培养箱中培养若干天，获得3D细胞的遗传毒性检测体系，最后对该体系进行遗传毒性检测，包括3D细胞特性指标检测和体系灵敏性检测。本发明将二维生长的AL细胞培养成三维生长的AL3D细胞团，能够有效模拟诱变剂对体内细胞突变的影响，对诱变试验的评价更加准确；并且，本发明既不需特殊的3D细胞培养装置，也不需要昂贵的生长因子等添加剂，3D细胞培养的生物反应装置简单，极大地降低了实验的成本，易于操作，适合小规模3D细胞培养用。
【IPC分类】C12N5/071, C12Q1/02, C12Q1/68
【公开号】CN104894052
【申请号】CN201510275458
【发明人】吴李君, 张亚骏, 徐升敏, 王一晨, 陈少鹏
【申请人】中国科学院合肥物质科学研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种细胞遗传检测的技术领域，尤其涉及的是一种基于三维细胞 培养的3D细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法。
【背景技术】
[0002] A#田胞是人成纤维细胞与中国仓鼠卵巢细胞（CHO)杂交后所得到的永生化细胞， 包含一条单拷贝的人11号染色体和整套中国仓鼠染色体。该细胞作为一种遗传毒性检测 体系对诱变剂种类没有选择特异性，且相比于其他突变检测体系更加灵敏（Hei TK，Piao CQ,He ZY1Vannais D1Waldren CA. Chrysotile fiber is a strong mutagen in mammalian cells[J]· Cancer Res, 1992, 52(22) :6305-6309)。然而，该遗传毒性检测体系是在二维 (2D)培养条件下进行实验，难以准确反映诱变剂对体内细胞突变的影响。
[0003] 随着细胞培养技术的发展，研宄发现由于体外培养条件与体内环境差异较大，细 胞在体外培养时，形态和功能会发生一定程度的改变，导致以2D细胞培养为基础的药物或 生物学研宄出现偏差，并且难以预测细胞在体内的真实活动信息。为了减少这种差异性，三 维（3D)细胞培养技术得以提出。使用这种培养技术可以让细胞聚集生长，形成组织样结 构，这样有助于细胞之间紧密连接，促进细胞间的信息交流，可以为研宄提供更真实的细胞 信息。
[0004] 判断3D细胞的构建情况，可通过检测细胞团形态、数目、直径、干性相关基因的表 达量来确定。其中检测细胞干性相关基因是由于多能干细胞倾向于形成团块或集落形态， 并且细胞团块的形成可能与细胞干性有关，相关研宄也证明了这点。例如，悬浮培养的神经 祖细胞（NPCs)会形成神经球，培养成细胞团状的间充质干细胞（MSC)能够保持干性标记基 因的表达。而3D细胞在培养期间会聚集成团，影响有关细胞干性相关基因（Nanog、0ct4、 Klf4、Sox2、Lin28等）的表达，因此通过检测细胞干性相关基因，可以帮助判断3D细胞的 构建情况。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于三维细胞培养的3D细 胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法，以解决二维（2D)培养条件下，细胞的形态和 功能会发生一定程度的改变，导致以2D细胞培养为基础的药物或生物学研宄出现偏差，并 且难以预测细胞在体内的真实活动信息。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种基于三维细胞培养的3D细胞培养基，所述3D培养基为由预热的无菌的 2XHam' s F12培养液与预热的无菌的质量比为1 %的琼脂糖溶液按照1 :1体积比混合制 成。
[0008] -种利用上述的基于三维细胞培养的3D细胞培养基建立遗传毒性检测体系的方 法，包括以下步骤：
[0009] (1)制备3D细胞培养基
[0010] 将预热的无菌的2XHam' s F12培养液与预热的无菌的质量比为1%的琼脂糖溶 液按照1 :1体积比混合，铺在培养皿中，待冷却后，获得胶状Ham' S F12培养基，即为3D细 胞培养基；
[0011] (2)AL3D细胞的培养
[0012] 步骤一、将\细胞接种于3D细胞培养基中，置于CO2细胞培养箱中培养；
[0013] 步骤二、每2天换液一次，具体步骤为：将培养的\细胞离心，去上清，加入新鲜的 无菌的Ham' s F12完全培养液混匀，重新接种在3D细胞培养基上；
[0014] 步骤三、培养若干天后，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。
[0015] 所述步骤⑴中，胶状Ham' s F12培养基在培养皿中的铺设厚度为4mm。
[0016] 所述步骤一中，Ajffl胞的接种量为3X 10 6个。
[0017] 所述步骤一中，置于CO2细胞培养箱中培养的条件为：37°C，C02含量为5%体积比。
[0018] 所述步骤二中，A1细胞离心的条件为：1000 g下离心3min。
[0019] 所述步骤三中，培养5~7天，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。
[0020] 所述基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法中，所述步骤（2)之后还包括 步骤（3) 3D细胞的遗传毒性检测体系的检测步骤，所述检测步骤包括3D细胞特性指标检测 和体系灵敏性检测。
[0021] 所述3D细胞特性指标检测包括3D细胞形态、直径、细胞数、细胞活性、本底基因突 变率和基因表达量检测，所述体系灵敏性检测包括诱变剂处理的基因突变率检测。
[0022] 本发明的原理是：贴壁细胞在培养皿中生长，会紧紧贴在细胞培养皿上，细胞呈现 二维生长，这种培养方法的培养环境与体内环境差异较大，但通过琼脂糖胶培养皿培养后， 细胞并不贴壁，而是悬浮在培养液中，细胞在培养液中聚集生长，形成组织样结构，这样有 助于细胞间紧密连接，促进细胞间的信息交流，从而减小培养环境与体内环境的差异性，模 拟体内细胞生长环境。
[0023] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种基于三维细胞培养的3D 细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法，该方法将二维生长的\细胞培养成三维生 长的\3D细胞团，这种3D细胞培养技术既能模拟体内细胞微环境的生长条件基础，又能体 现传统2D细胞培养的条件可控制性及直观性，可以将2D细胞培养体系与组织器官研宄联 系起来，从而有效模拟诱变剂对体内细胞突变的影响，对诱变试验的评价更加准确；同时， 利用本发明所述的方法培养数天的细胞，其细胞团结构更加紧密，培养期间，通过检测3D 细胞的形态、3D细胞的直径大小、每个细胞团内的细胞数目、3D细胞的细胞活性、CD59基因 突变数、3D细胞基因的表达量等来观察3D细胞构建情况，与其它3D细胞构建方法相比，本 发明既不需特殊的3D细胞培养装置，也不需要昂贵的生长因子等添加剂，3D细胞培养的生 物反应装置简单，极大地降低了实验的成本，同时实验易于操作，适合小规模3D细胞培养 用。
【附图说明】
[0024] 图1为3D细胞遗传毒性检测体系的结构示意图；
[0025] 图2为经过培养后得到的\3D细胞的DIC显微镜观察图；
[0026] 图3为不同培养天数下\3D细胞团的直径大小结果图；
[0027] 图4为不同培养天数下每个\30细胞团中含有的细胞数统计结果图；
[0028] 图5为不同培养天数下\3D细胞中⑶59基因突变率柱状图；
[0029] 图6为不同培养天数下\3D细胞活性柱状图；
[0030] 图7为不同培养天数下\3D细胞的基因表达量结果柱状图；
[0031] 图8为不同培养天数下\3D细胞的突变灵敏度结果柱状图。
【具体实施方式】
[0032] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0033] 实施例1
[0034] 1、试验材料
[0035] 1. 1、无菌的 2 倍浓度的 Ham' s F12(2XHam' s F12)培养液：10. 63g 的 F12 培养 基粉末（购于上海科兴商贸有限公司）溶于500ml CldH2O中，加入I. 176g的NaHCO3粉末， 并调节培养基pH值至7. 0~7. 2,在搅拌器上加转子，边加热边搅拌溶解，过滤灭菌。；
[0036] 1. 2、无菌的Ham's F12完全培养液：10. 63g的Ham's F12培养基粉末溶于1000 ml 的CldH2O中，加入I. 176g的NaHCO3粉末，并调节培养基pH值至7. 0~7. 2,在搅拌器上加转 子，边加热边搅拌溶解，过滤灭菌；再加入体积比为8%的胎牛血清，2 X KT4M的甘氨酸（将 4. 5ml的甘氨酸溶于1000 ml的CldH2O中配制获得），25ug/ml的庆大霉素（将625ul的庆大 霉素溶于1000 ml的CldH 2O中配制获得），混匀。
[0037] 1. 3、无菌的质量比为1 %的琼脂糖溶液；
[0038] 1. 4、CD59突变体系的\细胞：参见Τ. T. PUCK等人1971年11月在PNAS杂志上 发表的论文（Τ· T. PUCK，et. Genetics of Somatic Mammalian Cells: Lethal Antigens as Genetic Markers for Study of Human Linkage Groups? Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 6 8, No. 12, pp. 3102-3106, Decemberl971)
[0039] 2、试验方法：
[0040] 2. I、制备3D细胞培养皿
[0041] 将预热的无菌的2XHam' s F12培养液与预热的无菌的质量比为1%的琼脂糖溶 液按照I : 1体积比混合，铺在直径为60mm的培养皿中，待冷却后，获得4_厚的胶状Ham'S F12培养基，即为3D细胞培养皿。
[0042] 2. 2、AJD细胞的培养
[0043] 步骤一、将3X IO6个A #田胞接种于3D细胞培养皿中，置于37°C含5% (体积比） 的CO2的细胞培养箱中培养2天；
[0044] 步骤二、每2天换液一次，具体步骤为：将培养的\细胞离心，去上清，加入新鲜的 无菌的Ham' s F12培养液混匀，重新接种在3D细胞培养基上；
[0045] 步骤三、培养5~7天后，获得如图1所示的3D细胞的遗传毒性检测体系，图中， 1为培养皿，2为Ham's F12培养液，3为培养皿底层形成的胶状物质，41为\30细胞团，42 为未成团的\单细胞。
[0046] 2. 3、AJD细胞团直径的测量
[0047] 将\3D细胞通过孔径为40 μ m的筛网，筛去未成团的单细胞，获得\3D细胞团，在 DIC显微镜（微分干涉差显微镜）下，采集细胞图像，结果如图2所示，图中，细胞在培养液 中聚集生长，形成细胞团块状结构，这样有助于细胞间紧密连接，促进细胞间的信息交流， 从而减小培养环境与体内环境的差异性，模拟体内细胞生长环境。
[0048] 利用奥林巴斯的Cellsens Standard软件测量不同培养天数下，细胞团的直径大 小，结果如图3所示，图中可看出，随着培养时间的延长，细胞团直径开始逐渐增大，培养到 第7天时达到最大，平均为106. 09 μ m，随后细胞团直径开始降低。
[0049] 2. 4、AL3D细胞团计数[0050] 本实施例中，从被筛网滤过的\3D细胞团中，挑选若干细胞团，统计细胞团的数量 为N。
[0051] 加入胰酶充分酶解细胞团，在显微镜下统计单细胞数为M。
[0052] 计算M/N的值，即为每个细胞团中含有的细胞数，获得如图4所示的结果，图中可 看出，随着培养时间的延长，每个细胞团中含有的细胞数开始逐渐增大，培养到第7天时达 到最大，平均约为2500个，随后细胞数开始降低。
[0053] 2. 5、CD59基因突变检测
[0054] ⑶59基因突变检测的基本原理是：在野生型的\细胞中，⑶59基因会在细胞的表 面形成CD59抗原，在兔血清补体存在情况下，该CD59抗原与特异性抗体发生结合后，导致 野生型细胞裂解而无法生存；然而，突变细胞因不能表达CD59抗原，无法和抗体补体结合 从而得以存活；存活的突变细胞经过培养后，形成肉眼可见的克隆，由此筛选到突变细胞， 计算突变率。CD59基因突变检测的具体步骤包括：
[0055] (1)将经筛网筛选后的\3D细胞团中加入胰酶进行充分酶解，获得单细胞，1000 g 下离心3min，去除酶液，加入Ham's F12完全培养液，收集细胞并计数，计三次取平均值后， 用Ham's F12完全培养液配成浓度为2. 5 X IO4个/mL的细胞悬液，取6mL细胞悬液分别种 于3个60mm的细胞培养皿中，每皿2mL，每皿细胞计数为5 X IO4个。
[0056] (2)另取42 μ 1的细胞悬液置于6958 μ 1的Ham' s F12完全培养液中，吹打混匀 后，取6ml分装于3个直径为60mm的细胞培养皿中，每皿2ml，每皿细胞计数为300个。
[0057] (3)将步骤⑴和⑵的共6个细胞培养皿置于CO2培养箱中孵育a后，细胞贴 壁生长；给细胞计数为5 X IO4个的3个细胞培养皿中分别加入60 μ L的抗⑶59的抗体和 32 μ 1的补体；细胞计数为300个的3个细胞培养皿中，给其中2皿中加入32 μ 1补体，另1 皿作为空白对照；然后，晃动细胞培养皿使抗体补体混合均匀。
[0058] (4)连续培养7~10天，出现肉眼可见克隆时，终止培养。
[0059] (5)弃去培养液，用PBS缓冲液漂洗一遍，用体积比为9 :1的甲醇：冰醋酸溶液作 为固定液固定20min，再用PBS缓冲液漂洗一遍，然后用结晶紫染色液染色3h，再用流水洗 去染色液，最后置于空气中干燥。
[0060] (6)统计细胞克隆数，按照下式计算细胞致突变率：
[0061] 值板数 PE = (a+b)八2 X 300)
[0062] 突变率 Y = [ (d+e+f) X IO5]八3 X 5 X IO4 X PE)
[0063] 式中：a，b为只加补体的细胞计数为300个的细胞培养皿中长出的克隆数；d，e，f 为加抗体和补体的细胞计数为5 X IO4个的3个细胞培养皿中长出的克隆数；突变率Y为每 IO5个细胞中有Y个细胞发生突变。
[0064] 结果如图5所示，图中可以看出，随着培养时间的延长，CD59基因突变率先上升， 到第7天时，突变率达到最大，每IO 5个细胞中有119个细胞发生突变。
[0065] 2.6细胞活性
[0066] 细胞活性细胞克隆形成法，其基本原理是单细胞在培养增殖6代以上，其后代细 胞群体会形成肉眼可见的克隆，此时，每个克隆可含有50个以上细胞。活性良好的细胞可 在体外培养成克隆，而活性较差的细胞不能形成克隆，因此可通过计数克隆形成来判断细 胞活性。
[0067] 统计2. 5中空白对照的细胞培养皿中的细胞克隆数c，计算细胞活性A = c/300， 将2D细胞克隆形成数比作1，比较不同培养天数下3D细胞克隆形成数与2D细胞克隆形成 数相比，得结果如图6所示的细胞活性柱状图，图中可以看出，3D细胞在培养期间一直保持 良好的活性。
[0068] 2. 7、AJD细胞基因表达的测定
[0069] (1)将经筛网筛选后的\3D细胞团中加入胰酶进行充分酶解，获得单细胞，1000 g 下离心3min，去除酶液，利用Trizol法提取\3D细胞的总RNA，测定RNA浓度。
[0070] (2)按照 Transgene 的反转录试剂盒（TransScript One-Step gDNA RemovaL and cDNA Synthesis SuperMix)的操作说明书将RNA反转录成cDNA。
[0071] (3)按照TAKARA公司的荧光定量PCR试剂盒（SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNase H Plus))说明书操作，以如下所示的NANOG引物对和GAPDH引物对为引物进行荧光定量 PCR，检测Nanog基因的表达量；反应体系为：10μ1的SYBR Premix Ex Taq(2X)，不超过 IOOng的cDNA溶液，0· 4 μ 1的20 μ mol/L的正向引物，0· 4 μ 1的20 μ mol/1的反向引物，补 加无菌水至20 μ 1 ;反应程序为：95°C预变性30s，95°C变性5s，60°C退火20s，循环50次。
[0072] SEQ ID N0：1 ：NAN0G-MF1 ：TGTGACTTAGGACTCTGCGT
[0073] SEQ ID NO ：2 ：NAN0G-MR1 ：GCTTGCTCCATGTTGTGTTG
[0074] SEQ ID NO ：3 ：GAPDH-MF1 ：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA
[0075] SEQ ID NO ：4 ：GAPDH-MR1 ：GTGGGGGTTATTGGACAGGG
[0076] 结果如图7所示，图中可以看出，随着培养时间的延长，Nanog基因表达出来的 mRNA含量逐渐增加，当培养到第7天时达到最大，约是2D细胞（Control组）的9倍，随后 mRNA含量开始降低。
[0077] 综上所述，根据数据结果的统计图可以得出结论：在3D细胞模型中培养\细胞活 性保持良好，而其他几项指标有着相同的变化趋势：随着培养时间的不断延长，3D细胞直 径、细胞数目、CD59基因突变率以及Nanog基因表达量4项指标先是不断增加，第7天时达 到最大，随后又开始下降。这种趋势与形态学观察结果相类似，细胞在前期培养中，不断生 长聚集，形成了巨大的、无极性的细胞团块，在培养后期中，细胞团开始减小。
[0078] 2. 8、AJD细胞作为遗传毒性检测体系模拟诱变剂对体内细胞突变的试验
[0079] 试验采用γ射线作为诱变剂照射处理细胞，步骤如下：
[0080] (1)将培养5天的经过筛网筛选后的\3D细胞等量分装于3个小皿中，照射γ射 线，剂量分别为lGy、3Gy、5Gy。
[0081] ⑵照射处理后酶解细胞团，接种于2D细胞培养皿中，连续培养7天，使存活的\ 细胞有足够长的时间从生长暂停状态中恢复，CD59基因得以稳定表达。
[0082] (3)随后检测⑶59基因突变，检测结果如图8所示，图中可以看出，经过γ射线 处理后，2D细胞与3D细胞突变率均有上升，且存在一定的剂量-效应关系，但与2D细胞相 比，3D细胞更为灵敏。
【主权项】
1. 一种基于三维细胞培养的3D细胞培养基，其特征在于，所述3D培养基为由预热的无 菌的2XHam'sF12培养液与预热的无菌的质量比为1%的琼脂糖溶液按照1 :1体积比混 合制成。2. -种利用如权利要求1所述的基于三维细胞培养的3D细胞培养基建立遗传毒性检 测体系的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备3D细胞培养基 将预热的无菌的2XHam'sF12培养液与预热的无菌的质量比为1%的琼脂糖溶液按 照1 :1体积比混合，铺在培养皿中，待冷却后，获得胶状Ham'sF12培养基，即为3D细胞培 养基； (2)AL3D细胞的培养 步骤一、将\细胞接种于3D细胞培养基中，置于CO2细胞培养箱中培养； 步骤二、每2天换液一次，具体步骤为：将培养的\细胞离心，去上清，加入新鲜的无菌 的Ham'sF12完全培养液混匀，重新接种在3D细胞培养基上； 步骤三、培养若干天后，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。3. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤（1)中，胶状Ham'sF12培养基在培养皿中的铺设厚度为4mm。4. 根据权利要求1所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤一中，Aj田胞的接种量为3X10 6个。5. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤一中，置于CO2细胞培养箱中培养的条件为：37°C，CO2含量为5%体积比。6. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤二中，Aj田胞离心的条件为：1000g下离心3min。7. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤三中，培养5~7天，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。8. 根据权利要求2所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述步骤（2)之后还包括步骤（3)3D细胞的遗传毒性检测体系的检测步骤，所述检测 步骤包括3D细胞特性指标检测和体系灵敏性检测。9. 根据权利要求8所述的一种基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法，其特征 在于，所述3D细胞特性指标检测包括3D细胞形态、直径、细胞数、细胞活性、本底基因突变 率和基因表达量检测，所述体系灵敏性检测包括诱变剂处理的基因突变率检测。
【专利摘要】本发明公开了一种基于三维细胞培养的3D细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法，步骤包括：首先制备3D细胞培养基，然后将AL细胞接种于3D细胞培养基中，置于CO2细胞培养箱中培养若干天，获得3D细胞的遗传毒性检测体系，最后对该体系进行遗传毒性检测，包括3D细胞特性指标检测和体系灵敏性检测。本发明将二维生长的AL细胞培养成三维生长的AL3D细胞团，能够有效模拟诱变剂对体内细胞突变的影响，对诱变试验的评价更加准确；并且，本发明既不需特殊的3D细胞培养装置，也不需要昂贵的生长因子等添加剂，3D细胞培养的生物反应装置简单，极大地降低了实验的成本，易于操作，适合小规模3D细胞培养用。
【IPC分类】C12N5/071, C12Q1/02, C12Q1/68
【公开号】CN104894052
【申请号】CN201510275458
【发明人】吴李君, 张亚骏, 徐升敏, 王一晨, 陈少鹏
【申请人】中国科学院合肥物质科学研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
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