一种在胶中形成汗腺样结构的方法
一种在胶中形成汗腺样结构的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在胶中形成汗腺样结构的方法，属于汗腺样结构培养技术领域。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体最大的器官，覆盖全身，是人体的第一道防线，它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭，具有保护身体，排汗，感觉冷热和压力等功能。其中汗腺作为重要的功能性皮肤附属器，在调节体温，分泌汗液及排出人体部分代谢产物的过程中发挥着重要的作用。
[0003]汗腺是单曲管状腺，分泌部为较粗的管，位于真皮深层和皮下组织中，盘曲成团，管腔小。导管较细而直，开口于皮肤表面。汗腺的发育过程是一个复杂的过程，开始于胚胎发育14~16周，至24周基本成熟，出生后不再有新生的汗腺结构形成。
[0004]在我国，烧伤的年发病率约为1.5%?2%，即每年约有千万人遭受不同程度的烧伤，近万人严重烧伤，其中约10%病人由于缺乏皮源而无法挽救其性命。大面积烧伤获救病人由于无功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤的功能，严重影响病人的生活质量。大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。
[0005]轻度烧伤时，汗腺的导管细胞可以其深部未受创部分为模版，通过干细胞的分化形成它特有的三维结构而完全修复。但是，全层皮肤大面积深度烧伤，汗腺结构被完全破坏，则不能依赖干细胞的分化来重建其复杂结构。人体内存在的汗腺数量是一定的，由于其发育的特殊性，一旦大面积受损，将无法快速有效的恢复有功能性的汗腺。故大面积烧伤病人的创面虽经覆盖，但无排汗功能，严重影响病人生活质量。
[0006]皮肤组织修复和功能重建在国内和国际上都是生物医学领域研宄的核心和热点。目前，汗腺组织的发育机制还不明确，无法实现临床大量移植。现有研宄发现，体外培养的汗腺细胞可以在基质胶(Matrigel)中形成类似于人汗腺组织的具有官腔的细胞团，但是所使用Matrigel只能维持两周的时间，且得到的结构没有进行具体的检测，无法确定是否得到汗腺样结构。因此研发一种新的在胶中形成汗腺样结构的方法十分必要。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种可以在胶中形成汗腺样结构的方法；由此得到的汗腺样结构由6?15个细胞组成且具有明显管腔结构，根据对汗腺样结构进行的充分鉴定，确定本发明得到的汗腺样结构在形态上更接近正常人组织的汗腺结构，更有利于实际医学应用，从而解决大面积烧伤病人救治过程中对汗腺的需求。
[0008]为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种在胶中形成汗腺样结构的方法，包括以下步骤:
(O调整非细胞胶的PH为7，然后于室温下凝固非细胞胶；
(2)调整细胞胶的pH为7，然后将成纤维细胞与待诱导细胞加入细胞胶中；所述成纤细胞与待诱导细胞的数量比例为1: 2?3; (3)将步骤(2)的混有细胞的细胞胶接种在凝固的非细胞胶上，置于培养箱中，至细胞胶凝固；
(4)细胞胶凝固后再加入培养基；隔日更换一次培养基，通过染色检测汗腺样结构的形成程度，最终得到汗腺样结构；
所述非细胞胶包含体积比为1:1的胶原与基质胶，还包含添加剂；以ImL胶原计，所述添加剂及其用量为:
1XMEM0.2mL
L-谷氨酰胺1.8uL
胎牛血清0.24mL
氢氧化钠溶液12uL
所述细胞胶包含体积比为1:1的胶原与基质胶，还包含添加剂；以ImL胶原计，所述添加剂及其用量为:
10XMEM0.2mL
L-谷氨酰胺18uL
胎牛血清0.24mL
氢氧化钠溶液20uL
所述培养基为含有50ng/mL表皮生长因子的上皮细胞培养液。
[0009]以6孔板为培养器皿，本发明将非细胞胶铺满6孔板底部，室温静置20分钟，待其凝固；将混有细胞的细胞胶接种在非细胞胶上，置于培养箱中37度30分钟，待其凝固；凝固后加入培养基盖过胶的表面，大约5mL，隔天换液；切片染色检测，确定最终形成汗腺样结构。本发明首次公开了鉴定在胶中形成的汗腺样结构的方法，可以确定所得汗腺样结构类似人正常汗腺结构，有利于实际医学应用，从而有望解决大面积烧伤病人救治过程中对汗腺的需求。
[0010]上述技术方案中，所述待诱导细胞为人汗腺细胞或者汗腺样细胞。
[0011 ] 上述技术方案中，所述汗腺样细胞为由人羊水干细胞分化得到的汗腺样细胞或者由人多潜能细胞分化得到的汗腺样细胞。
[0012]上述技术方案中，使用氢氧化钠调整非细胞胶与细胞胶的pH为7。
[0013]本发明中，10XMEM为1X的基础培养基MEM Eagle EBSS，不含碳酸氢钠和谷氨酰胺，可购于Lonza公司；所述上皮细胞培养液为Epilife培养基，Epilife培养基是一种使用60μΜ氯化钙配制的无菌液体培养基，包括牛垂体提取物(ΒΡΕ)，牛胰岛素，皮质醇，转铁蛋白，人表皮生长因子，用于长期无血清培养人上皮细胞，使用时需要添加合适的生长因子。
[0014]本发明在将细胞加入细胞胶中的时候，将成纤维细胞与待诱导细胞混入细胞胶中，用移液枪轻轻吹打均匀，气泡较少为好；添加了成纤维细胞，成纤维细胞与待诱导细胞在胶中混合培养，成纤维细胞分泌的因子对汗腺样结构的生长有促进作用。
[0015]上述技术方案中，步骤(4)中，培养基盖过细胞胶的表面。
[0016]本发明首次将胶原(collagen)和基质胶(matrigel)以体积比为I: I加入到胶中，用以诱导细胞形成汗腺样结构；同时还添加了诸如谷氨酰胺和胎牛血清，为胶中的细胞提供了营养。培养体系对于细胞培养、分化以及形成汗腺结构有很大影响，如果各组分，特别是胶使用不当，则细胞在胶中无法形成汗腺样结构或者整个胶体系维持时间短，不到两周，也无法形成成熟的汗腺样结构；这也是现有技术几乎没有关于汗腺样结构的有效形成报道的原因；本发明创造性的设计培养体系并结合新的培养方法，得到的汗腺样结构由6?15个细胞组成且具有明显管腔结构，根据对汗腺样结构进行的充分鉴定，确定本发明得到的汗腺样结构在形态上符合正常人组织的汗腺结构，更有利于实际医学应用。
[0017]现有技术仅公开了针对体外培养的汗腺细胞可能形成汗腺样结构，未见其他细胞如干细胞分化得到汗腺样细胞形成汗腺样结构。所谓汗腺样细胞为由干细胞分化得到的具有汗腺细胞表型的一类细胞。人汗腺细胞体外培养时，由于其增殖速度慢，传代培养存在问题，无法满足形成汗腺样结构所需要的细胞量，限制了其应用。使用干细胞分化得到的汗腺样细胞作为种子细胞具有明显的数量优势，可以得到更多的汗腺样结构。但是汗腺样细胞与人汗腺细胞存在差异，在培养过程中受生长因子等培养因素的作用不一样，由其培养形成汗腺样结构存在困难与变数；本发明方法不仅可以使体外培养的汗腺细胞形成汗腺样结构，更能使汗腺样细胞形成汗腺样结构。
[0018]由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:
1.本发明公开了一种新的在胶中形成汗腺样结构的方法，利用新的培养体系与培养方法不仅能有效的使汗腺细胞形成汗腺样结构，更能使汗腺样细胞在胶中形成汗腺样结构，大大拓展了汗腺样结构的形成路径，取得了意想不到的效果。
[0019]2.利用使用本发明的方法，细胞在胶中形成汗腺样结构的过程中，可以观察到汗腺样结构形成管腔的过程，这一现象现有技术中未见报道，说明本发明的方法可以有效的将细胞培养成汗腺样结构。
[0020]3.本发明公开的培养细胞形成汗腺样结构的方法可以促进汗腺管状结构的形成且延长细胞在胶中的生长时间，有利于更好地将汗腺细胞或汗腺样细胞在胶中形成较成熟的汗腺样结构。
[0021]4.本发明方法得到的汗腺样结构由6?15个细胞组成且具有明显官腔结构，根据对汗腺样结构进行的充分鉴定，确定本发明得到的汗腺样结构在形态上更符合正常人组织的汗腺结构，更有利于实际医学应用。
【附图说明】
[0022]图1为实施例一中汗腺样结构、正常人汗腺组织图；
图2为实施例二中人羊水干细胞、汗腺样细胞以及人汗腺细胞形态图；
图3为实施例二中汗腺样结构、正常人汗腺组织图；
图4为实施例二中汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构的过程图；
图5为实施例二中汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构免疫荧光图；
图6为实施例三中汗腺样结构、正常人汗腺组织图；
图7为实施例三中汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构的过程图；
图8为实施例三中汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构免疫荧光图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例与附图对本发明作进一步描述: 实施例一:体外培养的人汗腺细胞在胶中形成汗腺样结构非细胞胶:
1xMEM0.1mL
L-谷氨酰胺9uL
胎牛血清0.12mL
氢氧化钠(0.1M)6uL
胶原(Sigma)0.5 mL
基质胶(BD)0.5mL
细胞胶:
1xMEM0.3mL
L-谷氨酰胺27uL
胎牛血清0.36mL
氢氧化钠(0.1M)30uL
胶原(Sigma)1.5 mL
基质胶(BD)1.5mL
冰上操作，非细胞胶和细胞胶的PH都调整为7 ;将非细胞胶铺满6孔板底部，室温静置20分钟，待其凝固；在细胞胶中加入两种细胞，分别是IxlO5的成纤维细胞和5x10 5的体外培养的人汗腺细胞；将混有细胞的细胞胶接种在已凝固的非细胞胶上，置于培养箱中37度30分钟，待细胞胶凝固。
[0024]细胞胶凝固后加入含有50ng/ml EGF的Epilife (Gibco公司)培养基，培养基没过胶的表面，大约5ml ;隔日换液。定期取出胶，固定，组织化学染色，最后，18天后取出胶，固定，组织化学染色。
[0025]附图1为体外培养的人汗腺细胞在胶中形成的汗腺样结构(18天)，正常人汗腺组织为对照。可以看出，在胶中形成的汗腺样结构由6?15个细胞组成，与正常人汗腺组织结构一致；且具有明显管腔结构，说明本发明方法形成的汗腺样结 构与正常人汗腺组织符合。
[0026]人汗腺细胞体外培养:人皮肤样本去除脂肪和皮下组织，剪成Imm3大小，加入lmg/ml分散酶(Dispase)中，放入4度18个小时。第二天取出，磷酸缓冲液漂洗，分离真皮层和表皮层。真皮层剪成小块，加入lmg/ml四型胶原酶中一个小时，然后在显微镜下使用移液枪吸取游离出来的汗腺组织，接种在预先铺好胶原的6cm培养皿上，放入培养箱I个小时，然后加入汗腺细胞培养基(DMEM-F12，添加10%胎牛血清，lmmol/L三碘甲状腺原氨酸、0.2mg/L氢化可的松、1%胰岛素-转铁蛋白-亚砸酸钠、lmmol/L L-谷氨酰胺、0.05U/L青霉素和0.05 μ g/L链霉素)。每两天换液一次。
[0027]实施例二:羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成汗腺样结构
采用实施例一的细胞胶与非细胞胶体系；所用非细胞胶与细胞胶中的collagen(Sigma)和 matrigel (BD)体积比为 1:1。
[0028]诱导人羊水干细胞分化为汗腺样细胞。取5 X 14个/孔的人羊水干细胞铺于6孔板中，使用羊水干细胞培养基培养(a-MEM培养基中添加15%胎牛血清(FBS)，1 mM L-谷氨酰胺和0.05U/L青霉素，0.05 μ g/L链霉素，18%Chang B和2%Chang C培养基)；20h后，待羊水干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基；然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基；待诱导后的羊水干细胞生长至汇合率为80%，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，使用ImL 0.25%胰酶对细胞消化2分钟，使用含血清的培养基终止胰酶的作用，将消化下来的细胞吸入离心管中离心，1200转/分钟，离心5分钟。弃去上清，加入汗腺细胞诱导培养基，将细胞沉淀混匀，按I传3的比例接种细胞至新的培养皿中；重复以上步骤，诱导分化28天后得到汗腺样细胞。
[0029]附图2为体外培养的人羊水干细胞，人羊水干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞在光学显微镜下的形态图。可以看出人羊水干细胞，细胞较小，呈梭型，排列无规则；由人羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞，细胞变大，成上皮细胞样，排列规则?’人汗腺细胞，细胞较大，具有明显的上皮细胞形态，呈铺路石状生长，细胞排列整齐。人羊水干细胞经过汗腺诱导培养基诱导分化后得到的汗腺样细胞在形态上接近体外培养的人汗腺细胞。
[0030]人羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成汗腺样结构。冰上操作，非细胞胶和细胞胶的PH都调整为7 ;将非细胞胶铺满6孔板底部，室温静置20分钟，待其凝固；在细胞胶中加入两种细胞，分别是IxlO5的成纤维细胞和3x10 5的羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞；将混有细胞的细胞胶接种在非细胞胶上，置于培养箱中37度30分钟，待其凝固。
[0031]细胞胶凝固后加入含有50ng/ml EGF的Epilife培养基，培养基没过胶的表面，大约5ml ;隔天换液。定期取出胶，固定，组织化学染色，最后，20天后取出胶，固定，组织化学染色。
[0032]附图3为人羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构，正常人汗腺组织为对照。可以看出，在胶中形成的汗腺样结构由6?15个细胞组成，且具有明显管腔结构，说明本发明方法形成的汗腺样结构与正常人汗腺组织极近似。
[0033]附图4为人羊水干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构形成官腔的过程。可以很明显的看出，汗腺样细胞在胶中增殖成团，随着时间推移，中间的细胞逐渐凋亡，形成管腔。
[0034]附图5为免疫荧光染色方法检测人羊水干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构。虚线勾出汗腺样结构的轮廓，以及管腔。从图中可以看出，得到的汗腺样结构表达汗腺相关基因EDA，EDAR，CEA, K8，K18，Na-K-ATP, SMA。
[0035]实施例三:诱导多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成汗腺样结构采用实施例一的细胞胶与非细胞胶体系；所用非细胞胶与细胞胶中的collagen
(Sigma)和 matrigel (BD)体积比为 1:1。
[0036]诱导多潜能干细胞分化为汗腺样细胞。取I X 15个/孔的多潜能干细胞铺于6孔板中，使用多潜能干细胞培养基培养(含20%Knock0ut血清、1%非必需氨基酸、0.1mmol/L β-2-巯基乙醇、4 μ g/L FGF-based、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1U/L 青霉素和 0.lug/L 链霉素的DMED F12细胞培养基);24h后，待多潜能干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基；然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基；待诱导后的多潜能干细胞生长至汇合率为70%，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，使用0.8mL 0.25%胰酶对细胞消化2分钟，使用含血清的培养基终止胰酶的作用，将消化下来的细胞吸入离心管中离心，1200转/分钟，离心5分钟。弃去上清，加入汗腺细胞诱导培养基，将细胞沉淀混匀，按I传4的比例接种细胞至新的培养皿中；重复以上步骤，诱导分化21天后得到汗腺样细胞，并对其进行汗腺指标的检测，利用汗腺细胞诱导培养基可以成功将多潜能干细胞诱导为汗腺样细胞。
[0037]在胶中形成汗腺样结构。冰上操作，非细胞胶和细胞胶的pH都调整为7 ;将非细胞胶铺满6孔板底部，室温静置30分钟，待其凝固；在细胞胶中加入两种细胞，分别是IxlO5的成纤维细胞和2xl05的多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞；将混有细胞的细胞胶接种在非细胞胶上，置于培养箱中37度25分钟，待其凝固。
[0038]细胞胶凝固后加入含有50ng/ml EGF的Epilife培养基，培养基没过胶的表面，大约5ml ;维持7天，胶稳定，隔天换液。定期取出胶，固定，组织化学染色，最后，18天后取出胶，固定，组织化学染色。
[0039]附图6为多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构，正常人汗腺组织为对照。在胶中形成的汗腺样结构由6~15个细胞组成，且具有明显管腔结构，说明本发明方法形成的汗腺样结构与正常人汗腺组织极近似。
[0040]附图7为多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程。汗腺样细胞在胶中增殖成团，中间的细胞逐渐凋亡，形成管腔。
[0041]附图8为免疫荧光染色方法检测多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构。虚线勾出汗腺样结构的轮廓，以及管腔。从图中可以看出，得到的汗腺样结构表达汗腺相关基因EDA，EDAR，CEA, K8，K18，Na-K-ATP, SMA。
[0042]综上所述，可以使用本发明的在胶中形成汗腺样结构的方法，有效的将人汗腺细胞以及汗腺样细胞培养为汗腺样结构；在体外重建汗腺组织，为大面积烧伤病人的救治提供足够数量的汗腺，大大改善病人的生活质量。也为研宄汗腺的分化发育提供理论依据，具有潜在的临床应用前景。
【主权项】
1.一种在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于，包括以下步骤: (O调整非细胞胶的PH为7，然后于室温下凝固非细胞胶； (2)调整细胞胶的pH为7，然后将成纤维细胞与待诱导细胞加入细胞胶中；所述成纤细胞与待诱导细胞的数量比例为1: 2?3; (3)将步骤(2)的混有细胞的细胞胶接种在步骤(I)凝固的非细胞胶上，置于培养箱中，至细胞胶凝固； (4)细胞胶凝固后再加入培养基；隔日更换一次培养基，通过染色检测汗腺样结构的形成程度，最终得到汗腺样结构； 所述非细胞胶包含体积比为1:1的胶原与基质胶，还包含添加剂；以ImL胶原计，所述添加剂及其用量为: 1XMEM0.2mL L-谷氨酰胺1.8uL 胎牛血清0.24mL 氢氧化钠溶液12uL 所述细胞胶包含体积比为1:1的胶原与基质胶，还包含添加剂；以ImL胶原计，所述添加剂及其用量为: 10XMEM0.2mL L-谷氨酰胺18uL 胎牛血清0.24mL 氢氧化钠溶液20uL 所述培养基为含有50ng/mL表皮生长因子的上皮细胞培养液。2.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:所述待诱导细胞为人汗腺细胞或者汗腺样细胞。3.根据权利要求2所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:所述汗腺样细胞为由人羊水干细胞分化得到的汗腺样细胞或者由人多潜能细胞分化得到的汗腺样细胞。4.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:使用氢氧化钠调整非细胞胶与细胞胶的PH为7。5.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:步骤(3)中，非细胞胶与细胞胶的体积比为1: (2.5?3.5)。6.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1M。7.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:步骤(2)中，细胞胶中细胞的密度为IxlO5个/ml。8.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:步骤(3)中，培养箱中的温度为37 °C。9.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:步骤(4)中，培养基盖过细胞胶的表面。10.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:所述上皮细胞培养液为Epilife培养基。
【专利摘要】本发明公开了一种在胶中形成汗腺样结构的方法。具体为先将非细胞胶和细胞胶的pH都调整为7；将非细胞胶凝固；在细胞胶中加入两种细胞，分别是成纤维细胞和汗腺（样）细胞；将混有细胞的细胞胶接种在非细胞胶上，置于培养箱中37度30分钟，待其凝固。细胞胶凝固后加入含有50ng/ml EGF的Epilife培养基，培养基没过胶的表面，大约5ml；维持5-7天，待胶稳定，隔天换液。采用本发明的方法可使用汗腺细胞和汗腺样细胞在胶中形成符合正常人汗腺组织的汗腺样结构，为大面积烧伤病人的救治提供足够数量的汗腺组织，从而改善病人的生活质量。同时也为研究汗腺的分化发育提供了理论依据，具有潜在的临床应用前景。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN104894053
【申请号】CN201510277273
【发明人】张学光, 秦明德, 孙青 , 李芳 , 梁含思
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在胶中形成汗腺样结构的方法，属于汗腺样结构培养技术领域。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体最大的器官，覆盖全身，是人体的第一道防线，它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭，具有保护身体，排汗，感觉冷热和压力等功能。其中汗腺作为重要的功能性皮肤附属器，在调节体温，分泌汗液及排出人体部分代谢产物的过程中发挥着重要的作用。
[0003]汗腺是单曲管状腺，分泌部为较粗的管，位于真皮深层和皮下组织中，盘曲成团，管腔小。导管较细而直，开口于皮肤表面。汗腺的发育过程是一个复杂的过程，开始于胚胎发育14~16周，至24周基本成熟，出生后不再有新生的汗腺结构形成。
[0004]在我国，烧伤的年发病率约为1.5%?2%，即每年约有千万人遭受不同程度的烧伤，近万人严重烧伤，其中约10%病人由于缺乏皮源而无法挽救其性命。大面积烧伤获救病人由于无功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤的功能，严重影响病人的生活质量。大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。
[0005]轻度烧伤时，汗腺的导管细胞可以其深部未受创部分为模版，通过干细胞的分化形成它特有的三维结构而完全修复。但是，全层皮肤大面积深度烧伤，汗腺结构被完全破坏，则不能依赖干细胞的分化来重建其复杂结构。人体内存在的汗腺数量是一定的，由于其发育的特殊性，一旦大面积受损，将无法快速有效的恢复有功能性的汗腺。故大面积烧伤病人的创面虽经覆盖，但无排汗功能，严重影响病人生活质量。
[0006]皮肤组织修复和功能重建在国内和国际上都是生物医学领域研宄的核心和热点。目前，汗腺组织的发育机制还不明确，无法实现临床大量移植。现有研宄发现，体外培养的汗腺细胞可以在基质胶(Matrigel)中形成类似于人汗腺组织的具有官腔的细胞团，但是所使用Matrigel只能维持两周的时间，且得到的结构没有进行具体的检测，无法确定是否得到汗腺样结构。因此研发一种新的在胶中形成汗腺样结构的方法十分必要。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种可以在胶中形成汗腺样结构的方法；由此得到的汗腺样结构由6?15个细胞组成且具有明显管腔结构，根据对汗腺样结构进行的充分鉴定，确定本发明得到的汗腺样结构在形态上更接近正常人组织的汗腺结构，更有利于实际医学应用，从而解决大面积烧伤病人救治过程中对汗腺的需求。
[0008]为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种在胶中形成汗腺样结构的方法，包括以下步骤:
(O调整非细胞胶的PH为7，然后于室温下凝固非细胞胶；
(2)调整细胞胶的pH为7，然后将成纤维细胞与待诱导细胞加入细胞胶中；所述成纤细胞与待诱导细胞的数量比例为1: 2?3; (3)将步骤(2)的混有细胞的细胞胶接种在凝固的非细胞胶上，置于培养箱中，至细胞胶凝固；
(4)细胞胶凝固后再加入培养基；隔日更换一次培养基，通过染色检测汗腺样结构的形成程度，最终得到汗腺样结构；
所述非细胞胶包含体积比为1:1的胶原与基质胶，还包含添加剂；以ImL胶原计，所述添加剂及其用量为:
1XMEM0.2mL
L-谷氨酰胺1.8uL
胎牛血清0.24mL
氢氧化钠溶液12uL
所述细胞胶包含体积比为1:1的胶原与基质胶，还包含添加剂；以ImL胶原计，所述添加剂及其用量为:
10XMEM0.2mL
L-谷氨酰胺18uL
胎牛血清0.24mL
氢氧化钠溶液20uL
所述培养基为含有50ng/mL表皮生长因子的上皮细胞培养液。
[0009]以6孔板为培养器皿，本发明将非细胞胶铺满6孔板底部，室温静置20分钟，待其凝固；将混有细胞的细胞胶接种在非细胞胶上，置于培养箱中37度30分钟，待其凝固；凝固后加入培养基盖过胶的表面，大约5mL，隔天换液；切片染色检测，确定最终形成汗腺样结构。本发明首次公开了鉴定在胶中形成的汗腺样结构的方法，可以确定所得汗腺样结构类似人正常汗腺结构，有利于实际医学应用，从而有望解决大面积烧伤病人救治过程中对汗腺的需求。
[0010]上述技术方案中，所述待诱导细胞为人汗腺细胞或者汗腺样细胞。
[0011 ] 上述技术方案中，所述汗腺样细胞为由人羊水干细胞分化得到的汗腺样细胞或者由人多潜能细胞分化得到的汗腺样细胞。
[0012]上述技术方案中，使用氢氧化钠调整非细胞胶与细胞胶的pH为7。
[0013]本发明中，10XMEM为1X的基础培养基MEM Eagle EBSS，不含碳酸氢钠和谷氨酰胺，可购于Lonza公司；所述上皮细胞培养液为Epilife培养基，Epilife培养基是一种使用60μΜ氯化钙配制的无菌液体培养基，包括牛垂体提取物(ΒΡΕ)，牛胰岛素，皮质醇，转铁蛋白，人表皮生长因子，用于长期无血清培养人上皮细胞，使用时需要添加合适的生长因子。
[0014]本发明在将细胞加入细胞胶中的时候，将成纤维细胞与待诱导细胞混入细胞胶中，用移液枪轻轻吹打均匀，气泡较少为好；添加了成纤维细胞，成纤维细胞与待诱导细胞在胶中混合培养，成纤维细胞分泌的因子对汗腺样结构的生长有促进作用。
[0015]上述技术方案中，步骤(4)中，培养基盖过细胞胶的表面。
[0016]本发明首次将胶原(collagen)和基质胶(matrigel)以体积比为I: I加入到胶中，用以诱导细胞形成汗腺样结构；同时还添加了诸如谷氨酰胺和胎牛血清，为胶中的细胞提供了营养。培养体系对于细胞培养、分化以及形成汗腺结构有很大影响，如果各组分，特别是胶使用不当，则细胞在胶中无法形成汗腺样结构或者整个胶体系维持时间短，不到两周，也无法形成成熟的汗腺样结构；这也是现有技术几乎没有关于汗腺样结构的有效形成报道的原因；本发明创造性的设计培养体系并结合新的培养方法，得到的汗腺样结构由6?15个细胞组成且具有明显管腔结构，根据对汗腺样结构进行的充分鉴定，确定本发明得到的汗腺样结构在形态上符合正常人组织的汗腺结构，更有利于实际医学应用。
[0017]现有技术仅公开了针对体外培养的汗腺细胞可能形成汗腺样结构，未见其他细胞如干细胞分化得到汗腺样细胞形成汗腺样结构。所谓汗腺样细胞为由干细胞分化得到的具有汗腺细胞表型的一类细胞。人汗腺细胞体外培养时，由于其增殖速度慢，传代培养存在问题，无法满足形成汗腺样结构所需要的细胞量，限制了其应用。使用干细胞分化得到的汗腺样细胞作为种子细胞具有明显的数量优势，可以得到更多的汗腺样结构。但是汗腺样细胞与人汗腺细胞存在差异，在培养过程中受生长因子等培养因素的作用不一样，由其培养形成汗腺样结构存在困难与变数；本发明方法不仅可以使体外培养的汗腺细胞形成汗腺样结构，更能使汗腺样细胞形成汗腺样结构。
[0018]由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:
1.本发明公开了一种新的在胶中形成汗腺样结构的方法，利用新的培养体系与培养方法不仅能有效的使汗腺细胞形成汗腺样结构，更能使汗腺样细胞在胶中形成汗腺样结构，大大拓展了汗腺样结构的形成路径，取得了意想不到的效果。
[0019]2.利用使用本发明的方法，细胞在胶中形成汗腺样结构的过程中，可以观察到汗腺样结构形成管腔的过程，这一现象现有技术中未见报道，说明本发明的方法可以有效的将细胞培养成汗腺样结构。
[0020]3.本发明公开的培养细胞形成汗腺样结构的方法可以促进汗腺管状结构的形成且延长细胞在胶中的生长时间，有利于更好地将汗腺细胞或汗腺样细胞在胶中形成较成熟的汗腺样结构。
[0021]4.本发明方法得到的汗腺样结构由6?15个细胞组成且具有明显官腔结构，根据对汗腺样结构进行的充分鉴定，确定本发明得到的汗腺样结构在形态上更符合正常人组织的汗腺结构，更有利于实际医学应用。
【附图说明】
[0022]图1为实施例一中汗腺样结构、正常人汗腺组织图；
图2为实施例二中人羊水干细胞、汗腺样细胞以及人汗腺细胞形态图；
图3为实施例二中汗腺样结构、正常人汗腺组织图；
图4为实施例二中汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构的过程图；
图5为实施例二中汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构免疫荧光图；
图6为实施例三中汗腺样结构、正常人汗腺组织图；
图7为实施例三中汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构的过程图；
图8为实施例三中汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构免疫荧光图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例与附图对本发明作进一步描述: 实施例一:体外培养的人汗腺细胞在胶中形成汗腺样结构非细胞胶:
1xMEM0.1mL
L-谷氨酰胺9uL
胎牛血清0.12mL
氢氧化钠(0.1M)6uL
胶原(Sigma)0.5 mL
基质胶(BD)0.5mL
细胞胶:
1xMEM0.3mL
L-谷氨酰胺27uL
胎牛血清0.36mL
氢氧化钠(0.1M)30uL
胶原(Sigma)1.5 mL
基质胶(BD)1.5mL
冰上操作，非细胞胶和细胞胶的PH都调整为7 ;将非细胞胶铺满6孔板底部，室温静置20分钟，待其凝固；在细胞胶中加入两种细胞，分别是IxlO5的成纤维细胞和5x10 5的体外培养的人汗腺细胞；将混有细胞的细胞胶接种在已凝固的非细胞胶上，置于培养箱中37度30分钟，待细胞胶凝固。
[0024]细胞胶凝固后加入含有50ng/ml EGF的Epilife (Gibco公司)培养基，培养基没过胶的表面，大约5ml ;隔日换液。定期取出胶，固定，组织化学染色，最后，18天后取出胶，固定，组织化学染色。
[0025]附图1为体外培养的人汗腺细胞在胶中形成的汗腺样结构(18天)，正常人汗腺组织为对照。可以看出，在胶中形成的汗腺样结构由6?15个细胞组成，与正常人汗腺组织结构一致；且具有明显管腔结构，说明本发明方法形成的汗腺样结 构与正常人汗腺组织符合。
[0026]人汗腺细胞体外培养:人皮肤样本去除脂肪和皮下组织，剪成Imm3大小，加入lmg/ml分散酶(Dispase)中，放入4度18个小时。第二天取出，磷酸缓冲液漂洗，分离真皮层和表皮层。真皮层剪成小块，加入lmg/ml四型胶原酶中一个小时，然后在显微镜下使用移液枪吸取游离出来的汗腺组织，接种在预先铺好胶原的6cm培养皿上，放入培养箱I个小时，然后加入汗腺细胞培养基(DMEM-F12，添加10%胎牛血清，lmmol/L三碘甲状腺原氨酸、0.2mg/L氢化可的松、1%胰岛素-转铁蛋白-亚砸酸钠、lmmol/L L-谷氨酰胺、0.05U/L青霉素和0.05 μ g/L链霉素)。每两天换液一次。
[0027]实施例二:羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成汗腺样结构
采用实施例一的细胞胶与非细胞胶体系；所用非细胞胶与细胞胶中的collagen(Sigma)和 matrigel (BD)体积比为 1:1。
[0028]诱导人羊水干细胞分化为汗腺样细胞。取5 X 14个/孔的人羊水干细胞铺于6孔板中，使用羊水干细胞培养基培养(a-MEM培养基中添加15%胎牛血清(FBS)，1 mM L-谷氨酰胺和0.05U/L青霉素，0.05 μ g/L链霉素，18%Chang B和2%Chang C培养基)；20h后，待羊水干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基；然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基；待诱导后的羊水干细胞生长至汇合率为80%，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，使用ImL 0.25%胰酶对细胞消化2分钟，使用含血清的培养基终止胰酶的作用，将消化下来的细胞吸入离心管中离心，1200转/分钟，离心5分钟。弃去上清，加入汗腺细胞诱导培养基，将细胞沉淀混匀，按I传3的比例接种细胞至新的培养皿中；重复以上步骤，诱导分化28天后得到汗腺样细胞。
[0029]附图2为体外培养的人羊水干细胞，人羊水干细胞诱导分化的汗腺样细胞以及人汗腺细胞在光学显微镜下的形态图。可以看出人羊水干细胞，细胞较小，呈梭型，排列无规则；由人羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞，细胞变大，成上皮细胞样，排列规则?’人汗腺细胞，细胞较大，具有明显的上皮细胞形态，呈铺路石状生长，细胞排列整齐。人羊水干细胞经过汗腺诱导培养基诱导分化后得到的汗腺样细胞在形态上接近体外培养的人汗腺细胞。
[0030]人羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成汗腺样结构。冰上操作，非细胞胶和细胞胶的PH都调整为7 ;将非细胞胶铺满6孔板底部，室温静置20分钟，待其凝固；在细胞胶中加入两种细胞，分别是IxlO5的成纤维细胞和3x10 5的羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞；将混有细胞的细胞胶接种在非细胞胶上，置于培养箱中37度30分钟，待其凝固。
[0031]细胞胶凝固后加入含有50ng/ml EGF的Epilife培养基，培养基没过胶的表面，大约5ml ;隔天换液。定期取出胶，固定，组织化学染色，最后，20天后取出胶，固定，组织化学染色。
[0032]附图3为人羊水干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构，正常人汗腺组织为对照。可以看出，在胶中形成的汗腺样结构由6?15个细胞组成，且具有明显管腔结构，说明本发明方法形成的汗腺样结构与正常人汗腺组织极近似。
[0033]附图4为人羊水干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构形成官腔的过程。可以很明显的看出，汗腺样细胞在胶中增殖成团，随着时间推移，中间的细胞逐渐凋亡，形成管腔。
[0034]附图5为免疫荧光染色方法检测人羊水干细胞经诱导后得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构。虚线勾出汗腺样结构的轮廓，以及管腔。从图中可以看出，得到的汗腺样结构表达汗腺相关基因EDA，EDAR，CEA, K8，K18，Na-K-ATP, SMA。
[0035]实施例三:诱导多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成汗腺样结构采用实施例一的细胞胶与非细胞胶体系；所用非细胞胶与细胞胶中的collagen
(Sigma)和 matrigel (BD)体积比为 1:1。
[0036]诱导多潜能干细胞分化为汗腺样细胞。取I X 15个/孔的多潜能干细胞铺于6孔板中，使用多潜能干细胞培养基培养(含20%Knock0ut血清、1%非必需氨基酸、0.1mmol/L β-2-巯基乙醇、4 μ g/L FGF-based、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1U/L 青霉素和 0.lug/L 链霉素的DMED F12细胞培养基);24h后，待多潜能干细胞贴壁后，添加汗腺细胞诱导培养基；然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基；待诱导后的多潜能干细胞生长至汇合率为70%，吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，使用0.8mL 0.25%胰酶对细胞消化2分钟，使用含血清的培养基终止胰酶的作用，将消化下来的细胞吸入离心管中离心，1200转/分钟，离心5分钟。弃去上清，加入汗腺细胞诱导培养基，将细胞沉淀混匀，按I传4的比例接种细胞至新的培养皿中；重复以上步骤，诱导分化21天后得到汗腺样细胞，并对其进行汗腺指标的检测，利用汗腺细胞诱导培养基可以成功将多潜能干细胞诱导为汗腺样细胞。
[0037]在胶中形成汗腺样结构。冰上操作，非细胞胶和细胞胶的pH都调整为7 ;将非细胞胶铺满6孔板底部，室温静置30分钟，待其凝固；在细胞胶中加入两种细胞，分别是IxlO5的成纤维细胞和2xl05的多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞；将混有细胞的细胞胶接种在非细胞胶上，置于培养箱中37度25分钟，待其凝固。
[0038]细胞胶凝固后加入含有50ng/ml EGF的Epilife培养基，培养基没过胶的表面，大约5ml ;维持7天，胶稳定，隔天换液。定期取出胶，固定，组织化学染色，最后，18天后取出胶，固定，组织化学染色。
[0039]附图6为多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构，正常人汗腺组织为对照。在胶中形成的汗腺样结构由6~15个细胞组成，且具有明显管腔结构，说明本发明方法形成的汗腺样结构与正常人汗腺组织极近似。
[0040]附图7为多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程。汗腺样细胞在胶中增殖成团，中间的细胞逐渐凋亡，形成管腔。
[0041]附图8为免疫荧光染色方法检测多潜能干细胞诱导分化得到的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构。虚线勾出汗腺样结构的轮廓，以及管腔。从图中可以看出，得到的汗腺样结构表达汗腺相关基因EDA，EDAR，CEA, K8，K18，Na-K-ATP, SMA。
[0042]综上所述，可以使用本发明的在胶中形成汗腺样结构的方法，有效的将人汗腺细胞以及汗腺样细胞培养为汗腺样结构；在体外重建汗腺组织，为大面积烧伤病人的救治提供足够数量的汗腺，大大改善病人的生活质量。也为研宄汗腺的分化发育提供理论依据，具有潜在的临床应用前景。
【主权项】
1.一种在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于，包括以下步骤: (O调整非细胞胶的PH为7，然后于室温下凝固非细胞胶； (2)调整细胞胶的pH为7，然后将成纤维细胞与待诱导细胞加入细胞胶中；所述成纤细胞与待诱导细胞的数量比例为1: 2?3; (3)将步骤(2)的混有细胞的细胞胶接种在步骤(I)凝固的非细胞胶上，置于培养箱中，至细胞胶凝固； (4)细胞胶凝固后再加入培养基；隔日更换一次培养基，通过染色检测汗腺样结构的形成程度，最终得到汗腺样结构； 所述非细胞胶包含体积比为1:1的胶原与基质胶，还包含添加剂；以ImL胶原计，所述添加剂及其用量为: 1XMEM0.2mL L-谷氨酰胺1.8uL 胎牛血清0.24mL 氢氧化钠溶液12uL 所述细胞胶包含体积比为1:1的胶原与基质胶，还包含添加剂；以ImL胶原计，所述添加剂及其用量为: 10XMEM0.2mL L-谷氨酰胺18uL 胎牛血清0.24mL 氢氧化钠溶液20uL 所述培养基为含有50ng/mL表皮生长因子的上皮细胞培养液。2.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:所述待诱导细胞为人汗腺细胞或者汗腺样细胞。3.根据权利要求2所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:所述汗腺样细胞为由人羊水干细胞分化得到的汗腺样细胞或者由人多潜能细胞分化得到的汗腺样细胞。4.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:使用氢氧化钠调整非细胞胶与细胞胶的PH为7。5.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:步骤(3)中，非细胞胶与细胞胶的体积比为1: (2.5?3.5)。6.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1M。7.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:步骤(2)中，细胞胶中细胞的密度为IxlO5个/ml。8.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:步骤(3)中，培养箱中的温度为37 °C。9.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:步骤(4)中，培养基盖过细胞胶的表面。10.根据权利要求1所述在胶中形成汗腺样结构的方法，其特征在于:所述上皮细胞培养液为Epilife培养基。
【专利摘要】本发明公开了一种在胶中形成汗腺样结构的方法。具体为先将非细胞胶和细胞胶的pH都调整为7；将非细胞胶凝固；在细胞胶中加入两种细胞，分别是成纤维细胞和汗腺（样）细胞；将混有细胞的细胞胶接种在非细胞胶上，置于培养箱中37度30分钟，待其凝固。细胞胶凝固后加入含有50ng/ml EGF的Epilife培养基，培养基没过胶的表面，大约5ml；维持5-7天，待胶稳定，隔天换液。采用本发明的方法可使用汗腺细胞和汗腺样细胞在胶中形成符合正常人汗腺组织的汗腺样结构，为大面积烧伤病人的救治提供足够数量的汗腺组织，从而改善病人的生活质量。同时也为研究汗腺的分化发育提供了理论依据，具有潜在的临床应用前景。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN104894053
【申请号】CN201510277273
【发明人】张学光, 秦明德, 孙青 , 李芳 , 梁含思
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日
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