一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗...的制作方法
一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病 毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用，属于生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种利用生 物反应器全悬浮Marc-145细胞生产蓝耳病病毒的方法。
【背景技术】
[0002] Marc-145细胞即猴胚胎肾上皮细胞，来源于猴肾细胞，是母细胞（MA104细胞）的 克隆株，贴壁依赖性生长，可连续传代培养，无致瘤性，该细胞株经过数次悬浮驯化得到悬 浮适应株，可不依赖于载体悬浮生长。该细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)特别敏 感，目前广泛用于蓝耳病疫苗的生产。
[0003] 因原始Marc-145细胞贴壁依赖性生长，所以目前蓝耳病疫苗的生产主要采用传 统转瓶工艺，疫苗抗原制备的每个生产批次都需要几百甚至上千个转瓶，而每个转瓶是单 独的培养操作单元，在一个生产周期中每个转瓶要经过细胞接种、病毒接种、病毒收获三次 开口机会，这不仅劳动强度大污染机率高，而且因为每瓶细胞的质量、病毒含量不尽相同， 使得疫苗质量不稳定，批间差异大；另外，采用细胞转瓶培养工艺，不仅生产效率低，还易污 染，病毒滴度不稳定，这种传统工艺已无法满足规模化工业化生产需求，逐渐被自动化生产 替代。
[0004] 因 Marc-145细胞贴壁依赖性生长，目前蓝耳疫苗的自动化生产研宄主要是载体 依赖性细胞悬浮培养，专利公开号为CN102002482B "猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产 方法"与专利公开号为CN102552896B "一种利用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗 的方法"的专利均公开了纸片载体细胞培养生产蓝耳病病毒的方法；专利CN102038942B"应 用生物反应器工业化生产蓝耳病疫苗的方法"公开了利用微载体细胞悬浮培养方法生产蓝 耳病病毒的方法；微载体、纸片载体培养虽然自动化程度高，但细胞培养本质上还是贴壁培 养，载体成本相对高，大多数是一次性使用，而且细胞生长受载体等众多因素限制不能最大 化生长，细胞密度提高幅度有限，尤其是在工业生产放大方面载体悬浮培养一般培养体积 都在300升以下，这种先天缺陷限制了该技术的大规模化应用。
【发明内容】
[0005] 本发明为解决上述现有培养工艺的缺陷，提供一种生产成本低、可以规模化放大 培养的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫 苗中的应用。
[0006] 本发明采用以下技术方案解决现有技术中存在的问题： 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，命名为Marc-145S，已于2015年4月22 日在保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO !C201542。
[0007] 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在培养蓝耳病病毒中的应用。
[0008] 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在生产蓝耳病疫苗中的应用。
[0009] -种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病毒的方法，包括如下 步骤： (1) 将权利要求1所述的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株传代培养，然后接种 到生物反应器中悬浮培养，得到Marc-145细胞悬浮培养液； (2) 当Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度达到2-5X IO6个/ml时，接种蓝耳病病 毒； (3) 继续培养蓝耳病病毒，当活细胞密度低于0. 5X IO6个/ml时收获病毒液。
[0010] 步骤（1)中获得Marc-145细胞悬浮培养液包括以下步骤： ① 取液氮冻存的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，快速融化后加入盛有营养 液的摇瓶中，传代放大培养； ② 将步骤①中放大培养的Marc-145细胞悬浮适应株稀释至0. 5 X IO6个/ml的密度， 接种入生物反应器，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力。
[0011] 步骤（2)中接种蓝耳病毒：Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度大于3. OX IO6 个/ml，细胞活力大于90%时，利用旋转过滤器截留细胞，更换20-50%的营养液，最终为含 0. 5~2. 0%新生牛血清的营养液，将蓝耳病病毒接种入生物反应器中，接种剂量为培养基 终体积的I. 〇~5. 0%。
[0012] 所述的蓝耳病病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度多IO7 tlTCID5ci/ ml 〇
[0013] 所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。
[0014] 与现有技术相比，本发明公开的Marc-145悬浮适应株生产蓝耳病疫苗方法自动 化程度高，不需要载体介入，无需细胞胰酶消化传代，容易规模化放大，本发明简化蓝耳病 疫苗的生产工艺，降低其生产成本，提高了疫苗的质量，解决批间差异问题，拥有无可比拟 的工业化优势。
【附图说明】
[0015] 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，命名为Marc-145S，保藏在中国典型培 养物保藏中心，保藏日期为2015年4月22日，保藏编号为CCTCC NO !C201542。
[0016] 图1为Marc-145细胞悬浮生长曲线图。
[0017] 图2为Marc-145细胞接种蓝耳病毒前显微图片（100倍放大）。
[0018] 图3为Marc-145细胞接种蓝耳病毒后显微图片（100倍放大）。
【具体实施方式】
[0019] 以下是本发明具体的实施方案，以进一步阐述本发明，但不能解释为限制本发明 的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术 方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。
[0020] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0021] 实验涉及的主要生物材料和设备 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址 为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月22日，保藏编号为CCTCC NO :C201542。
[0022] 细胞生长培养基：GRH公司M3专用培养基，添加3%新生牛血清，细胞生长培养基 即是Marc-145细胞悬浮株摇瓶培养与生物反应器全悬浮培养所用的营养液； 病毒培养维持培养基：GRH公司M3专用培养基，添加1 %新生牛血清，病毒培养维持培 养基即是全悬浮培养的Marc-145细胞培养蓝耳病毒所用的营养液； 蓝耳病病毒：蓝耳病病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度大于等于 107_ciTCID5ciAil，本实验中选用TJM-92株，为市售商品活疫苗分离； 生物反应器：美国NBS 14升生物反应器。
[0023] 实施例1 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株扩增培养 将保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :C201542的猴胚胎肾上皮 细胞Marc-14 5悬浮适应株传代培养，然后接种到生物反应器中悬浮培养，得到Marc-145细 胞悬浮培养液，具体步骤如下： ① 取液氮冻存的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，快速融化后加入盛有营养 液的摇瓶中，于36~37°C培养60~72h，按照1:3~1:5的比例传代放大培养； ② 将步骤①中放大培养的Marc-145细胞悬浮适应株稀释至0. 5 X IO6个/ml的密度， 接种入生物反应器，培养温度为36~37 °C，pH值为6. 8~7. 2,溶氧为40%~70%，细胞生 长曲线如图1所示； ③ 生物反应器中细胞密度的测定：用生物反应器连续培养三个批次Marc-145细胞，在 培养的第72小时采样，细胞离心后用胰酶消化，用台盼兰染色法检测细胞密度，实验结果 如表1所示。
[0024] 表 1
实施例2 不同接种剂量培养蓝耳病病毒的滴度比较 用5个500ml摇瓶培养Marc-145悬浮细胞，接种细胞均为0. 58 X IO6个/ml，在相同培 养条件下培养72小时，细胞密度均扩增到大于3 X IO6个/ml时，按照培养基终体积的1. 0%、 2. 0%、3. 0%、4. 0%、5. 0%接种蓝耳病毒TJM-92株，活细胞密度低于0. 5X IO6个/ml时收获病 毒。按照常规方法测定病毒滴度（TCID5cZml)，结果见表2。 表2
[0025] 实施例3 不同培养方式培养蓝耳病病毒滴度的比较 选用生长良好的贴壁Marc-145细胞2个转瓶，选用2个500ml摇瓶培养Marc-145悬浮 细胞，待转瓶细胞长满单层，摇瓶细胞密度大于3 X IO6个/ml后，按照培养基终体积的3. 0% 接种蓝耳病毒TJM-92株，待转瓶细胞CPE达70%时，摇瓶细胞密度小于0. 5 X IO6个/ml时 分别收获病毒液，冻融2次后，测定病毒滴度（TCID5tZml)，结果见表3所示。 表3
[0026] 实施例4 全悬浮Marc-145细胞培养蓝耳病病毒 当生物反应器中悬浮培养的Marc-145细胞密度扩增到2-5X IO6个/ml时，接种蓝耳 病病毒，具体步骤为：Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度大于3. OX IO6个/ml，细胞活 力大于90%时，利用旋转过滤器截留细胞，更换反应器中20-50%的营养液，最终为含0. 5~ 2. 0%新生牛血清的营养液，将蓝耳病毒接种入生物反应器中，接种剂量为培养基终体积的 1. 0~5. 0%，所述蓝耳病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度彡107_°TCID5(l/ml。 在35 °C~37 °C，pH值为6. 8~7. 2,溶氧为40%~70%培养蓝耳病病毒36~72h，活细胞 密度低于〇. 5X IO6个/ml时收获病毒。Marc-145细胞接种蓝耳病毒前后的显微图片如图 2、 图3所示，从图中可以看出接毒后的细胞密度降低幅度大，细胞病变明显；3个批次的培 养滴度见表4。 表4
[0027] 实施例5 蓝耳病疫苗的制备 按照实施例4连续制备3批次蓝耳病病毒液，收获病毒液作为制苗用抗原液，测定病毒 含量（TCID5cZml)，同时抽样参照《高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM-F92株)》质量 标准进行半成品检验，合格后按一定比例稀释并加入20%耐热冻干保护剂，混匀后定量分 装，于冻干机内进行冷冻真空干燥。疫苗成品参照我国现行《高致病性猪繁殖与呼吸综合征 活疫苗（TJM-F92株)》质量标准进行检验，各项指标均合格。
【主权项】
1. 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，其特征在于：命名为Marc-145S，已于 2015年4月22日在保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO!C201542。2. 权利要求1所述的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在培养蓝耳病病毒中的 应用。3. 权利要求1所述的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在生产蓝耳病疫苗中的 应用。4. 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病毒的方法，其特征在于， 包括如下步骤： 将权利要求1所述的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株传代培养，然后接种到生 物反应器中悬浮培养，得到Marc-145细胞悬浮培养液； 当Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度达到2-5 XIO6个/ml时，接种蓝耳病病毒； 继续培养蓝耳病病毒，当活细胞密度低于〇. 5XIO6个/ml时收获病毒液。5. 根据权利要求4所述的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病 毒的方法，其特征在于，步骤（1)中获得Marc-145细胞悬浮培养液包括以下步骤： ① 取液氮冻存的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，快速融化后加入盛有营养 液的摇瓶中，传代放大培养； ② 将步骤①中放大培养的Marc-145细胞悬浮适应株稀释至0. 5 XIO6个/ml的密度， 接种入生物反应器，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力。6. 根据权利要求4所述的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病 毒的方法，其特征在于：步骤（2)中接种蓝耳病毒：Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度大 于3.OXIO6个/ml，细胞活力大于90%时，利用旋转过滤器截留细胞，更换20-50%的营养 液，最终为含0. 5~2. 0%新生牛血清的营养液，将蓝耳病病毒接种入生物反应器中，接种剂 量为培养基终体积的I. 〇~5. 0%。7. 根据权利要求4所述的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病 病毒的方法，其特征在于：所述的蓝耳病病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度 彡IO7.0TCID50AiI〇8. 根据权利要求4所述的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病 毒的方法，其特征在于：所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。
【专利摘要】本发明涉及猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用，生物技术领域。本发明属于公开的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201542，本发明还公开了利用所述Marc-145细胞悬浮适应株培养蓝耳病病毒的方法。本发明提供的Marc-145细胞悬浮适应株实现了Marc-145细胞在培养基中的全悬浮培养，因而采用本发明的Marc-145细胞悬浮适应株生产蓝耳病病毒，在工业生产中易于用生物反应器逐级放大，实现蓝耳病疫苗大批量生产，相较于现有的转瓶、载体悬浮培养技术，本发明简化了生产工艺，缩短生产周期，降低生产成本，进一步提高了蓝耳病疫苗的质量和产量。CCTCC NO：C20154220150504
【IPC分类】C12N5/071, C12N7/00, C12R1/93
【公开号】CN104894054
【申请号】CN201510286081
【发明人】李少英, 徐树兰
【申请人】郑州爱科生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病 毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用，属于生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种利用生 物反应器全悬浮Marc-145细胞生产蓝耳病病毒的方法。
【背景技术】
[0002] Marc-145细胞即猴胚胎肾上皮细胞，来源于猴肾细胞，是母细胞（MA104细胞）的 克隆株，贴壁依赖性生长，可连续传代培养，无致瘤性，该细胞株经过数次悬浮驯化得到悬 浮适应株，可不依赖于载体悬浮生长。该细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)特别敏 感，目前广泛用于蓝耳病疫苗的生产。
[0003] 因原始Marc-145细胞贴壁依赖性生长，所以目前蓝耳病疫苗的生产主要采用传 统转瓶工艺，疫苗抗原制备的每个生产批次都需要几百甚至上千个转瓶，而每个转瓶是单 独的培养操作单元，在一个生产周期中每个转瓶要经过细胞接种、病毒接种、病毒收获三次 开口机会，这不仅劳动强度大污染机率高，而且因为每瓶细胞的质量、病毒含量不尽相同， 使得疫苗质量不稳定，批间差异大；另外，采用细胞转瓶培养工艺，不仅生产效率低，还易污 染，病毒滴度不稳定，这种传统工艺已无法满足规模化工业化生产需求，逐渐被自动化生产 替代。
[0004] 因 Marc-145细胞贴壁依赖性生长，目前蓝耳疫苗的自动化生产研宄主要是载体 依赖性细胞悬浮培养，专利公开号为CN102002482B "猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产 方法"与专利公开号为CN102552896B "一种利用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗 的方法"的专利均公开了纸片载体细胞培养生产蓝耳病病毒的方法；专利CN102038942B"应 用生物反应器工业化生产蓝耳病疫苗的方法"公开了利用微载体细胞悬浮培养方法生产蓝 耳病病毒的方法；微载体、纸片载体培养虽然自动化程度高，但细胞培养本质上还是贴壁培 养，载体成本相对高，大多数是一次性使用，而且细胞生长受载体等众多因素限制不能最大 化生长，细胞密度提高幅度有限，尤其是在工业生产放大方面载体悬浮培养一般培养体积 都在300升以下，这种先天缺陷限制了该技术的大规模化应用。
【发明内容】
[0005] 本发明为解决上述现有培养工艺的缺陷，提供一种生产成本低、可以规模化放大 培养的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫 苗中的应用。
[0006] 本发明采用以下技术方案解决现有技术中存在的问题： 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，命名为Marc-145S，已于2015年4月22 日在保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO !C201542。
[0007] 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在培养蓝耳病病毒中的应用。
[0008] 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在生产蓝耳病疫苗中的应用。
[0009] -种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病毒的方法，包括如下 步骤： (1) 将权利要求1所述的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株传代培养，然后接种 到生物反应器中悬浮培养，得到Marc-145细胞悬浮培养液； (2) 当Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度达到2-5X IO6个/ml时，接种蓝耳病病 毒； (3) 继续培养蓝耳病病毒，当活细胞密度低于0. 5X IO6个/ml时收获病毒液。
[0010] 步骤（1)中获得Marc-145细胞悬浮培养液包括以下步骤： ① 取液氮冻存的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，快速融化后加入盛有营养 液的摇瓶中，传代放大培养； ② 将步骤①中放大培养的Marc-145细胞悬浮适应株稀释至0. 5 X IO6个/ml的密度， 接种入生物反应器，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力。
[0011] 步骤（2)中接种蓝耳病毒：Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度大于3. OX IO6 个/ml，细胞活力大于90%时，利用旋转过滤器截留细胞，更换20-50%的营养液，最终为含 0. 5~2. 0%新生牛血清的营养液，将蓝耳病病毒接种入生物反应器中，接种剂量为培养基 终体积的I. 〇~5. 0%。
[0012] 所述的蓝耳病病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度多IO7 tlTCID5ci/ ml 〇
[0013] 所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。
[0014] 与现有技术相比，本发明公开的Marc-145悬浮适应株生产蓝耳病疫苗方法自动 化程度高，不需要载体介入，无需细胞胰酶消化传代，容易规模化放大，本发明简化蓝耳病 疫苗的生产工艺，降低其生产成本，提高了疫苗的质量，解决批间差异问题，拥有无可比拟 的工业化优势。
【附图说明】
[0015] 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，命名为Marc-145S，保藏在中国典型培 养物保藏中心，保藏日期为2015年4月22日，保藏编号为CCTCC NO !C201542。
[0016] 图1为Marc-145细胞悬浮生长曲线图。
[0017] 图2为Marc-145细胞接种蓝耳病毒前显微图片（100倍放大）。
[0018] 图3为Marc-145细胞接种蓝耳病毒后显微图片（100倍放大）。
【具体实施方式】
[0019] 以下是本发明具体的实施方案，以进一步阐述本发明，但不能解释为限制本发明 的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术 方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。
[0020] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0021] 实验涉及的主要生物材料和设备 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址 为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2015年4月22日，保藏编号为CCTCC NO :C201542。
[0022] 细胞生长培养基：GRH公司M3专用培养基，添加3%新生牛血清，细胞生长培养基 即是Marc-145细胞悬浮株摇瓶培养与生物反应器全悬浮培养所用的营养液； 病毒培养维持培养基：GRH公司M3专用培养基，添加1 %新生牛血清，病毒培养维持培 养基即是全悬浮培养的Marc-145细胞培养蓝耳病毒所用的营养液； 蓝耳病病毒：蓝耳病病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度大于等于 107_ciTCID5ciAil，本实验中选用TJM-92株，为市售商品活疫苗分离； 生物反应器：美国NBS 14升生物反应器。
[0023] 实施例1 猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株扩增培养 将保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :C201542的猴胚胎肾上皮 细胞Marc-14 5悬浮适应株传代培养，然后接种到生物反应器中悬浮培养，得到Marc-145细 胞悬浮培养液，具体步骤如下： ① 取液氮冻存的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，快速融化后加入盛有营养 液的摇瓶中，于36~37°C培养60~72h，按照1:3~1:5的比例传代放大培养； ② 将步骤①中放大培养的Marc-145细胞悬浮适应株稀释至0. 5 X IO6个/ml的密度， 接种入生物反应器，培养温度为36~37 °C，pH值为6. 8~7. 2,溶氧为40%~70%，细胞生 长曲线如图1所示； ③ 生物反应器中细胞密度的测定：用生物反应器连续培养三个批次Marc-145细胞，在 培养的第72小时采样，细胞离心后用胰酶消化，用台盼兰染色法检测细胞密度，实验结果 如表1所示。
[0024] 表 1
实施例2 不同接种剂量培养蓝耳病病毒的滴度比较 用5个500ml摇瓶培养Marc-145悬浮细胞，接种细胞均为0. 58 X IO6个/ml，在相同培 养条件下培养72小时，细胞密度均扩增到大于3 X IO6个/ml时，按照培养基终体积的1. 0%、 2. 0%、3. 0%、4. 0%、5. 0%接种蓝耳病毒TJM-92株，活细胞密度低于0. 5X IO6个/ml时收获病 毒。按照常规方法测定病毒滴度（TCID5cZml)，结果见表2。 表2
[0025] 实施例3 不同培养方式培养蓝耳病病毒滴度的比较 选用生长良好的贴壁Marc-145细胞2个转瓶，选用2个500ml摇瓶培养Marc-145悬浮 细胞，待转瓶细胞长满单层，摇瓶细胞密度大于3 X IO6个/ml后，按照培养基终体积的3. 0% 接种蓝耳病毒TJM-92株，待转瓶细胞CPE达70%时，摇瓶细胞密度小于0. 5 X IO6个/ml时 分别收获病毒液，冻融2次后，测定病毒滴度（TCID5tZml)，结果见表3所示。 表3
[0026] 实施例4 全悬浮Marc-145细胞培养蓝耳病病毒 当生物反应器中悬浮培养的Marc-145细胞密度扩增到2-5X IO6个/ml时，接种蓝耳 病病毒，具体步骤为：Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度大于3. OX IO6个/ml，细胞活 力大于90%时，利用旋转过滤器截留细胞，更换反应器中20-50%的营养液，最终为含0. 5~ 2. 0%新生牛血清的营养液，将蓝耳病毒接种入生物反应器中，接种剂量为培养基终体积的 1. 0~5. 0%，所述蓝耳病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度彡107_°TCID5(l/ml。 在35 °C~37 °C，pH值为6. 8~7. 2,溶氧为40%~70%培养蓝耳病病毒36~72h，活细胞 密度低于〇. 5X IO6个/ml时收获病毒。Marc-145细胞接种蓝耳病毒前后的显微图片如图 2、 图3所示，从图中可以看出接毒后的细胞密度降低幅度大，细胞病变明显；3个批次的培 养滴度见表4。 表4
[0027] 实施例5 蓝耳病疫苗的制备 按照实施例4连续制备3批次蓝耳病病毒液，收获病毒液作为制苗用抗原液，测定病毒 含量（TCID5cZml)，同时抽样参照《高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM-F92株)》质量 标准进行半成品检验，合格后按一定比例稀释并加入20%耐热冻干保护剂，混匀后定量分 装，于冻干机内进行冷冻真空干燥。疫苗成品参照我国现行《高致病性猪繁殖与呼吸综合征 活疫苗（TJM-F92株)》质量标准进行检验，各项指标均合格。
【主权项】
1. 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，其特征在于：命名为Marc-145S，已于 2015年4月22日在保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO!C201542。2. 权利要求1所述的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在培养蓝耳病病毒中的 应用。3. 权利要求1所述的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株在生产蓝耳病疫苗中的 应用。4. 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病毒的方法，其特征在于， 包括如下步骤： 将权利要求1所述的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株传代培养，然后接种到生 物反应器中悬浮培养，得到Marc-145细胞悬浮培养液； 当Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度达到2-5 XIO6个/ml时，接种蓝耳病病毒； 继续培养蓝耳病病毒，当活细胞密度低于〇. 5XIO6个/ml时收获病毒液。5. 根据权利要求4所述的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病 毒的方法，其特征在于，步骤（1)中获得Marc-145细胞悬浮培养液包括以下步骤： ① 取液氮冻存的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，快速融化后加入盛有营养 液的摇瓶中，传代放大培养； ② 将步骤①中放大培养的Marc-145细胞悬浮适应株稀释至0. 5 XIO6个/ml的密度， 接种入生物反应器，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力。6. 根据权利要求4所述的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病 毒的方法，其特征在于：步骤（2)中接种蓝耳病毒：Marc-145细胞悬浮培养液中细胞密度大 于3.OXIO6个/ml，细胞活力大于90%时，利用旋转过滤器截留细胞，更换20-50%的营养 液，最终为含0. 5~2. 0%新生牛血清的营养液，将蓝耳病病毒接种入生物反应器中，接种剂 量为培养基终体积的I. 〇~5. 0%。7. 根据权利要求4所述的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病 病毒的方法，其特征在于：所述的蓝耳病病毒为猪蓝耳病活疫苗或灭活疫苗种毒，病毒滴度 彡IO7.0TCID50AiI〇8. 根据权利要求4所述的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株培养蓝耳病病 毒的方法，其特征在于：所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。
【专利摘要】本发明涉及猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用，生物技术领域。本发明属于公开的一种猴胚胎肾上皮细胞Marc-145悬浮适应株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201542，本发明还公开了利用所述Marc-145细胞悬浮适应株培养蓝耳病病毒的方法。本发明提供的Marc-145细胞悬浮适应株实现了Marc-145细胞在培养基中的全悬浮培养，因而采用本发明的Marc-145细胞悬浮适应株生产蓝耳病病毒，在工业生产中易于用生物反应器逐级放大，实现蓝耳病疫苗大批量生产，相较于现有的转瓶、载体悬浮培养技术，本发明简化了生产工艺，缩短生产周期，降低生产成本，进一步提高了蓝耳病疫苗的质量和产量。CCTCC NO：C20154220150504
【IPC分类】C12N5/071, C12N7/00, C12R1/93
【公开号】CN104894054
【申请号】CN201510286081
【发明人】李少英, 徐树兰
【申请人】郑州爱科生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
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