神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用
神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及神经鞘氨醇磷酸胆碱（sphingosylphosphorylcholine，SPC)的新应 用，尤其涉及神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的 应用。
【背景技术】
[0002] 神经鞘氨醇磷酸胆碱（sphingosylphosphorylcholine，SPC)分子式为： C2AgN2O5P，分子量为：464. 62,结构式如下：
[0003]
[0004] SPC是一种具有生物活性的鞘磷脂，天然存在于血液内，是高密度脂蛋白（HDL)和 低密度脂蛋白的组成成分。SPC除了作为生物膜的组成成分外，也可以作为调节细胞外和 细胞内信号转导的信号分子存在。已有报道表明，SPC能抑制血管平滑肌细胞痉挛，调节血 管内皮细胞的凋亡，分化和增殖，表现出对心血管细胞的重要生物学活性。例如SPC结合 HDL后可以显著地降低小鼠瞬时心脏缺血/再灌注模型中心脏梗死面积，保护心脏免受心 肌缺血和再灌注中的伤害并产生抗炎症与抗凋亡作用。但是在已公开的报道中有关SPC在 干细胞分化过程中的研宄甚少，虽有报道SPC可以诱导间充质干细胞向血管平滑肌细胞分 化，但对于SPC在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用目前国内外尚 未见报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种神经鞘氨醇磷酸胆碱 (SPC)在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。
[0006] 本发明所述神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱 系细胞药物中的应用。
[0007] 其中：有效促进内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞的神经鞘氨醇磷酸胆碱 (SPC)浓度优选为5 μ M。
[0008] 本发明提供的SPC的应用为研制开发促心肌分化的新型药物奠定了基础。本发明 所述的SPC还可以作为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制的研宄。
[0009] 为了更好地理解本发明的实质，下面结合SPC的药理实验和细胞生物学和分子生 物学的方法及结果来阐明其在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。
[0010] 1.内源性Sca-r心脏干细胞的制备：以磁珠分选法提取并培养小鼠的sea-ι +心 脏干细胞。
[0011] 结果显示：第一代（Pl)细胞Sca-r阳性率为84. 8%，第五代（P5) 96. 8%，Sca-I + 细胞⑶34阳性率约0. 8%，⑶45阳性率约3. 5-7. 3%。表明该制备方法提取的细胞为Sca-Γ 的心脏干细胞，而非造血干细胞。
[0012] 2.本发明所述SPC药用溶液的制备：配制为5mg/ml的储液。
[0013] 3.倒置相差显微镜下定时观察SPC对心脏干细胞形态的影响。
[0014] 结果表明：与溶剂对照组和正常组相比，5 μ M的SPC可以促进sca-Γ心脏干细胞 拉长。
[0015] 4. QPCR检测心肌细胞标志物mRNA水平的变化。
[0016] 结果表明：5μΜ SPC处理2-3周能显著上调心肌细胞的marker Gata4, Nkx2.5， CTnt，Mef2c等的表达。
[0017] 5.激光共聚焦技术检测结合western blot，检测心肌细胞标志物蛋白水平变化。
[0018] 结果表明：5μΜ SPC能促进细胞内应力纤维的形成，并上调CTnt的蛋白水平表 达。
[0019] 另外，5 μ M SPC能显著促进心肌特异性转录因子GATA4的入核。
[0020] 6. QPCR及流式细胞术从mRNA及蛋白水平检测内皮细胞标志物的变化
[0021] 结果表明：5μΜ SPC处理2-3周能显著上调内皮细胞的marker⑶31及vWF等 mRNA水平的表达，及⑶31蛋白水平的表达。
[0022] 由上述实验及其结果，可以得出如下结论：
[0023] 分别用不同浓度的SPC处理Sca-Γ心脏干细胞2, 3,6周的结果显示，5 μΜ的SPC 处理sca-Γ心脏干细胞2-3周相对于其他浓度，能明显的促进心脏干细胞向心脏谱系的细 胞分化。而SPC处理6周以后促进分化的作用不是很明显。所以本说明书所确立的SPC应 用浓度时5 μ M，处理时间为2-3周，即从2周开始就会出现心脏干细胞的分化。因此本发 明为研宄内源鞘磷脂类诱导心脏干细胞分化的机制提供了理论和实验依据，本发明涉及的 SPC可以作为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制研宄，同时本发明为 研制开发有关促心肌再生的新生药物奠定了基础，为临床药物的开发应用提供了可靠的理 论依据。
【附图说明】
[0024] 图1 :为分离的sca-Γ心脏干细胞纯度。Pl，Ρ5表示传代次数。
[0025] 图2 :为sca-Γ心脏干细胞在正常培养条件下，倒置相差显微镜下显示的SPC处理 2-3周后细胞的形态变化图。
[0026] 其中：nor :正常培养组
[0027] ctr :溶剂对照组
[0028] spc :5 μ M SPC 处理组
[0029] 图3 :是SPC处理sca-Γ心脏干细胞后，心肌细胞特异性marker的mRNA水平的变 化。
[0030] 其中：
[0031] A. 1，2,5μΜ SPC处理心脏干细胞3周，QPCR检测心肌细胞转录因子gata4，Nkx2. 5 表达水平的变化。确立有效的诱导浓度为5 μ Μ。
[0032] Β.以5μΜ SPC处理sca-Γ心脏干细胞2,3,6周，再次检测心肌细胞转录因子 gata4, Nkx2. 5表达水平的变化。确立有效的诱导时间为2-3周。
[0033] C.以5 μΜ SPC处理sca-Γ心脏干细胞2-3周，检测其它心肌细胞marker CTnt， Mef2c的mRNA水平的变化。
[0034] 图4 :是SPC处理sca-Γ心脏干细胞后，心肌细胞特异性marker在细胞内的分布 及蛋白水平的变化。
[0035] 其中：ctr :溶剂对照组；spc :5 μM SPC处理组。
[0036] Α.激光扫描共聚焦显微镜结合免疫焚光化学显不5 μ M SPC对cTnt的细胞内分布 的影响。
[0037] B. Western blot 显示 5 μ M SPC 能促进 cTnt 的表达。ctr :溶剂对照组；spc :5 μ M SPC处理组。
[0038] C.激光扫描共聚焦显微镜结合免疫荧光化学显示5 μ M SPC促进细胞特异性转录 因子Gata4的入核。
[0039] D.柱形图分析显示对照组Gata4的入核率约为20%，SPC处理组Gata4的入核率 约为80%。
[0040] 图5 :是SPC处理sca-Γ心脏干细胞后，内皮细胞特异性marker在mRNA及蛋白水 平的变化。
[0041] 其中：nor :正常培养组；ctr :溶剂对照组；spc :SPC处理组。
[0042] A. QPCR检测不同浓度SPC处理sca-Γ心脏干细胞不同时间对CD31及vWF mRNA 水平的影响。确立有效的浓度为5 μ M，有效的作用时间为2-3周。
[0043] Β. 5 μ M SPC处理3周，流式细胞仪检测SPC对CD31的影响。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1Sca-I+心脏干细胞的提取及流式细胞仪检测其纯度
[0045] ①10周龄左右的C57/BL小鼠断颈处死，迅速用酒精消毒取心脏，清洗，剪碎，剪到 大约Imm 3大小。
[0046] ②37°C胰酶液消化30min。
[0047] ③消化完加少许胎牛血清终止消化，用200目的细胞筛过滤，加入少量的cell staining buffer悬浮过滤的细胞，进行细胞计数。
[004 8] ④将滤液350g离心8min，用cell staining buffer重悬细胞，使密度达到 2X l〇Vml，向溶液中加入生物素标记的sca-Ι抗体.，每IX IO7个细胞加5 μ 1抗体，冰上 孵育20min。
[0049] ⑤用过量体积的IxBD IMagTXbuffer洗绦标记的细胞，350g,离心8min,并小心吸 去上清。
[0050] ⑥彻底祸旋 BD IMagTX Streptavidin Partides Plus-DM，每 I X IO7个细胞加 25μ1，混匀，然后4°C孵育45min。
[0051] ⑦用 I X BD MagTXbuf f er，将标签量提高到 20-80 X 106/ml。
[0052] ⑧将EP管移到BD MagTX架上，吸附8min。（不超过lml)，吸出上清，再次加入 IxBD MagTXbuffer，轻轻重悬，再放架子上吸附8min。重复该步骤，用培养基悬浮细胞，将 细胞移入24孔板内培养。选取1-5代生长状态良好的、且处于对数生长期的细胞备用。
[0053] ⑨对第一代，第五代心脏干细胞进行流式检测干细胞纯度。收集细胞，300g，离心 5min 去除废液，用 cell staining buffer 重悬细胞，加入 PE-Cy5-〇)45 抗体，FITC-sca-1+ 抗体，PE-Q334抗体冰上染色30min，300g离心5min，洗两次，最后再次加入cell staining buffer重悬细胞，利用流式细胞术检测（结果见图I)
[0054] 结果显示：第一代（Pl)细胞Sca-Γ阳性率为84. 8%，第五代（P5) 96. 8%，Sca-I + 细胞⑶34阳性率约0. 8%，⑶45阳性率约3. 5-7. 3%。表明我们提取的细胞为Sca-Γ的心 脏干细胞，而非造血干细胞。
[0055] 实施例2 SPC储液的配制
[0056] 由sigma公司提供的SPC粉末配制浓度为5mg/ml的储液，分装到I. 5ml的 eppendorf管中，用液氮吹干，-20°C储存。
[0057] 实施例3 SPC对sca-Γ心脏干细胞形态影响的检测
[0058] 将提取出的sca-Γ心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含 有生长因子和10%胎牛血清的頂DM培养，长满后进行传代，取1-5代干细胞用于实验。将 贴壁24小时的细胞加入不同浓度（1，2, 5 μ M)的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对 照组，而不做任何处理的作为正常组。培养条件：37°C，CO2孵箱内培养。
[0059] 每隔三天换一次培养液并持续加入所述浓度的SPC，培养2-3周后在倒置相差显 微镜下定时观察（结果见图2)。
[0060] 结果表明：与正常组和溶剂对照组相比，5 μΜ SPC处理细胞2-3周，细胞拉长变 细。
[0061] 实施例4心肌细胞标志物RNA水平的检测
[0062] 将提取出的sca-Γ心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含 有生长因子和10%胎牛血清的頂DM培养24小时。待细胞贴壁后，弃废液，用IXPBS清洗， 加入新鲜培养液，并分别加入1，2, 5 μ M的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照组， 而不做任何处理的作为正常组。培养条件：37°C，CO2孵箱内培养。
[0063] 每隔三天换一次培养液并持续加入所述浓度的SPC，培养2-3周后加入trizol，提 取总RNA，反转录出cDNA，进行QPCR检测mRNA水平的变化（结果见图3)。
[0064] 结果表明：5μΜ的SPC处理2-3周可以有效的上调心肌细胞marker CTnt，GATA4， Mef2c，Nkx2. 5 的 mRNA 的表达。**ρ〈0· 01。
[0065] 实施例5心肌细胞标志物蛋白水平的检测
[0066] 将提取出的sca-Γ心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含 有生长因子和10%胎牛血清的頂DM培养24小时。待细胞贴壁后，弃废液，用IXPBS清洗， 加入新鲜培养液，并加入5 μ M的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照组。
[0067] ①弃废液，0.1 XPBS清洗三遍后，用4%的多聚甲醛固定15分钟，清洗后，山羊血 清封闭20分钟，加入CTnt的一抗4°C孵育过夜，0.1 XPBS清洗三遍后，加入二抗，37°C孵育 lh，清洗后，在激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞标志物一一CTnt的分布变化。
[0068] ②提取总蛋白，western blot检测心肌细胞marker CTnt的蛋白水平。
[0069] ③弃废液，0.1 XPBS清洗三遍后，用4%的多聚甲醛固定15分钟，清洗后，山羊血 清封闭20分钟，加入GATA4的一抗4°C孵育过夜，0.1 XPBS清洗三遍后，加入二抗，37°C孵 育lh，清洗后，在激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞标志物一一GATA4的分布变化。
[0070] ④随便选取6张 GATA4免疫荧光的图片，计算其入核率。（结果见图4)。
[0071] 结果表明：5 μΜ的SPC能促进细胞内应力纤维的形成，并上调的心肌细胞marker CTnT。另外，激光扫描共聚焦显微镜结合免疫荧光化学显示5 μΜ SPC促进细胞特异性转录 因子Gata4的入核；柱形图分析显示对照组GATA4的入核率约为20 %，SPC处理组GATA4的 入核率约为80%。#ρ〈0·01。
[0072] 实施例6内皮细胞特异性marker的RNA及蛋白水平的检测
[0073] 将提取出的sca-Ι+心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含 有生长因子和10%胎牛血清的頂DM培养24小时。待细胞贴壁后，弃废液，用IXPBS清洗， 加入新鲜培养液，并加入1，2, 5 μ M的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照组。而不 做任何处理的作为正常组。培养条件：37°C，5% 0)2培养箱内培养。
[0074] ①每隔三天换一次培养液并持续加入所述浓度的SPC，培养2-3周后加入trizol， 提取总RNA，反转录出cDNA，进行QPCR检测mRNA水平的变化。
[0075] ②5μΜ SPC处理sca-Ι+心脏干细胞3周，收集细胞，300g，离心5min去除废液， 用cell staining buffer重悬细胞，加入FITC-sca-Γ抗体，PE-〇)31抗体冰上染色30min， 300g离心5min，洗两次，最后再次加入cell staining buffer重悬细胞，利用流式细胞术 检测（结果见图5)。
[0076] 结果表明：QPCR检测不同浓度SPC处理sca-Γ心脏干细胞不同时间对⑶31及vWF mRNA水平的影响。确立有效的浓度为5 μ M，有效的作用时间为2-3周。*p〈0. 05, **p〈0. 01。 5 μΜ SPC处理3周，流式细胞术表明SPC促进内皮细胞marker⑶31的蛋白质水平的表达。
【主权项】
1. 一种神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药 物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征是：有效促进内源心脏干细胞分化为心脏谱系细 胞的神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)浓度为5yM。
【专利摘要】本发明公开了一种神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用；其中有效促进内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞的神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)浓度为5μM。本发明提供的应用为研制开发促心肌分化的新型药物奠定了基础，所述神经鞘氨醇磷酸胆碱还可作为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制的研究。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN104894058
【申请号】CN201510376913
【发明人】赵静, 张尚立, 李文静
【申请人】山东大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月1日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及神经鞘氨醇磷酸胆碱（sphingosylphosphorylcholine，SPC)的新应 用，尤其涉及神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的 应用。
【背景技术】
[0002] 神经鞘氨醇磷酸胆碱（sphingosylphosphorylcholine，SPC)分子式为： C2AgN2O5P，分子量为：464. 62,结构式如下：
[0003]
[0004] SPC是一种具有生物活性的鞘磷脂，天然存在于血液内，是高密度脂蛋白（HDL)和 低密度脂蛋白的组成成分。SPC除了作为生物膜的组成成分外，也可以作为调节细胞外和 细胞内信号转导的信号分子存在。已有报道表明，SPC能抑制血管平滑肌细胞痉挛，调节血 管内皮细胞的凋亡，分化和增殖，表现出对心血管细胞的重要生物学活性。例如SPC结合 HDL后可以显著地降低小鼠瞬时心脏缺血/再灌注模型中心脏梗死面积，保护心脏免受心 肌缺血和再灌注中的伤害并产生抗炎症与抗凋亡作用。但是在已公开的报道中有关SPC在 干细胞分化过程中的研宄甚少，虽有报道SPC可以诱导间充质干细胞向血管平滑肌细胞分 化，但对于SPC在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用目前国内外尚 未见报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种神经鞘氨醇磷酸胆碱 (SPC)在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。
[0006] 本发明所述神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱 系细胞药物中的应用。
[0007] 其中：有效促进内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞的神经鞘氨醇磷酸胆碱 (SPC)浓度优选为5 μ M。
[0008] 本发明提供的SPC的应用为研制开发促心肌分化的新型药物奠定了基础。本发明 所述的SPC还可以作为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制的研宄。
[0009] 为了更好地理解本发明的实质，下面结合SPC的药理实验和细胞生物学和分子生 物学的方法及结果来阐明其在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。
[0010] 1.内源性Sca-r心脏干细胞的制备：以磁珠分选法提取并培养小鼠的sea-ι +心 脏干细胞。
[0011] 结果显示：第一代（Pl)细胞Sca-r阳性率为84. 8%，第五代（P5) 96. 8%，Sca-I + 细胞⑶34阳性率约0. 8%，⑶45阳性率约3. 5-7. 3%。表明该制备方法提取的细胞为Sca-Γ 的心脏干细胞，而非造血干细胞。
[0012] 2.本发明所述SPC药用溶液的制备：配制为5mg/ml的储液。
[0013] 3.倒置相差显微镜下定时观察SPC对心脏干细胞形态的影响。
[0014] 结果表明：与溶剂对照组和正常组相比，5 μ M的SPC可以促进sca-Γ心脏干细胞 拉长。
[0015] 4. QPCR检测心肌细胞标志物mRNA水平的变化。
[0016] 结果表明：5μΜ SPC处理2-3周能显著上调心肌细胞的marker Gata4, Nkx2.5， CTnt，Mef2c等的表达。
[0017] 5.激光共聚焦技术检测结合western blot，检测心肌细胞标志物蛋白水平变化。
[0018] 结果表明：5μΜ SPC能促进细胞内应力纤维的形成，并上调CTnt的蛋白水平表 达。
[0019] 另外，5 μ M SPC能显著促进心肌特异性转录因子GATA4的入核。
[0020] 6. QPCR及流式细胞术从mRNA及蛋白水平检测内皮细胞标志物的变化
[0021] 结果表明：5μΜ SPC处理2-3周能显著上调内皮细胞的marker⑶31及vWF等 mRNA水平的表达，及⑶31蛋白水平的表达。
[0022] 由上述实验及其结果，可以得出如下结论：
[0023] 分别用不同浓度的SPC处理Sca-Γ心脏干细胞2, 3,6周的结果显示，5 μΜ的SPC 处理sca-Γ心脏干细胞2-3周相对于其他浓度，能明显的促进心脏干细胞向心脏谱系的细 胞分化。而SPC处理6周以后促进分化的作用不是很明显。所以本说明书所确立的SPC应 用浓度时5 μ M，处理时间为2-3周，即从2周开始就会出现心脏干细胞的分化。因此本发 明为研宄内源鞘磷脂类诱导心脏干细胞分化的机制提供了理论和实验依据，本发明涉及的 SPC可以作为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制研宄，同时本发明为 研制开发有关促心肌再生的新生药物奠定了基础，为临床药物的开发应用提供了可靠的理 论依据。
【附图说明】
[0024] 图1 :为分离的sca-Γ心脏干细胞纯度。Pl，Ρ5表示传代次数。
[0025] 图2 :为sca-Γ心脏干细胞在正常培养条件下，倒置相差显微镜下显示的SPC处理 2-3周后细胞的形态变化图。
[0026] 其中：nor :正常培养组
[0027] ctr :溶剂对照组
[0028] spc :5 μ M SPC 处理组
[0029] 图3 :是SPC处理sca-Γ心脏干细胞后，心肌细胞特异性marker的mRNA水平的变 化。
[0030] 其中：
[0031] A. 1，2,5μΜ SPC处理心脏干细胞3周，QPCR检测心肌细胞转录因子gata4，Nkx2. 5 表达水平的变化。确立有效的诱导浓度为5 μ Μ。
[0032] Β.以5μΜ SPC处理sca-Γ心脏干细胞2,3,6周，再次检测心肌细胞转录因子 gata4, Nkx2. 5表达水平的变化。确立有效的诱导时间为2-3周。
[0033] C.以5 μΜ SPC处理sca-Γ心脏干细胞2-3周，检测其它心肌细胞marker CTnt， Mef2c的mRNA水平的变化。
[0034] 图4 :是SPC处理sca-Γ心脏干细胞后，心肌细胞特异性marker在细胞内的分布 及蛋白水平的变化。
[0035] 其中：ctr :溶剂对照组；spc :5 μM SPC处理组。
[0036] Α.激光扫描共聚焦显微镜结合免疫焚光化学显不5 μ M SPC对cTnt的细胞内分布 的影响。
[0037] B. Western blot 显示 5 μ M SPC 能促进 cTnt 的表达。ctr :溶剂对照组；spc :5 μ M SPC处理组。
[0038] C.激光扫描共聚焦显微镜结合免疫荧光化学显示5 μ M SPC促进细胞特异性转录 因子Gata4的入核。
[0039] D.柱形图分析显示对照组Gata4的入核率约为20%，SPC处理组Gata4的入核率 约为80%。
[0040] 图5 :是SPC处理sca-Γ心脏干细胞后，内皮细胞特异性marker在mRNA及蛋白水 平的变化。
[0041] 其中：nor :正常培养组；ctr :溶剂对照组；spc :SPC处理组。
[0042] A. QPCR检测不同浓度SPC处理sca-Γ心脏干细胞不同时间对CD31及vWF mRNA 水平的影响。确立有效的浓度为5 μ M，有效的作用时间为2-3周。
[0043] Β. 5 μ M SPC处理3周，流式细胞仪检测SPC对CD31的影响。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1Sca-I+心脏干细胞的提取及流式细胞仪检测其纯度
[0045] ①10周龄左右的C57/BL小鼠断颈处死，迅速用酒精消毒取心脏，清洗，剪碎，剪到 大约Imm 3大小。
[0046] ②37°C胰酶液消化30min。
[0047] ③消化完加少许胎牛血清终止消化，用200目的细胞筛过滤，加入少量的cell staining buffer悬浮过滤的细胞，进行细胞计数。
[004 8] ④将滤液350g离心8min，用cell staining buffer重悬细胞，使密度达到 2X l〇Vml，向溶液中加入生物素标记的sca-Ι抗体.，每IX IO7个细胞加5 μ 1抗体，冰上 孵育20min。
[0049] ⑤用过量体积的IxBD IMagTXbuffer洗绦标记的细胞，350g,离心8min,并小心吸 去上清。
[0050] ⑥彻底祸旋 BD IMagTX Streptavidin Partides Plus-DM，每 I X IO7个细胞加 25μ1，混匀，然后4°C孵育45min。
[0051] ⑦用 I X BD MagTXbuf f er，将标签量提高到 20-80 X 106/ml。
[0052] ⑧将EP管移到BD MagTX架上，吸附8min。（不超过lml)，吸出上清，再次加入 IxBD MagTXbuffer，轻轻重悬，再放架子上吸附8min。重复该步骤，用培养基悬浮细胞，将 细胞移入24孔板内培养。选取1-5代生长状态良好的、且处于对数生长期的细胞备用。
[0053] ⑨对第一代，第五代心脏干细胞进行流式检测干细胞纯度。收集细胞，300g，离心 5min 去除废液，用 cell staining buffer 重悬细胞，加入 PE-Cy5-〇)45 抗体，FITC-sca-1+ 抗体，PE-Q334抗体冰上染色30min，300g离心5min，洗两次，最后再次加入cell staining buffer重悬细胞，利用流式细胞术检测（结果见图I)
[0054] 结果显示：第一代（Pl)细胞Sca-Γ阳性率为84. 8%，第五代（P5) 96. 8%，Sca-I + 细胞⑶34阳性率约0. 8%，⑶45阳性率约3. 5-7. 3%。表明我们提取的细胞为Sca-Γ的心 脏干细胞，而非造血干细胞。
[0055] 实施例2 SPC储液的配制
[0056] 由sigma公司提供的SPC粉末配制浓度为5mg/ml的储液，分装到I. 5ml的 eppendorf管中，用液氮吹干，-20°C储存。
[0057] 实施例3 SPC对sca-Γ心脏干细胞形态影响的检测
[0058] 将提取出的sca-Γ心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含 有生长因子和10%胎牛血清的頂DM培养，长满后进行传代，取1-5代干细胞用于实验。将 贴壁24小时的细胞加入不同浓度（1，2, 5 μ M)的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对 照组，而不做任何处理的作为正常组。培养条件：37°C，CO2孵箱内培养。
[0059] 每隔三天换一次培养液并持续加入所述浓度的SPC，培养2-3周后在倒置相差显 微镜下定时观察（结果见图2)。
[0060] 结果表明：与正常组和溶剂对照组相比，5 μΜ SPC处理细胞2-3周，细胞拉长变 细。
[0061] 实施例4心肌细胞标志物RNA水平的检测
[0062] 将提取出的sca-Γ心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含 有生长因子和10%胎牛血清的頂DM培养24小时。待细胞贴壁后，弃废液，用IXPBS清洗， 加入新鲜培养液，并分别加入1，2, 5 μ M的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照组， 而不做任何处理的作为正常组。培养条件：37°C，CO2孵箱内培养。
[0063] 每隔三天换一次培养液并持续加入所述浓度的SPC，培养2-3周后加入trizol，提 取总RNA，反转录出cDNA，进行QPCR检测mRNA水平的变化（结果见图3)。
[0064] 结果表明：5μΜ的SPC处理2-3周可以有效的上调心肌细胞marker CTnt，GATA4， Mef2c，Nkx2. 5 的 mRNA 的表达。**ρ〈0· 01。
[0065] 实施例5心肌细胞标志物蛋白水平的检测
[0066] 将提取出的sca-Γ心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含 有生长因子和10%胎牛血清的頂DM培养24小时。待细胞贴壁后，弃废液，用IXPBS清洗， 加入新鲜培养液，并加入5 μ M的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照组。
[0067] ①弃废液，0.1 XPBS清洗三遍后，用4%的多聚甲醛固定15分钟，清洗后，山羊血 清封闭20分钟，加入CTnt的一抗4°C孵育过夜，0.1 XPBS清洗三遍后，加入二抗，37°C孵育 lh，清洗后，在激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞标志物一一CTnt的分布变化。
[0068] ②提取总蛋白，western blot检测心肌细胞marker CTnt的蛋白水平。
[0069] ③弃废液，0.1 XPBS清洗三遍后，用4%的多聚甲醛固定15分钟，清洗后，山羊血 清封闭20分钟，加入GATA4的一抗4°C孵育过夜，0.1 XPBS清洗三遍后，加入二抗，37°C孵 育lh，清洗后，在激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞标志物一一GATA4的分布变化。
[0070] ④随便选取6张 GATA4免疫荧光的图片，计算其入核率。（结果见图4)。
[0071] 结果表明：5 μΜ的SPC能促进细胞内应力纤维的形成，并上调的心肌细胞marker CTnT。另外，激光扫描共聚焦显微镜结合免疫荧光化学显示5 μΜ SPC促进细胞特异性转录 因子Gata4的入核；柱形图分析显示对照组GATA4的入核率约为20 %，SPC处理组GATA4的 入核率约为80%。#ρ〈0·01。
[0072] 实施例6内皮细胞特异性marker的RNA及蛋白水平的检测
[0073] 将提取出的sca-Ι+心脏干细胞种于24孔板中，7天后长满，均匀传入小皿中，用含 有生长因子和10%胎牛血清的頂DM培养24小时。待细胞贴壁后，弃废液，用IXPBS清洗， 加入新鲜培养液，并加入1，2, 5 μ M的SPC作为实验组。加入乙醇的作为溶剂对照组。而不 做任何处理的作为正常组。培养条件：37°C，5% 0)2培养箱内培养。
[0074] ①每隔三天换一次培养液并持续加入所述浓度的SPC，培养2-3周后加入trizol， 提取总RNA，反转录出cDNA，进行QPCR检测mRNA水平的变化。
[0075] ②5μΜ SPC处理sca-Ι+心脏干细胞3周，收集细胞，300g，离心5min去除废液， 用cell staining buffer重悬细胞，加入FITC-sca-Γ抗体，PE-〇)31抗体冰上染色30min， 300g离心5min，洗两次，最后再次加入cell staining buffer重悬细胞，利用流式细胞术 检测（结果见图5)。
[0076] 结果表明：QPCR检测不同浓度SPC处理sca-Γ心脏干细胞不同时间对⑶31及vWF mRNA水平的影响。确立有效的浓度为5 μ M，有效的作用时间为2-3周。*p〈0. 05, **p〈0. 01。 5 μΜ SPC处理3周，流式细胞术表明SPC促进内皮细胞marker⑶31的蛋白质水平的表达。
【主权项】
1. 一种神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药 物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征是：有效促进内源心脏干细胞分化为心脏谱系细 胞的神经鞘氨醇磷酸胆碱（SPC)浓度为5yM。
【专利摘要】本发明公开了一种神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用；其中有效促进内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞的神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)浓度为5μM。本发明提供的应用为研制开发促心肌分化的新型药物奠定了基础，所述神经鞘氨醇磷酸胆碱还可作为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制的研究。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN104894058
【申请号】CN201510376913
【发明人】赵静, 张尚立, 李文静
【申请人】山东大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月1日
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