一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用
一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程领域，特别涉及一种干细胞外泌体(stem cell-derivedexosome)补片及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]干细胞作为生物体内具有增殖、分化潜能，具备自我更新复制能力，能够高度分化的功能细胞，一直是再生医学细胞治疗领域中热门的研宄材料。随着细胞治疗研宄的深入，由各种方法制备的干细胞补片对治疗心肌梗塞、皮肤创伤、股骨头坏死、糖尿病等组织或器官损伤、功能障碍等疾病显示了一定程度上的治疗作用，许多动物或临床实验研宄也证明了干细胞能够发挥促进坏死组织再生修复、改善相关组织器官功能等作用。
[0003]传统细胞治疗常以直接注射的方式把干细胞移植到组织损伤部位，后来，许多组织工程研宄者利用不同的构建方法把干细胞构建成细胞片再进行体内移植。相较于传统的直接注射细胞悬液的干细胞疗法，干细胞片移植的优势在于:①干细胞经过体外构建形成二维或三维的组织结构，在细胞片移植体内后仍能保持细胞与细胞间及细胞与胞质间的连接，有利于干细胞生物学活性的维持能使干细胞定向植入目的区域，不易流失，且在构建过程中人为控制细胞来源、种植密度、构建方法，大大促进细胞治疗的进程；③细胞片移植治疗可明显促进周围组织、细胞新生，对组织器官的损伤修复作用更为明显。
[0004]虽然通过干细胞补片移植的方法进行治疗能够一定程度提高损伤组织器官的修复作用，但是在体内进行干细胞移植的治疗方法仍存在一定的缺陷:①数量来源紧缺:从临床应用的角度出发，除造血干细胞和间充质干细胞外，很多种类临床应用价值高的干细胞由于提取困难或伦理问题限制了其临床应用，而异体来源的干细胞移植后易产生免疫排斥反应，如皮肤干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞等干细胞体外的生物学活性难以维持:在目前各种细胞片构建技术中，其研宄重点在于如何构建较完整的细胞片，并没有涉及干细胞活性的维持方案，包括目前运用最为成熟广泛的细胞片构建温敏培养法。因此，在使用这些方法进行干细胞补片构建容易导致干细胞在构建过程中出现分化现象，降低其增殖、旁分泌等生物学活性，不利于干细胞在体内发挥组织修复的作用；③干细胞补片构建周期较长:目前干细胞补片构建策略主要通过干细胞高密度种植培养，待细胞之间建立细胞连接连成片状再进行收获和后续加工操作。此类细胞补片构建周期较长，一般需要7至14天，此过程易降低干细胞生物学活性，也不利用干细胞补片产业化生产与保存；④干细胞体内移植存在风险与未知因素:干细胞是一类具有强自我更新能力的细胞，其体内移植成瘤风险是目前干细胞治疗的关注重点之一。另外，由于干细胞治疗发生机制尚不完全清楚，干细胞体内移植后可能因周围环境作用出现过度增殖、未像预期方向分化、迀移、凋亡、免疫排斥等不可控情况，很大程度上影响治疗效果。
[0005]随着干细胞作用机制研宄的深入，多项研宄表明干细胞在体内多数是通过旁分泌生长因子和细胞因子等物质发挥治疗作用，而外泌体正是这类物质的重要转运载体。近年来，研宄发现由干细胞天然分泌的外泌体在信息传递、调控、转运、免疫中发挥着重要作用，可广泛应用于临床治疗、美容等方面。外泌体是干细胞分泌的膜性小囊泡，当来源细胞外排时获得其膜蛋白成分，可选择性地将来源细胞内部含有的蛋白质、核酸等运送到受体细胞，调节细胞间信号传导。
[0006]相较于构建干细胞细胞补片的组织工程产品来说，干细胞外泌体补片的无细胞产品具有明显优势，具体在于:①来源广泛，易于收集与储存:绝大多数干细胞在一定环境条件下都能够持续不断分泌外泌体，且同种异体间外泌体差异微小，因而可以在细胞培养过程中不断提取外泌体，并通过离心、过滤、色谱、层析、物理吸附等常用方法获得所需外泌体，收集得到的外泌体可于4°C短期保存或-80°C长时间保存避免干细胞直接移植:干细胞外泌体补片结构稳定，能极大程度上避免发生类似干细胞补片体内移植后细胞迀移、失效、不定向分化的可能性，提高作用效率；③内容物丰富，治疗效果与干细胞直接移植相似:外泌体是由细胞分泌到体外的囊状结构，包含多种来自细胞内的蛋白质如生长因子、促血管生成因子等，以及核酸、脂类物质，是目前已知的干细胞旁分泌作用中重要的组成；④以补片形式植入提高外泌体作用靶向性:在目前的研宄中，研宄者多采用外泌体混悬液直接注射到组织或器官中的方法，虽然也有一定的治疗效果，但易造成外泌体的流失，而外泌体补片植入体内后定向作用于目的区域，在该区域能够长时间释放外泌体内的物质，延长外泌体作用时间；⑤易于规范化生产:干细胞外泌体补片更加易于标准化，能够准确测定相关计量和生物学活性，其负载量可人为控制，且补片可大量生产，成本较低、工艺简单。
[0007]由于干细胞补片多利用低分化的干细胞作为种子细胞，其对于生存环境要求高，通常植入体内后难以达到预期的分化结果，影响治疗效果。故可将干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因而在体外获得干细胞外泌体并以此制成补片植入，将成为细胞疗法的创新之举。
【发明内容】
[0008]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种干细胞外泌体(stem cell-derived exosome)补片的制备方法。该方法能在避免细胞片治疗缺陷的基础上提供优于细胞片治疗的效果。
[0009]本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的干细胞外泌体补片。
[0010]本发明的再一目的在于上述干细胞外泌体补片的应用。
[0011]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0012]一种干细胞外泌体补片的制备方法，包括以下步骤:
[0013](I)培养干细胞并收集干细胞的外泌体；
[0014](2)制备补片支架；
[0015](3)将步骤(I)得到的外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片。
[0016]所述的干细胞优选为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞中的一种或一种以上;
[0017]所述的干细胞优选为胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、神经干细胞、造血干细胞、成体干细胞和经血干细胞中的一种或一种以上；
[0018]所述的干细胞的外泌体指的是干细胞分泌的分子直径为30?10nm的亚细胞双层囊膜泡；
[0019]所述的收集的方法指的是通过收集培养上清液，经过离心法、色谱法、过滤法、免疫磁珠法和物理吸附法中的一种或一种以上方法进行外泌体的收集；
[0020]所述的离心法优选为超速离心、差速离心、超滤离心、密度梯度离心和旋转超滤中的一种或一种以上的方法进行外泌体的收集；
[0021]所述的色谱法指利用凝胶层析法、吸附层析法和离子交换法中的一种或一种以上的方法分离出完整的外泌体的收集方法；
[0022]所述的免疫磁珠法指将含有外泌体相关抗原的抗体的免疫磁珠与外泌体共同孵育，用蒸馏水冲洗后，放入PBS缓冲液中的收集方法；
[0023]所述的抗体优选为CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166 和 CD9 中的一种或一种以上；
[0024]所述的物理吸附法优选为静电吸附和磁力吸附中的一种或一种以上的收集方法;
[0025]所述的过滤法指利用纳滤膜和超滤膜中的一种或一种以上的膜将不同分子量或粒径的分子分离得到外泌体的方法；
[0026]所述的干细胞的外泌体指经过干细胞“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成并可分泌的分子，在体内或体外发挥信息传递、调控、转运、免疫的任何一种或一种以上的功能；
[0027]所述的干细胞的外泌体内含有用于体内或体外发挥信息传递、调控、转运、免疫的蛋白、核酸、酶和细胞因子中的一种或一种以上；
[0028]所述的补片的载体为天然载体或合成载体；
[0029]所述的天然载体优选为由基质胶、胶原凝胶、壳聚糖、明胶、脱细胞基质、动物腹膜、氨基葡聚糖任何一种或一种以上的天然材料制备获得；
[0030]所述的合成载体优选为由乙稀-醋酸乙稀共聚物(Ethylene Vinyl Acetate，EVA)、聚乳酸-轻基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚乳酸(polylacticacid，PLA)、藻酸盐和聚己内醋(polycaprolactone average)中的一种或一种以上的合成材料制备获得；
[0031]所述的脱细胞基质指的是利用天然组织形成的天然载体材料，优选为脱细胞角膜基质、脱细胞皮肤基质或脱细胞心脏基质形成的天然载体材料；
[0032]所述的外泌体附着在补片支架上指利用凝胶混悬法、交联剂法、带电吸附法和致孔注入法中的一种或一种以上的方法制备获得；
[0033]所述的凝胶指的是纳米纤维凝胶、纳米多肽凝胶、纤维蛋白凝胶、交联葡聚糖凝胶、胶原凝胶、明胶、壳聚糖凝胶和琼脂糖凝胶中的一种或一种以上；
[0034]所述的交联剂指的是1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(N-(3_Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDAC)、N-轻基瑭泊酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)、糖胺聚糖(glycosaminoglycan)、京尼平(Genipin)和戊二醛(glutaraldehyde，GA)中的一种或一种以上；
[0035]所述的带电吸附法指的是利用外泌体质膜表面带电的特性将其吸附到带电情况相反的带电补片载体上的方法；
[0036]所述的致孔注入法指利用致孔剂使补片载体内部成孔，再通过超饱和气体法、超临界流体致孔法、热致相分离法和微乳液聚合法中的一种或一种以上的方法去除致孔剂，而使外泌体留在补片载体内的孔中的方法；
[0037]所述的带电补片载体指的是将天然带电的壳聚糖、肝素等附着在补片载体形成的补片载体；
[0038]所述的致孔剂优选为氮气、二氧化碳、水、聚乙稀 醇(polyvinyl alcohol，PVA)、聚乙稀P比略烧酮(polyvinyl pyrroIidone,PVP)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等中的一种或一种以上。
[0039]一种干细胞外泌体补片，通过上述制备方法制备得到。
[0040]所述的干细胞外泌体补片在组织工程领域中的应用。
[0041]本发明选用干细胞外泌体构建干细胞外泌体补片，根据不同治疗目的，可选用不同来源的干细胞，通过直接收集或诱导或体外模拟微环境促使其产生外泌体，并可选用多种方法灵活制备所需的补片。
[0042]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0043](I)药物来源天然:外泌体是细胞分泌的一种天然微球，内含蛋白质、脂类、核酸等多种物质，且有良好的靶向性，植入后快速聚集于目的区域，持续释放高浓度营养或各类因子。相较于细胞片，该补片成本低，效率高，作用时间长，效果更好，免疫排斥可能性极低。可针对不同组织或器官受损情况控制剂量，避免干性高的干细胞在体内成瘤的可能性，以及避免胚胎干细胞应用的伦理道德问题。
[0044](2)容易获取:目前已有的外泌体获取方法多，且过程简易、方便、外泌体获取量大，前期准备工作轻松。此外，可通过诱导或体外模拟微环境的方式大量生产应用于不同情况的外泌体，便于后期保存、配置。已知的外泌体来源广泛，不限于人体干细胞，且不同生物来源的外泌体间差异微小，不易出现异体排斥现象。
[0045](3)可保障外泌体补片作用部位准确性:相较于外泌体悬液的直接注射，补片作为良好载体将外泌体固定在一定部位，保障外泌体植入后的定点定向作用，大大降低外泌体流失的可能性。此外，补片支架作为外泌体的储存容器，可一定程度上保护外泌体不受或降低外界的不良影响。
[0046](4)可延长补片植入后有效作用时间:天然外泌体是亚细胞双层囊膜泡，其膜结构来自细胞质膜，能保护内部物质，避免植入后被快速降解。并且不具有生物毒性或生物毒性较小，不易受体内环境影响发生不可预料的在形态、性质等方面的大的改变。天然外泌体的双层膜结构使其内部物质的释放一定程度上受作用微环境影响，并可以做成有缓释作用的补片，是天然的运载体、营养缓释系统、调节系统。
[0047](5)可很大程度上避免安全隐患:天然外泌体的采集为批量采集，来源、成熟程度相似或相同，保证其作用效果相同或相似，避免发生如不定向分化等不良结果影响的发生。且构建干细胞外泌体补片相较于干细胞细胞补片简易，减少外来物质的需求量，更加接近天然成分。通过本发明所述的方法，可获得具有良好生物学特性的干细胞外泌体补片，是组织工程领域构建生物补片的新突破，同时本产品也为解决临床疾病治疗提供了可行的方案。本发明原理科学可靠，工艺简单灵活。
【具体实施方式】
[0048]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0049]实施例1以脱细胞心包膜为载体的心脏干细胞外泌体补片用于心肌梗死治疗
[0050](I)实验原理
[0051]以天然的脱细胞心包膜为补片载体，利用过滤离心法提取体外培养至第3代的心脏干细胞所分泌的心脏干细胞外泌体，通过纤维蛋白凝胶混悬法将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替心脏干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善心肌梗死情况的作用。
[0052]⑵实验用具
[0053]仪器及试剂:移液枪、离心管、100-kDa MWCO中空纤维膜(Millipore)、PBS磷酸缓冲溶液(Sigma)、30%蔗糖/D2O缓冲液(密度1.210g/cm3)、低温超速离心机、100-kDa MWCOUltrafree-15 胶囊(Millipore)、含抗生素(100U/mL 青霉素 G，100 μ g/mL 硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6)、无菌纯水、水浴箱、含0.3% (w/v)十二烧基硫酸钠的无菌PBS盐溶液(0.01mol/L、pH = 6?8)、磁力搅拌器、直径12mm的环钻、含1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 24mg/mL和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)60mg/mL的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH = 7?8)、纤维蛋白凝胶、培养箱。
[0054]实验材料:纯化的(7?8) XlO6个/cm 2第3代的心脏干细胞、新鲜猪心包膜(25cm2) ο
[0055](3)实验步骤
[0056]a.培养干细胞并提取所述干细胞的外泌体:
[0057]无菌条件下收集纯化的(7?8) X 16个/cm2经原代培养传至第3代的心脏干细胞的培养上清液10mL，以2000g离心20min去除细胞碎片。浓缩后的上清液进一步用100-kDaMWCO中空纤维膜(Millipore)于100g离心30min，2次，将获得的上清液稀释在PBS磷酸缓冲溶液(Sigma)中。然后将溶液移入离心管中，与30%蔗糖/D2O缓冲液(密度1.210g/cm3) 一起在 4°C，10000g 下离心 lh。最后，用 PBS 溶液在 100-kDa MWCO Ultrafree-15 胶囊(Millipore)中以 100g 离心 30min，3 次。(方法参照:Lai RC, Arslan F，Lee MM, etal.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfus1n injury.StemCell Res, 2010，4:214-222)
[0058]b.制备补片支架:
[0059]在室温、常规无菌操作下，将新鲜猪心包膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/mL青霉素G，100 μ g/mL硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6)浸泡2次，每次5分钟。将心包膜置入无菌纯水中，在37°C水浴中浸泡30分钟。浸泡后置入1mL含0.3% (w/v)十二烷基硫酸钠的无菌PBS盐溶液(0.0lmol/L、pH = 6?8)中，在37°C水浴中震荡处理(转速=185rpm) 10?12小时。后置入50ml含抗生素(100U/mL青霉素G，100 μ g/mL硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6)中，在25°C水浴中震荡(转速=185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到洗净后的脱细胞猪心包膜。用直径12mm的环钻钻取12mm直径脱细胞猪心包膜材料，将其浸泡在含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 24mg/mL 和 N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 60mg/mL 的 PBS 盐缓冲液(0.01mol/L, pH =7?8，Sigma)中反应20分钟，用蒸馏水轻柔清洗6次，每次30分钟。清洗后的脱细胞心包膜密封于无菌塑料袋中，用钴60 (15kGy)照射灭菌后，4°C下保存备用。
[0060]c.将所述外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0061]将获得的外泌体与20 μ L纤维蛋白凝胶混合均匀，并滴加于制备的脱细胞心包膜表面，放入37 °C培养箱中静置5min，使其凝固。
[0062]⑷实验结果
[0063]免疫荧光染色表明心脏干细胞外泌体补片促进新血管形成，血管密度达到约150?200/梗死面积(mm2)，有利于梗死区域心肌细胞的再生。移植I周后，超声波心电图表明左心室压力下降约8%?10%。左心室射血分数(LVEF)改善程度相较于用心脏干细胞补片治疗提高5?8%。移植一周后取出补片，由ELISA分析显示补片中碱性成纤维细胞生长因子(b fibroblast growth factor，bFGF)、肝素生长因子(hyparin growth factor,HGF)、胰岛素样生长因子I (insulin-like growth factor-1, IGF-1)的含量较移植前下降20%，说明心脏干细胞外泌体补片持续时间可达一周及以上。病理切片表明有效抑制左心室壁变薄。
[0064]实施例2以聚乳酸(polylacticacid，PLA)为补片载体的骨髓间充质干细胞外泌体补片用于股骨头坏死治疗
[0065](I)实验原理
[0066]以合成的聚乳酸(polylacticacid，PLA)为补片载体，利用免疫磁珠法提取体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞所分泌的骨髓间充质干细胞外泌体，通过纳米多肽凝胶混悬法将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替骨髓间充质干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善股骨头坏死情况的作用。
[0067](2)实验用具
[0068]仪器及试剂:PBS磷酸缓冲液(Sigma)、无血清且去除外泌体的BMSC培养液、培养箱、超速离心机、SW28 转子(Beckman Coulter Instruments，Fullerton，CA)、0.32M 鹿糖、SW60rotor (Beckman Coulter Instruments)、免疫磁珠(Miltenyi)、羊抗鼠免疫球蛋白 G(Invitrogen Dynal AS，Oslo，Nroway)、抗 CD9 单克隆抗体(clone MM2/57，ChemiconInternat1nal, London，UK)、12nm 的环钻、纳米多肽凝胶(acetyl-(Arg-Ala-Asp-Ala)4_amide.4HCL，BD B1caotPuraMatrix)。
[0069]实验材料:纯化的(7?8) X 16个/cm 2第3代骨髓间充质干细胞、聚乳酸(polylacticacid, PLA)。
[0070](3)实验步骤
[0071]a.培养干细胞并提取所述干细胞的外泌体:
[0072]无菌条件下收集纯化的(7?8) X 16个/cm 2经原代培养传至第3代骨髓间充质干细胞(BMSC)用PBS磷酸缓冲液(Sigma)清洗培养皿2次，在无血清且去除外泌体的BMSC培养液中于37 °C培养箱孵育4 8h后，上清液经400 X g (1min)，3000 X g (20min)，10000 X g (30min)连续离心。外泌体于 64000 Xg (I1min)用 SW28 转子(Beckman CoulterInstruments, Fullerton，CA)浓缩。外泌体沉淀在0.32M鹿糖中重悬，然后10000Xg离心 lh(SW60 rotor, Beckman Coulter Instruments)。外泌体通过免疫磁珠(Miltenyi)进一步纯化。25 μ L预涂有羊抗鼠免疫球蛋白G(Invitrogen Dynal AS，Oslo，Nroway)的免疫磁珠与 30 μ L 抗 CD9 单克隆抗体(clone MM2/57，Chemicon Internat1nal, London,UK)孵育lh。其后，磁珠与20 μ g外泌体在4°C混悬lh。清洗4次后，外泌体和磁珠在PBS中再次重悬。(方法参照:Jansen FH, Krijgsveld J, van Rijswijk A, et al.ExosomalSecret1n of Cytoplasmic Prostate Cancer Xenograft-derived Proteins.Mol CellProteomics, 2009, 8:1192-1205)
[0073]b.制备补片支架:
[0074]用直径为12nm的环钻在现成的PLA补片上钻取直径为12nm的PLA补片载体备用。
[0075]c.将所述外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0076]将有上述步骤获得的外泌体悬液与20 μ L已制备好的纳米多肽凝胶溶液(acetyl-(Arg-Ala-Asp-Ala)4-amide ?4HCL,BD B1caotPuraMatrix)混合均勾，并滴加于制备的PLA补片载体表面，放入37°C培养箱中静置5min，在骨髓间充质干细胞培养液(DMEM基础培养液(Corning), 10% (v/v)已滤除外泌体的胎牛血清(Corning Cellgro)+1% (w/v)谷氨酰胺(Corning Cellgro)+100U/mL 青霉素 G(Sigma)+100 μ g/mL硫酸链霉素(Sigma))中静置5min，使其凝固。
[0077]⑷实验结果
[0078]植入股骨头坏死动物模型I周后，骨质密度提高12 %?18 %，关节功能改善40 %，病理组织学表现为空骨陷窝减少，成骨细胞增多，另外，血管密度提高15%?20%。此外，骨髓间充质干细胞来源的外泌体展现出对癌症、致死性心脏疾病、免疫疾病的治疗的优异作用。
[0079]实施例3以藻酸盐(Alginates)补片为载体的皮肤干细胞外泌体补片用于皮肤创伤治疗
[0080](I)实验原理
[0081]以天然的藻酸盐(Alginates)为补片载体，利用旋转超滤法提取体外培养至第3代的皮肤干细胞所分泌的皮肤干细胞外泌体，通过纳米多肽凝胶混悬法将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替皮肤干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善皮肤创伤情况的作用。
[0082]⑵实验仪器
[0083]仪器及试剂:移液枪、低温离心机、离心管、0.22 μm滤膜(Millex_GP，Millipore)、无菌 PBS 磷酸缓冲液(Sigma)、10nm 超滤离心管(Amicon Ultra-4,Millipore)、0.22 μ m超滤离心管(Millipore)、D_ 葡萄糖酸半 1?盐(1.08% (w/v)，Sigma)、双蒸馏水、96-孔板(100 μ L/ 孔)、1.2mg ml^DMEM 培养液(Corning)、NaOH 溶液。
[0084]实验材料:纯化的(7?8) X 16个/cm2第3代皮肤干细胞、藻酸盐。
[0085](3)实验步骤
[0086]a.培养干细胞并提取所述干细胞的外泌体:
[0087]无菌条件下收集纯化的(7-8) X 16个/cm2经原代培养传至第3代皮肤干细胞的培养上清液10mL，在4°C下以300r/min离心10分钟后，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中。在4°C下以2000r/min离心20分钟，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中。在超净工作台中，将收集得到的液体用0.22ym滤膜(MilleX-GP，Millip0re)过滤。收集滤后液体，在4°C下以lOOOOOr/min离心70分钟，得到白色沉淀即为外泌体。吸去上清液，加无菌PBS磷酸缓冲液(Sigma)洗涤，在4°C下以100000r/min离心70分钟，用ImL无菌PBS重悬外泌体。再用10nm超滤离心管(Amicon Ultra-4, Millipore)于4°C下以300r/min离心30分钟过滤，之后用0.22 μ m超滤离心管(Millipore)于4°C下以300r/min离心30分钟过滤外泌体备用。
[0088]b.制备补片支架:
[0089]藻酸盐溶于双蒸馏水中得到1.2%溶液(w/v)，当激发形成独特的藻酸盐交联时，然后加入D-葡萄糖酸半钙盐(1.08% (w/v), Sigma)交联，。交联藻酸盐溶液倒入96-孔板(100 μ L/孔)，在2?8°C下过夜冷冻，在_20°C冷冻24小时，并且冻干。支架暴露在UV 下杀菌 20min(方法参照:Y.Sapir et al.The promot1n of in vitro vessel-likeorganizat1n of endothelial cells in magneticalIy responsive alginatescaffolds.B1materials 33(2012)4100e4109)0
[0090]c.将所述外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0091]胶原蛋白基质的制备:将胶原分散到1.2mg Iiir1DMEM培养液(Corning)中并用NaOH溶液调pH到7.4。
[0092]将获得的外泌体与20 μ L胶原蛋白基质混合均匀，并滴加于制备的藻酸盐补片载体表面，37°C下培养45min，使其凝固。
[0093]⑷实验结果
[0094]植入创伤、受损部位后，伤口恢复速率提尚10%?18.4%，未出现炎症现象。I周后创口收缩率达17.5%?25%，且创伤部位新生细胞活性良好。ELISA检测表皮生长因子(EGF)表达明显上升15%?20%，SP免疫组织化学法能检测到创伤区域β I整合素、角蛋白19(Κ19)表达增多。HE染色切片发现新生表皮较厚，细胞层数较多且分层较为明显，创伤部位愈合较好。
[0095]实施例4以乙稀-醋酸乙稀共聚物(Ethylene Vinyl Acetate，EVA)补片为载体的胚胎干细胞外泌体补片用于慢性肝衰竭治疗
[0096](I)实验原理
[0097]以合成的乙稀-醋酸乙稀共聚物(Ethylene Vinyl Acetate，EVA)为补片载体，利用过滤离心法提取体外培养至第3代的胚胎干细胞所分泌的胚胎干细胞外泌体，通过EVA将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替胚胎干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善慢性肝衰竭情况的作用。
[0098](2)实验用具
[0099]仪器及试剂22μ m滤膜(MiIlex-GP，Millipore)、装有 100 000 NWCO超滤膜的Model 8050旋转超滤仪(Millipore)、氮气、磁力搅拌器、PBS磷酸缓冲液(Sigma)UZnn^a环钻、环己烧溶液(Sigma)。
[0100]实验材料:(7?8) X 16个/cm 2第3代的胚胎干细胞、乙烯-醋酸乙烯共聚物(Ethylene Vinyl Acetate，EVA)。
[0101](3)实验步骤
[0102]a.培养干细胞并提取所述干细胞的外泌体:
[0103]将纯化的(7?8) X 16个/cm 2经原代培养传至第3代的胚胎干细胞向肝细胞方向诱导成功后，于无菌条件下收集其培养上清液50mL，在超净工作台中用0.22 μπι滤膜(Mi I lex-GP, Millipore)进行过滤。将收集到的上清液加入装有100000NWC0超滤膜的Model 8050旋转超滤仪(Millipore)中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下，打开磁力搅拌器(IKA)，使涡漩高度为液体高度的1/3。待上清液超滤完毕后，加入50mLPBS磷酸缓冲液(Sigma)并再次超滤，重复3次。超滤完毕后，用0.5mL PBS磷酸缓冲液悬浮超滤膜上的外泌体待用。(方法参考:胡国文等，旋转超滤:一种提取细胞外泌体的新方法，Acad J Sec Mil Med Univ, 2014, 35(6):59860)
[0104]b.制备补片支架:
[0105]用直径为12nm的环钻在现成的EVA补片上钻取直径为12nm的EVA补片载体备用。
[0106]c.将所述外泌体附着在补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0107]在EVA补片表面涂抹0.3%的EVA环己烧溶(Sigma)中，置于室温挥发，在完全干燥前使外泌体悬液缓慢滴在EVA补片载体表面使其附在EVA补片载体表面，再将EVA的环己烷溶液放入聚四氟乙烯(Sigma)槽中在室温下晾干，制备的EVA薄膜浮在表面。将补片自然风干，得到附有胚胎干细胞外泌体的EVA补片。
[0108](4)实验结果
[0109]诱导胚胎干细胞向肝细胞方向转变后，用RT-PCR和Western blot法检测到干细胞标志物甲胎球蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表达量随着时间的延长明显增加。将补片移植到慢性肝衰竭动物模型7天后，肝细胞双核增多，并出现炎性细胞浸润，坏死灶明显减小，充血、出血现象减轻。模型组肝功能指标丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的表达均下降8.7%?15%，而白蛋白(ALB)表达无明显变化。
[0110]实施例5以脱细胞羊膜为载体的经血干细胞外泌体补片用于I型糖尿病治 疗
[0111](I)实验原理
[0112]以天然的脱细胞羊膜为补片载体，利用旋转超滤法提取体外培养至第3代的经血干细胞所分泌的经血干细胞外泌体，通过交联法将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替经血干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善I型糖尿病情况的作用。
[0113](2)实验用具
[0114]仪器及试剂:低温离心机、离心管、0.22 μ??滤膜(Millex_GP，Millipore)、无菌PBS 磷酸缓冲液(Sigma)、10nm 超滤离心管(Amicon Ultra-4, Millipore)、0.22 μ m 超滤离心管(Millipore)、含抗生素(100U/mL青霉素G和100 μ g/mL硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6，Sigma)、无菌纯水、水浴箱、(使用0.05mol/L碳酸盐缓冲液配制，pH = 8?9 ;磷脂酶Al = 200U/mL，磷脂酶A2 = 250U/mL, Sigma)、12mm的环钻、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，Sigma)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS, Sigma)的一水吗啉乙磺酸(MES, Sigma)缓冲液(0.lmol/L、pH = 6.0)、摇床、磷酸氢二钠溶液(0.lmol/L, Sigma)、氯化钠溶液(4mol/L，Sigma)。
[0115]实验材料:纯化的(7?8) X 16个/cm2第3代经血干细胞、脱细胞羊膜。
[0116](3)实验步骤
[0117]a.培养干细胞并提取所述干细胞外泌体:
[0118]无菌条件下收集纯化的(7?8) X 16个/cm 2经原代培养传至第3代经血干细胞的培养上清液10mL，在4°C下以300r/min离心10分钟后，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中。在4°C下以2000r/min离心20分钟，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中。在超净工作台中，将收集得到的液体用0.22ym滤膜(Millex-GP，Millipore)过滤。收集滤后液体，在4°C下以lOOOOOr/min离心70分钟，得到白色沉淀即为外泌体。吸去上清液，加无菌PBS磷酸缓冲液(Sigma)洗涤，在4°C下以100000r/min离心70分钟，用ImL无菌PBS重悬外泌体。再用10nm超滤离心管(Amicon Ultra-4,MiIIipore)于4°C下以300r/min离心30分钟过滤外泌体。再用0.22 μπι超滤离心管(Millipore)于4°C下以300r/min离心30分钟过滤外泌体。
[0119]b.制备补片支架:
[0120]在室温，常规无菌操作下，将新鲜羊膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/mL青霉素G和100 μ g/mL硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6)浸泡5次，每次10分钟。将羊膜置入无菌纯水中，在37°C水浴中浸泡60分钟。浸泡后将其置入1mL无菌磷脂酶溶液(使用0.05mol/L碳酸盐缓冲液配制，pH = 8?9 ;磷脂酶Al = 200U/mL，磷脂酶A2 =250U/mL，Sigma)中，在37°C水浴中震荡处理(转速=185rpm)6小时。后置入50mL含抗生素(100U/mL青霉素G和100 μ g/mL硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH=9.0?9.6, Sigma)中，在25°C水浴中震荡(转速=185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到脱细胞羊膜。
[0121]c.将所述外泌体附着在补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0122]在室温下，常规无菌操作下，用直径12mm的环钻钻取12mm直径脱细胞羊膜材料，将其浸入到2mL外泌体悬液、3mmol/L 1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC, Sigma)和 5mmol/L N-轻基丁二酰亚胺(NHS，Sigma)的一水吗啉乙横酸(MES，Sigma)缓冲液(0.lmol/L、pH = 6.0)中，在摇床上(转速=40rpm)反应24?72小时后，依次用磷酸氢二钠溶液(0.lmol/L, Sigma)清洗6次，每次30分钟；氯化钠溶液(4mol/L，Sigma)清洗6次，每次30分钟；蒸馏水轻柔清洗6次，每次30分钟，得到以脱细胞羊膜为载体的经血干细胞外泌体补片。
[0123](4)实验结果
[0124]将补片植入I型糖尿病小鼠模型I周后，免疫荧光检测发现补片促进胰岛β细胞前体标记物Ngn3的表达，且发现Ngn3阳性细胞在导管上皮细胞、胰岛、外分泌组织均能检测到。此外，通过实时定量PCR检测β细胞分化发育基因明显上调13%，说明经血干细胞(mentrual blood progenitor cells，MBPCs)通过促进胰腺内源干细胞分化改善I型糖尿病。
[0125]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种干细胞外泌体补片的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)培养干细胞并收集干细胞的外泌体； (2)制备补片支架； (3)将步骤(I)得到的外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于: 所述的干细胞为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞中的一种或一种以上； 所述的干细胞的外泌体指的是干细胞分泌的分子直径为30?10nm的亚细胞双层囊膜泡。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于: 所述的干细胞为胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、神经干细胞、造血干细胞、成体干细胞和经血干细胞中的一种或一种以上； 所述的干细胞的外泌体内含有用于体内或体外发挥信息传递、调控、转运、免疫的蛋白、核酸、酶和细胞因子中的一种或一种以上。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于: 所述的收集的方法指的是通过收集培养上清液，经过离心法、色谱法、过滤法、免疫磁珠法和物理吸附法中的一种或一种以上方法进行外泌体的收集； 所述的补片的载体为天然载体或合成载体； 所述的外泌体附着在补片支架上指利用凝胶混悬法、交联剂法、带电吸附法和致孔注入法中的一种或一种以上的方法制备获得。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于: 所述的离心法为超速离心、差速离心、超滤离心、密度梯度离心和旋转超滤中的一种或一种以上的方法进行外泌体的收集； 所述的色谱法指利用凝胶层析法、吸附层析法和离子交换法中的一种或一种以上的方法分离出完整的外泌体的收集方法； 所述的免疫磁珠法指将含有外泌体相关抗原的抗体的免疫磁珠与外泌体共同孵育，用蒸馏水冲洗后，放入PBS缓冲液中的收集方法； 所述的抗体为⑶63、⑶81、⑶90、⑶73、⑶105、⑶29、⑶166和⑶9中的一种或一种以上; 所述的物理吸附法为静电吸附和磁力吸附中的一种或一种以上的收集方法； 所述的过滤法指利用纳滤膜和超滤膜中的一种或一种以上的膜将不同分子量或粒径的分子分离得到外泌体的方法。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于: 所述的天然载体为由基质胶、胶原凝胶、壳聚糖、明胶、脱细胞基质、动物腹膜、氨基葡聚糖任何一种或一种以上的天然材料制备获得； 所述的脱细胞基质为脱细胞角膜基质、脱细胞皮肤基质或脱细胞心脏基质形成的天然载体材料； 所述的合成载体为由乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、藻酸盐和聚己内酯中的一种或一种以上的合成材料制备获得。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于: 所述的凝胶指的是纳米纤维凝胶、纳米多肽凝胶、纤维蛋白凝胶、交联葡聚糖凝胶、胶原凝胶、明胶、壳聚糖凝胶和琼脂糖凝胶中的一种或一种以上； 所述的交联剂指的是1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、糖胺聚糖、京尼平和戊二醛中的一种或一种以上； 所述的带电吸附法指的是利用外泌体质膜表面带电的特性将其吸附到带电情况相反的带电补片载体上的方法； 所述的致孔注入法指利用致孔剂使补片载体内部成孔，再通过超饱和气体法、超临界流体致孔法、热致相分离法和微乳液聚合法中的一种或一种以上的方法去除致孔剂，而使外泌体留在补片载体内的孔中的方法。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于: 所述的带电补片载体指的是将天然带电的壳聚糖、肝素附着在补片载体形成的补片载体； 所述的致孔剂为氮气、二氧化碳、水、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的一种或一种以上。9.一种干细胞外泌体补片，通过权利要求1?8任一项所述的制备方法制备得到。10.权利要求9所述的干细胞外泌体补片在组织工程领域中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用，属于组织工程领域。该干细胞外泌体补片包括以下步骤：培养干细胞并收集干细胞的外泌体；制备补片支架；将得到的外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片。本发明获得的干细胞外泌体补片的药物来源天然、容易获取、可保障外泌体补片作用部位准确性、可延长补片植入后有效作用时间、可很大程度上避免安全隐患。通过本发明所述的方法，可获得具有良好生物学特性的干细胞外泌体补片，是组织工程领域构建生物补片的新突破，同时本产品也为解决临床疾病治疗提供了可行的方案。本发明原理科学可靠，工艺简单灵活。
【IPC分类】C12N5/0797, C12N5/0789, C12N5/0735, C12N11/00, C12N5/0775
【公开号】CN104894062
【申请号】CN201510260758
【发明人】武征, 林熙, 王颖薇, 严惠泽, 周清, 张建华, 张中夏, 秦子夕, 樊泽培, 路程
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程领域，特别涉及一种干细胞外泌体(stem cell-derivedexosome)补片及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]干细胞作为生物体内具有增殖、分化潜能，具备自我更新复制能力，能够高度分化的功能细胞，一直是再生医学细胞治疗领域中热门的研宄材料。随着细胞治疗研宄的深入，由各种方法制备的干细胞补片对治疗心肌梗塞、皮肤创伤、股骨头坏死、糖尿病等组织或器官损伤、功能障碍等疾病显示了一定程度上的治疗作用，许多动物或临床实验研宄也证明了干细胞能够发挥促进坏死组织再生修复、改善相关组织器官功能等作用。
[0003]传统细胞治疗常以直接注射的方式把干细胞移植到组织损伤部位，后来，许多组织工程研宄者利用不同的构建方法把干细胞构建成细胞片再进行体内移植。相较于传统的直接注射细胞悬液的干细胞疗法，干细胞片移植的优势在于:①干细胞经过体外构建形成二维或三维的组织结构，在细胞片移植体内后仍能保持细胞与细胞间及细胞与胞质间的连接，有利于干细胞生物学活性的维持能使干细胞定向植入目的区域，不易流失，且在构建过程中人为控制细胞来源、种植密度、构建方法，大大促进细胞治疗的进程；③细胞片移植治疗可明显促进周围组织、细胞新生，对组织器官的损伤修复作用更为明显。
[0004]虽然通过干细胞补片移植的方法进行治疗能够一定程度提高损伤组织器官的修复作用，但是在体内进行干细胞移植的治疗方法仍存在一定的缺陷:①数量来源紧缺:从临床应用的角度出发，除造血干细胞和间充质干细胞外，很多种类临床应用价值高的干细胞由于提取困难或伦理问题限制了其临床应用，而异体来源的干细胞移植后易产生免疫排斥反应，如皮肤干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞等干细胞体外的生物学活性难以维持:在目前各种细胞片构建技术中，其研宄重点在于如何构建较完整的细胞片，并没有涉及干细胞活性的维持方案，包括目前运用最为成熟广泛的细胞片构建温敏培养法。因此，在使用这些方法进行干细胞补片构建容易导致干细胞在构建过程中出现分化现象，降低其增殖、旁分泌等生物学活性，不利于干细胞在体内发挥组织修复的作用；③干细胞补片构建周期较长:目前干细胞补片构建策略主要通过干细胞高密度种植培养，待细胞之间建立细胞连接连成片状再进行收获和后续加工操作。此类细胞补片构建周期较长，一般需要7至14天，此过程易降低干细胞生物学活性，也不利用干细胞补片产业化生产与保存；④干细胞体内移植存在风险与未知因素:干细胞是一类具有强自我更新能力的细胞，其体内移植成瘤风险是目前干细胞治疗的关注重点之一。另外，由于干细胞治疗发生机制尚不完全清楚，干细胞体内移植后可能因周围环境作用出现过度增殖、未像预期方向分化、迀移、凋亡、免疫排斥等不可控情况，很大程度上影响治疗效果。
[0005]随着干细胞作用机制研宄的深入，多项研宄表明干细胞在体内多数是通过旁分泌生长因子和细胞因子等物质发挥治疗作用，而外泌体正是这类物质的重要转运载体。近年来，研宄发现由干细胞天然分泌的外泌体在信息传递、调控、转运、免疫中发挥着重要作用，可广泛应用于临床治疗、美容等方面。外泌体是干细胞分泌的膜性小囊泡，当来源细胞外排时获得其膜蛋白成分，可选择性地将来源细胞内部含有的蛋白质、核酸等运送到受体细胞，调节细胞间信号传导。
[0006]相较于构建干细胞细胞补片的组织工程产品来说，干细胞外泌体补片的无细胞产品具有明显优势，具体在于:①来源广泛，易于收集与储存:绝大多数干细胞在一定环境条件下都能够持续不断分泌外泌体，且同种异体间外泌体差异微小，因而可以在细胞培养过程中不断提取外泌体，并通过离心、过滤、色谱、层析、物理吸附等常用方法获得所需外泌体，收集得到的外泌体可于4°C短期保存或-80°C长时间保存避免干细胞直接移植:干细胞外泌体补片结构稳定，能极大程度上避免发生类似干细胞补片体内移植后细胞迀移、失效、不定向分化的可能性，提高作用效率；③内容物丰富，治疗效果与干细胞直接移植相似:外泌体是由细胞分泌到体外的囊状结构，包含多种来自细胞内的蛋白质如生长因子、促血管生成因子等，以及核酸、脂类物质，是目前已知的干细胞旁分泌作用中重要的组成；④以补片形式植入提高外泌体作用靶向性:在目前的研宄中，研宄者多采用外泌体混悬液直接注射到组织或器官中的方法，虽然也有一定的治疗效果，但易造成外泌体的流失，而外泌体补片植入体内后定向作用于目的区域，在该区域能够长时间释放外泌体内的物质，延长外泌体作用时间；⑤易于规范化生产:干细胞外泌体补片更加易于标准化，能够准确测定相关计量和生物学活性，其负载量可人为控制，且补片可大量生产，成本较低、工艺简单。
[0007]由于干细胞补片多利用低分化的干细胞作为种子细胞，其对于生存环境要求高，通常植入体内后难以达到预期的分化结果，影响治疗效果。故可将干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因而在体外获得干细胞外泌体并以此制成补片植入，将成为细胞疗法的创新之举。
【发明内容】
[0008]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种干细胞外泌体(stem cell-derived exosome)补片的制备方法。该方法能在避免细胞片治疗缺陷的基础上提供优于细胞片治疗的效果。
[0009]本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的干细胞外泌体补片。
[0010]本发明的再一目的在于上述干细胞外泌体补片的应用。
[0011]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0012]一种干细胞外泌体补片的制备方法，包括以下步骤:
[0013](I)培养干细胞并收集干细胞的外泌体；
[0014](2)制备补片支架；
[0015](3)将步骤(I)得到的外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片。
[0016]所述的干细胞优选为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞中的一种或一种以上;
[0017]所述的干细胞优选为胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、神经干细胞、造血干细胞、成体干细胞和经血干细胞中的一种或一种以上；
[0018]所述的干细胞的外泌体指的是干细胞分泌的分子直径为30?10nm的亚细胞双层囊膜泡；
[0019]所述的收集的方法指的是通过收集培养上清液，经过离心法、色谱法、过滤法、免疫磁珠法和物理吸附法中的一种或一种以上方法进行外泌体的收集；
[0020]所述的离心法优选为超速离心、差速离心、超滤离心、密度梯度离心和旋转超滤中的一种或一种以上的方法进行外泌体的收集；
[0021]所述的色谱法指利用凝胶层析法、吸附层析法和离子交换法中的一种或一种以上的方法分离出完整的外泌体的收集方法；
[0022]所述的免疫磁珠法指将含有外泌体相关抗原的抗体的免疫磁珠与外泌体共同孵育，用蒸馏水冲洗后，放入PBS缓冲液中的收集方法；
[0023]所述的抗体优选为CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166 和 CD9 中的一种或一种以上；
[0024]所述的物理吸附法优选为静电吸附和磁力吸附中的一种或一种以上的收集方法;
[0025]所述的过滤法指利用纳滤膜和超滤膜中的一种或一种以上的膜将不同分子量或粒径的分子分离得到外泌体的方法；
[0026]所述的干细胞的外泌体指经过干细胞“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成并可分泌的分子，在体内或体外发挥信息传递、调控、转运、免疫的任何一种或一种以上的功能；
[0027]所述的干细胞的外泌体内含有用于体内或体外发挥信息传递、调控、转运、免疫的蛋白、核酸、酶和细胞因子中的一种或一种以上；
[0028]所述的补片的载体为天然载体或合成载体；
[0029]所述的天然载体优选为由基质胶、胶原凝胶、壳聚糖、明胶、脱细胞基质、动物腹膜、氨基葡聚糖任何一种或一种以上的天然材料制备获得；
[0030]所述的合成载体优选为由乙稀-醋酸乙稀共聚物(Ethylene Vinyl Acetate，EVA)、聚乳酸-轻基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚乳酸(polylacticacid，PLA)、藻酸盐和聚己内醋(polycaprolactone average)中的一种或一种以上的合成材料制备获得；
[0031]所述的脱细胞基质指的是利用天然组织形成的天然载体材料，优选为脱细胞角膜基质、脱细胞皮肤基质或脱细胞心脏基质形成的天然载体材料；
[0032]所述的外泌体附着在补片支架上指利用凝胶混悬法、交联剂法、带电吸附法和致孔注入法中的一种或一种以上的方法制备获得；
[0033]所述的凝胶指的是纳米纤维凝胶、纳米多肽凝胶、纤维蛋白凝胶、交联葡聚糖凝胶、胶原凝胶、明胶、壳聚糖凝胶和琼脂糖凝胶中的一种或一种以上；
[0034]所述的交联剂指的是1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(N-(3_Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDAC)、N-轻基瑭泊酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)、糖胺聚糖(glycosaminoglycan)、京尼平(Genipin)和戊二醛(glutaraldehyde，GA)中的一种或一种以上；
[0035]所述的带电吸附法指的是利用外泌体质膜表面带电的特性将其吸附到带电情况相反的带电补片载体上的方法；
[0036]所述的致孔注入法指利用致孔剂使补片载体内部成孔，再通过超饱和气体法、超临界流体致孔法、热致相分离法和微乳液聚合法中的一种或一种以上的方法去除致孔剂，而使外泌体留在补片载体内的孔中的方法；
[0037]所述的带电补片载体指的是将天然带电的壳聚糖、肝素等附着在补片载体形成的补片载体；
[0038]所述的致孔剂优选为氮气、二氧化碳、水、聚乙稀 醇(polyvinyl alcohol，PVA)、聚乙稀P比略烧酮(polyvinyl pyrroIidone,PVP)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等中的一种或一种以上。
[0039]一种干细胞外泌体补片，通过上述制备方法制备得到。
[0040]所述的干细胞外泌体补片在组织工程领域中的应用。
[0041]本发明选用干细胞外泌体构建干细胞外泌体补片，根据不同治疗目的，可选用不同来源的干细胞，通过直接收集或诱导或体外模拟微环境促使其产生外泌体，并可选用多种方法灵活制备所需的补片。
[0042]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0043](I)药物来源天然:外泌体是细胞分泌的一种天然微球，内含蛋白质、脂类、核酸等多种物质，且有良好的靶向性，植入后快速聚集于目的区域，持续释放高浓度营养或各类因子。相较于细胞片，该补片成本低，效率高，作用时间长，效果更好，免疫排斥可能性极低。可针对不同组织或器官受损情况控制剂量，避免干性高的干细胞在体内成瘤的可能性，以及避免胚胎干细胞应用的伦理道德问题。
[0044](2)容易获取:目前已有的外泌体获取方法多，且过程简易、方便、外泌体获取量大，前期准备工作轻松。此外，可通过诱导或体外模拟微环境的方式大量生产应用于不同情况的外泌体，便于后期保存、配置。已知的外泌体来源广泛，不限于人体干细胞，且不同生物来源的外泌体间差异微小，不易出现异体排斥现象。
[0045](3)可保障外泌体补片作用部位准确性:相较于外泌体悬液的直接注射，补片作为良好载体将外泌体固定在一定部位，保障外泌体植入后的定点定向作用，大大降低外泌体流失的可能性。此外，补片支架作为外泌体的储存容器，可一定程度上保护外泌体不受或降低外界的不良影响。
[0046](4)可延长补片植入后有效作用时间:天然外泌体是亚细胞双层囊膜泡，其膜结构来自细胞质膜，能保护内部物质，避免植入后被快速降解。并且不具有生物毒性或生物毒性较小，不易受体内环境影响发生不可预料的在形态、性质等方面的大的改变。天然外泌体的双层膜结构使其内部物质的释放一定程度上受作用微环境影响，并可以做成有缓释作用的补片，是天然的运载体、营养缓释系统、调节系统。
[0047](5)可很大程度上避免安全隐患:天然外泌体的采集为批量采集，来源、成熟程度相似或相同，保证其作用效果相同或相似，避免发生如不定向分化等不良结果影响的发生。且构建干细胞外泌体补片相较于干细胞细胞补片简易，减少外来物质的需求量，更加接近天然成分。通过本发明所述的方法，可获得具有良好生物学特性的干细胞外泌体补片，是组织工程领域构建生物补片的新突破，同时本产品也为解决临床疾病治疗提供了可行的方案。本发明原理科学可靠，工艺简单灵活。
【具体实施方式】
[0048]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0049]实施例1以脱细胞心包膜为载体的心脏干细胞外泌体补片用于心肌梗死治疗
[0050](I)实验原理
[0051]以天然的脱细胞心包膜为补片载体，利用过滤离心法提取体外培养至第3代的心脏干细胞所分泌的心脏干细胞外泌体，通过纤维蛋白凝胶混悬法将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替心脏干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善心肌梗死情况的作用。
[0052]⑵实验用具
[0053]仪器及试剂:移液枪、离心管、100-kDa MWCO中空纤维膜(Millipore)、PBS磷酸缓冲溶液(Sigma)、30%蔗糖/D2O缓冲液(密度1.210g/cm3)、低温超速离心机、100-kDa MWCOUltrafree-15 胶囊(Millipore)、含抗生素(100U/mL 青霉素 G，100 μ g/mL 硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6)、无菌纯水、水浴箱、含0.3% (w/v)十二烧基硫酸钠的无菌PBS盐溶液(0.01mol/L、pH = 6?8)、磁力搅拌器、直径12mm的环钻、含1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 24mg/mL和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)60mg/mL的PBS盐缓冲液(0.01mol/L、pH = 7?8)、纤维蛋白凝胶、培养箱。
[0054]实验材料:纯化的(7?8) XlO6个/cm 2第3代的心脏干细胞、新鲜猪心包膜(25cm2) ο
[0055](3)实验步骤
[0056]a.培养干细胞并提取所述干细胞的外泌体:
[0057]无菌条件下收集纯化的(7?8) X 16个/cm2经原代培养传至第3代的心脏干细胞的培养上清液10mL，以2000g离心20min去除细胞碎片。浓缩后的上清液进一步用100-kDaMWCO中空纤维膜(Millipore)于100g离心30min，2次，将获得的上清液稀释在PBS磷酸缓冲溶液(Sigma)中。然后将溶液移入离心管中，与30%蔗糖/D2O缓冲液(密度1.210g/cm3) 一起在 4°C，10000g 下离心 lh。最后，用 PBS 溶液在 100-kDa MWCO Ultrafree-15 胶囊(Millipore)中以 100g 离心 30min，3 次。(方法参照:Lai RC, Arslan F，Lee MM, etal.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfus1n injury.StemCell Res, 2010，4:214-222)
[0058]b.制备补片支架:
[0059]在室温、常规无菌操作下，将新鲜猪心包膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/mL青霉素G，100 μ g/mL硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6)浸泡2次，每次5分钟。将心包膜置入无菌纯水中，在37°C水浴中浸泡30分钟。浸泡后置入1mL含0.3% (w/v)十二烷基硫酸钠的无菌PBS盐溶液(0.0lmol/L、pH = 6?8)中，在37°C水浴中震荡处理(转速=185rpm) 10?12小时。后置入50ml含抗生素(100U/mL青霉素G，100 μ g/mL硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6)中，在25°C水浴中震荡(转速=185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到洗净后的脱细胞猪心包膜。用直径12mm的环钻钻取12mm直径脱细胞猪心包膜材料，将其浸泡在含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 24mg/mL 和 N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 60mg/mL 的 PBS 盐缓冲液(0.01mol/L, pH =7?8，Sigma)中反应20分钟，用蒸馏水轻柔清洗6次，每次30分钟。清洗后的脱细胞心包膜密封于无菌塑料袋中，用钴60 (15kGy)照射灭菌后，4°C下保存备用。
[0060]c.将所述外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0061]将获得的外泌体与20 μ L纤维蛋白凝胶混合均匀，并滴加于制备的脱细胞心包膜表面，放入37 °C培养箱中静置5min，使其凝固。
[0062]⑷实验结果
[0063]免疫荧光染色表明心脏干细胞外泌体补片促进新血管形成，血管密度达到约150?200/梗死面积(mm2)，有利于梗死区域心肌细胞的再生。移植I周后，超声波心电图表明左心室压力下降约8%?10%。左心室射血分数(LVEF)改善程度相较于用心脏干细胞补片治疗提高5?8%。移植一周后取出补片，由ELISA分析显示补片中碱性成纤维细胞生长因子(b fibroblast growth factor，bFGF)、肝素生长因子(hyparin growth factor,HGF)、胰岛素样生长因子I (insulin-like growth factor-1, IGF-1)的含量较移植前下降20%，说明心脏干细胞外泌体补片持续时间可达一周及以上。病理切片表明有效抑制左心室壁变薄。
[0064]实施例2以聚乳酸(polylacticacid，PLA)为补片载体的骨髓间充质干细胞外泌体补片用于股骨头坏死治疗
[0065](I)实验原理
[0066]以合成的聚乳酸(polylacticacid，PLA)为补片载体，利用免疫磁珠法提取体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞所分泌的骨髓间充质干细胞外泌体，通过纳米多肽凝胶混悬法将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替骨髓间充质干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善股骨头坏死情况的作用。
[0067](2)实验用具
[0068]仪器及试剂:PBS磷酸缓冲液(Sigma)、无血清且去除外泌体的BMSC培养液、培养箱、超速离心机、SW28 转子(Beckman Coulter Instruments，Fullerton，CA)、0.32M 鹿糖、SW60rotor (Beckman Coulter Instruments)、免疫磁珠(Miltenyi)、羊抗鼠免疫球蛋白 G(Invitrogen Dynal AS，Oslo，Nroway)、抗 CD9 单克隆抗体(clone MM2/57，ChemiconInternat1nal, London，UK)、12nm 的环钻、纳米多肽凝胶(acetyl-(Arg-Ala-Asp-Ala)4_amide.4HCL，BD B1caotPuraMatrix)。
[0069]实验材料:纯化的(7?8) X 16个/cm 2第3代骨髓间充质干细胞、聚乳酸(polylacticacid, PLA)。
[0070](3)实验步骤
[0071]a.培养干细胞并提取所述干细胞的外泌体:
[0072]无菌条件下收集纯化的(7?8) X 16个/cm 2经原代培养传至第3代骨髓间充质干细胞(BMSC)用PBS磷酸缓冲液(Sigma)清洗培养皿2次，在无血清且去除外泌体的BMSC培养液中于37 °C培养箱孵育4 8h后，上清液经400 X g (1min)，3000 X g (20min)，10000 X g (30min)连续离心。外泌体于 64000 Xg (I1min)用 SW28 转子(Beckman CoulterInstruments, Fullerton，CA)浓缩。外泌体沉淀在0.32M鹿糖中重悬，然后10000Xg离心 lh(SW60 rotor, Beckman Coulter Instruments)。外泌体通过免疫磁珠(Miltenyi)进一步纯化。25 μ L预涂有羊抗鼠免疫球蛋白G(Invitrogen Dynal AS，Oslo，Nroway)的免疫磁珠与 30 μ L 抗 CD9 单克隆抗体(clone MM2/57，Chemicon Internat1nal, London,UK)孵育lh。其后，磁珠与20 μ g外泌体在4°C混悬lh。清洗4次后，外泌体和磁珠在PBS中再次重悬。(方法参照:Jansen FH, Krijgsveld J, van Rijswijk A, et al.ExosomalSecret1n of Cytoplasmic Prostate Cancer Xenograft-derived Proteins.Mol CellProteomics, 2009, 8:1192-1205)
[0073]b.制备补片支架:
[0074]用直径为12nm的环钻在现成的PLA补片上钻取直径为12nm的PLA补片载体备用。
[0075]c.将所述外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0076]将有上述步骤获得的外泌体悬液与20 μ L已制备好的纳米多肽凝胶溶液(acetyl-(Arg-Ala-Asp-Ala)4-amide ?4HCL,BD B1caotPuraMatrix)混合均勾，并滴加于制备的PLA补片载体表面，放入37°C培养箱中静置5min，在骨髓间充质干细胞培养液(DMEM基础培养液(Corning), 10% (v/v)已滤除外泌体的胎牛血清(Corning Cellgro)+1% (w/v)谷氨酰胺(Corning Cellgro)+100U/mL 青霉素 G(Sigma)+100 μ g/mL硫酸链霉素(Sigma))中静置5min，使其凝固。
[0077]⑷实验结果
[0078]植入股骨头坏死动物模型I周后，骨质密度提高12 %?18 %，关节功能改善40 %，病理组织学表现为空骨陷窝减少，成骨细胞增多，另外，血管密度提高15%?20%。此外，骨髓间充质干细胞来源的外泌体展现出对癌症、致死性心脏疾病、免疫疾病的治疗的优异作用。
[0079]实施例3以藻酸盐(Alginates)补片为载体的皮肤干细胞外泌体补片用于皮肤创伤治疗
[0080](I)实验原理
[0081]以天然的藻酸盐(Alginates)为补片载体，利用旋转超滤法提取体外培养至第3代的皮肤干细胞所分泌的皮肤干细胞外泌体，通过纳米多肽凝胶混悬法将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替皮肤干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善皮肤创伤情况的作用。
[0082]⑵实验仪器
[0083]仪器及试剂:移液枪、低温离心机、离心管、0.22 μm滤膜(Millex_GP，Millipore)、无菌 PBS 磷酸缓冲液(Sigma)、10nm 超滤离心管(Amicon Ultra-4,Millipore)、0.22 μ m超滤离心管(Millipore)、D_ 葡萄糖酸半 1?盐(1.08% (w/v)，Sigma)、双蒸馏水、96-孔板(100 μ L/ 孔)、1.2mg ml^DMEM 培养液(Corning)、NaOH 溶液。
[0084]实验材料:纯化的(7?8) X 16个/cm2第3代皮肤干细胞、藻酸盐。
[0085](3)实验步骤
[0086]a.培养干细胞并提取所述干细胞的外泌体:
[0087]无菌条件下收集纯化的(7-8) X 16个/cm2经原代培养传至第3代皮肤干细胞的培养上清液10mL，在4°C下以300r/min离心10分钟后，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中。在4°C下以2000r/min离心20分钟，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中。在超净工作台中，将收集得到的液体用0.22ym滤膜(MilleX-GP，Millip0re)过滤。收集滤后液体，在4°C下以lOOOOOr/min离心70分钟，得到白色沉淀即为外泌体。吸去上清液，加无菌PBS磷酸缓冲液(Sigma)洗涤，在4°C下以100000r/min离心70分钟，用ImL无菌PBS重悬外泌体。再用10nm超滤离心管(Amicon Ultra-4, Millipore)于4°C下以300r/min离心30分钟过滤，之后用0.22 μ m超滤离心管(Millipore)于4°C下以300r/min离心30分钟过滤外泌体备用。
[0088]b.制备补片支架:
[0089]藻酸盐溶于双蒸馏水中得到1.2%溶液(w/v)，当激发形成独特的藻酸盐交联时，然后加入D-葡萄糖酸半钙盐(1.08% (w/v), Sigma)交联，。交联藻酸盐溶液倒入96-孔板(100 μ L/孔)，在2?8°C下过夜冷冻，在_20°C冷冻24小时，并且冻干。支架暴露在UV 下杀菌 20min(方法参照:Y.Sapir et al.The promot1n of in vitro vessel-likeorganizat1n of endothelial cells in magneticalIy responsive alginatescaffolds.B1materials 33(2012)4100e4109)0
[0090]c.将所述外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0091]胶原蛋白基质的制备:将胶原分散到1.2mg Iiir1DMEM培养液(Corning)中并用NaOH溶液调pH到7.4。
[0092]将获得的外泌体与20 μ L胶原蛋白基质混合均匀，并滴加于制备的藻酸盐补片载体表面，37°C下培养45min，使其凝固。
[0093]⑷实验结果
[0094]植入创伤、受损部位后，伤口恢复速率提尚10%?18.4%，未出现炎症现象。I周后创口收缩率达17.5%?25%，且创伤部位新生细胞活性良好。ELISA检测表皮生长因子(EGF)表达明显上升15%?20%，SP免疫组织化学法能检测到创伤区域β I整合素、角蛋白19(Κ19)表达增多。HE染色切片发现新生表皮较厚，细胞层数较多且分层较为明显，创伤部位愈合较好。
[0095]实施例4以乙稀-醋酸乙稀共聚物(Ethylene Vinyl Acetate，EVA)补片为载体的胚胎干细胞外泌体补片用于慢性肝衰竭治疗
[0096](I)实验原理
[0097]以合成的乙稀-醋酸乙稀共聚物(Ethylene Vinyl Acetate，EVA)为补片载体，利用过滤离心法提取体外培养至第3代的胚胎干细胞所分泌的胚胎干细胞外泌体，通过EVA将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替胚胎干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善慢性肝衰竭情况的作用。
[0098](2)实验用具
[0099]仪器及试剂22μ m滤膜(MiIlex-GP，Millipore)、装有 100 000 NWCO超滤膜的Model 8050旋转超滤仪(Millipore)、氮气、磁力搅拌器、PBS磷酸缓冲液(Sigma)UZnn^a环钻、环己烧溶液(Sigma)。
[0100]实验材料:(7?8) X 16个/cm 2第3代的胚胎干细胞、乙烯-醋酸乙烯共聚物(Ethylene Vinyl Acetate，EVA)。
[0101](3)实验步骤
[0102]a.培养干细胞并提取所述干细胞的外泌体:
[0103]将纯化的(7?8) X 16个/cm 2经原代培养传至第3代的胚胎干细胞向肝细胞方向诱导成功后，于无菌条件下收集其培养上清液50mL，在超净工作台中用0.22 μπι滤膜(Mi I lex-GP, Millipore)进行过滤。将收集到的上清液加入装有100000NWC0超滤膜的Model 8050旋转超滤仪(Millipore)中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下，打开磁力搅拌器(IKA)，使涡漩高度为液体高度的1/3。待上清液超滤完毕后，加入50mLPBS磷酸缓冲液(Sigma)并再次超滤，重复3次。超滤完毕后，用0.5mL PBS磷酸缓冲液悬浮超滤膜上的外泌体待用。(方法参考:胡国文等，旋转超滤:一种提取细胞外泌体的新方法，Acad J Sec Mil Med Univ, 2014, 35(6):59860)
[0104]b.制备补片支架:
[0105]用直径为12nm的环钻在现成的EVA补片上钻取直径为12nm的EVA补片载体备用。
[0106]c.将所述外泌体附着在补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0107]在EVA补片表面涂抹0.3%的EVA环己烧溶(Sigma)中，置于室温挥发，在完全干燥前使外泌体悬液缓慢滴在EVA补片载体表面使其附在EVA补片载体表面，再将EVA的环己烷溶液放入聚四氟乙烯(Sigma)槽中在室温下晾干，制备的EVA薄膜浮在表面。将补片自然风干，得到附有胚胎干细胞外泌体的EVA补片。
[0108](4)实验结果
[0109]诱导胚胎干细胞向肝细胞方向转变后，用RT-PCR和Western blot法检测到干细胞标志物甲胎球蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表达量随着时间的延长明显增加。将补片移植到慢性肝衰竭动物模型7天后，肝细胞双核增多，并出现炎性细胞浸润，坏死灶明显减小，充血、出血现象减轻。模型组肝功能指标丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的表达均下降8.7%?15%，而白蛋白(ALB)表达无明显变化。
[0110]实施例5以脱细胞羊膜为载体的经血干细胞外泌体补片用于I型糖尿病治 疗
[0111](I)实验原理
[0112]以天然的脱细胞羊膜为补片载体，利用旋转超滤法提取体外培养至第3代的经血干细胞所分泌的经血干细胞外泌体，通过交联法将外泌体附着在补片支架上，以期制备为代替经血干细胞补片却能极大程度上达到细胞补片改善I型糖尿病情况的作用。
[0113](2)实验用具
[0114]仪器及试剂:低温离心机、离心管、0.22 μ??滤膜(Millex_GP，Millipore)、无菌PBS 磷酸缓冲液(Sigma)、10nm 超滤离心管(Amicon Ultra-4, Millipore)、0.22 μ m 超滤离心管(Millipore)、含抗生素(100U/mL青霉素G和100 μ g/mL硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6，Sigma)、无菌纯水、水浴箱、(使用0.05mol/L碳酸盐缓冲液配制，pH = 8?9 ;磷脂酶Al = 200U/mL，磷脂酶A2 = 250U/mL, Sigma)、12mm的环钻、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，Sigma)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS, Sigma)的一水吗啉乙磺酸(MES, Sigma)缓冲液(0.lmol/L、pH = 6.0)、摇床、磷酸氢二钠溶液(0.lmol/L, Sigma)、氯化钠溶液(4mol/L，Sigma)。
[0115]实验材料:纯化的(7?8) X 16个/cm2第3代经血干细胞、脱细胞羊膜。
[0116](3)实验步骤
[0117]a.培养干细胞并提取所述干细胞外泌体:
[0118]无菌条件下收集纯化的(7?8) X 16个/cm 2经原代培养传至第3代经血干细胞的培养上清液10mL，在4°C下以300r/min离心10分钟后，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中。在4°C下以2000r/min离心20分钟，吸取上清液至另一干净无菌的15mL离心管中。在超净工作台中，将收集得到的液体用0.22ym滤膜(Millex-GP，Millipore)过滤。收集滤后液体，在4°C下以lOOOOOr/min离心70分钟，得到白色沉淀即为外泌体。吸去上清液，加无菌PBS磷酸缓冲液(Sigma)洗涤，在4°C下以100000r/min离心70分钟，用ImL无菌PBS重悬外泌体。再用10nm超滤离心管(Amicon Ultra-4,MiIIipore)于4°C下以300r/min离心30分钟过滤外泌体。再用0.22 μπι超滤离心管(Millipore)于4°C下以300r/min离心30分钟过滤外泌体。
[0119]b.制备补片支架:
[0120]在室温，常规无菌操作下，将新鲜羊膜(25cm2)用无菌生理盐水反复擦洗，清除血块和浆液至干净，置于无菌方盘中，使用含抗生素(100U/mL青霉素G和100 μ g/mL硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH = 9.0?9.6)浸泡5次，每次10分钟。将羊膜置入无菌纯水中，在37°C水浴中浸泡60分钟。浸泡后将其置入1mL无菌磷脂酶溶液(使用0.05mol/L碳酸盐缓冲液配制，pH = 8?9 ;磷脂酶Al = 200U/mL，磷脂酶A2 =250U/mL，Sigma)中，在37°C水浴中震荡处理(转速=185rpm)6小时。后置入50mL含抗生素(100U/mL青霉素G和100 μ g/mL硫酸链霉素，Sigma)的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH=9.0?9.6, Sigma)中，在25°C水浴中震荡(转速=185rpm)冲洗6次，每次60分钟，得到脱细胞羊膜。
[0121]c.将所述外泌体附着在补片支架上，制得干细胞外泌体补片:
[0122]在室温下，常规无菌操作下，用直径12mm的环钻钻取12mm直径脱细胞羊膜材料，将其浸入到2mL外泌体悬液、3mmol/L 1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC, Sigma)和 5mmol/L N-轻基丁二酰亚胺(NHS，Sigma)的一水吗啉乙横酸(MES，Sigma)缓冲液(0.lmol/L、pH = 6.0)中，在摇床上(转速=40rpm)反应24?72小时后，依次用磷酸氢二钠溶液(0.lmol/L, Sigma)清洗6次，每次30分钟；氯化钠溶液(4mol/L，Sigma)清洗6次，每次30分钟；蒸馏水轻柔清洗6次，每次30分钟，得到以脱细胞羊膜为载体的经血干细胞外泌体补片。
[0123](4)实验结果
[0124]将补片植入I型糖尿病小鼠模型I周后，免疫荧光检测发现补片促进胰岛β细胞前体标记物Ngn3的表达，且发现Ngn3阳性细胞在导管上皮细胞、胰岛、外分泌组织均能检测到。此外，通过实时定量PCR检测β细胞分化发育基因明显上调13%，说明经血干细胞(mentrual blood progenitor cells，MBPCs)通过促进胰腺内源干细胞分化改善I型糖尿病。
[0125]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种干细胞外泌体补片的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)培养干细胞并收集干细胞的外泌体； (2)制备补片支架； (3)将步骤(I)得到的外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于: 所述的干细胞为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞中的一种或一种以上； 所述的干细胞的外泌体指的是干细胞分泌的分子直径为30?10nm的亚细胞双层囊膜泡。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于: 所述的干细胞为胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、神经干细胞、造血干细胞、成体干细胞和经血干细胞中的一种或一种以上； 所述的干细胞的外泌体内含有用于体内或体外发挥信息传递、调控、转运、免疫的蛋白、核酸、酶和细胞因子中的一种或一种以上。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于: 所述的收集的方法指的是通过收集培养上清液，经过离心法、色谱法、过滤法、免疫磁珠法和物理吸附法中的一种或一种以上方法进行外泌体的收集； 所述的补片的载体为天然载体或合成载体； 所述的外泌体附着在补片支架上指利用凝胶混悬法、交联剂法、带电吸附法和致孔注入法中的一种或一种以上的方法制备获得。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于: 所述的离心法为超速离心、差速离心、超滤离心、密度梯度离心和旋转超滤中的一种或一种以上的方法进行外泌体的收集； 所述的色谱法指利用凝胶层析法、吸附层析法和离子交换法中的一种或一种以上的方法分离出完整的外泌体的收集方法； 所述的免疫磁珠法指将含有外泌体相关抗原的抗体的免疫磁珠与外泌体共同孵育，用蒸馏水冲洗后，放入PBS缓冲液中的收集方法； 所述的抗体为⑶63、⑶81、⑶90、⑶73、⑶105、⑶29、⑶166和⑶9中的一种或一种以上; 所述的物理吸附法为静电吸附和磁力吸附中的一种或一种以上的收集方法； 所述的过滤法指利用纳滤膜和超滤膜中的一种或一种以上的膜将不同分子量或粒径的分子分离得到外泌体的方法。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于: 所述的天然载体为由基质胶、胶原凝胶、壳聚糖、明胶、脱细胞基质、动物腹膜、氨基葡聚糖任何一种或一种以上的天然材料制备获得； 所述的脱细胞基质为脱细胞角膜基质、脱细胞皮肤基质或脱细胞心脏基质形成的天然载体材料； 所述的合成载体为由乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、藻酸盐和聚己内酯中的一种或一种以上的合成材料制备获得。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于: 所述的凝胶指的是纳米纤维凝胶、纳米多肽凝胶、纤维蛋白凝胶、交联葡聚糖凝胶、胶原凝胶、明胶、壳聚糖凝胶和琼脂糖凝胶中的一种或一种以上； 所述的交联剂指的是1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、糖胺聚糖、京尼平和戊二醛中的一种或一种以上； 所述的带电吸附法指的是利用外泌体质膜表面带电的特性将其吸附到带电情况相反的带电补片载体上的方法； 所述的致孔注入法指利用致孔剂使补片载体内部成孔，再通过超饱和气体法、超临界流体致孔法、热致相分离法和微乳液聚合法中的一种或一种以上的方法去除致孔剂，而使外泌体留在补片载体内的孔中的方法。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于: 所述的带电补片载体指的是将天然带电的壳聚糖、肝素附着在补片载体形成的补片载体； 所述的致孔剂为氮气、二氧化碳、水、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的一种或一种以上。9.一种干细胞外泌体补片，通过权利要求1?8任一项所述的制备方法制备得到。10.权利要求9所述的干细胞外泌体补片在组织工程领域中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用，属于组织工程领域。该干细胞外泌体补片包括以下步骤：培养干细胞并收集干细胞的外泌体；制备补片支架；将得到的外泌体附着到补片支架上，制得干细胞外泌体补片。本发明获得的干细胞外泌体补片的药物来源天然、容易获取、可保障外泌体补片作用部位准确性、可延长补片植入后有效作用时间、可很大程度上避免安全隐患。通过本发明所述的方法，可获得具有良好生物学特性的干细胞外泌体补片，是组织工程领域构建生物补片的新突破，同时本产品也为解决临床疾病治疗提供了可行的方案。本发明原理科学可靠，工艺简单灵活。
【IPC分类】C12N5/0797, C12N5/0789, C12N5/0735, C12N11/00, C12N5/0775
【公开号】CN104894062
【申请号】CN201510260758
【发明人】武征, 林熙, 王颖薇, 严惠泽, 周清, 张建华, 张中夏, 秦子夕, 樊泽培, 路程
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月19日
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