一种用于培养间充质干细胞的培养基的制作方法
一种用于培养间充质干细胞的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞与组织培养领域，特别是一种用于培养间充质干细胞的培养基。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞，英文名称为mesenchymal stem cells (MSC)，是指单个或一群符合 国际统一标准的细胞（Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006 ;8 (4):315-7)〇
[0003] 在骨髓中，MSC属于非造血干细胞，具备向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化的能力， 具有免疫调节和造血支持作用。最近的研宄表明，MSC也存在于其它组织，包括脂肪、脐带、 胎盘和肌肉等。体外培养的MSC可以分泌多种生物活性物质，具有促进新生血管形成，促进 神经组织、骨组织、肝脏组织和胰岛组织损伤修复的作用。
[0004] 因此，自体或异体MSC已经用于临床试验研宄，以治疗移植物抗宿主病、肝脏纤维 化、脊髓损伤、糖尿病、外周血管病等多种疾病。另外，作为组织工程化骨和软骨构建中重要 的种子细胞，MSC也用于股骨头坏死、骨折后骨不连和软骨损伤的治疗。
[0005] 然而，涉及多种疾病的细胞治疗需要一定的细胞量。为进行以MSC为基础的细胞 治疗，人们通常获取少量的骨髓，或获取脐带、脂肪或胎盘组织，在体外通过贴壁生长筛选 并扩增MSC，待细胞量达到治疗所需量时，收获MSC用于以上疾病的治疗，体外扩增MSC是实 施MSC细胞治疗的关键步骤之一。
[0006] 通常，人们利用经筛选、适于人MSC生长的牛血清，作为细胞增殖的主要刺激物， 体外培养扩增MSC。然而，研宄表明，在培养过程中，MSC可以吞噬培养体系中的牛蛋白，使 异种_+
[0007] 蛋白内在化，每IO8MSC中牛蛋白含量达到10_30mg (Spees几 ，Gregory CA, Singh H，Tucker HA, Peister A, Lynch PJ, Hsu SC, Smith J, Prockop DJ. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Mol Ther 2004;9:747-56)。
[0008] 因此，使用牛血清培养人MSC用于细胞治疗，不仅将使病人暴露于罹患人畜共患 病的风险，也可能因移植MSC死亡释放牛蛋白，引起机体免疫反应，造成血清病或其它免疫 性疾病。
[0009] 此外，每批次血清的活性是不同的，对批次间收获的细胞的稳定性，有一定影响。 因此，利用一种无动物血清成分的培养基，培养扩增MSC，对治疗的安全性和有效性，都是十 分必要的。
[0010] 为此，人们一直在寻找动物血清替代物，用于人MSC的培养。
[0011] 有人用血清替代物Ultroser G替代牛血清，培养人骨髓MSC，获得了较好的效 果(Meuleman N, Tondreau T,Delforge A, Dejeneffe M, Massy M, Libertalis M, Bron Dj Lagneaux L. Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum-free medium allows better expansion than classical alpha-MEM medium. Eur J Haematol 2006 ； 76:309 - 16)〇
[0012] 然而，Ultroser G本身就含有牛血清成分，这种方式的替代并不能从根本上 角军决异体蛋白污染问题（Korhonen M. Culture of human mesenchymal stem cells in serum-free conditions:no breakthroughs yet. Eur J Haematol 2006 ;78:167)〇
[0013] 之后，有人提出应用人血小板浓缩液替代牛血清，并获得了较好的效果。但是，血 小板供者是否完全正常，这种使用方式能否引起传染病的传播，以及能否保障所获得MSC 的批次间稳定性等，都是必须考虑的问题。
[0014] 因此，研制化学成分清晰明确、无动物血清成分的MSC培养基，是很有必要的。
[0015] 有人曾报道一种人脐带血MSC的无血清体系，血清替代成分为碱性成纤维细胞生 长因子（bFGF)、人白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITSE)和氢化可的松，可简称为 FAITH，据报道效果较好（Liu CH, Wu ML, Hwang SM. Optimization of serum free medium for cord blood mesenchymal stem cells. Biochemical Engineering Journal, 2007 ； 331 - 9)〇
[0016] 然而，利用该体系进行人脐带MSC培养，发现细胞呈球形生长方式（见图I);而 且，随着培养时间的延长，细胞出现自发分化现象，细胞的本质发生了变化。这可能与加 入高浓度的氢化考的松有关。皮质类激素，包括地塞米松和氢化考的松，在一定浓度下虽 然能刺激MSC增殖，也能使MSC发生非特异性分化（Williams JT，Southerland SS，Souza J,Calcutt AF, Cartledge RG. Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes. Am Surg. 1999 ； 65:22-6)。因此可以认为，以bFGF-ITSE和氢化可的松等为主的血清替代物进行MSC培养， 其本身的稳定性和对干细胞多能性的维持，可能存在诸多不肯定的因素。
【发明内容】
[0017] 针对现有的牛血清培养基及人血清培养培养间充质干细胞存在的问题，本发明 的目的是提供一种无血清、化学成分清晰的适用于培养间充质干细胞的培养基。
[0018] 其解决问题的技术方案是：
[0019] 一种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括基础培养基和培养基添 加剂两类组份。
[0020] 所述的培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生 素类物质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0021] 上述培养基中每类物质组成特点描述如下：
[0022] (1)基础培养基頂DM，是在商售頂DM基础上，添加至少包括生物素（1-50 μ M) 和谷氨酰胺（l-50yM)在内的水溶性化合物；所述水溶性化合物还可包括氯化铬 (0· 1-10 μ g/L)、硫酸铜（0· 1-lmg/L)、氯化猛 0· 01-0. lmg/L 和硫酸锌 0· l-10mg/L。进行改 良后间充质干细胞增殖速度增加。
[0023] (2)所述细胞生长因子组合至少包括碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，I-IOOng/ mL)和表皮生长因子（EGF，l-100ng/mL)，还可包括激活素 A(activin A，l-100ng/ml)、转 化生长因子-MTGF-β，l-100ng/mL)、骨形成蛋白（BMP，l-100ng/mL)、白血病抑制因子 (LIF，Ι-lOOng/mL)、干细胞生长因子（SCF，Ι-lOOng/mL)、肝细胞生长因子（HGF，I-IOOng/ mL)、胰岛素样生长因子-I (IGF-1，Ι-lOOng/mL)、促红细胞生成素（EP0,0. l-50U/mL)、血清 素（l-100nM/L)、血小板源生长因子 BB(PDGF-BB，l-100ng/mL)、白介素-6(IL-6,1-IOOng/ mL)。这些细胞因子和生长因子，是始动间充质干细胞增殖的重要组成部分。
[0024] (3)所述胰岛素添加量为5-500 μ g/mL，可为临床级用药或重组蛋白。
[0025] 胰岛素参与细胞糖代谢。
[0026] (4)所述微量元素至少包括硒（IO-IOOnM)，以亚硒酸钠或其它化合物形式提 供，所述微量元素组合还可包括氯化铬（〇.1-1(^8/1)、氯化铜（0.1-1 11^/1)、氯化锰 0· 01-0. lmg/L、氯化锌 0· 1-10 μ g/L 以及钼酸钠（100-1000ng/mL)。
[0027] 微量元素不但促进细胞增殖，也是细胞结构组成必要的成分。
[0028] (5)所述脂类物质可为胆固醇（10-100 μ g/mL)，还可为亚油酸（l-50mg/L)、亚麻 酸（1-50 μ g/mL)、中链甘油三酯（1-500 μ g/mL)、卵磷脂（0· 1 - 20 μ g/mL)和注射用大豆 油（1-500 μ g/mL)〇
[0029] 脂类是细胞膜结构的主要成分。
[0030] (6)所述维生素类物质包括脂溶性和水溶性维生素两种，包括维生素 B组如 Vit-B 5 (1-100 μ M)、维生素 A (1-200 μ M)、维生素 C (50 μ g/mL)、维生素 E (10-100 μ g/mL)。
[0031] 添加维生素的目的在于基础培养基中维生素含量偏低，添加后能促进细胞增殖。
[0032] (7)所述激素类物质为地塞米松（低于10-9M)或氢化考的松（低于5 μ g/mL)。皮 质类激素是血清中促细胞增殖的成分之一，在无血清体系中添加，能促进间充质干细胞增 殖。
[0033] (8)所述蛋白质分子主要为注射用人白蛋白，添加量为5_50mg/mL，也可包括其它 分子，如乙酰辅酶 A(0. l-10U/mL)、辅酶 I(10-1000ng/mL)。
[0034] 作为一种载体，白蛋白是细胞物质转运的关键分子。
[0035] (9)所述氨基酸类物质指多种氨基酸复合物，可包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙 氨酸、L-异亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨 酸、苏氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸和甘氨酸，添加量为1-100 μΜ。可以用商购的细胞培 养用复合氨基酸的形式提供。氨基酸是细胞蛋白代谢的必需成分。
[0036] (10)所述其它化合物：所述培养基中还可包含有二巯基乙醇（IXKT6M-IXl(T 4M)和其它化合物，包括还原型谷胱甘肽（0. l-10mg/L，作为一种还原剂保护细 胞免受氧自由基的损害），胶原或纤连蛋白或明胶（l〇yg-l〇mg/mL)以促进细胞贴壁、 wnt-3a(l_100ng/mL)以及 Bio(5_250nM)以调节细胞增殖。
[0037] 本发明所提供的培养基不含血清或血浆，使用该体系培养间充质干细胞，在细胞 治疗过程中将避免因动物血清或血浆引起的人畜共患病，以及因细胞治疗引起的人体免疫 反应的风险。此外，该培养基化学成分明确清晰，避免了因培养体系批次间差异，造成所培 养的间充质干细胞性质不同的可能性。本发明的培养基不仅适用于人骨髓和人脐带来源的 间充质干细胞的培养，也可适用于其它组织或其它动物间充质干细胞的培养，应用前景广 阔。
【附图说明】
[0038] 图1为不同培养基培养的人脐带MSC细胞形态。
[0039] 图2为不同培养基培养的人骨髓MSC表型分析结果。
[0040] 图3为不同培养体系人脐带和骨髓MSC增殖特点。
[0041] 图4为不同体系培养条件下人骨髓MSC分化特性。
【具体实施方式】
[0042] 以下结合实施例对发明的内容做出详细的说明：
[0043] 实施例1、
[0044] 一种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基有以下成分组成包括基础培养基 和培养基添加剂两类组份，
[0045] 培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物 质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0046] 无血清培养基的配方
[0047]
[0048]
[0049] 实施例2、
[0050] -种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括基础培养基和培养基添 加剂两类组份。
[0051] 培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物 质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0052] 无血清培养基的配方
[0053]
[0054]
[0055] 实施例3、
[0056] -种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括基础培养基和培养基添 加剂两类组份。
[0057] 培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物 质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0058] 无血清培养基的配方
[0059]
[0060]
[0061] 实施例4、
[0062] 一种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括基础培养基和培养基添 加剂两类组份。
[0063] 培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物 质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0064] 无血清培养基的配方
[0065]
[0066]
L〇〇67」 买施例在以不友明扠木万菜为前提卜进仃买施，给出丨评细的买施万式和具体的 操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
[0068] 下述实施例及试验中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0069] 实验一、
[0070] 人脐带MSC在不同培养基中的培养
[0071] 1、试验材料
[0072] 标本：人脐带MSC取自正常分娩出生后的胎儿。
[0073] 试剂：胶原蛋白酶I、胰蛋白酶、a-MEM和IMDM购自Invitrogen公司；胎牛血清 (FCS)为加拿大StemCell公司产品；配制SF-M和FAITH的试剂多购自Sigma公司，为培养 纯。人白蛋白为注射用，为重组蛋白，由华北制药厂生产。
[0074] 2、试验方法
[0075] 1)人脐带MSC培养按常规方法进行，原代细胞培养体系为含10% FCS的 alpha-MEM。取第一代细胞用于以下试验。
[0076] 2)细胞培养及传代：贴壁层形成后，用0. 05 %胰蛋白酶/2mM EDTA消化，细胞计 数。将细胞分别悬浮于含10% FCS的alpha-MEM、含SF-M的IMDM或含FAITH的IMDM中， 然后按3000细胞/cm2进行传代培养。细胞传代过程中，显微照相，记录细胞形态。
[0077] 3、试验结果
[0078] 结果如图1
[0079] 图1.不同培养体系下人脐带MSC的形态。人脐带MSC分别在10% FCS(A，B)，文 献报道的无血清体系（FAITH，C和D)以及本发明的体系（SF-M，E和F)中培养，细胞低密度 时（A，C，E)和高密度时（B，D，F)形态的特点。
[0080] (A:脐带 MSC (Pl)在含 10% FCS (StemCell Co. Canada) alpha-MEM 中培养，细胞未 完全融合时的形态；B:脐带 MSC(Pl)在含 10% FCS(StemCell Co. Canada)alpha-MEM 中培 养，细胞完全融合时的形态；C:脐带MSC(Pl)在含FAITH的MDM中培养时细胞的形态；D: 脐带MSC(Pl)在含FAITH的頂DM中培养时的细胞形态；E:脐带MSC(Pl)在含SF-M的頂DM 中培养，细胞未完全融合时的形态；F:脐带MSC (Pl)在含SF-M的IMDM中培养，细胞完全融 合时的形态）所示，通过A/B和E/F比较可以发现，SF-M培养的MSC细胞折光性强，细胞较 细长；C/D所示细胞呈团块生长方式。
[0081] 试验二、
[0082] 不同培养基培养的人骨髓MSC表型分析
[0083] I、试验材料
[0084] 标本：人肝素化骨髓5mL，取自正常献髓者。
[0085] 试剂：PE标记小鼠抗人⑶14、⑶31、⑶44、⑶45、⑶73均为BD公司（美国）产品， 其它产品如试验一所描述。
[0086] 2、试验方法
[0087] 1)细胞培养：人骨髓MSC培养按文献中记载的方法进行（Jin JD，Wang HX，Xiao FJj Wang JSj Lou Xj Wang LSj Guo ZK. A novel source of human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow sample. Biochem Biophys Res Comm 2008 ；376:191-5)? 原代细胞培养体系为含10% FCS的alpha-MEM。取第一代细胞用于以下试验。
[0088] 将人骨髓MSC分别悬浮于含10 % FCS的alpha-MEM或含SF-M的IMDM中，然后按 3000细胞/cm2进行传代培养。待细胞传至第三代时，用0. 05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化， 细胞计数。
[0089] 2)细胞标记：用PBS洗涤收获的MSC，加入单克隆抗体室温避光反应30分钟。PBS 洗涤两次后，用流式细胞仪检测，每个反应至少收集10000个点数据。
[0090] 3)结果分析：WinMdi2. 9软件分析所收获数据，分析过程中设门去除细胞碎片。
[0091] 3、试验结果
[0092] 结果如图2
[0093] 图2:细胞在不同体系培养下表型特征。纵坐标：细胞数；横坐标：相对荧光强度。
[0094] (纵坐标：细胞数；横坐标：相对荧光强度）所示，人骨髓MSC(P3)在10% FCS(StemCell Co，Canada)和SF-M体系中培养，细胞表型一致，均表达CD44、CD73,不表达 ⑶31 (内皮细胞标记）、⑶14 (单核/巨噬细胞标记）、⑶45 (血细胞标记），表明两种体系培 养的骨髓MSC的表型均一性。
[0095] 试验三、
[0096] 不同体系培养条件下MSC增殖特性
[0097] 1、试验材料
[0098] 标本：人骨髓MSC和脐带MSC (P3)按试验一和试验二方法收获，P3代细胞用于以 下实验。
[0099] 试剂：细胞荧光标记物CFSE为Sigma产品。其它产品如试验一所描述。
[0100] 2、试 验方法
[0101] 1)细胞标记：CFSE标记MSC按本小组报道的方法进行（Jin JD，Wang HX，Xiao FJ, Wang JS, Lou X, Wang LS, Guo ZK. A novel source of human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow sample. Biochem Biophys Res Comm 2008 ;376:191-5)〇
[0102] 2)细胞培养：将标记后的细胞分别悬浮于含10 % FCS的alpha-MEM或含SF-M的 IMDM或含FAITH的IMDM中，然后按3000细胞/cm2进行培养。72小时后用0. 05 %胰蛋白 酶/2mM EDTA消化，细胞计数。
[0103] 2)流式细胞仪获取数据及结果分析：用PBS洗涤收获的MSC，用流式细胞仪检测， 每个反应至少收集10000个点数据。WinMdi2. 9软件分析所收获数据，分析过程中设门去除 细胞碎片。
[0104] 3、试验结果
[0105] 结果如图3
[0106] 图3.人脐带和骨髓MSC在不同体系培养下的增殖情况。第三代人骨髓或脐带MSC， 荧光染料CFSE标记后培养72小时，流式细胞仪收集数据，winmdi29软件分析。直方图： CFSE相对荧光强度；散点图：横坐标代表相对荧光强度，纵坐标代表SSC，表示细胞颗粒度。
[0107] (纵坐标：细胞数；横坐标：相对荧光强度）所示，应用CFSE标记第三代骨髓 MSC (BM-MSC)和脐带MSC (UC-MSC)，培养72小时后，流式细胞仪检测细胞荧光强度。直方图： 横坐标表不FLl相对焚光强度；纵坐标表不events。散点图：横坐标表不FLl相对焚光强 度；纵坐标表示SSC。结果提示BM-MSC和UC-MSC在10 % FCS和SF-M培养条件下，两种细 胞在两种体系中生长速度相当，无明显差别。细胞在FAITH中生长较差。
[0108] 试验四、
[0109] 不同体系培养条件下人骨髓MSC分化特性
[0110] 1、试验材料
[0111] 标本：人骨髓MSC(Pl)按试验二方法收获，Pl代细胞用于以下试验。
[0112] 试剂：分化诱导试剂包括维生素 C、磷酸甘油、地塞米松、消炎痛、IMBX、胰岛素，均 为Sigma产品。
[0113] 2、试验方法
[0114] 1)细胞传代培养：将Pl代骨髓MSC分别悬浮于含10%FCS的alpha-MEM或含SF-M 的MDM中，按3000细胞/cm2进行培养。传代至第三代时用于以下实验后。
[0115] 2)诱导分化：
[0116] 按文献中记载的方法（Sun S, Guo Z, Xiao X，et al. Isolation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a novel and reliable method. Stem Cells 2003 ； 21:527-35) (Jin JD1Wang HX1Xiao FJ1Wang JS1Lou X, Wang LS1Guo ZK. A novel source of human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow sample. Biochem Biophys Res Co_ 2008;376:191-5)进行所得MSC细胞的诱导分化。
[0117] 3)组织化学染色鉴定
[0118] 以未加诱导体系的细胞为对照，利用NBT-BCIP和油红0染色，分别鉴定成骨细胞 和脂肪细胞。
[0119] 3、试验结果
[0120] 图4.人骨髓MSC在不同体系培养至第三代时细胞成骨（ALP)和成脂肪（Oil-Red) 能力分析。
[0121] 结果如图4所示，经不同体系培养的第三代人骨髓MSC，体外诱导向成骨（ALP)和 成脂肪（Oil-Red)细胞分化，10天后进行组织化学染色，显示两种体系培养的人骨髓MSC具 有成骨和成脂肪分化能力，说明所得到的MSC细胞，符合公认的MSC标准。
【主权项】
1. 一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：该培养基组成包括：（1)经过改良的 基础培养基頂DM; (2)细胞生长因子组合；（3)胰岛素；（4)微量元素；（5)脂类物质；（6)维 生素类物质；（7)激素类物质；(8)蛋白质分子；(9)氨基酸类物质；（10)其它化合物。2. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（1)经 过改良的基础培养基頂DM，是在商售頂DM基础上，添加至少包括生物素（1-50yM)和谷氨 酰胺（1-50yM)在内的水溶性化合物；所述可溶性化合物还可包括氯化铬（0. 1-10yg/L)、 氯化铜（〇?l-lmg/L)、氯化猛 0? 01-0.lmg/L和氯化锌 0?l-10mg/L。3. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（2)细 胞生长因子组合至少包括碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，l-100ng/mL)和表皮生长因子 (EGF，l-100ng/mL)，还可包括激活素A(l-100ng/ml)、转化生长因子-MTGF-0，I-IOOng/ mL)、骨形成蛋白（BMP，l-100ng/mL)、白血病抑制因子（LIF，l-100ng/mL)、干细胞生长因 子（SCF，1-lOOng/mL)、肝细胞生长因子（HGF，1-lOOng/mL)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1， l-100ng/mL)、促红细胞生成素（EP0,0.l-50U/mL)、血清素（l-100nM/L)、血小板源生长因 子BB(PDGF-BB，l-100ng/mL)、白介素-6 (IL-6,l-100ng/mL)。4. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（3)胰 岛素添加量为5-500yg/mL，可为临床级用药或重组蛋白。5. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（4)微 量元素至少包括硒（IO-IOOnM)，以亚硒酸钠或其它化合物形式提供，所述微量元素组合还 可包括氯化铁（50-1000ng/mL)、氯化锰（l-100ng/mL)、氯化铜（50-1000ng/mL)、氯化铬和 钼酸钠（lOO-lOOOng/mL)。6. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（5)脂 类物质可为胆固醇（10-100yg/mL)，还可为亚油酸（l_50mg/L)、亚麻酸（1-50yg/mL)、中 链甘油三酯（1-500yg/mL)、卵磷脂（0. 1 - 20yg/mL)和注射用大豆油（1-500yg/mL)。7. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（6)维 生素类物质包括脂溶性和水溶性维生素两种，包括维生素B组如Vit-B5 (1-100yM)、维生 素A(1-200yM)、维生素C(50yg/mL)、维生素E(10-100yg/mL)。8. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（7)激 素类物质可为地塞米松（低于I(T9M)或氢化考的松（低于5yg/mL)。9. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述⑶蛋 白质分子主要为注射用人白蛋白，添加量为5-50mg/mL;也可包括其它分子，如乙酰辅酶 (0?l-10U/mL)、辅酶I(10-1000ng/mL)。10. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（9)氨 基酸类物质指多种氨基酸复合物，包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-门 冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸、组氨酸、甲硫 氨酸、胱氨酸和甘氨酸等，添加量为1-100UM。11. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（10) 其它化合物包含有二巯基乙醇（IXKT6M-IXl(T4M)和其它化合物，包括还原型谷胱 甘肽（0.1-10mg/L)、胶原或纤连蛋白或明胶（10yg-10mg/mL)、wnt-3a(l-100ng/mL)和 Bio(5-250nM) 〇12. 权利要求1 一 11任一项所述的一种培养间充质干细胞的培养基在培养间充质干细 胞中的应用。13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述间充质干细胞包括人骨髓和人脐 带来源的，也包括其它组织或其它动物的间充质干细胞。
【专利摘要】本发明涉及细胞与组织培养领域，特别是一种用于培养间充质干细胞的培养基。针对现有的牛血清培养基及人血清培养培养间充质干细胞存在的问题,本发明的目的是提供一种用于培养间充质干细胞的培养基,其技术方案是，一种用于培养间充质干细胞的培养基，由基础培养基和培养基添加剂两类组份；添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。本发明所提供的培养基培养间充质干细胞，在细胞治疗过程中可避免人畜共患病，人体免疫反应的风险，还可避免因培养体系批次间差异，造成所培养的间充质干细胞性质不同的可能性，适用于各种间充质干细胞的培养，前景广阔。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN104894064
【申请号】CN201510397087
【发明人】郭子宽, 赵靖, 王娟, 李乔丽, 芦俊萍, 刘瑾, 尹珊
【申请人】河南中科干细胞基因工程有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月8日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞与组织培养领域，特别是一种用于培养间充质干细胞的培养基。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞，英文名称为mesenchymal stem cells (MSC)，是指单个或一群符合 国际统一标准的细胞（Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006 ;8 (4):315-7)〇
[0003] 在骨髓中，MSC属于非造血干细胞，具备向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化的能力， 具有免疫调节和造血支持作用。最近的研宄表明，MSC也存在于其它组织，包括脂肪、脐带、 胎盘和肌肉等。体外培养的MSC可以分泌多种生物活性物质，具有促进新生血管形成，促进 神经组织、骨组织、肝脏组织和胰岛组织损伤修复的作用。
[0004] 因此，自体或异体MSC已经用于临床试验研宄，以治疗移植物抗宿主病、肝脏纤维 化、脊髓损伤、糖尿病、外周血管病等多种疾病。另外，作为组织工程化骨和软骨构建中重要 的种子细胞，MSC也用于股骨头坏死、骨折后骨不连和软骨损伤的治疗。
[0005] 然而，涉及多种疾病的细胞治疗需要一定的细胞量。为进行以MSC为基础的细胞 治疗，人们通常获取少量的骨髓，或获取脐带、脂肪或胎盘组织，在体外通过贴壁生长筛选 并扩增MSC，待细胞量达到治疗所需量时，收获MSC用于以上疾病的治疗，体外扩增MSC是实 施MSC细胞治疗的关键步骤之一。
[0006] 通常，人们利用经筛选、适于人MSC生长的牛血清，作为细胞增殖的主要刺激物， 体外培养扩增MSC。然而，研宄表明，在培养过程中，MSC可以吞噬培养体系中的牛蛋白，使 异种_+
[0007] 蛋白内在化，每IO8MSC中牛蛋白含量达到10_30mg (Spees几 ，Gregory CA, Singh H，Tucker HA, Peister A, Lynch PJ, Hsu SC, Smith J, Prockop DJ. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Mol Ther 2004;9:747-56)。
[0008] 因此，使用牛血清培养人MSC用于细胞治疗，不仅将使病人暴露于罹患人畜共患 病的风险，也可能因移植MSC死亡释放牛蛋白，引起机体免疫反应，造成血清病或其它免疫 性疾病。
[0009] 此外，每批次血清的活性是不同的，对批次间收获的细胞的稳定性，有一定影响。 因此，利用一种无动物血清成分的培养基，培养扩增MSC，对治疗的安全性和有效性，都是十 分必要的。
[0010] 为此，人们一直在寻找动物血清替代物，用于人MSC的培养。
[0011] 有人用血清替代物Ultroser G替代牛血清，培养人骨髓MSC，获得了较好的效 果(Meuleman N, Tondreau T,Delforge A, Dejeneffe M, Massy M, Libertalis M, Bron Dj Lagneaux L. Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum-free medium allows better expansion than classical alpha-MEM medium. Eur J Haematol 2006 ； 76:309 - 16)〇
[0012] 然而，Ultroser G本身就含有牛血清成分，这种方式的替代并不能从根本上 角军决异体蛋白污染问题（Korhonen M. Culture of human mesenchymal stem cells in serum-free conditions:no breakthroughs yet. Eur J Haematol 2006 ;78:167)〇
[0013] 之后，有人提出应用人血小板浓缩液替代牛血清，并获得了较好的效果。但是，血 小板供者是否完全正常，这种使用方式能否引起传染病的传播，以及能否保障所获得MSC 的批次间稳定性等，都是必须考虑的问题。
[0014] 因此，研制化学成分清晰明确、无动物血清成分的MSC培养基，是很有必要的。
[0015] 有人曾报道一种人脐带血MSC的无血清体系，血清替代成分为碱性成纤维细胞生 长因子（bFGF)、人白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITSE)和氢化可的松，可简称为 FAITH，据报道效果较好（Liu CH, Wu ML, Hwang SM. Optimization of serum free medium for cord blood mesenchymal stem cells. Biochemical Engineering Journal, 2007 ； 331 - 9)〇
[0016] 然而，利用该体系进行人脐带MSC培养，发现细胞呈球形生长方式（见图I);而 且，随着培养时间的延长，细胞出现自发分化现象，细胞的本质发生了变化。这可能与加 入高浓度的氢化考的松有关。皮质类激素，包括地塞米松和氢化考的松，在一定浓度下虽 然能刺激MSC增殖，也能使MSC发生非特异性分化（Williams JT，Southerland SS，Souza J,Calcutt AF, Cartledge RG. Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes. Am Surg. 1999 ； 65:22-6)。因此可以认为，以bFGF-ITSE和氢化可的松等为主的血清替代物进行MSC培养， 其本身的稳定性和对干细胞多能性的维持，可能存在诸多不肯定的因素。
【发明内容】
[0017] 针对现有的牛血清培养基及人血清培养培养间充质干细胞存在的问题，本发明 的目的是提供一种无血清、化学成分清晰的适用于培养间充质干细胞的培养基。
[0018] 其解决问题的技术方案是：
[0019] 一种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括基础培养基和培养基添 加剂两类组份。
[0020] 所述的培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生 素类物质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0021] 上述培养基中每类物质组成特点描述如下：
[0022] (1)基础培养基頂DM，是在商售頂DM基础上，添加至少包括生物素（1-50 μ M) 和谷氨酰胺（l-50yM)在内的水溶性化合物；所述水溶性化合物还可包括氯化铬 (0· 1-10 μ g/L)、硫酸铜（0· 1-lmg/L)、氯化猛 0· 01-0. lmg/L 和硫酸锌 0· l-10mg/L。进行改 良后间充质干细胞增殖速度增加。
[0023] (2)所述细胞生长因子组合至少包括碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，I-IOOng/ mL)和表皮生长因子（EGF，l-100ng/mL)，还可包括激活素 A(activin A，l-100ng/ml)、转 化生长因子-MTGF-β，l-100ng/mL)、骨形成蛋白（BMP，l-100ng/mL)、白血病抑制因子 (LIF，Ι-lOOng/mL)、干细胞生长因子（SCF，Ι-lOOng/mL)、肝细胞生长因子（HGF，I-IOOng/ mL)、胰岛素样生长因子-I (IGF-1，Ι-lOOng/mL)、促红细胞生成素（EP0,0. l-50U/mL)、血清 素（l-100nM/L)、血小板源生长因子 BB(PDGF-BB，l-100ng/mL)、白介素-6(IL-6,1-IOOng/ mL)。这些细胞因子和生长因子，是始动间充质干细胞增殖的重要组成部分。
[0024] (3)所述胰岛素添加量为5-500 μ g/mL，可为临床级用药或重组蛋白。
[0025] 胰岛素参与细胞糖代谢。
[0026] (4)所述微量元素至少包括硒（IO-IOOnM)，以亚硒酸钠或其它化合物形式提 供，所述微量元素组合还可包括氯化铬（〇.1-1(^8/1)、氯化铜（0.1-1 11^/1)、氯化锰 0· 01-0. lmg/L、氯化锌 0· 1-10 μ g/L 以及钼酸钠（100-1000ng/mL)。
[0027] 微量元素不但促进细胞增殖，也是细胞结构组成必要的成分。
[0028] (5)所述脂类物质可为胆固醇（10-100 μ g/mL)，还可为亚油酸（l-50mg/L)、亚麻 酸（1-50 μ g/mL)、中链甘油三酯（1-500 μ g/mL)、卵磷脂（0· 1 - 20 μ g/mL)和注射用大豆 油（1-500 μ g/mL)〇
[0029] 脂类是细胞膜结构的主要成分。
[0030] (6)所述维生素类物质包括脂溶性和水溶性维生素两种，包括维生素 B组如 Vit-B 5 (1-100 μ M)、维生素 A (1-200 μ M)、维生素 C (50 μ g/mL)、维生素 E (10-100 μ g/mL)。
[0031] 添加维生素的目的在于基础培养基中维生素含量偏低，添加后能促进细胞增殖。
[0032] (7)所述激素类物质为地塞米松（低于10-9M)或氢化考的松（低于5 μ g/mL)。皮 质类激素是血清中促细胞增殖的成分之一，在无血清体系中添加，能促进间充质干细胞增 殖。
[0033] (8)所述蛋白质分子主要为注射用人白蛋白，添加量为5_50mg/mL，也可包括其它 分子，如乙酰辅酶 A(0. l-10U/mL)、辅酶 I(10-1000ng/mL)。
[0034] 作为一种载体，白蛋白是细胞物质转运的关键分子。
[0035] (9)所述氨基酸类物质指多种氨基酸复合物，可包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙 氨酸、L-异亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨 酸、苏氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸和甘氨酸，添加量为1-100 μΜ。可以用商购的细胞培 养用复合氨基酸的形式提供。氨基酸是细胞蛋白代谢的必需成分。
[0036] (10)所述其它化合物：所述培养基中还可包含有二巯基乙醇（IXKT6M-IXl(T 4M)和其它化合物，包括还原型谷胱甘肽（0. l-10mg/L，作为一种还原剂保护细 胞免受氧自由基的损害），胶原或纤连蛋白或明胶（l〇yg-l〇mg/mL)以促进细胞贴壁、 wnt-3a(l_100ng/mL)以及 Bio(5_250nM)以调节细胞增殖。
[0037] 本发明所提供的培养基不含血清或血浆，使用该体系培养间充质干细胞，在细胞 治疗过程中将避免因动物血清或血浆引起的人畜共患病，以及因细胞治疗引起的人体免疫 反应的风险。此外，该培养基化学成分明确清晰，避免了因培养体系批次间差异，造成所培 养的间充质干细胞性质不同的可能性。本发明的培养基不仅适用于人骨髓和人脐带来源的 间充质干细胞的培养，也可适用于其它组织或其它动物间充质干细胞的培养，应用前景广 阔。
【附图说明】
[0038] 图1为不同培养基培养的人脐带MSC细胞形态。
[0039] 图2为不同培养基培养的人骨髓MSC表型分析结果。
[0040] 图3为不同培养体系人脐带和骨髓MSC增殖特点。
[0041] 图4为不同体系培养条件下人骨髓MSC分化特性。
【具体实施方式】
[0042] 以下结合实施例对发明的内容做出详细的说明：
[0043] 实施例1、
[0044] 一种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基有以下成分组成包括基础培养基 和培养基添加剂两类组份，
[0045] 培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物 质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0046] 无血清培养基的配方
[0047]
[0048]
[0049] 实施例2、
[0050] -种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括基础培养基和培养基添 加剂两类组份。
[0051] 培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物 质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0052] 无血清培养基的配方
[0053]
[0054]
[0055] 实施例3、
[0056] -种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括基础培养基和培养基添 加剂两类组份。
[0057] 培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物 质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0058] 无血清培养基的配方
[0059]
[0060]
[0061] 实施例4、
[0062] 一种用于培养间充质干细胞的培养基，该培养基组成包括基础培养基和培养基添 加剂两类组份。
[0063] 培养基添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物 质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。
[0064] 无血清培养基的配方
[0065]
[0066]
L〇〇67」 买施例在以不友明扠木万菜为前提卜进仃买施，给出丨评细的买施万式和具体的 操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
[0068] 下述实施例及试验中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0069] 实验一、
[0070] 人脐带MSC在不同培养基中的培养
[0071] 1、试验材料
[0072] 标本：人脐带MSC取自正常分娩出生后的胎儿。
[0073] 试剂：胶原蛋白酶I、胰蛋白酶、a-MEM和IMDM购自Invitrogen公司；胎牛血清 (FCS)为加拿大StemCell公司产品；配制SF-M和FAITH的试剂多购自Sigma公司，为培养 纯。人白蛋白为注射用，为重组蛋白，由华北制药厂生产。
[0074] 2、试验方法
[0075] 1)人脐带MSC培养按常规方法进行，原代细胞培养体系为含10% FCS的 alpha-MEM。取第一代细胞用于以下试验。
[0076] 2)细胞培养及传代：贴壁层形成后，用0. 05 %胰蛋白酶/2mM EDTA消化，细胞计 数。将细胞分别悬浮于含10% FCS的alpha-MEM、含SF-M的IMDM或含FAITH的IMDM中， 然后按3000细胞/cm2进行传代培养。细胞传代过程中，显微照相，记录细胞形态。
[0077] 3、试验结果
[0078] 结果如图1
[0079] 图1.不同培养体系下人脐带MSC的形态。人脐带MSC分别在10% FCS(A，B)，文 献报道的无血清体系（FAITH，C和D)以及本发明的体系（SF-M，E和F)中培养，细胞低密度 时（A，C，E)和高密度时（B，D，F)形态的特点。
[0080] (A:脐带 MSC (Pl)在含 10% FCS (StemCell Co. Canada) alpha-MEM 中培养，细胞未 完全融合时的形态；B:脐带 MSC(Pl)在含 10% FCS(StemCell Co. Canada)alpha-MEM 中培 养，细胞完全融合时的形态；C:脐带MSC(Pl)在含FAITH的MDM中培养时细胞的形态；D: 脐带MSC(Pl)在含FAITH的頂DM中培养时的细胞形态；E:脐带MSC(Pl)在含SF-M的頂DM 中培养，细胞未完全融合时的形态；F:脐带MSC (Pl)在含SF-M的IMDM中培养，细胞完全融 合时的形态）所示，通过A/B和E/F比较可以发现，SF-M培养的MSC细胞折光性强，细胞较 细长；C/D所示细胞呈团块生长方式。
[0081] 试验二、
[0082] 不同培养基培养的人骨髓MSC表型分析
[0083] I、试验材料
[0084] 标本：人肝素化骨髓5mL，取自正常献髓者。
[0085] 试剂：PE标记小鼠抗人⑶14、⑶31、⑶44、⑶45、⑶73均为BD公司（美国）产品， 其它产品如试验一所描述。
[0086] 2、试验方法
[0087] 1)细胞培养：人骨髓MSC培养按文献中记载的方法进行（Jin JD，Wang HX，Xiao FJj Wang JSj Lou Xj Wang LSj Guo ZK. A novel source of human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow sample. Biochem Biophys Res Comm 2008 ；376:191-5)? 原代细胞培养体系为含10% FCS的alpha-MEM。取第一代细胞用于以下试验。
[0088] 将人骨髓MSC分别悬浮于含10 % FCS的alpha-MEM或含SF-M的IMDM中，然后按 3000细胞/cm2进行传代培养。待细胞传至第三代时，用0. 05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化， 细胞计数。
[0089] 2)细胞标记：用PBS洗涤收获的MSC，加入单克隆抗体室温避光反应30分钟。PBS 洗涤两次后，用流式细胞仪检测，每个反应至少收集10000个点数据。
[0090] 3)结果分析：WinMdi2. 9软件分析所收获数据，分析过程中设门去除细胞碎片。
[0091] 3、试验结果
[0092] 结果如图2
[0093] 图2:细胞在不同体系培养下表型特征。纵坐标：细胞数；横坐标：相对荧光强度。
[0094] (纵坐标：细胞数；横坐标：相对荧光强度）所示，人骨髓MSC(P3)在10% FCS(StemCell Co，Canada)和SF-M体系中培养，细胞表型一致，均表达CD44、CD73,不表达 ⑶31 (内皮细胞标记）、⑶14 (单核/巨噬细胞标记）、⑶45 (血细胞标记），表明两种体系培 养的骨髓MSC的表型均一性。
[0095] 试验三、
[0096] 不同体系培养条件下MSC增殖特性
[0097] 1、试验材料
[0098] 标本：人骨髓MSC和脐带MSC (P3)按试验一和试验二方法收获，P3代细胞用于以 下实验。
[0099] 试剂：细胞荧光标记物CFSE为Sigma产品。其它产品如试验一所描述。
[0100] 2、试 验方法
[0101] 1)细胞标记：CFSE标记MSC按本小组报道的方法进行（Jin JD，Wang HX，Xiao FJ, Wang JS, Lou X, Wang LS, Guo ZK. A novel source of human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow sample. Biochem Biophys Res Comm 2008 ;376:191-5)〇
[0102] 2)细胞培养：将标记后的细胞分别悬浮于含10 % FCS的alpha-MEM或含SF-M的 IMDM或含FAITH的IMDM中，然后按3000细胞/cm2进行培养。72小时后用0. 05 %胰蛋白 酶/2mM EDTA消化，细胞计数。
[0103] 2)流式细胞仪获取数据及结果分析：用PBS洗涤收获的MSC，用流式细胞仪检测， 每个反应至少收集10000个点数据。WinMdi2. 9软件分析所收获数据，分析过程中设门去除 细胞碎片。
[0104] 3、试验结果
[0105] 结果如图3
[0106] 图3.人脐带和骨髓MSC在不同体系培养下的增殖情况。第三代人骨髓或脐带MSC， 荧光染料CFSE标记后培养72小时，流式细胞仪收集数据，winmdi29软件分析。直方图： CFSE相对荧光强度；散点图：横坐标代表相对荧光强度，纵坐标代表SSC，表示细胞颗粒度。
[0107] (纵坐标：细胞数；横坐标：相对荧光强度）所示，应用CFSE标记第三代骨髓 MSC (BM-MSC)和脐带MSC (UC-MSC)，培养72小时后，流式细胞仪检测细胞荧光强度。直方图： 横坐标表不FLl相对焚光强度；纵坐标表不events。散点图：横坐标表不FLl相对焚光强 度；纵坐标表示SSC。结果提示BM-MSC和UC-MSC在10 % FCS和SF-M培养条件下，两种细 胞在两种体系中生长速度相当，无明显差别。细胞在FAITH中生长较差。
[0108] 试验四、
[0109] 不同体系培养条件下人骨髓MSC分化特性
[0110] 1、试验材料
[0111] 标本：人骨髓MSC(Pl)按试验二方法收获，Pl代细胞用于以下试验。
[0112] 试剂：分化诱导试剂包括维生素 C、磷酸甘油、地塞米松、消炎痛、IMBX、胰岛素，均 为Sigma产品。
[0113] 2、试验方法
[0114] 1)细胞传代培养：将Pl代骨髓MSC分别悬浮于含10%FCS的alpha-MEM或含SF-M 的MDM中，按3000细胞/cm2进行培养。传代至第三代时用于以下实验后。
[0115] 2)诱导分化：
[0116] 按文献中记载的方法（Sun S, Guo Z, Xiao X，et al. Isolation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a novel and reliable method. Stem Cells 2003 ； 21:527-35) (Jin JD1Wang HX1Xiao FJ1Wang JS1Lou X, Wang LS1Guo ZK. A novel source of human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow sample. Biochem Biophys Res Co_ 2008;376:191-5)进行所得MSC细胞的诱导分化。
[0117] 3)组织化学染色鉴定
[0118] 以未加诱导体系的细胞为对照，利用NBT-BCIP和油红0染色，分别鉴定成骨细胞 和脂肪细胞。
[0119] 3、试验结果
[0120] 图4.人骨髓MSC在不同体系培养至第三代时细胞成骨（ALP)和成脂肪（Oil-Red) 能力分析。
[0121] 结果如图4所示，经不同体系培养的第三代人骨髓MSC，体外诱导向成骨（ALP)和 成脂肪（Oil-Red)细胞分化，10天后进行组织化学染色，显示两种体系培养的人骨髓MSC具 有成骨和成脂肪分化能力，说明所得到的MSC细胞，符合公认的MSC标准。
【主权项】
1. 一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：该培养基组成包括：（1)经过改良的 基础培养基頂DM; (2)细胞生长因子组合；（3)胰岛素；（4)微量元素；（5)脂类物质；（6)维 生素类物质；（7)激素类物质；(8)蛋白质分子；(9)氨基酸类物质；（10)其它化合物。2. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（1)经 过改良的基础培养基頂DM，是在商售頂DM基础上，添加至少包括生物素（1-50yM)和谷氨 酰胺（1-50yM)在内的水溶性化合物；所述可溶性化合物还可包括氯化铬（0. 1-10yg/L)、 氯化铜（〇?l-lmg/L)、氯化猛 0? 01-0.lmg/L和氯化锌 0?l-10mg/L。3. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（2)细 胞生长因子组合至少包括碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，l-100ng/mL)和表皮生长因子 (EGF，l-100ng/mL)，还可包括激活素A(l-100ng/ml)、转化生长因子-MTGF-0，I-IOOng/ mL)、骨形成蛋白（BMP，l-100ng/mL)、白血病抑制因子（LIF，l-100ng/mL)、干细胞生长因 子（SCF，1-lOOng/mL)、肝细胞生长因子（HGF，1-lOOng/mL)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1， l-100ng/mL)、促红细胞生成素（EP0,0.l-50U/mL)、血清素（l-100nM/L)、血小板源生长因 子BB(PDGF-BB，l-100ng/mL)、白介素-6 (IL-6,l-100ng/mL)。4. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（3)胰 岛素添加量为5-500yg/mL，可为临床级用药或重组蛋白。5. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（4)微 量元素至少包括硒（IO-IOOnM)，以亚硒酸钠或其它化合物形式提供，所述微量元素组合还 可包括氯化铁（50-1000ng/mL)、氯化锰（l-100ng/mL)、氯化铜（50-1000ng/mL)、氯化铬和 钼酸钠（lOO-lOOOng/mL)。6. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（5)脂 类物质可为胆固醇（10-100yg/mL)，还可为亚油酸（l_50mg/L)、亚麻酸（1-50yg/mL)、中 链甘油三酯（1-500yg/mL)、卵磷脂（0. 1 - 20yg/mL)和注射用大豆油（1-500yg/mL)。7. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（6)维 生素类物质包括脂溶性和水溶性维生素两种，包括维生素B组如Vit-B5 (1-100yM)、维生 素A(1-200yM)、维生素C(50yg/mL)、维生素E(10-100yg/mL)。8. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（7)激 素类物质可为地塞米松（低于I(T9M)或氢化考的松（低于5yg/mL)。9. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述⑶蛋 白质分子主要为注射用人白蛋白，添加量为5-50mg/mL;也可包括其它分子，如乙酰辅酶 (0?l-10U/mL)、辅酶I(10-1000ng/mL)。10. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（9)氨 基酸类物质指多种氨基酸复合物，包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-门 冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸、组氨酸、甲硫 氨酸、胱氨酸和甘氨酸等，添加量为1-100UM。11. 根据权利要求1所述的一种培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述（10) 其它化合物包含有二巯基乙醇（IXKT6M-IXl(T4M)和其它化合物，包括还原型谷胱 甘肽（0.1-10mg/L)、胶原或纤连蛋白或明胶（10yg-10mg/mL)、wnt-3a(l-100ng/mL)和 Bio(5-250nM) 〇12. 权利要求1 一 11任一项所述的一种培养间充质干细胞的培养基在培养间充质干细 胞中的应用。13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述间充质干细胞包括人骨髓和人脐 带来源的，也包括其它组织或其它动物的间充质干细胞。
【专利摘要】本发明涉及细胞与组织培养领域，特别是一种用于培养间充质干细胞的培养基。针对现有的牛血清培养基及人血清培养培养间充质干细胞存在的问题,本发明的目的是提供一种用于培养间充质干细胞的培养基,其技术方案是，一种用于培养间充质干细胞的培养基，由基础培养基和培养基添加剂两类组份；添加剂包括细胞生长因子组合；胰岛素；微量元素；脂类物质；维生素类物质；激素类物质；蛋白质分子；氨基酸类物质；其它化合物。本发明所提供的培养基培养间充质干细胞，在细胞治疗过程中可避免人畜共患病，人体免疫反应的风险，还可避免因培养体系批次间差异，造成所培养的间充质干细胞性质不同的可能性，适用于各种间充质干细胞的培养，前景广阔。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN104894064
【申请号】CN201510397087
【发明人】郭子宽, 赵靖, 王娟, 李乔丽, 芦俊萍, 刘瑾, 尹珊
【申请人】河南中科干细胞基因工程有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月8日
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