一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法
一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，属于生物学领域。
【背景技术】
[0002] 免疫系统是人体的防御体系，一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能，另 一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞，有的突变细胞会变成癌细胞。机体免疫系 统和癌细胞相互作用的结果决定了癌症的最终演变。对于健康的人来说，其免疫系统的强 大足以及时清除体内因突变产生的癌细胞。但对于癌细胞病人来说，普遍存在免疫系统低 下、不能有效地识别、杀灭癌症细胞；另一方面，癌症细胞大量增殖，会进一步抑制患者的免 疫功能，而且，癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤，癌症的免疫治疗就是借 助分子生物学技术和细胞工程技术，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正 常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗瘤免疫应答，提高癌症对机体抗癌症免疫效 应的敏感性，在体内、外诱导癌症特异性和非特异性效应细胞和分子，达到最终清除癌症的 目的。癌症免疫治疗正是通过人为的干预，来调动机体自身的免疫系统对癌细胞进行杀灭 和抑制其增殖。
[0003] 肿瘤免疫治疗技术主要包括利用CTL细胞、DC瘤苗、CIK细胞、DC-CIK细胞、 NK细胞、TIL细胞、TCR细胞和CAR-T细胞等进行治疗。最近一两年，从中脱颖而出的是 CAR-T细胞治疗。该疗法通过分离患者外周血液中的免疫T细胞，在体外无菌培养，然后 经过基因工程改造，也就是根据患者所患的肿瘤类型进行特异性的基因修饰和体外扩增， 最后回输患者的体内，达到杀死肿瘤细胞的目的（Figueroa JA et al, Int Rev Immunol 2015, 34(2) :154-87) 〇
[0004] 目前，欧美及亚洲各国都在积极开展CAR-T疗法的临床试验，包括美国、英国、瑞 典、中国、日本等。其中，美国开展临床试验项目最多、达41项，占据了全球CAR-T疗法 临床试验的74. 5%。宾夕法尼亚大学医院、费城儿童医院、美国癌症研宄院（NCI)、Fred Hutchinson癌症研宄中心、纪念斯隆凯特琳癌症中心和西雅图儿童医院等是最早开展 CAR-T细胞疗法的研宄机构。中国在CAR-T疗法领域起步较晚，目前仅北京大学肿瘤医院 和解放军总医院（301医院）、四川华西医院在开展相关临床试验而且临床目前仅限于白血 病，实体肿瘤CAR-T治疗鲜有报道。新兴生物制药公司如Juno、Kite、Celgene、Cellectis、 Bluebird，传统制药公司如诺华、葛兰素史克、辉瑞、强生等都投入到了 CAR-T疗法的研发 中，推动这一极具前景的疗法尽早进入到临床，从而造福癌症及肿瘤患者。
[0005] (A service of the U. S. National Institute of Health, http: // clinicaltrials. gov)〇
[0006] 虽然许多机构都在进行CAR-T疗法的研宄，但目前并没有统一的标准，他们在CAR 设计、培养技术、淋巴细胞去除方法以及所治疗的疾病等方面都有不同。如美国国家癌症 研宄院（NCI)使用的是靶向⑶19含⑶28共刺激域的第二代CAR，且通过逆转录病毒进行 基因转导，使用0KT3和IL2扩增，治疗疾病是非霍奇金淋巴瘤，而宾夕法尼亚大学研宄人 员使用的是加入4-1BB共刺激分子的第二代CAR，使用抗-⑶3/⑶28扩增，通过慢病毒载 体转导，治疗疾病是 ALL 和 CLL(Mazzarella L.2013American Society of Haematology meeting[J]2014, 8:390)〇
[0007] CAR-T细胞疗法在晚期难治性白血病和淋巴瘤患者中进行的早期临床试验已经显 示出非常振奋人心的结果。宾夕法尼亚大学研宄人员今年10月在世界顶尖医学杂志《新英 格兰医学杂志》上发表的一项临床试验结果显示，在接受了 CTL019输注（靶向⑶19抗原 的CAR-T疗法）的30名复发性或难治性ALL受试者中，治疗后1个月有27名患者获得完 全缓解，其中甚至包括15位已经接受过骨髓干细胞移植的患者。6个月时无反复生存率为 67% (20人），总体生存率为78% (23人）。另外还有1名患者2年随访时仍然持续完全缓 解（Grupp SA et al, N Engl J Med 2013,368(16):1509-18)。
[0008] NCI开展的一项临床试验也展现了良好的结果，该试验入组了 20名ALL患儿，在 接受CAR-T细胞疗法后，14名达到了完全缓解；12名患儿的骨髓中已检测不到未成熟的白 血病细胞，其中10名又接受了干细胞移植，至今无癌生存。研宄结果还表明，CAR-T细胞 疗法可帮助化疗无应答的患者顺利地过度到骨髓移植治疗。纪念斯隆凯特林癌症中心与 NCI在成人患者中开展的1期临床试验也取得了类似的结果（Mazzarella L. 2013American Society of Haematology meeting[J]2014, 8:390)〇
[0009] 除白血病之外，CAR-T疗法对淋巴瘤也显示了喜人的疗效，NCI领导的CAR-T细胞 临床试验招募了 15名成人受试者，其中的绝大多数（9名）都患有晚期弥漫性大B细胞淋 巴瘤（DLBCL)。据Kochenderfer博士及NCI的同事报道，该临床试验的大多数患者都达到 了缓解，在7例可评估的DLBCL受试者中4例获得完全缓解，持续时间从9个月到22个月 (Kochenderfer JN et al，Blood 2012, 119(12):2709-20)〇
[0010] 这些临床试验的其他结果也非常鼓舞人心。比如，CAR-T细胞在被输注到患者体 内后数量急剧增加，在有些患者中其数量增加多达1000倍。此外，CAR-T细胞输注后，患者 的中枢神经系统中也检测到了 CAR-T细胞，中枢神经系统可以说是恶性肿瘤的避难所-- 少量癌细胞逃脱化疗或放疗后的藏身之处。在NCI开展的儿童临床试验中，CAR-T细胞疗 法就根除了两名患儿的已转移至中枢神经系统的癌症。如果CAR-T细胞能够在这些部位持 久发挥作用，那么它们将有助于防止癌症复发。
[0011] 但是目前国际上用于临床试验的CAR-T细胞普遍是采用病毒载体来将CAR分子导 入T细胞中的，从临床治疗安全角度来考虑存在较大的风险。
【发明内容】
[0012] 为解决上述技术问题，本发明提出一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法， 该方法可以将CAR分子定点整合到T细胞的基因组中，避免了使用病毒载体制备CAR-T细 胞存在的安全隐患，能应用于科研评估临床治疗各类癌症患者。
[0013] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种CAR-T细胞制备方法，利用 CRISPR/Cas9技术将CAR分子整合到人第19号染色体上AAVSl位点的第一个内含子内。 [0014] 优选的，提供供体DNA序列，在CAR分子序列上游含有剪切体受体序列和AAVSl左 同源臂序列，CAR分子下游含有poly-A序列和AAVSl右同源臂序列。
[0015] -种CAR-T细胞的应用，利用CRISPR/Cas9将各类肿瘤表面抗原的抗体分子整合 到人类T细胞基因组中AAVSl位点的应用。
[0016] 更进一步，利用CRISPR/Cas9技术制备的CAR-T细胞在评估各类CAR分子对肿瘤 细胞的杀伤力和对正常细胞的副作用，以及临床治疗血癌和各类实体肿瘤中的应用。
[0017] 本发明的有益效果：CRISPR/Cas9系统操作简单，对基因组的编辑效率高，可对任 何物种的基因组进行高效率的定向编辑。为了避免潜在的脱靶效应，我们采用一种突变的 Cas9酶Ni ckase Cas9来克服这个局限，它只切断DNA的一个链，这个单链缺口会促进同源 重组，但不会产生脱靶突变。因此，利用该技术，我们可以将CAR分子精确地整合到人T细 胞基因组特定的"安全港"位点，不影响任何人体正常基因的功能，避免了使用病毒载体存 在的安全隐患和外源基因转机插入基因组的遗传毒性和免疫原性等一系列临床风险问题。
[0018] 该方法将各类肿瘤表面抗原受体整合到人T细胞基因组中的AAVSl位点，在T细 胞表面表达针对各类肿瘤的特异受体，专一性识别并杀死肿瘤细胞，可用于评估各类CAR-T 细胞对肿瘤细胞的杀伤力及临床治疗各类癌症患者，其安全性更高。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0020] 实施例1 (制备实施例）
[0021] 利用CRISRP/Cas9系统生产白血病CAR-T细胞：
[0022] I) T细胞分离培养
[0023] a.通过密度梯度离心分离新鲜的外周血单核细胞（PBMC, peripheral blood mononuclear cell)；
[0024] b.利用偶联 anti_CD3 和 anti_CD28 抗体的 paramagnetic beads (Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28, Invitrogen, Camarillo, CA, USA)富集 CD3+细胞，磁珠与细胞比例 为3:1 ;细 胞稀释到TNC(total nucleated cell)浓度为20-30xl06/mL，在培养皿中与磁珠 在室温共孵育2小时；
[0025] c.利用 Magnetic particles concentrator (MPC) (Invitrogen)富集 CD3+细胞； 含有CD3+的细胞在培养皿中重悬于培养液（OpTmizer? CTS? T-Cell Expansion SFM, Life Technologies)中，终浓度为 lx 106cells/mL。在 37°C，5%C02 培养箱中培养 2 天。
[0026] 2)CRISPR/Cas9 质粒的构建
[0027] 合成寡核苷酸 gRNA-Al，gRNA-A2, gRNA-Bl，gRNA-B2,序列如下：
[0028] gRNA-AI ： CACCGTGGGGGTTAGACCCAATATCAGG
[0029] gRNA-A2 ： CCCTGATATTGGGTCTAACCCCCA
[0030] gRNA-B I ： CACCGTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGG
[0031] gRNA-B2 ： CCCAGATAAGGAATCTGCCTAACA
[0032] 将gRNA-Al与gRNA-A2退火形成双链gRNA-A ;gRNA-Bl与gRNA-B2退火形成双链 gRNA-B。分别将gRNA-A和gRNA-B连接到经过BbsI酶切的载体pX334中（#42333, Addgene)， 形成 CRISPR/Cas9 质粒 pX334-gRNA-A 和 pX334-gRNA-B。供体 DNA 由 HA-L(左同源臂）、 SA (剪切体接受位点）、FMC63-28Z (白血病CAR分子）、bGH-PA-terminator (转录终止子） 以及HA-R(右同源臂）组成，序列见序列表2。
[0033] 3) T细胞的电转
[0034] 取250uL浓度为lx 107cells/mL的细胞置于0. 2cm Bio-rad电转杯中；将质粒 pX334-gRNA-A、pX334-gRNA-B与供体DNA同时加入电转杯的细胞中小心混匀；设置电压 140V，将电转杯放入电转槽中电转；电转完成后立即取出电转杯，将转染的细胞小心移入培 养板中，在37°C，5% C02培养箱中培养48小时。
[0035] 4)阳性克隆的筛选与扩增
[0036] a.第2-5天：用puromycin(Sigma, P8833)进行筛选。连续4天，每天用含新鲜配 制puromycin(0. 5ug/ml)的培养液进行换液培养；
[0037] b.第6天：换成正常不含puromycin的培养液继续培养，直到第7-10天，克隆长 到大约2mm直径大小，可以进行挑克隆；通常挑取20个克隆，在24孔培养板中进行培养，每 天换液，直到细胞长成融合状态，即可进行下一步分析或细胞冻存。
[0038] 5)基因型鉴定
[0039] 提取细胞的基因组DNA(DNeasy Blood&Tissue Kit, Qiagen)作为模板，用引物 AAVSlF和AAVSlR进行PCR扩增，跑DNA电泳比较条带大小。插入CAR分子的PCR条带为 2343bp，未插入CAR分子的PCR条带为360bp。将PCR条带正确的基因组DNA进行测序，进 一步确认CAR分子的正确性。PCR引物如下：
[0040] AAVSlF:TGTCCCCGAGCTGGGACCAC
[0041] AAVSIR:TGGGAGAGGGTAGCGCAGGG
[0042] 6)流式细胞分析检测CAR分子的表达
[0043] a.离心细胞，利用流式细胞仪通过Protein L实验对CAR分子在T细胞表面 的表达进行评测。Biotinylated Protein L(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 重悬于无菌水中，浓度为50ng/uL，4°C保存；5ug用于标记lx 106的细胞。细胞与 Protein L避光，4°C，孵育30分钟。Protein L的终浓度通过滴度实验确定。用cold fluorescence-activated cell sorting buffer清洗管子两次，去除多余的试剂。取 30uL，1:120 稀释于 PBS 中的 phycoerythrin-labeled streptavidin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)加入管子，20分钟后清洗。
[0044] b. 7-Aminoactinomycin D (Immunotech, Marseille, France)用于确定活性；最 终产物检测 CD3, CD8(Invitrogen)，CD4, CD19(BD Biosicences)。阴性对照用同样的 方法检测。BD FacsCanto II(BD Biosicences)用于获取染色细胞，FlowJo(Treestar Inc, Ashland, OR, USA)用于分析结果。
[0045] CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是最近两年新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对祀向基因进行编辑 的技术，入选了 2013年《科学》杂志十大进展（Couzin-Frankel J et al, Science 2013, 342(6165) :1432-1433)。在这一系统中，包含与靶位点互补序列的sgRNA(single guide RNA)指导Cas9蛋白在序列靶位点切断双链DNA，起到靶向剪切的作用。这时如果 我们提供供体DNA的话，诱导位点与供体DNA之间发生同源重组（HR)，就能将供体上的DNA 片段整合到基因组上。
[0046] CRISPR/Cas9系统操作简单，对基因组的编辑效率高，可对任何物种的基因组进行 高效率的定向编辑。为了避免潜在的脱靶效应，我们采用一种突变的Cas9酶Nickase Cas9 来克服这个局限，它只切断DNA的一个链，这个单链缺口会促进同源重组，但不会产生脱靶 突变（Ran FA et al, Cell 2013, 154(6): 1380-9)。
[0047] 人类第19号染色体上的AAVSl (又名为PPP1R2C位点）是一个经过验证、能确保 转入DNA片段预期功能的"安全港"位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入 基因能被正常转录。另外很重要的一点是在该位点插入外源基因片段对细胞无已知的副 作用。靶向AAVSl位点的CRISPR/Cas9体系能特异剪切人类第19号染色体上的AAVSl位 点，生成断裂DNA，触发DNA的自然修复机制，诱导位点与AAVSl供体DNA之间发生同源重 组（HR)，将供体上的DNA片段整合到基因组上的"安全港"位点（Mali P et al，Science 2013, 339(6121) :823-6)。
[0048] 因此，利用该技术，我们可以将CAR分子精确地整合到人T细胞基因组特定的"安 全港"位点，不影响任何人体正常基因的功能，避免了使用病毒载体存在的安全隐患和外源 基因转机插入基因组的遗传毒性和免疫原性等一系列临床风险问题。
【主权项】
1. 一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术 将CAR分子整合到人第19号染色体上AAVSl位点的第一个内含子内。2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：提 供供体DNA序列，在CAR分子序列上游含有剪切体受体序列和AAVSl左同源臂序列，CAR分 子下游含有Poly-A序列和AAVSl右同源臂序列。3.根据权利要求2所述的利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：利 用CRISPR/Cas9将各类肿瘤表面抗原的抗体分子整合到人类T细胞基因组中AAVSl位点的 应用。4.根据权利要求3所述的利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：利 用CRISPR/Cas9技术制备的CAR-T细胞在评估各类CAR分子对肿瘤细胞的杀伤力和对正常 细胞的副作用，以及临床治疗血癌和各类实体肿瘤中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其制备方法为利用CRISPR/Cas9技术将CAR分子整合到人第19号染色体上AAVS1位点的第一个内含子内；利用CRISPR/Cas9将各类肿瘤表面抗原的抗体分子整合到人类T细胞基因组中AAVS1位点的应用。利用该技术，我们可以将CAR分子精确地整合到人T细胞基因组特定的“安全港”位点，不影响任何人体正常基因的功能，避免了使用病毒载体存在的安全隐患和外源基因转机插入基因组的遗传毒性和免疫原性等一系列临床风险问题。
【IPC分类】C12N5/10, C12Q1/02
【公开号】CN104894068
【申请号】CN201510220941
【发明人】熊波
【申请人】南京凯地生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月4日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，属于生物学领域。
【背景技术】
[0002] 免疫系统是人体的防御体系，一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能，另 一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞，有的突变细胞会变成癌细胞。机体免疫系 统和癌细胞相互作用的结果决定了癌症的最终演变。对于健康的人来说，其免疫系统的强 大足以及时清除体内因突变产生的癌细胞。但对于癌细胞病人来说，普遍存在免疫系统低 下、不能有效地识别、杀灭癌症细胞；另一方面，癌症细胞大量增殖，会进一步抑制患者的免 疫功能，而且，癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤，癌症的免疫治疗就是借 助分子生物学技术和细胞工程技术，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正 常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗瘤免疫应答，提高癌症对机体抗癌症免疫效 应的敏感性，在体内、外诱导癌症特异性和非特异性效应细胞和分子，达到最终清除癌症的 目的。癌症免疫治疗正是通过人为的干预，来调动机体自身的免疫系统对癌细胞进行杀灭 和抑制其增殖。
[0003] 肿瘤免疫治疗技术主要包括利用CTL细胞、DC瘤苗、CIK细胞、DC-CIK细胞、 NK细胞、TIL细胞、TCR细胞和CAR-T细胞等进行治疗。最近一两年，从中脱颖而出的是 CAR-T细胞治疗。该疗法通过分离患者外周血液中的免疫T细胞，在体外无菌培养，然后 经过基因工程改造，也就是根据患者所患的肿瘤类型进行特异性的基因修饰和体外扩增， 最后回输患者的体内，达到杀死肿瘤细胞的目的（Figueroa JA et al, Int Rev Immunol 2015, 34(2) :154-87) 〇
[0004] 目前，欧美及亚洲各国都在积极开展CAR-T疗法的临床试验，包括美国、英国、瑞 典、中国、日本等。其中，美国开展临床试验项目最多、达41项，占据了全球CAR-T疗法 临床试验的74. 5%。宾夕法尼亚大学医院、费城儿童医院、美国癌症研宄院（NCI)、Fred Hutchinson癌症研宄中心、纪念斯隆凯特琳癌症中心和西雅图儿童医院等是最早开展 CAR-T细胞疗法的研宄机构。中国在CAR-T疗法领域起步较晚，目前仅北京大学肿瘤医院 和解放军总医院（301医院）、四川华西医院在开展相关临床试验而且临床目前仅限于白血 病，实体肿瘤CAR-T治疗鲜有报道。新兴生物制药公司如Juno、Kite、Celgene、Cellectis、 Bluebird，传统制药公司如诺华、葛兰素史克、辉瑞、强生等都投入到了 CAR-T疗法的研发 中，推动这一极具前景的疗法尽早进入到临床，从而造福癌症及肿瘤患者。
[0005] (A service of the U. S. National Institute of Health, http: // clinicaltrials. gov)〇
[0006] 虽然许多机构都在进行CAR-T疗法的研宄，但目前并没有统一的标准，他们在CAR 设计、培养技术、淋巴细胞去除方法以及所治疗的疾病等方面都有不同。如美国国家癌症 研宄院（NCI)使用的是靶向⑶19含⑶28共刺激域的第二代CAR，且通过逆转录病毒进行 基因转导，使用0KT3和IL2扩增，治疗疾病是非霍奇金淋巴瘤，而宾夕法尼亚大学研宄人 员使用的是加入4-1BB共刺激分子的第二代CAR，使用抗-⑶3/⑶28扩增，通过慢病毒载 体转导，治疗疾病是 ALL 和 CLL(Mazzarella L.2013American Society of Haematology meeting[J]2014, 8:390)〇
[0007] CAR-T细胞疗法在晚期难治性白血病和淋巴瘤患者中进行的早期临床试验已经显 示出非常振奋人心的结果。宾夕法尼亚大学研宄人员今年10月在世界顶尖医学杂志《新英 格兰医学杂志》上发表的一项临床试验结果显示，在接受了 CTL019输注（靶向⑶19抗原 的CAR-T疗法）的30名复发性或难治性ALL受试者中，治疗后1个月有27名患者获得完 全缓解，其中甚至包括15位已经接受过骨髓干细胞移植的患者。6个月时无反复生存率为 67% (20人），总体生存率为78% (23人）。另外还有1名患者2年随访时仍然持续完全缓 解（Grupp SA et al, N Engl J Med 2013,368(16):1509-18)。
[0008] NCI开展的一项临床试验也展现了良好的结果，该试验入组了 20名ALL患儿，在 接受CAR-T细胞疗法后，14名达到了完全缓解；12名患儿的骨髓中已检测不到未成熟的白 血病细胞，其中10名又接受了干细胞移植，至今无癌生存。研宄结果还表明，CAR-T细胞 疗法可帮助化疗无应答的患者顺利地过度到骨髓移植治疗。纪念斯隆凯特林癌症中心与 NCI在成人患者中开展的1期临床试验也取得了类似的结果（Mazzarella L. 2013American Society of Haematology meeting[J]2014, 8:390)〇
[0009] 除白血病之外，CAR-T疗法对淋巴瘤也显示了喜人的疗效，NCI领导的CAR-T细胞 临床试验招募了 15名成人受试者，其中的绝大多数（9名）都患有晚期弥漫性大B细胞淋 巴瘤（DLBCL)。据Kochenderfer博士及NCI的同事报道，该临床试验的大多数患者都达到 了缓解，在7例可评估的DLBCL受试者中4例获得完全缓解，持续时间从9个月到22个月 (Kochenderfer JN et al，Blood 2012, 119(12):2709-20)〇
[0010] 这些临床试验的其他结果也非常鼓舞人心。比如，CAR-T细胞在被输注到患者体 内后数量急剧增加，在有些患者中其数量增加多达1000倍。此外，CAR-T细胞输注后，患者 的中枢神经系统中也检测到了 CAR-T细胞，中枢神经系统可以说是恶性肿瘤的避难所-- 少量癌细胞逃脱化疗或放疗后的藏身之处。在NCI开展的儿童临床试验中，CAR-T细胞疗 法就根除了两名患儿的已转移至中枢神经系统的癌症。如果CAR-T细胞能够在这些部位持 久发挥作用，那么它们将有助于防止癌症复发。
[0011] 但是目前国际上用于临床试验的CAR-T细胞普遍是采用病毒载体来将CAR分子导 入T细胞中的，从临床治疗安全角度来考虑存在较大的风险。
【发明内容】
[0012] 为解决上述技术问题，本发明提出一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法， 该方法可以将CAR分子定点整合到T细胞的基因组中，避免了使用病毒载体制备CAR-T细 胞存在的安全隐患，能应用于科研评估临床治疗各类癌症患者。
[0013] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种CAR-T细胞制备方法，利用 CRISPR/Cas9技术将CAR分子整合到人第19号染色体上AAVSl位点的第一个内含子内。 [0014] 优选的，提供供体DNA序列，在CAR分子序列上游含有剪切体受体序列和AAVSl左 同源臂序列，CAR分子下游含有poly-A序列和AAVSl右同源臂序列。
[0015] -种CAR-T细胞的应用，利用CRISPR/Cas9将各类肿瘤表面抗原的抗体分子整合 到人类T细胞基因组中AAVSl位点的应用。
[0016] 更进一步，利用CRISPR/Cas9技术制备的CAR-T细胞在评估各类CAR分子对肿瘤 细胞的杀伤力和对正常细胞的副作用，以及临床治疗血癌和各类实体肿瘤中的应用。
[0017] 本发明的有益效果：CRISPR/Cas9系统操作简单，对基因组的编辑效率高，可对任 何物种的基因组进行高效率的定向编辑。为了避免潜在的脱靶效应，我们采用一种突变的 Cas9酶Ni ckase Cas9来克服这个局限，它只切断DNA的一个链，这个单链缺口会促进同源 重组，但不会产生脱靶突变。因此，利用该技术，我们可以将CAR分子精确地整合到人T细 胞基因组特定的"安全港"位点，不影响任何人体正常基因的功能，避免了使用病毒载体存 在的安全隐患和外源基因转机插入基因组的遗传毒性和免疫原性等一系列临床风险问题。
[0018] 该方法将各类肿瘤表面抗原受体整合到人T细胞基因组中的AAVSl位点，在T细 胞表面表达针对各类肿瘤的特异受体，专一性识别并杀死肿瘤细胞，可用于评估各类CAR-T 细胞对肿瘤细胞的杀伤力及临床治疗各类癌症患者，其安全性更高。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0020] 实施例1 (制备实施例）
[0021] 利用CRISRP/Cas9系统生产白血病CAR-T细胞：
[0022] I) T细胞分离培养
[0023] a.通过密度梯度离心分离新鲜的外周血单核细胞（PBMC, peripheral blood mononuclear cell)；
[0024] b.利用偶联 anti_CD3 和 anti_CD28 抗体的 paramagnetic beads (Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28, Invitrogen, Camarillo, CA, USA)富集 CD3+细胞，磁珠与细胞比例 为3:1 ;细 胞稀释到TNC(total nucleated cell)浓度为20-30xl06/mL，在培养皿中与磁珠 在室温共孵育2小时；
[0025] c.利用 Magnetic particles concentrator (MPC) (Invitrogen)富集 CD3+细胞； 含有CD3+的细胞在培养皿中重悬于培养液（OpTmizer? CTS? T-Cell Expansion SFM, Life Technologies)中，终浓度为 lx 106cells/mL。在 37°C，5%C02 培养箱中培养 2 天。
[0026] 2)CRISPR/Cas9 质粒的构建
[0027] 合成寡核苷酸 gRNA-Al，gRNA-A2, gRNA-Bl，gRNA-B2,序列如下：
[0028] gRNA-AI ： CACCGTGGGGGTTAGACCCAATATCAGG
[0029] gRNA-A2 ： CCCTGATATTGGGTCTAACCCCCA
[0030] gRNA-B I ： CACCGTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGG
[0031] gRNA-B2 ： CCCAGATAAGGAATCTGCCTAACA
[0032] 将gRNA-Al与gRNA-A2退火形成双链gRNA-A ;gRNA-Bl与gRNA-B2退火形成双链 gRNA-B。分别将gRNA-A和gRNA-B连接到经过BbsI酶切的载体pX334中（#42333, Addgene)， 形成 CRISPR/Cas9 质粒 pX334-gRNA-A 和 pX334-gRNA-B。供体 DNA 由 HA-L(左同源臂）、 SA (剪切体接受位点）、FMC63-28Z (白血病CAR分子）、bGH-PA-terminator (转录终止子） 以及HA-R(右同源臂）组成，序列见序列表2。
[0033] 3) T细胞的电转
[0034] 取250uL浓度为lx 107cells/mL的细胞置于0. 2cm Bio-rad电转杯中；将质粒 pX334-gRNA-A、pX334-gRNA-B与供体DNA同时加入电转杯的细胞中小心混匀；设置电压 140V，将电转杯放入电转槽中电转；电转完成后立即取出电转杯，将转染的细胞小心移入培 养板中，在37°C，5% C02培养箱中培养48小时。
[0035] 4)阳性克隆的筛选与扩增
[0036] a.第2-5天：用puromycin(Sigma, P8833)进行筛选。连续4天，每天用含新鲜配 制puromycin(0. 5ug/ml)的培养液进行换液培养；
[0037] b.第6天：换成正常不含puromycin的培养液继续培养，直到第7-10天，克隆长 到大约2mm直径大小，可以进行挑克隆；通常挑取20个克隆，在24孔培养板中进行培养，每 天换液，直到细胞长成融合状态，即可进行下一步分析或细胞冻存。
[0038] 5)基因型鉴定
[0039] 提取细胞的基因组DNA(DNeasy Blood&Tissue Kit, Qiagen)作为模板，用引物 AAVSlF和AAVSlR进行PCR扩增，跑DNA电泳比较条带大小。插入CAR分子的PCR条带为 2343bp，未插入CAR分子的PCR条带为360bp。将PCR条带正确的基因组DNA进行测序，进 一步确认CAR分子的正确性。PCR引物如下：
[0040] AAVSlF:TGTCCCCGAGCTGGGACCAC
[0041] AAVSIR:TGGGAGAGGGTAGCGCAGGG
[0042] 6)流式细胞分析检测CAR分子的表达
[0043] a.离心细胞，利用流式细胞仪通过Protein L实验对CAR分子在T细胞表面 的表达进行评测。Biotinylated Protein L(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 重悬于无菌水中，浓度为50ng/uL，4°C保存；5ug用于标记lx 106的细胞。细胞与 Protein L避光，4°C，孵育30分钟。Protein L的终浓度通过滴度实验确定。用cold fluorescence-activated cell sorting buffer清洗管子两次，去除多余的试剂。取 30uL，1:120 稀释于 PBS 中的 phycoerythrin-labeled streptavidin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)加入管子，20分钟后清洗。
[0044] b. 7-Aminoactinomycin D (Immunotech, Marseille, France)用于确定活性；最 终产物检测 CD3, CD8(Invitrogen)，CD4, CD19(BD Biosicences)。阴性对照用同样的 方法检测。BD FacsCanto II(BD Biosicences)用于获取染色细胞，FlowJo(Treestar Inc, Ashland, OR, USA)用于分析结果。
[0045] CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是最近两年新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对祀向基因进行编辑 的技术，入选了 2013年《科学》杂志十大进展（Couzin-Frankel J et al, Science 2013, 342(6165) :1432-1433)。在这一系统中，包含与靶位点互补序列的sgRNA(single guide RNA)指导Cas9蛋白在序列靶位点切断双链DNA，起到靶向剪切的作用。这时如果 我们提供供体DNA的话，诱导位点与供体DNA之间发生同源重组（HR)，就能将供体上的DNA 片段整合到基因组上。
[0046] CRISPR/Cas9系统操作简单，对基因组的编辑效率高，可对任何物种的基因组进行 高效率的定向编辑。为了避免潜在的脱靶效应，我们采用一种突变的Cas9酶Nickase Cas9 来克服这个局限，它只切断DNA的一个链，这个单链缺口会促进同源重组，但不会产生脱靶 突变（Ran FA et al, Cell 2013, 154(6): 1380-9)。
[0047] 人类第19号染色体上的AAVSl (又名为PPP1R2C位点）是一个经过验证、能确保 转入DNA片段预期功能的"安全港"位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入 基因能被正常转录。另外很重要的一点是在该位点插入外源基因片段对细胞无已知的副 作用。靶向AAVSl位点的CRISPR/Cas9体系能特异剪切人类第19号染色体上的AAVSl位 点，生成断裂DNA，触发DNA的自然修复机制，诱导位点与AAVSl供体DNA之间发生同源重 组（HR)，将供体上的DNA片段整合到基因组上的"安全港"位点（Mali P et al，Science 2013, 339(6121) :823-6)。
[0048] 因此，利用该技术，我们可以将CAR分子精确地整合到人T细胞基因组特定的"安 全港"位点，不影响任何人体正常基因的功能，避免了使用病毒载体存在的安全隐患和外源 基因转机插入基因组的遗传毒性和免疫原性等一系列临床风险问题。
【主权项】
1. 一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术 将CAR分子整合到人第19号染色体上AAVSl位点的第一个内含子内。2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：提 供供体DNA序列，在CAR分子序列上游含有剪切体受体序列和AAVSl左同源臂序列，CAR分 子下游含有Poly-A序列和AAVSl右同源臂序列。3.根据权利要求2所述的利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：利 用CRISPR/Cas9将各类肿瘤表面抗原的抗体分子整合到人类T细胞基因组中AAVSl位点的 应用。4.根据权利要求3所述的利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：利 用CRISPR/Cas9技术制备的CAR-T细胞在评估各类CAR分子对肿瘤细胞的杀伤力和对正常 细胞的副作用，以及临床治疗血癌和各类实体肿瘤中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，其制备方法为利用CRISPR/Cas9技术将CAR分子整合到人第19号染色体上AAVS1位点的第一个内含子内；利用CRISPR/Cas9将各类肿瘤表面抗原的抗体分子整合到人类T细胞基因组中AAVS1位点的应用。利用该技术，我们可以将CAR分子精确地整合到人T细胞基因组特定的“安全港”位点，不影响任何人体正常基因的功能，避免了使用病毒载体存在的安全隐患和外源基因转机插入基因组的遗传毒性和免疫原性等一系列临床风险问题。
【IPC分类】C12N5/10, C12Q1/02
【公开号】CN104894068
【申请号】CN201510220941
【发明人】熊波
【申请人】南京凯地生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月4日
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