一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置的制造方法
一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本申请项目涉及一种能够精确调控胰岛素分泌的组织工程装置，属于生命科学、 基础及临床医学、生物工程领域一项技术革新。
【背景技术】
[0002] 胰岛素相对或者绝对的缺乏是糖尿病的重要病因，胰岛素注射是终末期糖尿病治 疗的重要治疗手段。但是注射胰岛素给患者造成严重的经济负担和身体痛苦。另一方面， 胰岛素的注射需要考虑饮食节律，从而保证血糖水平相对稳定。基于这样的需求，设计能够 精确控制的"人工胰腺"成为糖尿病领域的热点和难点。光遗传学技术是遗传技术和光控 技术结合之后产生的一项全新技术。人们可以借助光遗传学技术对活细胞或组织中的活细 胞进行调控，开启或者关闭某个已经被研宄的非常清楚的细胞功能。譬如，拟南芥中隐光色 素 CRY2和CIBl在蓝光照射下可以发生相互作用，通过诱导这种相互作用可以调控基因的 表达。另一方面，蓝光照射在临床上已经用于新生儿黄疸的治疗，临床实践表明，这种光治 疗的方法安全可靠。而随着遗传技术的进步，特别是病毒载体的进步和CRISPR/Cas9技术 的发展，在细胞进行精确位点的基因编辑逐渐成为可能，有望显著提高基因治疗的安全性。 组织工程技术可以为我们再生出需要的组织，代替体内功能异常的器官或组织，然而胰腺 再生依然遥远。制作能够分泌胰岛素的组织成为一种现实而可行的选择。另外，通过光路 控制胰岛素基因的时空表达有望精确调控细胞的生物学行为，从而为胰岛素的节律性分泌 带来新的希望。本发明综合上述技术的优势，设计了一种光控胰岛素节律性分泌的组织工 程装置，有望代替胰岛素注射治疗糖尿病。
【发明内容】
本申请提出了一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置，有望代替胰 岛素注射治疗糖尿病。本发明解决的技术问题包括：1)构建了受光调控的 VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN正反馈系统，2)构建了受光调控的胰岛素病毒表达系统， 3)构建了基于细胞移植和组织工程装置，在蓝光照射下能够持久按需分泌胰岛素。 本申请的有益效果是，能够替代胰岛素注射治疗，用于重度、难治性糖尿病的治疗，具 有重要的社会及经济效益。 【附图说明】 下面结合附图对本发明专利进一步说明：附图IA是能够受光调控的 Gal4AD-CIBlN-IRES-Gal4BD-CIBlN表达载体的基本结构，附图IB是Gal4/UAS系统驱动表 达突变胰岛素前体的表达载体的基本结构，附图IC是突变的胰岛素前体和野生型胰岛素 前体的序列特征。附图2基因表达调控原理，当没有光照射时，只有本底水平的VP16-CRY2 和Gal4BD-CIBlN的表达，且二者不能相互作用，当有蓝光照射时，本底的VP16-CRY2和 Gal4BD的相互作用，通过结合启动子区Gal4结合位点，诱导其自身表达增加，形成正反馈。 当VP16-CRY2和Gal4BD的高表达且相互作用时，载体表达大量胰岛素前体，后者进一步被 加工成熟、进而分泌。附图3A是蓝光照射不同时间后，VP16-CRY2、Gal4BD的表达情况；附 图3B是蓝光照射不同时间后Insulin的表达情况，附图3C是指蓝光照射1小时后，撤掉 蓝光，不同时间分泌胰岛素的情况。附图4显示对照、白光照射感染目标病毒载体的细胞、 蓝光照射感染目标病毒载体的细胞的三种细胞增殖情况，结果显示细胞增殖基本没差别。 附图5A显示PLGA支架的大体结构，附图5B显示PLGA支架的微观结构，附图5C显示感染 VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN病毒载体和Insulin病毒载体的成纤维细胞加载至PLGA支 架后移植于皮下，形成稳定的结构。附图6A显示在蓝光刺激下，体内诱导糖尿病小鼠表达 产生胰岛素；附图6B显示蓝光照射处理后，糖耐量显著改善。附图7A显示蓝光照射治疗 后，糖尿病小鼠体重显著恢复，附图7B显示蓝光照射治疗后，糖尿病小鼠糖尿病血糖降低。 具体的实施方式 1. 设计、包装光控的VP16-CRY2和Gal4BD-CIBlN共表达病毒系统 (1) 通过公司合成序列，其特征是：包括cPPT、启动子Gal4/UAS、VP16-CRY2、IRES、 Gal4BD-CIBlN，具体序列见序列表；然后将上述序列克隆至pUC57载体，命名为 pUC57-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN〇 (2) 通过 Clal+BstBl 双酶切 pUC57-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN 和 pWPI 载体，然后将上述含有cPPT、启动子Gal4/UAS、VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN的序列克隆 至 pWPI 载体，称为 pWPI-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN。 (3) 连接产物转化入高效率的Stbl3E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新抽提质粒，供病毒包装使用。 (4) 将提取好的高纯度 pWPI-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN、psPAX2、 pMD2G按照10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续 培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养基，获得含 有病毒的培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。 2. 设计、包装光控的胰岛素病毒表达系统 (1) 通过公司合成序列，其特征是：包括cPPT、启动子Gal4/UAS、突变的胰岛素前 体表达框，具体序列见序列表；然后将上述序列克隆至PUC57载体，命名为pUC57-Gal4/ UAS-mProinsulin。其中突变的Proinsulin A/B链与C-肽相连部位突变成furin剪切位 点，使得Insulin能够在非内分泌细胞表达、分泌。 (2) 通过 Clal+BstBl 双酶切 pUC57-Gal4/UAS_mProinsulin 和 pWPI 载体，然后将上述 Gal4/UAS_mProinsulin 的片段克隆至 pWPI 载体，称为 pWPI-Gal4/UAS_mProinsulin〇 (3) 连接产物转化入高效率的Stbl3E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新大量抽提质粒，供病毒包装使用。 (4) 将预先提取好的高纯度pWPI-Gal4/UAS_mProInsulin、psPAX2、pMD2G按照质量比 10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h， 收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养基，获得含有病毒的 培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。 3. 细胞学检测基因修饰过的成纤维细胞在光诱导下胰岛素分泌的情况 (1)麻醉C57/B6小鼠后，颈椎脱臼处死小鼠，背部皮肤脱毛后取小鼠背部皮肤，大小约 2 X 3cm2。剪碎皮肤组织块，至组织块大小能够自由通过IOml的Tip头。加入0. 3 %的胶原 酶37度孵育lh，然后将消化液通过100 μ m的筛子，收集滤液，1000 g离心5min，获得消化的 单个细胞的细胞团。将细胞沉淀重悬，铺板培养。 (2) 将上述单个细胞传代至IOcm培养板中，至细胞密度达到80%时，同时感染前述的 两种病毒。感染方法为：使病毒液复温至室温，取8ml细胞培养基、100 μ 1病毒液（MOI = 30)和终浓度为8 μ g/ml的Polybrene混合后，加入细胞中。在37°C、5% C02和95%相对 湿度的孵箱培养16h，更换新鲜培养基。 (3) 将细胞重新接种于48孔板，相邻的孔不接种细胞。采用蓝光照射（460nm，10W，光 源距离细胞IOcm)细胞，分别照射15min，30min、45min和60min，于照射后半个小时检测 CRY2、CIB1和Insulin的表达及培养基中新分泌的胰岛素情况。结果发现，与对照相比，照 射时间越长，胰岛素的分泌越多；随着时间的推移，胰岛素的分泌先升高，后降低。 4. 细胞学检测基因修饰过的成纤维细胞增殖情况 (1)细胞处理同上 ⑵MTT检测上述基因修饰的成纤维细 胞的增殖情况。具体方法为将上述基因修饰的细 胞和对照未经转染的细胞同时按1000/孔的密度铺板于96孔板，每天MTT检测细胞增殖情 况。结果显示，基因改造后细胞增殖没有显著差异。 5. 基因修饰成纤维细胞皮下移植治疗糖尿病的效果观察 (1) PLGA支架制备 采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)制备大小为 5X3mm(dia. Xheight)的支架。具体方法为：将 3g 的 85 : 15PLGA(Sigma Aldrich)溶于 30ml二氯甲烷（DCM)。以直径为125-500 μ m的NaCl晶体为致孔剂，将上述PLGA溶液倾倒 于NaCl晶体上并搅拌均匀，同时使得液面高度为3mm。第二天，将上述固体用水洗涤，去除 NaCl晶体，形成多孔的PLGA支架。最后采用直径为5-_的活检针打孔出直径为5-_的支 架，-20 °C保存备用。 (2) PLGA支架消毒与细胞加载 使用Anprolene气体消毒器对PLGA支架支架进行环氧乙烷消毒，消毒模式选择24h 循环。将转染病毒的成纤维细胞培养至对数生长期，0.25%胰酶37°C消化lmin，并用两 倍体积培养基中和，计数，1200rpm室温离心5min，去上清，将细胞重悬并使细胞密度为 2. 5X 107。与此同时将PLGA生物支架置于培养基中，37°C、5% 0)2和95%相对湿度的孵箱 培养浸泡30分钟。取出PLGA支架置于无菌纱布上10分钟，沥干，然后将支架转移到空白 的12孔板中，每个支架上滴加40μ1细胞悬液（细胞总数为IXlO 6/支架）。37°C、5% CO2 和95%相对湿度孵育2h，随后用于糖尿病小鼠的皮下移植。 (3) 糖尿病模型制备 采用C57/BL6小鼠制作模型，具体方法是按50mg/kg连续5天注射链脲佐菌素 (Streptozocin，STZ)，在造模后的72小时进行血糖监测，其血糖值大于16. 7mmol/l，判定 造模成功。 (4) PLGA支架和成纤维细胞复合体的皮下移植 造模成功的C57/B16小鼠称重，使用吸入法进行麻醉（3. 5%异氟醚诱导麻醉，2%异氟 醚维持麻醉）。根据呼吸深度和频率、后肢脚趾捏反射判断和监控麻醉深度。使用脱毛剂去 除小鼠背部皮肤，消毒切口处和周围皮肤：使用10%聚维酮碘和70%乙醇消毒纱布交替涂 抹，重复三次。手术者穿一次性手术服、戴一次性手术帽、口罩和无菌手套。切口附近皮下 注射2mg/kg的0. 5%盐酸布比卡因局部浸润麻醉，然后沿小鼠背部中线作I. 5-2cm切口，钝 性分离两侧皮下组织，分别在、右两侧的皮下袋中放入接种载有成纤维细胞的PLGA生物支 架，植入时，接种细胞面朝上与实验小鼠皮肤接触。4-0不可吸收尼龙缝线缝合创口。术后 1-2周拆线。手术开始至术后2天内，每8-12小鼠皮下注射0. lmg/kg盐酸丁丙诺啡镇痛。 术后密切观察实验小鼠状态和伤口恢复情况。 (5) 小鼠蓝光照射对胰岛素分泌情况的影响 将小鼠分为2组，小鼠撤食4小时后，分别照射白光（白色荧光灯，20W)和蓝光（LED， 20W，波长450nm)60min。放回笼子里并分别在30,60,120,180和240min时测试胰岛素水 平。具体做法如下：用70%乙醇清洗尾部并在用消毒剪刀剪之前摩擦它以使其血液流通得 更好，从大隐静脉血管中采集约30 μ 1血样，分离血清并放射免疫（RIA)测定胰岛素水平。 结果显示，蓝光照射组小鼠胰岛素呈现先升高后降低的表达趋势。 (6) 小鼠蓝光照射对糖耐量的影响 配置10%葡萄糖的IX PBS溶液，0. 2 ym滤器过滤备用。注射葡萄糖前，先将小鼠饥饿 16小时，然后分别照射白光和蓝光60min，1. 5小时后，按照2mg葡萄糖/g体重的比例，腹腔 内注射葡萄糖溶液。注射完将动物放回笼子里并分别在0, 30,60,90和120min时测试血糖 水平。结果显示，蓝光照射组小鼠的糖耐量显著增强。 (7) 小鼠蓝光照射治疗 正常饲养移植有PLGA支架的糖尿病小鼠，于移植后10天将小鼠分为两组，每组5只： 接受蓝光照射组和不接受蓝光照射的对照组。小鼠每天接受照射时间起始于晚上8点，持 续时间为1小时；对照组接受白光照射相同时间；5周后测量小鼠基础代谢水平。检测小鼠 代谢指标，具体包括小鼠体重和基础血糖检测。 ① 体重检测 于晨时08 :00称重小鼠，结果显示经过蓝光照射治疗的小鼠体重显著恢复。 ② 基础血糖检测 小鼠撤食4小时后，采用ACCU-CHEK舒适度曲线血糖测试仪检测小鼠血糖水平。结果 显示，蓝光照射组与白光对照组相比，基础血糖水平显著降低。
【主权项】
1. 一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置的构建方法，其特征在于：构建光控 Gal4/UAS驱动表达的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN的病毒表达载体和Gal4/UAS驱动表 达的胰岛素病毒表达载体；采用病毒感染或者其它方法，将VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN 的表达载体和胰岛素表达载体同时转染至皮肤来源的成纤维细胞，然后进一步将修饰的成 纤维细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下；待再生组织在体内稳定后，蓝光照射局部皮 肤，诱导胰岛素按需表达。2. 按照权利1表述的构建光控Gal4/UAS驱动表达的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN 的病毒表达载体，其特征是：启动子调控序列为3-5个Gal4结合元件的串联体，表达基因为 两个在光刺激下能够相互作用的两个蛋白编码基因，蛋白编码基因分别与Gal4AD、Gal4BD 融合表达。3. 按照权利1表述的构建光控Gal4/UAS驱动表达的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN 的病毒表达载体，其特征是：IRES序列介导的两个受光控制相互作用的蛋白编码基因，蛋 白编码基因分别与Gal4AD、Gal4BD融合表达。4. 按照权利1表述的GalVUAS驱动表达的胰岛素病毒表达载体，其特征是：启动子调 控序列为3-5个Gal4结合元件的串联体，表达框为突变的insulin前体，后面加入一个短 半衰期RNA的 3'UTR，如TNFa的 3'UTR。5. 按照权利1表述的将VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN的表达载体和胰岛素表达载 体同时转染至皮肤来源的成纤维细胞，其特征是通过腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒和 CRISPR技术将上述表达序列整合入组织工程种子细胞。6. 按照权利1表述的将修饰的成纤维细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下，其特 征是分离皮肤成纤维细胞、骨髓或脂肪来源的间充质细胞等组织工程种子细胞，进行基因 改造后；加载至PLGA、胶原等构成支架，移植于皮下，形成稳定的皮下脂肪组织或纤维组 织。7. 按照权利1表述的蓝光照射局部皮肤，诱导胰岛素按需表达，其特征是诱导光源为 波长为460nm左右的蓝光，人工组织位于皮下，蓝光照射再生组织处局部皮肤，VP16-CRY2 和Gal4BD-CIBlN相互作用，进一步引起自身表达增加，形成正反馈，同时表达增加且相互 作用的VP16-CRY2和Gal4BD-CIBlN促进另一个病毒载体上胰岛素的分泌，当撤掉蓝光后， 系统转为静息状态，胰岛素停止分泌。
【专利摘要】一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置，有望代替胰岛素注射治疗糖尿病。其方法是：构建Gal4/UAS驱动表达的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N的病毒表达载体和Gal4/UAS驱动表达的胰岛素病毒表达载体；分别包装成病毒，转染至皮肤来源的成纤维细胞，然后进一步将修饰的成纤维细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下。待再生组织在体内稳定后，蓝光照射局部皮肤，诱导VP16-CRY2和Gal4BD-CIB1N相互作用，进一步引起自身表达增加，形成正反馈；同时促进另一个载体上胰岛素的分泌。当撤掉蓝光后，系统转为静息状态，胰岛素停止分泌。该组织工程装置有望按需分泌胰岛素。
【IPC分类】C12N15/17, C12N15/86, C12N5/10
【公开号】CN104894069
【申请号】CN201510243877
【发明人】杨国栋
【申请人】杨国栋
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月7日
【技术领域】
[0001] 本申请项目涉及一种能够精确调控胰岛素分泌的组织工程装置，属于生命科学、 基础及临床医学、生物工程领域一项技术革新。
【背景技术】
[0002] 胰岛素相对或者绝对的缺乏是糖尿病的重要病因，胰岛素注射是终末期糖尿病治 疗的重要治疗手段。但是注射胰岛素给患者造成严重的经济负担和身体痛苦。另一方面， 胰岛素的注射需要考虑饮食节律，从而保证血糖水平相对稳定。基于这样的需求，设计能够 精确控制的"人工胰腺"成为糖尿病领域的热点和难点。光遗传学技术是遗传技术和光控 技术结合之后产生的一项全新技术。人们可以借助光遗传学技术对活细胞或组织中的活细 胞进行调控，开启或者关闭某个已经被研宄的非常清楚的细胞功能。譬如，拟南芥中隐光色 素 CRY2和CIBl在蓝光照射下可以发生相互作用，通过诱导这种相互作用可以调控基因的 表达。另一方面，蓝光照射在临床上已经用于新生儿黄疸的治疗，临床实践表明，这种光治 疗的方法安全可靠。而随着遗传技术的进步，特别是病毒载体的进步和CRISPR/Cas9技术 的发展，在细胞进行精确位点的基因编辑逐渐成为可能，有望显著提高基因治疗的安全性。 组织工程技术可以为我们再生出需要的组织，代替体内功能异常的器官或组织，然而胰腺 再生依然遥远。制作能够分泌胰岛素的组织成为一种现实而可行的选择。另外，通过光路 控制胰岛素基因的时空表达有望精确调控细胞的生物学行为，从而为胰岛素的节律性分泌 带来新的希望。本发明综合上述技术的优势，设计了一种光控胰岛素节律性分泌的组织工 程装置，有望代替胰岛素注射治疗糖尿病。
【发明内容】
本申请提出了一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置，有望代替胰 岛素注射治疗糖尿病。本发明解决的技术问题包括：1)构建了受光调控的 VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN正反馈系统，2)构建了受光调控的胰岛素病毒表达系统， 3)构建了基于细胞移植和组织工程装置，在蓝光照射下能够持久按需分泌胰岛素。 本申请的有益效果是，能够替代胰岛素注射治疗，用于重度、难治性糖尿病的治疗，具 有重要的社会及经济效益。 【附图说明】 下面结合附图对本发明专利进一步说明：附图IA是能够受光调控的 Gal4AD-CIBlN-IRES-Gal4BD-CIBlN表达载体的基本结构，附图IB是Gal4/UAS系统驱动表 达突变胰岛素前体的表达载体的基本结构，附图IC是突变的胰岛素前体和野生型胰岛素 前体的序列特征。附图2基因表达调控原理，当没有光照射时，只有本底水平的VP16-CRY2 和Gal4BD-CIBlN的表达，且二者不能相互作用，当有蓝光照射时，本底的VP16-CRY2和 Gal4BD的相互作用，通过结合启动子区Gal4结合位点，诱导其自身表达增加，形成正反馈。 当VP16-CRY2和Gal4BD的高表达且相互作用时，载体表达大量胰岛素前体，后者进一步被 加工成熟、进而分泌。附图3A是蓝光照射不同时间后，VP16-CRY2、Gal4BD的表达情况；附 图3B是蓝光照射不同时间后Insulin的表达情况，附图3C是指蓝光照射1小时后，撤掉 蓝光，不同时间分泌胰岛素的情况。附图4显示对照、白光照射感染目标病毒载体的细胞、 蓝光照射感染目标病毒载体的细胞的三种细胞增殖情况，结果显示细胞增殖基本没差别。 附图5A显示PLGA支架的大体结构，附图5B显示PLGA支架的微观结构，附图5C显示感染 VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN病毒载体和Insulin病毒载体的成纤维细胞加载至PLGA支 架后移植于皮下，形成稳定的结构。附图6A显示在蓝光刺激下，体内诱导糖尿病小鼠表达 产生胰岛素；附图6B显示蓝光照射处理后，糖耐量显著改善。附图7A显示蓝光照射治疗 后，糖尿病小鼠体重显著恢复，附图7B显示蓝光照射治疗后，糖尿病小鼠糖尿病血糖降低。 具体的实施方式 1. 设计、包装光控的VP16-CRY2和Gal4BD-CIBlN共表达病毒系统 (1) 通过公司合成序列，其特征是：包括cPPT、启动子Gal4/UAS、VP16-CRY2、IRES、 Gal4BD-CIBlN，具体序列见序列表；然后将上述序列克隆至pUC57载体，命名为 pUC57-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN〇 (2) 通过 Clal+BstBl 双酶切 pUC57-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN 和 pWPI 载体，然后将上述含有cPPT、启动子Gal4/UAS、VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN的序列克隆 至 pWPI 载体，称为 pWPI-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN。 (3) 连接产物转化入高效率的Stbl3E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新抽提质粒，供病毒包装使用。 (4) 将提取好的高纯度 pWPI-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN、psPAX2、 pMD2G按照10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续 培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养基，获得含 有病毒的培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。 2. 设计、包装光控的胰岛素病毒表达系统 (1) 通过公司合成序列，其特征是：包括cPPT、启动子Gal4/UAS、突变的胰岛素前 体表达框，具体序列见序列表；然后将上述序列克隆至PUC57载体，命名为pUC57-Gal4/ UAS-mProinsulin。其中突变的Proinsulin A/B链与C-肽相连部位突变成furin剪切位 点，使得Insulin能够在非内分泌细胞表达、分泌。 (2) 通过 Clal+BstBl 双酶切 pUC57-Gal4/UAS_mProinsulin 和 pWPI 载体，然后将上述 Gal4/UAS_mProinsulin 的片段克隆至 pWPI 载体，称为 pWPI-Gal4/UAS_mProinsulin〇 (3) 连接产物转化入高效率的Stbl3E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新大量抽提质粒，供病毒包装使用。 (4) 将预先提取好的高纯度pWPI-Gal4/UAS_mProInsulin、psPAX2、pMD2G按照质量比 10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h， 收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养基，获得含有病毒的 培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。 3. 细胞学检测基因修饰过的成纤维细胞在光诱导下胰岛素分泌的情况 (1)麻醉C57/B6小鼠后，颈椎脱臼处死小鼠，背部皮肤脱毛后取小鼠背部皮肤，大小约 2 X 3cm2。剪碎皮肤组织块，至组织块大小能够自由通过IOml的Tip头。加入0. 3 %的胶原 酶37度孵育lh，然后将消化液通过100 μ m的筛子，收集滤液，1000 g离心5min，获得消化的 单个细胞的细胞团。将细胞沉淀重悬，铺板培养。 (2) 将上述单个细胞传代至IOcm培养板中，至细胞密度达到80%时，同时感染前述的 两种病毒。感染方法为：使病毒液复温至室温，取8ml细胞培养基、100 μ 1病毒液（MOI = 30)和终浓度为8 μ g/ml的Polybrene混合后，加入细胞中。在37°C、5% C02和95%相对 湿度的孵箱培养16h，更换新鲜培养基。 (3) 将细胞重新接种于48孔板，相邻的孔不接种细胞。采用蓝光照射（460nm，10W，光 源距离细胞IOcm)细胞，分别照射15min，30min、45min和60min，于照射后半个小时检测 CRY2、CIB1和Insulin的表达及培养基中新分泌的胰岛素情况。结果发现，与对照相比，照 射时间越长，胰岛素的分泌越多；随着时间的推移，胰岛素的分泌先升高，后降低。 4. 细胞学检测基因修饰过的成纤维细胞增殖情况 (1)细胞处理同上 ⑵MTT检测上述基因修饰的成纤维细 胞的增殖情况。具体方法为将上述基因修饰的细 胞和对照未经转染的细胞同时按1000/孔的密度铺板于96孔板，每天MTT检测细胞增殖情 况。结果显示，基因改造后细胞增殖没有显著差异。 5. 基因修饰成纤维细胞皮下移植治疗糖尿病的效果观察 (1) PLGA支架制备 采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)制备大小为 5X3mm(dia. Xheight)的支架。具体方法为：将 3g 的 85 : 15PLGA(Sigma Aldrich)溶于 30ml二氯甲烷（DCM)。以直径为125-500 μ m的NaCl晶体为致孔剂，将上述PLGA溶液倾倒 于NaCl晶体上并搅拌均匀，同时使得液面高度为3mm。第二天，将上述固体用水洗涤，去除 NaCl晶体，形成多孔的PLGA支架。最后采用直径为5-_的活检针打孔出直径为5-_的支 架，-20 °C保存备用。 (2) PLGA支架消毒与细胞加载 使用Anprolene气体消毒器对PLGA支架支架进行环氧乙烷消毒，消毒模式选择24h 循环。将转染病毒的成纤维细胞培养至对数生长期，0.25%胰酶37°C消化lmin，并用两 倍体积培养基中和，计数，1200rpm室温离心5min，去上清，将细胞重悬并使细胞密度为 2. 5X 107。与此同时将PLGA生物支架置于培养基中，37°C、5% 0)2和95%相对湿度的孵箱 培养浸泡30分钟。取出PLGA支架置于无菌纱布上10分钟，沥干，然后将支架转移到空白 的12孔板中，每个支架上滴加40μ1细胞悬液（细胞总数为IXlO 6/支架）。37°C、5% CO2 和95%相对湿度孵育2h，随后用于糖尿病小鼠的皮下移植。 (3) 糖尿病模型制备 采用C57/BL6小鼠制作模型，具体方法是按50mg/kg连续5天注射链脲佐菌素 (Streptozocin，STZ)，在造模后的72小时进行血糖监测，其血糖值大于16. 7mmol/l，判定 造模成功。 (4) PLGA支架和成纤维细胞复合体的皮下移植 造模成功的C57/B16小鼠称重，使用吸入法进行麻醉（3. 5%异氟醚诱导麻醉，2%异氟 醚维持麻醉）。根据呼吸深度和频率、后肢脚趾捏反射判断和监控麻醉深度。使用脱毛剂去 除小鼠背部皮肤，消毒切口处和周围皮肤：使用10%聚维酮碘和70%乙醇消毒纱布交替涂 抹，重复三次。手术者穿一次性手术服、戴一次性手术帽、口罩和无菌手套。切口附近皮下 注射2mg/kg的0. 5%盐酸布比卡因局部浸润麻醉，然后沿小鼠背部中线作I. 5-2cm切口，钝 性分离两侧皮下组织，分别在、右两侧的皮下袋中放入接种载有成纤维细胞的PLGA生物支 架，植入时，接种细胞面朝上与实验小鼠皮肤接触。4-0不可吸收尼龙缝线缝合创口。术后 1-2周拆线。手术开始至术后2天内，每8-12小鼠皮下注射0. lmg/kg盐酸丁丙诺啡镇痛。 术后密切观察实验小鼠状态和伤口恢复情况。 (5) 小鼠蓝光照射对胰岛素分泌情况的影响 将小鼠分为2组，小鼠撤食4小时后，分别照射白光（白色荧光灯，20W)和蓝光（LED， 20W，波长450nm)60min。放回笼子里并分别在30,60,120,180和240min时测试胰岛素水 平。具体做法如下：用70%乙醇清洗尾部并在用消毒剪刀剪之前摩擦它以使其血液流通得 更好，从大隐静脉血管中采集约30 μ 1血样，分离血清并放射免疫（RIA)测定胰岛素水平。 结果显示，蓝光照射组小鼠胰岛素呈现先升高后降低的表达趋势。 (6) 小鼠蓝光照射对糖耐量的影响 配置10%葡萄糖的IX PBS溶液，0. 2 ym滤器过滤备用。注射葡萄糖前，先将小鼠饥饿 16小时，然后分别照射白光和蓝光60min，1. 5小时后，按照2mg葡萄糖/g体重的比例，腹腔 内注射葡萄糖溶液。注射完将动物放回笼子里并分别在0, 30,60,90和120min时测试血糖 水平。结果显示，蓝光照射组小鼠的糖耐量显著增强。 (7) 小鼠蓝光照射治疗 正常饲养移植有PLGA支架的糖尿病小鼠，于移植后10天将小鼠分为两组，每组5只： 接受蓝光照射组和不接受蓝光照射的对照组。小鼠每天接受照射时间起始于晚上8点，持 续时间为1小时；对照组接受白光照射相同时间；5周后测量小鼠基础代谢水平。检测小鼠 代谢指标，具体包括小鼠体重和基础血糖检测。 ① 体重检测 于晨时08 :00称重小鼠，结果显示经过蓝光照射治疗的小鼠体重显著恢复。 ② 基础血糖检测 小鼠撤食4小时后，采用ACCU-CHEK舒适度曲线血糖测试仪检测小鼠血糖水平。结果 显示，蓝光照射组与白光对照组相比，基础血糖水平显著降低。
【主权项】
1. 一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置的构建方法，其特征在于：构建光控 Gal4/UAS驱动表达的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN的病毒表达载体和Gal4/UAS驱动表 达的胰岛素病毒表达载体；采用病毒感染或者其它方法，将VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN 的表达载体和胰岛素表达载体同时转染至皮肤来源的成纤维细胞，然后进一步将修饰的成 纤维细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下；待再生组织在体内稳定后，蓝光照射局部皮 肤，诱导胰岛素按需表达。2. 按照权利1表述的构建光控Gal4/UAS驱动表达的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN 的病毒表达载体，其特征是：启动子调控序列为3-5个Gal4结合元件的串联体，表达基因为 两个在光刺激下能够相互作用的两个蛋白编码基因，蛋白编码基因分别与Gal4AD、Gal4BD 融合表达。3. 按照权利1表述的构建光控Gal4/UAS驱动表达的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN 的病毒表达载体，其特征是：IRES序列介导的两个受光控制相互作用的蛋白编码基因，蛋 白编码基因分别与Gal4AD、Gal4BD融合表达。4. 按照权利1表述的GalVUAS驱动表达的胰岛素病毒表达载体，其特征是：启动子调 控序列为3-5个Gal4结合元件的串联体，表达框为突变的insulin前体，后面加入一个短 半衰期RNA的 3'UTR，如TNFa的 3'UTR。5. 按照权利1表述的将VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIBlN的表达载体和胰岛素表达载 体同时转染至皮肤来源的成纤维细胞，其特征是通过腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒和 CRISPR技术将上述表达序列整合入组织工程种子细胞。6. 按照权利1表述的将修饰的成纤维细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下，其特 征是分离皮肤成纤维细胞、骨髓或脂肪来源的间充质细胞等组织工程种子细胞，进行基因 改造后；加载至PLGA、胶原等构成支架，移植于皮下，形成稳定的皮下脂肪组织或纤维组 织。7. 按照权利1表述的蓝光照射局部皮肤，诱导胰岛素按需表达，其特征是诱导光源为 波长为460nm左右的蓝光，人工组织位于皮下，蓝光照射再生组织处局部皮肤，VP16-CRY2 和Gal4BD-CIBlN相互作用，进一步引起自身表达增加，形成正反馈，同时表达增加且相互 作用的VP16-CRY2和Gal4BD-CIBlN促进另一个病毒载体上胰岛素的分泌，当撤掉蓝光后， 系统转为静息状态，胰岛素停止分泌。
【专利摘要】一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置，有望代替胰岛素注射治疗糖尿病。其方法是：构建Gal4/UAS驱动表达的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N的病毒表达载体和Gal4/UAS驱动表达的胰岛素病毒表达载体；分别包装成病毒，转染至皮肤来源的成纤维细胞，然后进一步将修饰的成纤维细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下。待再生组织在体内稳定后，蓝光照射局部皮肤，诱导VP16-CRY2和Gal4BD-CIB1N相互作用，进一步引起自身表达增加，形成正反馈；同时促进另一个载体上胰岛素的分泌。当撤掉蓝光后，系统转为静息状态，胰岛素停止分泌。该组织工程装置有望按需分泌胰岛素。
【IPC分类】C12N15/17, C12N15/86, C12N5/10
【公开号】CN104894069
【申请号】CN201510243877
【发明人】杨国栋
【申请人】杨国栋
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月7日
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