一种监测肿瘤演变的组织工程装置的制造方法
一种监测肿瘤演变的组织工程装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本申请项目涉及一种能够随时监测肿瘤演变的组织工程装置，属于生命科学、临 床医学、诊断学、再生医学领域一项技术革新。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是严重威胁人类生命健康的主要杀手，及时和早期监测肿瘤发生及其复发转 移对改善肿瘤预后具有重要的意义。传统的肿瘤诊断方法存在一定局限性，如影像学和病 理学方法只能检测一定大小的原位肿瘤或者转移瘤，血清学和生化检测缺乏特异性。最为 重要的是，这些检测方法不能成为实时监测的手段。预警敏感人群和监测术后患者肿瘤复 发转移风险依然是肿瘤诊断和预防的关键难题。肿瘤相关的低热和炎症是肿瘤演变的重要 因素，也是肿瘤演变的重要特征，同时监测体内致热和致炎因素的改变一定程度上能够预 警肿瘤的演变。近年来的研宄表明，肿瘤演变过程中，伴随低热等代谢特征的改变，UCPl启 动子活性增强，这种改变是消瘦等恶病质的原因，因而先于消瘦，是病变的早期特征之一。 由于这种代谢改变特异性差，而鲜有用来诊断肿瘤的。此外，炎症相关介质IL6升高是多种 肿瘤的特征。消耗性产热和IL6同时增加更加提示罹患肿瘤或者肿瘤演变的风险，特别是 当这种变化具有持续性、递增性等特征时。目前，随着基因工程和合成生物学的发展，我们 能够设计并人为构建一系列基因表达载体/报告系统/生物环路，实现一定的生物功能。特 别是荧光成像系统的发展，使得实时监测报告基因的表达情况成为可能，光学成像诊断具 有广泛应用前景。而另一方面，脂肪组织，在体内更新较慢，但同时又保证了自我更新。基 于脂肪干细胞的脂肪组织再生已经成为整形和代谢病治疗的潜在手段。携带报告基因的脂 肪（干）细胞，一方面不会引起肿瘤等风险，另一方面，又能在体内持续存在，是潜在的长期 监测和预警肿瘤的生物装置的候选再生组织。本发明综合上述肿瘤生物学、再生医学和诊 断医学等的技术优势，设计了一种能够监测肿瘤演变的组织工程装置，有望用于肿瘤高危 人群和术后患者复发转移的预警。
【发明内容】
本申请提出了一种实时监测肿瘤演变的组织工程装置，本发明解决的技术问题包 括：1)构建了 UCPl启动子驱动VP16- Δ PPARg (128-229aa)表达表达系统，2)构建了 mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动GaHBD- Δ PGCla (170-350aa)表达系统，3)构建 了 UAS/Gal4驱动EGFP表达的报告基因，当机体UCPl启动子活性增强和IL6增高时，诱导 VP16- Δ PPARg和GaHBD- Δ PGCla表达增加，二者能够发生相互作用，导致报告基因 EGFP表 达增强，4)构建了基于脂肪（干）细胞移植的组织工程装置，能够长期监测报告基因的表 达。 本申请的有益效果是，有望用于肿瘤高危人群和术后患者肿瘤演变的预警，具有重要 的社会及经济效益。 【附图说明】 下面结合附图对本发明专利进一步说明：附图IA是UCPl启动子驱动 VP16-APPARg(128-229aa)表达的病毒载体基本结构，附图IB是mCMV-STAT3-结合元 件融合启动子驱动Gal4BD-APGCla(170_350aa)表达的病毒载体基本结构，附图IC 是UAS/Ga 14驱动EGFP表达的载体基本结构。附图2是本发明的工作原理，当没有肿 瘤时，UCPl启动子活性和mCMV-STAT3结合元件融合启动子活性都很低，二者驱动的 VP16-APPARg(128_229aa)和 Gal4BD-APGCla(170_350aa)表达很少，不能产生足够的相 互作用诱导EGFP表达，随着肿瘤的发生发展，UCPl和mCMV-STAT3结合元件融合启动子活 性增强，诱导 VP16- Δ PPARg (128_229aa)和 GaHBD- Δ PGCla (170_350aa)表达及相互作用， 进而诱导大量EGFP表达。通过监测EGFP表达预测肿瘤进展。 具体的实施方式 1. 设计UCPl驱动的VP16-APPARg(128-229aa)病毒表达系统 (1) 通过公司合成序列，其特征是：包括分列于5'和3'末端的Clal和BstBl酶切位 点、cPPT、UCPl启动子、VP16- Λ PPARg (128-229aa)，具体序列见序列表；然后将上述序列克 隆至 pUC57 载体，命名为 pUC57-UCPl-VP16-APPARg (128-229aa)。 (2) 通过 Clal+BstBl 双酶切 pUC57-UCPl-VP16-APPARg(128-229aa)和 pWPI 载体，然 后将上述含有cPPT、UCPl启动子、VP16-APPARg(128-229aa)的序列克隆至pWPI载体，称 为 PWPI-UCP1-VP16-Δ PPARg(128-229aa)〇 (3) 连接产物转化入高效率的Stbl3 E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新抽提质粒，供病毒包装使用。 (4) 将提取好的高纯度 pWPI-UCPl-VP16-APPARg(128-229aa)。、psPAX2、pMD2G 按照 10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h， 收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养基，获得含有病毒的 培养液。在此基础上，进一步通过CsCI法纯化病毒。 2. mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动GaHBD-APGCla (170-350aa)表达的病毒载 体 (1) 通过公司合成序列，其特征是：包括分列于5'和3'末端的Clal和BstBl酶切位 点、cPPT、mCMV-STAT3-结合元件融合启动子、GaHBD-APGCla (170-350aa)，具体序列见序 列表；然后将上述序列克隆至PUC57载体，命名为pUC57-mCMV-STAT3-Gal4BD- Δ PGCla (170 _350aa)〇 (2) 通过 Clal+BstBl 双酶切 pUC57-mCMV-STAT3-Gal4BD- Δ PGCla (170-350aa)和 pWPI 载体，然后将上述mCMV-STAT3-Gal4BD- Δ PGCla (170-350aa)的片段克隆至pWPI载体，称为 pWPI-mCMV-STAT3-Gal4BD-Δ PGCla(170-350aa)。 (3) 连接产物转化入高效率的Stbl3 E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新大量抽提质粒，供病毒包装使用。 (4) 将预先提取好的高纯度 pWPI-mCMV-STAT3-Gal4BD-APGCla(170-350aa)、psPAX2、 pMD2G按照质量比10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养 基，继续培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养 基，获得含有病毒的培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。 3. 构建UAS/GAL4驱动EGFP表达的病毒载体 (1)通过公司合成序列， 其特征是：包括分列于5'和3'末端的Clal和BstBl酶切位 点、cPPT、UAS/GAL4启动子和EGFP，具体序列见序列表；然后将上述序列克隆至pUC57载体， 命名为 PUC57-UAS/GAL4-EGFP。 ⑵通过Clal+BstBl双酶切pUC57-UAS/GAL4-EGFP和pWPI载体，然后将上述UAS/ GAL4-EGFP 的片段克隆至 pWPI 载体，称为 pWPI-UAS/GAL4-EGFP。 (3)连接产物转化入高效率的Stbl3 E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新大量抽提质粒，供病毒包装使用。 ⑷将预先提取好的高纯度PWPI-UAS/GAL4-EGFP、psPAX2、pMD2G按照质量比 10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h， 收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养基，获得含有病毒的 培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。 4. 细胞学检测基因修饰过的脂肪细胞不同条件下绿色荧光表达情况 (1) 麻醉C57/B6小鼠后，颈椎脱白处死小鼠，酒精消毒后沿腹股沟皮肤切开皮肤，分离 脂肪组织。剪碎脂肪组织块，至组织块大小能够自由通过IOml的Tip头。加入0.3%的胶 原酶37度孵育lh，然后将消化液通过100 μ m的筛子，收集滤液，1000 g离心5min，获得消化 的单个细胞的细胞团。将细胞沉淀重悬，铺板培养。 (2) 通过流式细胞仪分选⑶31-Scal+⑶34+⑶24+的脂肪干细胞，培养于IOcm培养板 中，至细胞密度达到80%时，同时感染前述的三种病毒。感染方法为：使病毒液复温至室 温，取8ml细胞培养基、100 μ 1病毒液（Μ0Ι = 30)和终浓度为8 μ g/ml的Polybrene混合 后，加入细胞中。在37°C、5% C02和95%相对湿度的孵箱培养16h，更换新鲜培养基。 (3) 将细胞重新接种于24孔板，脂肪分化诱导3天，然后分别进行对照和肿瘤细胞条件 培养基处理，观察EGFP的表达情况。结果发现，肿瘤条件培养基显著增强EGFP的表达。 4. 细胞学检测基因修饰过的脂肪前体细胞增殖情况 (1) 细胞处理同上 (2) MTT检测上述基因修饰的脂肪前体细胞的增殖情况。具体方法为将上述基因修饰的 细胞和对照未感染的细胞同时按1000/孔的密度铺板于96孔板，每天MTT检测细胞增殖情 况。结果显示，基因改造后细胞增殖没有显著差异。 5. 基因修饰脂肪前体细胞皮下移植监测肿瘤的效果观察 (1) 细胞加载与移植 将经三种病毒转染的脂肪干细胞高密度培养诱导分化2天后，0. 25%胰酶37°C消化 lmin，并用两倍体积培养基中和，计数，1200rpm室温离心5min，去上清，将细胞重悬并使细 胞密度为2. 5 X 107,然后将细胞加载至Collagen海绵，每个Collagen海绵上滴加40 μ 1细 胞悬液（细胞总数为I X 1〇7支架），随后移植于小鼠腹股沟脂肪垫下，再生脂肪组织。 (2) 小鼠荷瘤模型 在上述再生脂肪组织的C57/BL6小鼠模型基础上，进一步制作小鼠 Lewis肺癌荷瘤模 型。具体方法是在小鼠腋下皮肤注射Lewis肺癌细胞系，接种细胞数分别为0,10~3,10~4， 10~5 和 10~6。 (3) 监测不同荷瘤鼠再生脂肪的荧光强度 接种Lewis肺癌细胞1周后，采用小动物荧光成像仪记录接种不同细胞数的肿瘤模型 中，再生脂肪组织处绿色荧光蛋白的强度。研宄表明随着接种细胞数的增加，再生的脂肪组 织中绿色荧光蛋白表达强度逐渐增强。
【主权项】
1. 一种监测肿瘤演变的组织工程装置的构建方法，其特征在于：构建协同监测基于代 谢和炎症的报告系统，具体包括，UCPl启动子驱动VP16-APPARg(128-229aa)表达的病毒 载体、mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动Gal4BD-APGCla(170-350aa)表达的病毒载 体和UAS/Gal4驱动EGFP表达的报告基因载体；采用病毒感染或者其它方法，将上述三种表 达载体同时转染至脂肪干细胞等能够分化为脂肪细胞的种子细胞，然后将干细胞进行体外 分化诱导后进一步将定向分化的细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下；待再生组织在 体内稳定后，通过监测EGFP的表达水平监测肿瘤的演变。2. 按照权利1表述的构建协同监测基于代谢和炎症的报告系统，其特征是：包括监测 产热的UCPl启动子和监测炎症的STAT3调控的启动子，共同调控两个能够相互作用的蛋 白；两个相互作用蛋白的同时高表达，诱导报告基因EGFP表达增加；预测肿瘤演变。3. 按照权利1表述的UCPl启动子驱动VP16-APPARg(128-229aa)表达的病毒载体，其 特征是：启动子调控序列为UCPl的启动子，表达基因为VP16-APPARg(128-229aa)融合表 达蛋白。4. 按照权利1表述的mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动 Gal4BD-APGCla(170-350aa)表达的病毒载体，其特征是：启动子序列为miniCMV启动子和 多个串联的STAT3结合元件的融合启动子，表达的基因是Gal4BD-APGCla(170-350aa)融 合蛋白。5. 按照权利1表述的UAS/Gal4驱动EGFP表达的报告基因载体，其特征是：启动子调 控序列为3-5个Gal4结合元件的串联体，表达框为EGFP。6. 按照权利1表述的将上述三种表达载体同时转染至脂肪干细胞等能够分化为脂肪 细胞的种子细胞，然后将干细胞进行体外分化诱导后进一步将定向分化的细胞加载至组织 工程支架后，移植于皮下，其特征是，将三个表达载体通过腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒 和CRISPR技术导入组织工程种子细胞，种子细胞包括脂肪干细胞和骨髓基质干细胞，移植 部位为皮下。7. 按照权利1表述的监测EGFP的表达水平监测肿瘤的演变，其特征是通过监测荧光蛋 白的多少反映炎症和产热的多少，包括各类荧光蛋白。
【专利摘要】一种监测肿瘤演变组织工程装置的构建，其方法是：构建协同监测基于代谢和炎症的报告系统，具体包括，UCP1启动子驱动VP16-ΔPPARg(128-229aa)表达的病毒载体、mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动Gal4BD-ΔPGC1a(170-350aa)表达的病毒载体和UAS/Gal4驱动EGFP表达的报告基因载体。采用病毒感染等方法，将上述三种表达载体同时转染至脂肪干细胞等能够分化为脂肪细胞的种子细胞，然后将干细胞进行体外分化诱导后进一步将定向分化的细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下，再生出脂肪；通过监测EGFP的表达强度监测机体炎症和发热的程度，预测肿瘤演变趋势。
【IPC分类】C12N15/86, C12N15/11, G01N33/68, C12N5/10
【公开号】CN104894070
【申请号】CN201510244369
【发明人】杨国栋
【申请人】杨国栋
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月7日
【技术领域】
[0001] 本申请项目涉及一种能够随时监测肿瘤演变的组织工程装置，属于生命科学、临 床医学、诊断学、再生医学领域一项技术革新。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是严重威胁人类生命健康的主要杀手，及时和早期监测肿瘤发生及其复发转 移对改善肿瘤预后具有重要的意义。传统的肿瘤诊断方法存在一定局限性，如影像学和病 理学方法只能检测一定大小的原位肿瘤或者转移瘤，血清学和生化检测缺乏特异性。最为 重要的是，这些检测方法不能成为实时监测的手段。预警敏感人群和监测术后患者肿瘤复 发转移风险依然是肿瘤诊断和预防的关键难题。肿瘤相关的低热和炎症是肿瘤演变的重要 因素，也是肿瘤演变的重要特征，同时监测体内致热和致炎因素的改变一定程度上能够预 警肿瘤的演变。近年来的研宄表明，肿瘤演变过程中，伴随低热等代谢特征的改变，UCPl启 动子活性增强，这种改变是消瘦等恶病质的原因，因而先于消瘦，是病变的早期特征之一。 由于这种代谢改变特异性差，而鲜有用来诊断肿瘤的。此外，炎症相关介质IL6升高是多种 肿瘤的特征。消耗性产热和IL6同时增加更加提示罹患肿瘤或者肿瘤演变的风险，特别是 当这种变化具有持续性、递增性等特征时。目前，随着基因工程和合成生物学的发展，我们 能够设计并人为构建一系列基因表达载体/报告系统/生物环路，实现一定的生物功能。特 别是荧光成像系统的发展，使得实时监测报告基因的表达情况成为可能，光学成像诊断具 有广泛应用前景。而另一方面，脂肪组织，在体内更新较慢，但同时又保证了自我更新。基 于脂肪干细胞的脂肪组织再生已经成为整形和代谢病治疗的潜在手段。携带报告基因的脂 肪（干）细胞，一方面不会引起肿瘤等风险，另一方面，又能在体内持续存在，是潜在的长期 监测和预警肿瘤的生物装置的候选再生组织。本发明综合上述肿瘤生物学、再生医学和诊 断医学等的技术优势，设计了一种能够监测肿瘤演变的组织工程装置，有望用于肿瘤高危 人群和术后患者复发转移的预警。
【发明内容】
本申请提出了一种实时监测肿瘤演变的组织工程装置，本发明解决的技术问题包 括：1)构建了 UCPl启动子驱动VP16- Δ PPARg (128-229aa)表达表达系统，2)构建了 mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动GaHBD- Δ PGCla (170-350aa)表达系统，3)构建 了 UAS/Gal4驱动EGFP表达的报告基因，当机体UCPl启动子活性增强和IL6增高时，诱导 VP16- Δ PPARg和GaHBD- Δ PGCla表达增加，二者能够发生相互作用，导致报告基因 EGFP表 达增强，4)构建了基于脂肪（干）细胞移植的组织工程装置，能够长期监测报告基因的表 达。 本申请的有益效果是，有望用于肿瘤高危人群和术后患者肿瘤演变的预警，具有重要 的社会及经济效益。 【附图说明】 下面结合附图对本发明专利进一步说明：附图IA是UCPl启动子驱动 VP16-APPARg(128-229aa)表达的病毒载体基本结构，附图IB是mCMV-STAT3-结合元 件融合启动子驱动Gal4BD-APGCla(170_350aa)表达的病毒载体基本结构，附图IC 是UAS/Ga 14驱动EGFP表达的载体基本结构。附图2是本发明的工作原理，当没有肿 瘤时，UCPl启动子活性和mCMV-STAT3结合元件融合启动子活性都很低，二者驱动的 VP16-APPARg(128_229aa)和 Gal4BD-APGCla(170_350aa)表达很少，不能产生足够的相 互作用诱导EGFP表达，随着肿瘤的发生发展，UCPl和mCMV-STAT3结合元件融合启动子活 性增强，诱导 VP16- Δ PPARg (128_229aa)和 GaHBD- Δ PGCla (170_350aa)表达及相互作用， 进而诱导大量EGFP表达。通过监测EGFP表达预测肿瘤进展。 具体的实施方式 1. 设计UCPl驱动的VP16-APPARg(128-229aa)病毒表达系统 (1) 通过公司合成序列，其特征是：包括分列于5'和3'末端的Clal和BstBl酶切位 点、cPPT、UCPl启动子、VP16- Λ PPARg (128-229aa)，具体序列见序列表；然后将上述序列克 隆至 pUC57 载体，命名为 pUC57-UCPl-VP16-APPARg (128-229aa)。 (2) 通过 Clal+BstBl 双酶切 pUC57-UCPl-VP16-APPARg(128-229aa)和 pWPI 载体，然 后将上述含有cPPT、UCPl启动子、VP16-APPARg(128-229aa)的序列克隆至pWPI载体，称 为 PWPI-UCP1-VP16-Δ PPARg(128-229aa)〇 (3) 连接产物转化入高效率的Stbl3 E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新抽提质粒，供病毒包装使用。 (4) 将提取好的高纯度 pWPI-UCPl-VP16-APPARg(128-229aa)。、psPAX2、pMD2G 按照 10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h， 收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养基，获得含有病毒的 培养液。在此基础上，进一步通过CsCI法纯化病毒。 2. mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动GaHBD-APGCla (170-350aa)表达的病毒载 体 (1) 通过公司合成序列，其特征是：包括分列于5'和3'末端的Clal和BstBl酶切位 点、cPPT、mCMV-STAT3-结合元件融合启动子、GaHBD-APGCla (170-350aa)，具体序列见序 列表；然后将上述序列克隆至PUC57载体，命名为pUC57-mCMV-STAT3-Gal4BD- Δ PGCla (170 _350aa)〇 (2) 通过 Clal+BstBl 双酶切 pUC57-mCMV-STAT3-Gal4BD- Δ PGCla (170-350aa)和 pWPI 载体，然后将上述mCMV-STAT3-Gal4BD- Δ PGCla (170-350aa)的片段克隆至pWPI载体，称为 pWPI-mCMV-STAT3-Gal4BD-Δ PGCla(170-350aa)。 (3) 连接产物转化入高效率的Stbl3 E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新大量抽提质粒，供病毒包装使用。 (4) 将预先提取好的高纯度 pWPI-mCMV-STAT3-Gal4BD-APGCla(170-350aa)、psPAX2、 pMD2G按照质量比10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养 基，继续培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养 基，获得含有病毒的培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。 3. 构建UAS/GAL4驱动EGFP表达的病毒载体 (1)通过公司合成序列， 其特征是：包括分列于5'和3'末端的Clal和BstBl酶切位 点、cPPT、UAS/GAL4启动子和EGFP，具体序列见序列表；然后将上述序列克隆至pUC57载体， 命名为 PUC57-UAS/GAL4-EGFP。 ⑵通过Clal+BstBl双酶切pUC57-UAS/GAL4-EGFP和pWPI载体，然后将上述UAS/ GAL4-EGFP 的片段克隆至 pWPI 载体，称为 pWPI-UAS/GAL4-EGFP。 (3)连接产物转化入高效率的Stbl3 E. Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的 LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新大量抽提质粒，供病毒包装使用。 ⑷将预先提取好的高纯度PWPI-UAS/GAL4-EGFP、psPAX2、pMD2G按照质量比 10 : 5 : 1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h， 收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0. 45 μ m滤器过滤培养基，获得含有病毒的 培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。 4. 细胞学检测基因修饰过的脂肪细胞不同条件下绿色荧光表达情况 (1) 麻醉C57/B6小鼠后，颈椎脱白处死小鼠，酒精消毒后沿腹股沟皮肤切开皮肤，分离 脂肪组织。剪碎脂肪组织块，至组织块大小能够自由通过IOml的Tip头。加入0.3%的胶 原酶37度孵育lh，然后将消化液通过100 μ m的筛子，收集滤液，1000 g离心5min，获得消化 的单个细胞的细胞团。将细胞沉淀重悬，铺板培养。 (2) 通过流式细胞仪分选⑶31-Scal+⑶34+⑶24+的脂肪干细胞，培养于IOcm培养板 中，至细胞密度达到80%时，同时感染前述的三种病毒。感染方法为：使病毒液复温至室 温，取8ml细胞培养基、100 μ 1病毒液（Μ0Ι = 30)和终浓度为8 μ g/ml的Polybrene混合 后，加入细胞中。在37°C、5% C02和95%相对湿度的孵箱培养16h，更换新鲜培养基。 (3) 将细胞重新接种于24孔板，脂肪分化诱导3天，然后分别进行对照和肿瘤细胞条件 培养基处理，观察EGFP的表达情况。结果发现，肿瘤条件培养基显著增强EGFP的表达。 4. 细胞学检测基因修饰过的脂肪前体细胞增殖情况 (1) 细胞处理同上 (2) MTT检测上述基因修饰的脂肪前体细胞的增殖情况。具体方法为将上述基因修饰的 细胞和对照未感染的细胞同时按1000/孔的密度铺板于96孔板，每天MTT检测细胞增殖情 况。结果显示，基因改造后细胞增殖没有显著差异。 5. 基因修饰脂肪前体细胞皮下移植监测肿瘤的效果观察 (1) 细胞加载与移植 将经三种病毒转染的脂肪干细胞高密度培养诱导分化2天后，0. 25%胰酶37°C消化 lmin，并用两倍体积培养基中和，计数，1200rpm室温离心5min，去上清，将细胞重悬并使细 胞密度为2. 5 X 107,然后将细胞加载至Collagen海绵，每个Collagen海绵上滴加40 μ 1细 胞悬液（细胞总数为I X 1〇7支架），随后移植于小鼠腹股沟脂肪垫下，再生脂肪组织。 (2) 小鼠荷瘤模型 在上述再生脂肪组织的C57/BL6小鼠模型基础上，进一步制作小鼠 Lewis肺癌荷瘤模 型。具体方法是在小鼠腋下皮肤注射Lewis肺癌细胞系，接种细胞数分别为0,10~3,10~4， 10~5 和 10~6。 (3) 监测不同荷瘤鼠再生脂肪的荧光强度 接种Lewis肺癌细胞1周后，采用小动物荧光成像仪记录接种不同细胞数的肿瘤模型 中，再生脂肪组织处绿色荧光蛋白的强度。研宄表明随着接种细胞数的增加，再生的脂肪组 织中绿色荧光蛋白表达强度逐渐增强。
【主权项】
1. 一种监测肿瘤演变的组织工程装置的构建方法，其特征在于：构建协同监测基于代 谢和炎症的报告系统，具体包括，UCPl启动子驱动VP16-APPARg(128-229aa)表达的病毒 载体、mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动Gal4BD-APGCla(170-350aa)表达的病毒载 体和UAS/Gal4驱动EGFP表达的报告基因载体；采用病毒感染或者其它方法，将上述三种表 达载体同时转染至脂肪干细胞等能够分化为脂肪细胞的种子细胞，然后将干细胞进行体外 分化诱导后进一步将定向分化的细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下；待再生组织在 体内稳定后，通过监测EGFP的表达水平监测肿瘤的演变。2. 按照权利1表述的构建协同监测基于代谢和炎症的报告系统，其特征是：包括监测 产热的UCPl启动子和监测炎症的STAT3调控的启动子，共同调控两个能够相互作用的蛋 白；两个相互作用蛋白的同时高表达，诱导报告基因EGFP表达增加；预测肿瘤演变。3. 按照权利1表述的UCPl启动子驱动VP16-APPARg(128-229aa)表达的病毒载体，其 特征是：启动子调控序列为UCPl的启动子，表达基因为VP16-APPARg(128-229aa)融合表 达蛋白。4. 按照权利1表述的mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动 Gal4BD-APGCla(170-350aa)表达的病毒载体，其特征是：启动子序列为miniCMV启动子和 多个串联的STAT3结合元件的融合启动子，表达的基因是Gal4BD-APGCla(170-350aa)融 合蛋白。5. 按照权利1表述的UAS/Gal4驱动EGFP表达的报告基因载体，其特征是：启动子调 控序列为3-5个Gal4结合元件的串联体，表达框为EGFP。6. 按照权利1表述的将上述三种表达载体同时转染至脂肪干细胞等能够分化为脂肪 细胞的种子细胞，然后将干细胞进行体外分化诱导后进一步将定向分化的细胞加载至组织 工程支架后，移植于皮下，其特征是，将三个表达载体通过腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒 和CRISPR技术导入组织工程种子细胞，种子细胞包括脂肪干细胞和骨髓基质干细胞，移植 部位为皮下。7. 按照权利1表述的监测EGFP的表达水平监测肿瘤的演变，其特征是通过监测荧光蛋 白的多少反映炎症和产热的多少，包括各类荧光蛋白。
【专利摘要】一种监测肿瘤演变组织工程装置的构建，其方法是：构建协同监测基于代谢和炎症的报告系统，具体包括，UCP1启动子驱动VP16-ΔPPARg(128-229aa)表达的病毒载体、mCMV-STAT3-结合元件融合启动子驱动Gal4BD-ΔPGC1a(170-350aa)表达的病毒载体和UAS/Gal4驱动EGFP表达的报告基因载体。采用病毒感染等方法，将上述三种表达载体同时转染至脂肪干细胞等能够分化为脂肪细胞的种子细胞，然后将干细胞进行体外分化诱导后进一步将定向分化的细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下，再生出脂肪；通过监测EGFP的表达强度监测机体炎症和发热的程度，预测肿瘤演变趋势。
【IPC分类】C12N15/86, C12N15/11, G01N33/68, C12N5/10
【公开号】CN104894070
【申请号】CN201510244369
【发明人】杨国栋
【申请人】杨国栋
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月7日
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