一种对gt1-7细胞进行基因编辑的方法
一种对gt1-7细胞进行基因编辑的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于CRISPR_Cas9领域，特别涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法。
【背景技术】
[0002] CRISPR序列的发现可以追溯到1987年，Nakata和他的同事在研宄E. coli iap基 因时发现，在该基因的下游存在着一系列长度为29nt的重复序列，这些29nt的重复元件 被32nt的非重复序列所间隔开。在以后的十年间，随着大量微生物的基因被测序，Mojica 和他的同事发现这种被间隔的重复序列广泛存在于细菌和古细菌中[Ishino Y, Shinagawa Hj Makino Kj et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product[J]. Journal of bacteriology, 1987, 169 (12):5429-5433]λ [Mojica F J Mj Dicz - Villasenor Cj Soria E，et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea，Bacteria and mitochondria[J]· Molecular microbiology，2000, 36(I):244-246] 〇
[0003] 2002年，Jansen和Mojica首次用CRISPR这一新的名词来命名这些规则被间 隔的重复序列。与此同时，Jansen等在CRISPR序列的上游发现了 CRISPR相关联的保 守基因家族-Cas [Jansen R，Embden J，Gaastra Wj et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular microbiolo gy，2002,43(6) :1565-1575]。2007年，Horvath和他的同事证明了 CRIPSR系统中的间隔序 列作为革E向序列结合目标DNA而Cas酶介导DNA的剪切[Barrangou R，Fremaux C，Deveau Hj et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science，2007, 315 (5819):1709-1712]〇
[0004] 根据CRISPR序列的上游Cas基因家族成员的不同，可以将CRISPR系统大致分 成三类（typel-III)，其中typell CRISPR系统的Cas基因家族成员最少，用来作为基 因编辑工具最为简便。2011到2013年。Sikney和Cong等利用typell CRISPR-Cas9系 统在体外、细菌体内和哺乳动物体内完成了多基因编辑操作[Sapranauskas R，Gasiunas Gj Fremaux Cj et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli[J]. Nucleic acids research，2011]、[Nucleic acids research, 2011 ；Cong L，Ran F A, Cox D，et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems [J]·Science，2013, 339(6121) :819-823]。
[0005] 目前广泛使用的酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes) typell CRISPR_Cas9 系 统主要由CRISPR、trancrRNA和Cas9三个元件组成。CRISPR元件位于基因的下游部分，而 Cas和trancrRNA则位于其上游部分^ trancrRNA与CRISPR按照不同方向转录，trancrRNA 有两个转录起始点D首先CRISPR会被转录成511nt长度的pre-crRNA序列，而trancrRNA 会被转录成171nt和89nt长度的两种初级转录本。trancrRNA这两种初级转录本有25nt的 序列与CRISPR的重复序列（repeats)互补，这两者的互补使得CRISPR能被加工成39-42nt 的成熟crRNA，而trancrRNA的初级转录本则被加工成75nt的序列。39-42nt的成熟crRNA 包含20nt的间隔序列（spacers)，它能互补靶向目标序列。而Cas9负责对目标序列进行 双链切割，Cas9切割的位点通常位于PAM序列上游3个核苷酸处。其中PAM(protospacer adjacent motif)序列对于CRISPR系统发挥功能是必需的[Deltcheva E, Chylinski K, Sharma C M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III [J]· Nature, 2011, 471 (7340) :602-607]。为了进一步简化 CRISPR-Cas9 系统，Zhang等针对crRNA :trancrRNA复合体构建了 sgRNA元件，使得在CRISPR_Cas9系 统只需要sgRNA和Cas9两种兀件就能完成精确的基因编辑而不影响基因编辑的效率。目 前，分别表达sgRNA、Cas9基因以及同时表达crRNA、trancrRNA和Cas9基因的质粒都能从 addgene(http://www. addgene. org/)网站上查询与购买。
[0006] 虽然CRISPR-Cas9已广泛应用于细菌、植物以及哺乳动物细胞，但是其中往往 是细胞系和胚胎细胞。对于转染效率较低的神经元细胞，由于Cas9质粒较大所以无法 形成有效的基因编辑。GT1-7细胞是通过对小鼠 GnRH神经元进行改造分离得到的细胞 系。该细胞系保留了原高度分化GnRH神经元的表型，能够产生神经突起并且保留了原有 神经元的标记物，是研宄小鼠 GnRH分泌、生殖发育重要的细胞模型[Mellon P L，Windle J J, Goldsmith P C, et al. Immortalization of hypothalamic GnRH by genetically targeted tumorigenesis[J] · Neuron, 1990, 5(I):1-10]〇
[0007] 目前利用CRISPR-Cas9系统研宄神经元的报道较少，而利用CRISPR-Cas9系统研 宄GT1-7细胞系的更是未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，该方 法只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了 Cas9质粒较大对于转染效率的影响。此外，在实际应用中采用病毒携带sgRNA来转染细胞 更能进一步地提高基因编辑的效率，具有良好的应用前景。
[0009] 本发明的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：
[0010] 将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，利用Lipo2000法将含有Cas9基 因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用 终浓度0. 3ug/ml的嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培 养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移 到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。
[0011] 所述GT1-7细胞铺于24孔板具体参数为每个孔15万个细胞，铺6个孔。
[0012] 所述 42229 质粒与 Lipo2000 的浓度配比分别为 500ng/L 5ul、700ng/L 5ul、 500ng/2. 0ul、700ng/2. Oul 和两个阴性对照。
[0013] 所述嘌呤霉素筛选时间为9~10天。
[0014] 本发明通过质粒抗性筛选获得了 Cas9稳转的GT1-7细胞，结合特定sgRNA可以用 于GT1-7细胞进行分子水平的研宄。此外，本发明中使用质粒抗性筛选相对于PB转座子和 病毒载体构建Cas9稳转细胞更加方便、快捷。
[0015] 有益效果
[0016] 本发明提供了利用CRISPR_Cas9系统对GT1-7细胞系进行基因编辑的方法，由于 本发明构建了 Cas9稳转的GT1-7细胞系，在实际应用中只需要转染特定的SgRNA质粒就能 对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了 Cas9质粒较大对于转染效率的影响。此 外，在实际应用中采用病毒携带SgRNA来转染细胞更能进一步地提高基因编辑的效率，具 有良好的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1为嘌呤霉素筛选GT1-7细胞结果；其中，A为GT1-7细胞阳性克隆；B为阴性 对照；
[0018] 图2为PCR验证42229质粒随机整合进入GT1-7细胞；其中，泳道1-3为引物 42229-Cas9阳性克隆，4-6为小鼠基因组，7为引物42229-Cas9PCR阴性，8-10为引物 42229-Puro阳性克隆，11-13为小鼠基因组，14为引物42229-Cas9PCR阴性。
[0019] 图3为阳性克隆Cas9基因表达量变化（η = 4);
[0020] 图4为Cas9和sgRNA双质粒转染GT1-7细胞靶向mir-505基因 Τ7Ε1电泳图；其 中，泳道1为Cas9和SgRNA双质粒转染，泳道2为未转染质粒；
[0021] 图5为sgRNA转染Cas9稳转GT1-7细胞靶向mir-505基因 T7E1电泳图；其中，泳 道1为转染505sgRNA质粒，泳道2为未转染505sgRNA质粒；
[0022] 图6为Cas9和sgRNA双质粒转染GT1-7细胞靶向mir-505基因测序图；
[0023] 图7为sgRNA转染Cas9稳转GT1-7细胞靶向mir-505基因测序图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0025] 实施例1
[0026] (1)嘌呤霉素 筛选GT1-7细胞最低致死浓度的摸索：
[0027] 第一天：将GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔6万个细胞，铺5个孔。
[0028] 第二天：GT1_7细胞贴壁生长。对5个细胞培养孔加入不同量的嘌呤霉素，使得5 个孔的最终嗓呤霉素浓度为0. 3ug/ml、0. 5ug/ml、0. 7ug/ml、lug/ml和Oug/ml。之后每天观 察嘌呤霉素对各个孔GT1-7细胞的致死情况，由于嘌呤霉素毒性较大筛选周期定为4天。
[0029] 结果发现0. 3ug/ml的嘌呤霉素浓度4天能完全杀死细胞。
[0030] (2)用0· 3ug/ml嘌呤霉素筛选稳转Cas9基因 GT1-7细胞：
[0031] 第一天：将GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔15万个细胞，铺6个孔。
[0032] 第二天：待细胞贴壁生长，利用Lipo2000法将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因 的42229质粒转染进入GT1-7细胞系。质粒与Lipo2000的浓度配比分别为：500ng/l. 5ul、 700ng/l. 5ul、500ng/2. 0ul、700ng/2. Oul 和两个阴性对照。
[0033] 第四天：待细胞表达嘌呤霉素基因，用终浓度0. 3ug/ml的嘌呤霉素筛选42229转 染GT1-7细胞。
[0034] 第十三天：用终浓度0. 3ug/ml嘌呤霉素筛选9天后，去除含有嘌呤霉素的培养基， 更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养（图1)。待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移 到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。
[0035] (3)设计两对引物检测42229质粒是否随机整合进入GT1-7细胞中。为了确保 Cas9整合进入细胞中，其中一对引物设计在Cas9基因上，而另一对引物则设计在Puro基因 上。
[0036] 引物則· 42229-Cas9-F:CGAAGAGGGCATCAAAGAGC ^Obp 42229-Cas9-R:TCTGAGGCACGATATGGTCC 20bp 产物大小：182bp 42229-Puro-F: CTTCTCGTTGGGGTC TTTGC 20bp 42229-Puro-R:TGTCGCTATGTGTTCTGGGA 20bp ;、'物人小：236bp
[0037] PCR 反应体系：ddH20 7. 8ul，GT Buffer I. 5ul，dNTP I. 5ul，Taq 酶 I. 5ul， BSA 0· 2ul，上下游引物（2P)1. 5ul，模板 I. 5ul ;共 15. 5ul ;PCR 反应体系：95°C 2min， (94。〇3〇86(3,58。〇3〇86(：，72。〇3〇8)35个循环，72。〇1〇11^11〇
[0038] PCR结果采用I. 5%的琼脂糖电泳进行鉴定（图2)。
[0039] (4)从基因表达水平验证42229质粒稳转的GT1-7细胞的Cas9表达量是否上升： [0040] 首先用Trizol法提取42229质粒稳转GT1-7细胞的总RNA。然后用随机引物和 oligodT对GT1-7的总RNA进行逆转录。Real-time PCR引物同步骤（3)中42229-Cas9引 物。
[0041] DnaseI 处理体系：DnaseI Iul，10*bufTer Iul，RNA lug，DEPC H2O 补至 IOul ;反 应程序：室温 15min，IOul 体系加入 Iul EDTA 65°C lOmin。
[0042] 逆转录：体系 RNA 6. 25ul，Random Primer 0· 25ul，oligodT 0· 25ul，5*Reaction Bufferlul， dNTP mix lul， Ribolock RNase Inhibitor 0.5ul, RevertAidReverse Transcriptase 0· 5ul 共 10. 75ul ;反应程序：25°C 5min，42°C 60min，7CTC 5min。
[0043] cDNA 稀释 5 倍作为模板，Real-time PCR:体系 DEPC-H2O 4. Iul，2*Premix IOul， cDNA2. 5ul，Primer(2P)3ul，ROX 0· 4ul 共 20ul ;反应程序：95 °C 2min，（94 °C 30sec， 58°〇2〇86(：，72°〇3〇8)40个循环。
[0044] Real-time PCR的结果通过7500软件进行分析（图3)
[0045] (5)只表达sgRNA的41824质粒转染Cas9稳转GT1-7细胞。
[0046] 第一天：将Cas9稳转的GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔20万个细胞，铺2个 孔；
[0047] 第二天：待细胞贴壁生长汇合度达到70-90%，首先对细胞进行无血清饥饿处理 然后利用Lip 〇2000法将只表达sgRNA的41824质粒转染进入Cas9稳转GT1-7细胞中。其 中 Lipo2000 :41824 质粒=2. Oul: lug。
[0048] 待细胞长满，消化下细胞抽取基因组DNA。
[0049] (6)基因突变检测：步骤（5)所获得的细胞基因组DNA通过PCR将目的基因进行 扩增，然后对PCR产物进行纯化。纯化好的产物利用T7Elassay进行目的基因突变的检测。
[0050] T7Elassay 体系：PCR 产物 600ng，buffer I. lul，H2O 补至 10. 5ul ;反应程序： 95°C10min(95°C每30s降温l°C)共70个循环；25°Clmin。然后加入0.45ulT7El酶 37 °C 30min〇
[0051] 酶切的结果通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0052] (7)将只含有靶向mir-505基因 SgRNA的41824质粒转染Cas9稳转GT1-7细胞：
[0053] sgRNA 靶序列（20nt)为：GTAAATTGATGCACCCAGTG。
[0054] 第一天：将Cas9稳转的GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔20万个细胞，铺2个 孔；
[0055] 第二天：细胞汇合度达到70-90%。转染前用无血清培养基饥饿培养细胞2h，然后 用lipo2000法；将41824质粒转染进入细胞中，Lipo2000 :41824质粒=2. Oul :lug。转染 6h后用正常培养基代替无血清培养基培养细胞。
[0056] 第五天：转染3天后，细胞长满孔中，利用生工动物基因组提取试剂盒将细胞基因 组抽提处理出来。
[0057] (8)针对小鼠 mir-505基因进行PCR扩增：
[0058] Mir-505-F:catgccaacaaacccagtga 20bp
[0059] Mir-505-L:ctggcttctactccctggtg 20bp 产物大小 942bp
[0060] PCR 反应体系：H20 3. 725ul、buffer 3ul、上下游引物（2P)3ul、dNTP I. 5ul、 Mg2+L 2ul、Taq 酶 0· 075ul、模板 2. 5ul ;反应程序：95°C 15min，（94°C 30sec，62°C 30sec， 72°C lmin)40 个循环，72°C 5min。
[0061] PCR结果用I. 5 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0062] (9)利用生工PCR产物纯化试剂盒将步骤（2)的PCR产物进行纯化回收，然后进行 T7Elassay检测mir-505基因是否存在突变：
[0063] T7Elassay 体系：PCR 产物 600ng，buffer I. lul，H2O 补至 10. 5ul ;反应程序： 95°C10min(95°C每 30s 降温 1°C)共 70 个循环；25°Clmin。然后加入 0. 45ul T7E1 酶， 37 〇C 30min〇
[0064] 酶切结果用2. 0 %的琼脂糖凝胶电泳检测，相比于之前采用Cas9和sgRNA双质粒 系统转染GT1-7细胞电泳结果没有酶切条带（图4)，本发明采用的基因编辑方法可以看到 清晰的酶切条带，酶切条带大约为400bp和500bp两个条带（图5)。
[0065] (10)将mir-505基因的PCR纯化产物送去生工测序，相比于之前采用Cas9和 sgRNA双质粒系统转染GT1-7细胞测序结果（图6)。本发明采用的基因编辑方法可以在测 序图中看到乱峰出现，乱峰位置开始于PAM序列上游3bp附近（图7)。该结果证明了该基 因编辑方法对于GT1-7细胞的有效性。
【主权项】
1. 一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括： 将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，利用Lipo2000法将含有Cas9基因和 嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用终浓 度0. 3ug/ml的嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基， 更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养 瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。2.根据权利要求1所述的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，其特征在于：所述 GT1-7细胞铺于24孔板具体参数为每个孔15万个细胞，铺6个孔。3.根据权利要求1所述的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，其特征在于：所 述 42229 质粒与Lipo2000 的浓度配比分别为 500ng/l. 5ul、700ng/l. 5ul、500ng/2.Oul、 700ng/2.Oul和两个阴性对照。4.根据权利要求1所述的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，其特征在于：所述 嘌呤霉素筛选时间为9~10天。
【专利摘要】本发明涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。本发明在实际应用中只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了Cas9质粒较大对于转染效率的影响，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/63, C12N5/10
【公开号】CN104894071
【申请号】CN201510311719
【发明人】王斯佳, 周宇荀, 邓倩云, 李晓宁, 李文文, 肖君华, 李凯
【申请人】东华大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月8日
【技术领域】
[0001] 本发明属于CRISPR_Cas9领域，特别涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法。
【背景技术】
[0002] CRISPR序列的发现可以追溯到1987年，Nakata和他的同事在研宄E. coli iap基 因时发现，在该基因的下游存在着一系列长度为29nt的重复序列，这些29nt的重复元件 被32nt的非重复序列所间隔开。在以后的十年间，随着大量微生物的基因被测序，Mojica 和他的同事发现这种被间隔的重复序列广泛存在于细菌和古细菌中[Ishino Y, Shinagawa Hj Makino Kj et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product[J]. Journal of bacteriology, 1987, 169 (12):5429-5433]λ [Mojica F J Mj Dicz - Villasenor Cj Soria E，et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea，Bacteria and mitochondria[J]· Molecular microbiology，2000, 36(I):244-246] 〇
[0003] 2002年，Jansen和Mojica首次用CRISPR这一新的名词来命名这些规则被间 隔的重复序列。与此同时，Jansen等在CRISPR序列的上游发现了 CRISPR相关联的保 守基因家族-Cas [Jansen R，Embden J，Gaastra Wj et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular microbiolo gy，2002,43(6) :1565-1575]。2007年，Horvath和他的同事证明了 CRIPSR系统中的间隔序 列作为革E向序列结合目标DNA而Cas酶介导DNA的剪切[Barrangou R，Fremaux C，Deveau Hj et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science，2007, 315 (5819):1709-1712]〇
[0004] 根据CRISPR序列的上游Cas基因家族成员的不同，可以将CRISPR系统大致分 成三类（typel-III)，其中typell CRISPR系统的Cas基因家族成员最少，用来作为基 因编辑工具最为简便。2011到2013年。Sikney和Cong等利用typell CRISPR-Cas9系 统在体外、细菌体内和哺乳动物体内完成了多基因编辑操作[Sapranauskas R，Gasiunas Gj Fremaux Cj et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli[J]. Nucleic acids research，2011]、[Nucleic acids research, 2011 ；Cong L，Ran F A, Cox D，et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems [J]·Science，2013, 339(6121) :819-823]。
[0005] 目前广泛使用的酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes) typell CRISPR_Cas9 系 统主要由CRISPR、trancrRNA和Cas9三个元件组成。CRISPR元件位于基因的下游部分，而 Cas和trancrRNA则位于其上游部分^ trancrRNA与CRISPR按照不同方向转录，trancrRNA 有两个转录起始点D首先CRISPR会被转录成511nt长度的pre-crRNA序列，而trancrRNA 会被转录成171nt和89nt长度的两种初级转录本。trancrRNA这两种初级转录本有25nt的 序列与CRISPR的重复序列（repeats)互补，这两者的互补使得CRISPR能被加工成39-42nt 的成熟crRNA，而trancrRNA的初级转录本则被加工成75nt的序列。39-42nt的成熟crRNA 包含20nt的间隔序列（spacers)，它能互补靶向目标序列。而Cas9负责对目标序列进行 双链切割，Cas9切割的位点通常位于PAM序列上游3个核苷酸处。其中PAM(protospacer adjacent motif)序列对于CRISPR系统发挥功能是必需的[Deltcheva E, Chylinski K, Sharma C M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III [J]· Nature, 2011, 471 (7340) :602-607]。为了进一步简化 CRISPR-Cas9 系统，Zhang等针对crRNA :trancrRNA复合体构建了 sgRNA元件，使得在CRISPR_Cas9系 统只需要sgRNA和Cas9两种兀件就能完成精确的基因编辑而不影响基因编辑的效率。目 前，分别表达sgRNA、Cas9基因以及同时表达crRNA、trancrRNA和Cas9基因的质粒都能从 addgene(http://www. addgene. org/)网站上查询与购买。
[0006] 虽然CRISPR-Cas9已广泛应用于细菌、植物以及哺乳动物细胞，但是其中往往 是细胞系和胚胎细胞。对于转染效率较低的神经元细胞，由于Cas9质粒较大所以无法 形成有效的基因编辑。GT1-7细胞是通过对小鼠 GnRH神经元进行改造分离得到的细胞 系。该细胞系保留了原高度分化GnRH神经元的表型，能够产生神经突起并且保留了原有 神经元的标记物，是研宄小鼠 GnRH分泌、生殖发育重要的细胞模型[Mellon P L，Windle J J, Goldsmith P C, et al. Immortalization of hypothalamic GnRH by genetically targeted tumorigenesis[J] · Neuron, 1990, 5(I):1-10]〇
[0007] 目前利用CRISPR-Cas9系统研宄神经元的报道较少，而利用CRISPR-Cas9系统研 宄GT1-7细胞系的更是未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，该方 法只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了 Cas9质粒较大对于转染效率的影响。此外，在实际应用中采用病毒携带sgRNA来转染细胞 更能进一步地提高基因编辑的效率，具有良好的应用前景。
[0009] 本发明的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：
[0010] 将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，利用Lipo2000法将含有Cas9基 因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用 终浓度0. 3ug/ml的嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培 养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移 到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。
[0011] 所述GT1-7细胞铺于24孔板具体参数为每个孔15万个细胞，铺6个孔。
[0012] 所述 42229 质粒与 Lipo2000 的浓度配比分别为 500ng/L 5ul、700ng/L 5ul、 500ng/2. 0ul、700ng/2. Oul 和两个阴性对照。
[0013] 所述嘌呤霉素筛选时间为9~10天。
[0014] 本发明通过质粒抗性筛选获得了 Cas9稳转的GT1-7细胞，结合特定sgRNA可以用 于GT1-7细胞进行分子水平的研宄。此外，本发明中使用质粒抗性筛选相对于PB转座子和 病毒载体构建Cas9稳转细胞更加方便、快捷。
[0015] 有益效果
[0016] 本发明提供了利用CRISPR_Cas9系统对GT1-7细胞系进行基因编辑的方法，由于 本发明构建了 Cas9稳转的GT1-7细胞系，在实际应用中只需要转染特定的SgRNA质粒就能 对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了 Cas9质粒较大对于转染效率的影响。此 外，在实际应用中采用病毒携带SgRNA来转染细胞更能进一步地提高基因编辑的效率，具 有良好的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1为嘌呤霉素筛选GT1-7细胞结果；其中，A为GT1-7细胞阳性克隆；B为阴性 对照；
[0018] 图2为PCR验证42229质粒随机整合进入GT1-7细胞；其中，泳道1-3为引物 42229-Cas9阳性克隆，4-6为小鼠基因组，7为引物42229-Cas9PCR阴性，8-10为引物 42229-Puro阳性克隆，11-13为小鼠基因组，14为引物42229-Cas9PCR阴性。
[0019] 图3为阳性克隆Cas9基因表达量变化（η = 4);
[0020] 图4为Cas9和sgRNA双质粒转染GT1-7细胞靶向mir-505基因 Τ7Ε1电泳图；其 中，泳道1为Cas9和SgRNA双质粒转染，泳道2为未转染质粒；
[0021] 图5为sgRNA转染Cas9稳转GT1-7细胞靶向mir-505基因 T7E1电泳图；其中，泳 道1为转染505sgRNA质粒，泳道2为未转染505sgRNA质粒；
[0022] 图6为Cas9和sgRNA双质粒转染GT1-7细胞靶向mir-505基因测序图；
[0023] 图7为sgRNA转染Cas9稳转GT1-7细胞靶向mir-505基因测序图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0025] 实施例1
[0026] (1)嘌呤霉素 筛选GT1-7细胞最低致死浓度的摸索：
[0027] 第一天：将GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔6万个细胞，铺5个孔。
[0028] 第二天：GT1_7细胞贴壁生长。对5个细胞培养孔加入不同量的嘌呤霉素，使得5 个孔的最终嗓呤霉素浓度为0. 3ug/ml、0. 5ug/ml、0. 7ug/ml、lug/ml和Oug/ml。之后每天观 察嘌呤霉素对各个孔GT1-7细胞的致死情况，由于嘌呤霉素毒性较大筛选周期定为4天。
[0029] 结果发现0. 3ug/ml的嘌呤霉素浓度4天能完全杀死细胞。
[0030] (2)用0· 3ug/ml嘌呤霉素筛选稳转Cas9基因 GT1-7细胞：
[0031] 第一天：将GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔15万个细胞，铺6个孔。
[0032] 第二天：待细胞贴壁生长，利用Lipo2000法将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因 的42229质粒转染进入GT1-7细胞系。质粒与Lipo2000的浓度配比分别为：500ng/l. 5ul、 700ng/l. 5ul、500ng/2. 0ul、700ng/2. Oul 和两个阴性对照。
[0033] 第四天：待细胞表达嘌呤霉素基因，用终浓度0. 3ug/ml的嘌呤霉素筛选42229转 染GT1-7细胞。
[0034] 第十三天：用终浓度0. 3ug/ml嘌呤霉素筛选9天后，去除含有嘌呤霉素的培养基， 更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养（图1)。待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移 到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。
[0035] (3)设计两对引物检测42229质粒是否随机整合进入GT1-7细胞中。为了确保 Cas9整合进入细胞中，其中一对引物设计在Cas9基因上，而另一对引物则设计在Puro基因 上。
[0036] 引物則· 42229-Cas9-F:CGAAGAGGGCATCAAAGAGC ^Obp 42229-Cas9-R:TCTGAGGCACGATATGGTCC 20bp 产物大小：182bp 42229-Puro-F: CTTCTCGTTGGGGTC TTTGC 20bp 42229-Puro-R:TGTCGCTATGTGTTCTGGGA 20bp ;、'物人小：236bp
[0037] PCR 反应体系：ddH20 7. 8ul，GT Buffer I. 5ul，dNTP I. 5ul，Taq 酶 I. 5ul， BSA 0· 2ul，上下游引物（2P)1. 5ul，模板 I. 5ul ;共 15. 5ul ;PCR 反应体系：95°C 2min， (94。〇3〇86(3,58。〇3〇86(：，72。〇3〇8)35个循环，72。〇1〇11^11〇
[0038] PCR结果采用I. 5%的琼脂糖电泳进行鉴定（图2)。
[0039] (4)从基因表达水平验证42229质粒稳转的GT1-7细胞的Cas9表达量是否上升： [0040] 首先用Trizol法提取42229质粒稳转GT1-7细胞的总RNA。然后用随机引物和 oligodT对GT1-7的总RNA进行逆转录。Real-time PCR引物同步骤（3)中42229-Cas9引 物。
[0041] DnaseI 处理体系：DnaseI Iul，10*bufTer Iul，RNA lug，DEPC H2O 补至 IOul ;反 应程序：室温 15min，IOul 体系加入 Iul EDTA 65°C lOmin。
[0042] 逆转录：体系 RNA 6. 25ul，Random Primer 0· 25ul，oligodT 0· 25ul，5*Reaction Bufferlul， dNTP mix lul， Ribolock RNase Inhibitor 0.5ul, RevertAidReverse Transcriptase 0· 5ul 共 10. 75ul ;反应程序：25°C 5min，42°C 60min，7CTC 5min。
[0043] cDNA 稀释 5 倍作为模板，Real-time PCR:体系 DEPC-H2O 4. Iul，2*Premix IOul， cDNA2. 5ul，Primer(2P)3ul，ROX 0· 4ul 共 20ul ;反应程序：95 °C 2min，（94 °C 30sec， 58°〇2〇86(：，72°〇3〇8)40个循环。
[0044] Real-time PCR的结果通过7500软件进行分析（图3)
[0045] (5)只表达sgRNA的41824质粒转染Cas9稳转GT1-7细胞。
[0046] 第一天：将Cas9稳转的GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔20万个细胞，铺2个 孔；
[0047] 第二天：待细胞贴壁生长汇合度达到70-90%，首先对细胞进行无血清饥饿处理 然后利用Lip 〇2000法将只表达sgRNA的41824质粒转染进入Cas9稳转GT1-7细胞中。其 中 Lipo2000 :41824 质粒=2. Oul: lug。
[0048] 待细胞长满，消化下细胞抽取基因组DNA。
[0049] (6)基因突变检测：步骤（5)所获得的细胞基因组DNA通过PCR将目的基因进行 扩增，然后对PCR产物进行纯化。纯化好的产物利用T7Elassay进行目的基因突变的检测。
[0050] T7Elassay 体系：PCR 产物 600ng，buffer I. lul，H2O 补至 10. 5ul ;反应程序： 95°C10min(95°C每30s降温l°C)共70个循环；25°Clmin。然后加入0.45ulT7El酶 37 °C 30min〇
[0051] 酶切的结果通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0052] (7)将只含有靶向mir-505基因 SgRNA的41824质粒转染Cas9稳转GT1-7细胞：
[0053] sgRNA 靶序列（20nt)为：GTAAATTGATGCACCCAGTG。
[0054] 第一天：将Cas9稳转的GT1-7细胞铺于24孔板中，每个孔20万个细胞，铺2个 孔；
[0055] 第二天：细胞汇合度达到70-90%。转染前用无血清培养基饥饿培养细胞2h，然后 用lipo2000法；将41824质粒转染进入细胞中，Lipo2000 :41824质粒=2. Oul :lug。转染 6h后用正常培养基代替无血清培养基培养细胞。
[0056] 第五天：转染3天后，细胞长满孔中，利用生工动物基因组提取试剂盒将细胞基因 组抽提处理出来。
[0057] (8)针对小鼠 mir-505基因进行PCR扩增：
[0058] Mir-505-F:catgccaacaaacccagtga 20bp
[0059] Mir-505-L:ctggcttctactccctggtg 20bp 产物大小 942bp
[0060] PCR 反应体系：H20 3. 725ul、buffer 3ul、上下游引物（2P)3ul、dNTP I. 5ul、 Mg2+L 2ul、Taq 酶 0· 075ul、模板 2. 5ul ;反应程序：95°C 15min，（94°C 30sec，62°C 30sec， 72°C lmin)40 个循环，72°C 5min。
[0061] PCR结果用I. 5 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0062] (9)利用生工PCR产物纯化试剂盒将步骤（2)的PCR产物进行纯化回收，然后进行 T7Elassay检测mir-505基因是否存在突变：
[0063] T7Elassay 体系：PCR 产物 600ng，buffer I. lul，H2O 补至 10. 5ul ;反应程序： 95°C10min(95°C每 30s 降温 1°C)共 70 个循环；25°Clmin。然后加入 0. 45ul T7E1 酶， 37 〇C 30min〇
[0064] 酶切结果用2. 0 %的琼脂糖凝胶电泳检测，相比于之前采用Cas9和sgRNA双质粒 系统转染GT1-7细胞电泳结果没有酶切条带（图4)，本发明采用的基因编辑方法可以看到 清晰的酶切条带，酶切条带大约为400bp和500bp两个条带（图5)。
[0065] (10)将mir-505基因的PCR纯化产物送去生工测序，相比于之前采用Cas9和 sgRNA双质粒系统转染GT1-7细胞测序结果（图6)。本发明采用的基因编辑方法可以在测 序图中看到乱峰出现，乱峰位置开始于PAM序列上游3bp附近（图7)。该结果证明了该基 因编辑方法对于GT1-7细胞的有效性。
【主权项】
1. 一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括： 将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，利用Lipo2000法将含有Cas9基因和 嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用终浓 度0. 3ug/ml的嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基， 更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养 瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。2.根据权利要求1所述的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，其特征在于：所述 GT1-7细胞铺于24孔板具体参数为每个孔15万个细胞，铺6个孔。3.根据权利要求1所述的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，其特征在于：所 述 42229 质粒与Lipo2000 的浓度配比分别为 500ng/l. 5ul、700ng/l. 5ul、500ng/2.Oul、 700ng/2.Oul和两个阴性对照。4.根据权利要求1所述的一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，其特征在于：所述 嘌呤霉素筛选时间为9~10天。
【专利摘要】本发明涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用嘌呤霉素筛选42229转染GT1-7细胞；筛选后，去除含有嘌呤霉素的培养基，更换成正常高糖培养基，并进行扩大培养，待培养板中的GT1-7细胞长满，消化转移到培养瓶中继续扩大培养，即得Cas9稳转GT1-7细胞。本发明在实际应用中只需要转染特定的sgRNA质粒就能对GT1-7细胞靶基因进行精确的基因编辑，避免了Cas9质粒较大对于转染效率的影响，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/63, C12N5/10
【公开号】CN104894071
【申请号】CN201510311719
【发明人】王斯佳, 周宇荀, 邓倩云, 李晓宁, 李文文, 肖君华, 李凯
【申请人】东华大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月8日
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