杂交瘤细胞株Zj/2D8及其检测尼克酰胺-N-甲基化酶抗原的应用
杂交瘤细胞株Zj/2D8及其检测尼克酰胺-N-甲基化酶抗原的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白免疫学检测方法，具体涉及一种可以抗尼克酰胺-N-甲基化 酶蛋白的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株、制备方法及该单克隆抗体的用途。 (二）
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病。据世界卫生组织最新数据显示，每年 全球癌症新发病例1000多万，死亡700多万，占总死亡人数的12%。到2020年前，每年将 新增1500万癌症患者，不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅速上升，2030年这个数字可 能会增至1320万。
[0003] 肿瘤的早期诊断是肿瘤防治的关键，肿瘤的死亡和复发的危险性与初诊时的分期 密切相关，且化疗、放疗的敏感性一定程度上取决于癌细胞内的酶或蛋白分子。生物标志物 是细胞处于特定条件下代表该细胞生物学状态的重要信号指示分子。为了降低肿瘤的死亡 率或提高治疗的效果，许多研宄致力于肿瘤关键生物标准物的发现和筛选。因此，寻求肿瘤 早期诊断、分期或/和指示化疗、放疗的敏感性、预后以及潜在治疗靶点的肿瘤标志物一直 是肿瘤学的研宄热点。
[0004] 尼克酰胺-N-甲基化酶（NNMT，EC2. I. I. 1)正常表达于人肝脏组织中，其他组织如 肠、肺、肾、胎盘、心脏、骨骼肌、脑、胰腺表达很低或者没有表达。NNMT在不同人的肝脏中活 性差异较大，活性的高低取决于胞浆中NNMT的浓度，NNMT的浓度与NNMT的mRNA水平有关， 与基因的多态性无关，通常认为NNMT过表达的机制是由于基因翻译后调控异常所致，可能 受肝细胞核因子-I (HNF-I)、TGF- β 1、STAT3等激活。
[0005] NNMT的主要功能是以S-腺苷-L蛋氨酸（SAM)为供体，催化尼克酰胺和吡啶类物 质的甲基化，形成吡啶盐，在正常肝细胞中参与药物的生物转化，是催化药物、异型生物质 代谢的一种酶。NNMT是维持尼克酰胺平衡的关键酶，所以可以推测NNMT的增高可影响尼 克酰胺参与细胞的功能。尼克酰胺是NAD分子的组成部分，可通过补救合成途径生产NAD， 而NAD参与细胞的很多基本可能如能力代谢，对应和损伤的抵抗，细胞的寿命等。帕金森综 合症被认为与NNMT增高引起的尼克酰胺代谢异常有关，在脑组织中该酶活性过度增高通 过两条途径导致帕金森综合症，一是生成神经毒物N-甲基吡啶（如N-甲基-4苯基吡啶 (ΜΡΡ+))激活导致线粒体复合体1受损，二是降低了尼克酰胺导致能量代谢障碍。尼克酰胺 还能抑制多聚ADP聚合酶（PARP)，而PRAP通过碱基切除修复、坏死、凋亡等多细胞调节来 保持基因组的完整性。因此有理由推测NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的 发生和发展有关，或可影响化，放疗效果。如能明确NNMT在肿瘤细胞中的作用，并阐明NNMT 在肿瘤中的作用机制或分析其下游相关分子组成的模块或通路，必将进一步明确NNMT作 为在肿瘤防治中的价值。
[0006] 近年来，用蛋白助学和基因芯片技术比较不同癌组织和癌旁组织差异时发现NNMT 在多种癌组织中异常表达。与正常组织和癌旁组织相比，NNMT在结直肠癌、肺癌、膀胱癌、胃 癌、甲状腺乳头状癌、肾透明细胞癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌和胰腺等肿瘤组织有过表达， 并在多种肿瘤患者的血清中升高。这些研宄提示NNMT与肿瘤发生密切相关，推测NNMT可 能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响化、放疗效果。 (三）
【发明内容】
[0007] 本发明采用尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作为免疫原免疫小鼠制备了能稳定分泌 抗NNMT单克隆抗体的细胞株，然后通过NNMT蛋白的间接ELISA法筛选并进一步纯化获得 了能分泌NNMT抗体的细胞系及由所属细胞系提取的单克隆抗体，因此本发明目的是提供 一株高效分泌抗NNMT (尼克酰胺-N-甲基化酶）抗体的杂交瘤细胞株，利用该细胞株提取 NNMT抗体，采用NNMT抗体对待测组织中的NNMT抗原进行检测，进而确定待测组织中NNMT 抗原的含量，有助于临床诊断。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一株杂交瘤细胞株Zj/2D8,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日 期为2013年10月22日，保藏编号为CCTCC NO !C2013149,保藏地址为中国武汉，武汉大学， 邮编：430072。
[0010] 本发明还涉及一种所述杂交瘤细胞株Zj/2D8在检测尼克酰胺-N-甲基化酶 (NNMT)抗原中的应用，具体所述的应用是提取杂交瘤细胞株Zj/2D8中的NNMT抗体，再根据 抗原抗体特异性结合原理，利用NNMT抗体检测待测样品中NNMT抗原含量。
[0011] 本发明所述NNMT抗体的提取方法为：（1)将杂交瘤细胞株Zj/2D8用含10 %胎牛 血清的1640培养液，在37°C，含5% CO2的细胞培养箱内扩大培养，收集细胞，用PBS (pH值 为7. 4)配制成0. 4X IO6Ail的细胞液，再将细胞液腹腔注射石蜡致敏的BALB/c小鼠（不 限于BALB/c小鼠，本领域公知的小鼠型号均可），每只注射Iml，接种后9天收获腹水，1200 转/分钟离心，除去沉淀，收集上清液；
[0012] (2)向步骤⑴收集的上清液中加入2倍体积的pH 5.0、0.06mol/L醋酸钠缓冲 液，再用lmol/L HCl调pH至4. 8,制成稀释上清液；然后按每毫升稀释上清液中加11 μ 1 辛酸的比例，室温搅拌下向稀释上清液中逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4°C静置2小时， 取出，15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经125 μ m尼龙筛过滤后，滤液加入1/10体积的 0· Olmol/L PBS，用lmol/L NaOH调pH至7. 2 ;在4°C下加入硫酸铵至45%饱和度（所述 45%饱和度是指质量浓度），搅拌30分钟，静置1小时，1000 Og离心30分钟，弃上清，沉淀 以含 137mmol/L NaCl+2. 6mol/LKCl+0. 2mmol/L EDTA 的 PBS 为透析液进行透析，4°C过夜， 直至用l〇g/L BaCljK溶液检测截留液无 SO 4离子，取出截留液，1000 Og离心30分钟，除去 不溶性沉渣，上清即为NNMT抗体。
[0013] 本发明提供的杂交瘤细胞Zj/2D8所产生的单克隆NNMT抗体对于NNMT抗原均有 高水平的抗体效价，因此单克隆NNMT抗体、其活性片段或其保守性突变体以及标记的活性 片段或其保守性突变体，或其任意组合均可用于制备检测NNMT抗原的试剂、药剂或试剂 盒。本发明所述制备检测NNMT抗原的试剂、药剂或试剂盒优选采用双抗夹心法检测NNMT 抗原。
[0014] 对于本发明所述标记的活性片段或其保守性突变体，是指本领域公知的生物标记 或化学标记。例如酶标记、荧光标记（例如荧光素标记）或化学发光标记。优选地，所述酶 标记为辣根过氧化物、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记。
[0015] 本发明所述单克隆抗体优选为人源化的单克隆抗体（人源化抗体主要指鼠源单 克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源 序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性）。
[0016] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0017] (1)本发明提供的单克隆杂交瘤细胞株Zj/2D8能够高效分泌（是指在实施例1的 1. 3中培养液上清稀释1000倍后检测细胞分泌到上清液中的抗体亦为阳性）NNMT单克隆抗 体蛋白。
[0018] (2)本发明从单克隆杂交瘤细胞株Zj/2D8提取的NNMT单克隆抗体对NNMT抗原具 有很高的（I :1000000)抗体效价，较好的亲和力和较高的纯度，提示该单克隆抗体可应用 于检测NNMT抗原的科研研宄领域。
[0019] (2)本发明的从单克隆杂交瘤细胞株Zj/2D8提取的NNMT单克隆抗体可应用于临 床检测，通过对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测该组织中NNMT蛋白的表达情况。 (四）
【附图说明】
[0020] 图 1 为 Zj/2D8、1E7 和 2F8 纯品抗体 SDS-PAGE 电泳图，M !Marker，I :Zj/2D8 纯品 抗体，2 :1E7纯品抗体，3 :2F8纯品抗体。
[0021] 图2为Zj/2D8、1E7和2F8细胞株分泌抗体的亚类、轻链型图，A为Zj/2D8、B为 1E7, C 为 2F8C。
[0022] 图3为Z j/2D8纯品抗体凝胶扫描图。
[0023] 图4为Zj/2D8、2F8和1E7细胞株纯品抗体的亲和力反应曲线图。
[0024] 图5为Zj/2D8细胞株单抗的免疫印迹，I :GST蛋白，2 !NNMT-GST融合蛋白，3 :NNMT 蛋白。
[0025] 图6为10条合成短肽的免疫印迹。
[0026] 图7为大肠癌细胞株及阳性细胞株HT-29细胞NNMT慢病毒干扰后的免疫印迹。< br>[0027] 图8为裸鼠移植瘤HT-29细胞（A)及NNMT干扰后HT-29细胞⑶的免疫组化 (X100) 〇 (五）
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0029] 本发明百分浓度，若没有特殊指明，皆是质量浓度，溶剂皆是水。
[0030] 实施例1 :杂交瘤细胞系的获得、单克隆抗体的筛选、制备及鉴定
[0031] 1、单克隆抗体的制备
[0032] 按照本领域已知的常规方法制备本发明抗NNMT的单克隆抗体杂交瘤细胞株 Zj/2D8,主要参照美国专利5585089中所述的原则和方法制备人源化形式的抗NNMT的单克 隆抗体杂交瘤细胞株Zj/2D8(常见Kohler and MIlrtein, Nature 256:495-96, 1975)，方法 中将提到如下试剂：
[0033] (1)包被液！Na2CO3L 5g，NaHC032. 9g，NaN3O. 2g，溶于 IL 水中，调 pH 至 9. 6。
[0034] (2)封闭液：I %小牛血清白蛋白。
[0035] (3)洗涤液：0· 5mlTween-20 溶于 1000ml IXPBS 中。
[0036] (4) TMB显色液（包括底物显色A液和B液），底物显色A液：醋酸钠13. 6g、柠檬 酸1.6g、30%双氧水0. 3ml，蒸馏水加至500ml ;底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0. 2g、柠 檬酸〇.95g、甘油50ml、取0. 15g四甲基联苯胺（TMB)溶于3ml DMSO中，蒸馏水加至500ml。 使用时各取50 μ 1混合即可。
[0037] (5)终止液：2. Omol/L H2SO4水溶液。
[0038] 1. 1、免疫原的制备
[0039] 免疫原为GST-NNMT融合蛋白及NNMT蛋白，利用基因工程技术制备NNMT蛋白：根 据NCBI核苷酸数据库编码为gi : 12652950人NNMT cDNA序列，合成NNMT基因的PCR引物，
[0040] Pl (sense):3，-CG' GGATCC' ATGGAATCAGGCTTCACCTCC-5，；
[0041] P2 (antisense):3，-G'CTCGAG'AATTGAGGTCACAGGCATCACAG-S，〇
[0042] 在Pl的5'端和P2的3'端设计BamHI和XhoI位点。以肝c DNA为模板（序 列与上述NCBI核苷酸数据库编码为gi :12652950人NNMT cDNA序列一致），在引物P1、 P2作用下进行PCR扩增NNMT片段，反应参数为94°C预变性2min，94°C 20s、60°C 30s、 72°C45s。20次循环之后，立即加入0. 8μ1 Taq酶，72°C延长10min，4°C保存。PCR产物 经胶回收后，T-A克隆至PGEM-Teasy载体，得pGEM-T-Easy-NNMT质粒，质粒经测序验证后 用BamHI和XhoI酶切，回收DNA片段，连接到p GEX-4T-2载体，构建pGEX-4T-2/NNMT质 粒，转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3)中以表达GST-NNMT融合蛋白，获得重组大肠杆菌 BL-21-STAR(DE3) -GST-NNMT，37°C培养 2h 后，用终浓度 0· ImM 的 IPTG 在 30°C诱导 3h，4°C， 5000rpm离心10分钟，收集菌体，使用scientz- II D超声波细胞粉碎机，在100瓦，超声10 秒，停10秒，60个循环的条件下超声破碎菌体，13000rpm离心3分钟后，留取上清液，将上 清液经Glutathione Sepharose 4B (购自美国Pharmacia公司）亲和层析柱纯化GST-NNMT 蛋白。然后向GST-NNMT蛋白中加入凝血酶（每Img蛋白加入IOU凝血酶）使其充分酶切，再 次经过Glutathione Sepharose 4B(购自美国Pharmacia公司）亲和层析柱，室温轻摇30 分钟，使GST蛋白与亲和层析柱充分结合，收集流出液，500g离心5分钟，收集上清，上清中 仅含有NNMT蛋白，获得纯化后的NNMT蛋白。用邻苯三酸红法测定蛋白浓度，10 % SDS-PAGE 电泳和Western-blot鉴定NNMT蛋白，上清液中仅含有NNMT蛋白。
[0043] 1. 2、动物免疫：免疫程序为：初次免疫取8周龄BALB/C雌性小鼠，将NNMT蛋白与 弗氏完全佐剂等体积混匀后，在小鼠背部皮下多点注射，剂量为每只小鼠140 μ g。30天后， 再次用NNMT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀后，在小鼠背部皮下多点注射，剂量为每只 小鼠140 μ g。之后每隔10天再用NNMT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混勾物免疫一次，共 三次，作为加强免疫。最后进行细胞融合前三天，NNMT蛋白与生理盐水等体积混匀后腹腔 注射，剂量为每只小鼠80 μ g。弗氏不完全佐剂组成为液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分体 积比为2 :1，弗氏完全佐剂组成为弗氏不完全佐剂中加卡介苗（浓度5mg/ml)。
[0044] 1. 3、细胞融合：取免疫BALB/C鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤（购自中科院细胞库） 按比例（5:1)融合，1200rpm离心5分钟，弃上清。37°C下，1分钟内向细胞沉淀加入50% PEG(0. 8ml每IO8脾细胞），静置融合90秒，1200rpm离心5分钟，弃上清，加入20ml HAT 选择培养液（每500ml HAT选择培养液中含1640培养基400ml，胎牛血清100ml，50 X HAT IOml (sigma))，铺96孔细胞培养板，采用HAT选择培养液培养杂交瘤细胞（正常的细胞培 养，37°C，5% CO2的细胞培养孵箱内），选择存活下来的即是杂交瘤细胞。BALB/C小鼠脾细 胞与SP2/0骨髓瘤细胞完成细胞融合，细胞融合率为96. 7%。第七天采用间接ELISA法检 测细胞上清，以筛选阳性细胞。间接ELISA法如下：将NNMT蛋白用包被液稀释成0. 025 μ g/ ml，每孔100 μ 1包被酶标板，GST-NNMT蛋白用包被液稀释成0. 04 μ g/ml，每孔100 μ 1包被 酶标板，4°C放置过夜。次日，洗涤液洗涤3次，加封闭液约350 μ 1/孔，37°C、1小时，洗涤液 洗涤后拍干。每孔加入杂交瘤上清100μΙ，设阳性血清对照（免疫后小鼠的血清，多抗）、 阴性血清对照（未免疫小鼠的血清），同时设置空白对照孔（IXPBS)，37°C反应2小时后， 洗绦液洗绦酶标板，加入IOOyl兔抗小鼠 IG-HRP(Cell signaling Technology)(用PBSl : 4000稀释），37°C反应1小时后洗涤酶标板，加入TMB显色液，37°C显色15分钟，加终止液 终止反应，分光光度计（BIO RAD，Model 680，Japan)上读取0045(|的吸光度。融合细胞的初 筛阳性率为62. 4%。在大约一百例初筛阳性中选择抗NNMT滴度高（达到I :1000)且抗 GST-NNMT滴度很低（低于1 :10)的杂交瘤细胞株21例，进一步克隆化（将一个阳性孔内 的细胞挑取单克隆到96孔板中扩大培养，再进行上述鉴定，直到这个孔的细胞挑出来的全 为阳性，即为单克隆抗体株）直至阳性率达到100%，从而筛选到单克隆抗体杂交瘤细胞株 Zj/2D8、杂交瘤细胞株1E7和杂交瘤细胞株2F8,杂交瘤细胞株1E7保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏日期2011年8月31日，保藏编号CCTCC N0:C201167,保藏地址为中国武汉 武汉大学，邮编430072 ;杂交瘤细胞株2F8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2015 年1月15日，保藏编号CCTCC NO:C201506,保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。
[0045] 结果，阳性血清对照的OD值为2. 192，阴性血清对照的OD值为0. 101，空白孔OD 值为0. 097,经过筛选，所获得的目的细胞株所对应的OD值如表1所示。
[0046] 表1单克隆抗体细胞株筛选细胞上清OD值
[0047]
[0048] 由此筛选出的3株杂交瘤细胞株均能分泌抗NNMT蛋白的抗体且OD值大于1. 4。 而且抗GST-NNMT的OD值均很低，几乎与空白孔的OD值一致。其中杂交瘤细胞株Zj/2D8 的抗NNMT蛋白OD值明显高于杂交瘤细胞株1E7和杂交瘤细胞株2F8,且抗GST-NNMT的OD 值更低。
[0049] 1. 4、腹水制备：将杂交瘤细胞株Zj/2D8扩大培养（正常的细胞培养，37°C，5% CO2 的细胞培养孵箱内），收集细胞后用PBS配制成0. 4 X 106/ml细胞液，将细胞液腹腔注射石 蜡致敏（石蜡致敏是指腹腔注射Iml石蜡/只）的BALB/c小鼠，每只注射Iml，接种后9天 收获腹水，1200转/分钟离心，除去沉淀，收集上清液，即为上层单克隆抗体腹水。
[0050] 1. 5、抗体纯化：1份上 清液（步骤1. 4制备）中加入2份醋酸钠缓冲液（0· 06mol/ L，pH 5. 0)，用lmol/L HCl调pH至4. 8,制成稀释上清液。按每毫升稀释上清液加11 μ 1 辛酸的比例，室温搅拌下向稀释上清液中逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4°C静置2小 时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125 μm)后，滤液加入1/10体 积的0.01111〇1/1?85，用1111〇1/1恥0!1调？!1至7.2;在4°0下加入硫酸铵至45%饱和度，搅 拌30分钟，静置1小时；1000 Og离心30分钟，弃上清；沉淀以含137mmol/L NaCl+2. 6mol/ L KC1+0. 2mmol/L EDTA的PBS为透析液（透析袋的截留分子量为14000)，用50-100倍沉 淀体积的透析液进行透析，4°C过夜，其间换透析液3次以上，直至用10g/L的BaCl 2水溶液 检测截留液无 SO4离子。取出截留液，1000 Og离心30分钟，除去不溶性沉渣，上清即为纯化 的NNMT单克隆抗体，紫外分光光度法测定蛋白质含量后，加入0. 02%似队分装保存备用。 腹水粗品经4%辛酸提取与50%硫酸铵盐析，主要的杂蛋白，如白蛋白等几乎全部被去除。 SDS-PAGE电泳显示（图1)纯化后除抗体的重链（50KD)及轻链（25KD)条带之外的杂带较 少，表明纯化效果较好。
[0051] 1.6、抗体的鉴定
[0052] 1. 6. 1、杂交瘤细胞分泌的抗体的亚类及轻链型，使用sigma-aldrich公司的 IsoQuick Kits for Mouse Monoclonal Isotyping检测：（后文提到的本实验制备的抗体 或者是Zj/2D8皆是指1.，5纯化制备所得）1. 5纯化制备所得Z j/2D8分泌的NNMT抗体，为 IgG2a κ类（图2中A)，与1E7杂交瘤细胞株类型相同（图2中B)，但与2F8分泌的抗体为 IgG2bK类不同（图2中C)。
[0053] 1. 6. 2、纯品抗体的纯度及分子量：1. 5纯化制备所得NNMT抗体经SDS-PAGE电泳 和凝胶扫描分析后，抗体纯度为91. 4% (图3)。轻链分子量约为25KD，重链分子量约为 50KD，与抗体分子的特性相符。
[0054] 1. 6. 3、纯品抗体效价与亲和力分析：1· 5纯化制备所得NNMT抗体、1E7、2F8细胞株 纯品抗体经间接法ELISA分析后，抗体效价均在100000以上，但ZJ/2D8分离的NNMT抗体 要高于1E7和2F8(如表2和图4)分离的抗体。具体方法如下：将NNMT蛋白用包被液稀 释至0. 025 μ g/ml后包酶标板，4°C过夜。酶标板中加封闭液，37°C封闭1小时后，洗涤液洗 涤。洗涤拍干后，分别加 Zj/2D8分离的NNMT抗体、1E7分离的抗体、2F8分离的抗体（IOmg/ ml)，按1:100~I: IO7的10倍比例（表2)和2倍比例（图4)稀释量入孔，37°C洗涤2小 时后，加入100 μ 1二抗兔抗鼠 HRP-IgG 1小时后洗涤。最后TMB显色液显色15分钟，加入 终止液终止反应，测定波长450nm的OD值（表2)。表明经纯化后，抗体的效价有所增高，并 保持了抗体的免疫活性。
[0055] 表2 Zj/2D8、1E7和2F8提取的单克隆抗体对NNMT蛋白间接法抗体效价结果
[0056]
[0057] 结果以抗体浓度的对数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制单抗亲和力的测定曲线 (如图4)。Zj/2D8细胞株达到最大结合50%时的抗体浓度（单位μ g/ml)为0· 11 μ g/ml， 比1E7的0. 34 μ g/ml和2F8的0. 22 μ g/ml都要低，表明Zj/2D8细胞株所分泌抗体的相对 亲和力比1E7和2F8株都要高，其亲和力已能满足于生产各类检测试剂和试剂盒。
[0058] 1. 7、抗体特异性鉴定（采用Western-blot)
[0059] 1.7.1、方法
[0060] a.聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
[0061]
[0063] (1)按表配制聚丙烯酰胺15%分离胶。最后一步加入TEMED，混匀后，小心地将分 离胶注入准备好的玻璃凝胶模中，上面要为浓缩胶留I. 5-2cm的空隙。在顶层加水覆盖，使 界面平整，并防止空气中的氧气对凝胶聚合起抑制作用，室温下放置约30分钟，使之聚合。 聚合完成后，倾去分离胶上的水，尽量用吸水纸吸干凝胶顶端的残存液体。
[0064] (2)按表配制5%浓缩胶，混匀后加入玻璃凝胶模，插上梳子，室温下放置30分钟。 将凝胶电泳板放入电泳槽，浸没于IXTris甘氨酸电泳缓冲液中，小心移去梳子。
[0065] (3)准备样品：取上样缓冲液8 μ 1，IM DTT 2 μ 1，蛋白样品10 μ 1，置于0. 5ml的 离心管中，沸水浴10分钟后立刻置于冰上。
[0066] (4)上样：每个泳道分别用微量加样器加样10 μ 1。
[0067] (5)接通电源，35mA电泳10~15分钟，使蛋白质快速泳动至分离胶上层并浓缩成 一条窄带；电压改为25mA，继续电泳约1. 5小时，直至示踪染料接近凝胶的底端。
[0068] b.转膜及显影
[0069] (1)取4张与电泳凝胶大小一致的滤纸和一张氟化聚偏二乙烯滤膜（PVDF， Polyvinylidene-Fluoride)，用甲醇浸泡15分钟至滤膜呈透明。
[0070] (2)将两层滤纸放在固定的转移装置上，将己电泳好的聚丙烯酰胺凝胶放在滤纸 上，然后将PVDF滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，PVDF滤膜上再覆盖两层滤纸，每一步都要用 玻璃棒赶去气泡，然后固定装置。
[0071] (3)将整个装置置于电泳槽中，注意使凝胶层位于负极，滤膜层位于正极，在转移 电泳槽中加入预冷的转移缓冲液。
[0072] (4)接通电源，250mA转移2小时。
[0073] (5)封闭：在封闭液中室温转动60分钟。
[0074] (6)加一抗：一抗（抗NNMT单抗）用封闭液稀释，配稀释后一抗2ml (体积比1 : 12000)，将膜放入其中，4°C转动过夜。
[0075] (7)用封闭液室温浸洗膜3次，每次10分钟。
[0076] (8)加二抗：将二抗兔抗小鼠（IgG-HRP) (Cell signaling Technology)，用封闭液 1:5000稀释，配稀释后二抗2ml，将膜放入其中，室温转动2小时。
[0077] (9)用浸洗液室温浸洗条带3次，每次10分钟。
[0078] (10)加 ECL显影液后显影。
[0079] 结果经 Western-blot 鉴定单克隆抗体，在 PVDF(Polyvinylidene-Fluoride)膜 上，只有NNMT-GST融合蛋白（55KD)及NNMT蛋白（29KD)泳道相应分子量区域出现一条明 显的特异性条带，而在GST蛋白（26KD)泳道未出现相应条带（如图5所示）。
[0080] 1. 8、抗体抗原表位鉴定
[0081] 1.8.1、方法
[0082] a. NNMT短肽的合成：根据NNMT蛋白氨基酸序列（mesgftskdt ylshfnprdy lekyykfgsr hsaesqilkh llknlfkifc ldgvkgdlli digsgptiyq llsacesfke ivvtdysdqn lqelekwlkk epeafdwspv vtyvcdlegn rvkgpekeek lrqavkqvlk cdvtqsqplg avplppadcv lstlcldaac pdlptycral rnlgsllkpg gflvimdalk ssyymigeqk fsslplgrea veaavkeagy tiewfevisq sysstmanne glfslvarkl srpl)及结构分析，委托杭州中肽生化有限公司设计 并化学合成10条短肽（Nl-NlO)(表3)。
[0083] b. Western-blot和Elisa方法鉴定抗体识别抗原表位：利用Elisa方法进行 抗原表位鉴定，将合成的10条短肽作为包被抗原，以作为阴性对照，按照间接Elisa方 法（如1. 6. 3)进行，结果显示Zj/2D8组的第3条短肽呈阳性，说明Zj/2D8识别的抗原 表位为N3(SGPTIYQLLSACESFKEIVVTD)，而1E7和2F8均无响应短肽与其对应。同时利用 Western-blot进行验证，将这些短肽进行SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜上，分别用3株单 抗作为一抗，羊抗鼠 HRP-IgG作为二抗，经DAB显色，结果与Elisa实验结果一致（图6)。因 为Zj/2D8有明确的抗原识别表位，而1E7和2F8还没有明确的抗原识别表位，所以Zj/2D8 更适合于生产各类检测试剂和试剂盒，用于各类检测和研宄。
[0084] 表3 10条合成短肽序列信息
[0085]
[0086] I. 10、饥件Z刀、泌榻疋性的测疋
[0087] 将制备的3株杂交瘤细胞在冻存6个月以及12个月复苏，生长状态良好，用间接 Elisa方法鉴定，OD45tol值为1. 3~2. 0,表明分泌抗体的能力均稳定。
[0088] 实施例2 :单克隆抗体应用于免疫组化检测临床标本（采用二步间接法）
[0089] 1、本实验生产的抗NNMT单克隆抗体可以应用于临床病理标本的免疫组化实验。 我们选用杂交瘤细胞株Zj/2D8分离的NNMT单克隆抗体（实施例1中1. 5纯化后制备所 得）对不同组织进行免疫组化实验。先将一抗（特异性抗体一NNMT单克隆抗体）与相应 的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗（酶标记的抗体）与复合物中的特异抗体 结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。具体方法如下：
[0090] (1)石蜡NNMT干扰后的HT-29细胞（购自中科院细胞库）移植裸鼠，移植瘤的组 织切片脱腊至水（常规术语，就是用二甲苯-无水酒精脱去石蜡，然后经过无水酒精70 %酒 精，50%酒精依次过渡到水）。
[0091] (2) I XPBS冲洗，每次5分钟，共3次。
[0092] (3) 3%过氧化氢甲醇溶液作用20分钟，阻断内源性过氧化物酶活性。
[0093] (4) I XPBS冲洗，每次5分钟，共3次。
[0094] (5)封闭液封闭10分钟。
[0095] (6)用枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复。
[0096] (7)每张切片滴加实施例1制备的NNMT抗体作为一抗（I XPBS I :16000稀释）， 37 °C、60分钟或4°C冰箱过夜。
[0097] (8) I XPBS冲洗，每次5分钟，共3次。
[0098] (9)滴加辣根过氧化物酶（HRP)标记的兔抗小鼠的二抗（1:5000)，37°C、40分钟。
[0099] (10) I X PBS冲洗，每次5分钟，共3次。
[0100] (11)加入100 μ 1新鲜配制的3, 3-二氨基联苯胺（DAB)显色溶液（美国GENMEM 公司），10分钟。
[0101] (12)自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。
[0102] 同样条件以HCE8693细胞作为对照。
[0103] 2、大肠癌细胞株的免疫印记
[0104] 其中HCE8693和ΗΤ-29细胞显示NNMT阳性（图7)，ΗΤ-29细胞慢病毒干扰NNMT 表达后NNMT阳性减弱（图7)。
[0105] 3、ΗΤ-29细胞及NNMT干扰后的ΗΤ-29细胞移植裸鼠的免疫组化
[0106] ΗΤ-29细胞移植的裸鼠明显比NNMT干扰后的ΗΤ-29细胞移植的裸鼠阳性要强（图 8) 〇
[0107] 实施例3 :单克隆抗体应用于临床血清标本检测（采用双抗体夹心法）
[0108] 实施例1中1. 5最终纯化的NNMT单克隆抗体可以应用于临床血清标本中NNMT 抗原的检测实验。我们选用Zj/2D8,1Ε7和2F8分离的单克隆抗体对用血清稀释液（购自 Prospec公司的NNMT抗原标准品（ENZ-418))稀释的不同浓度标本进行NNMT抗原检测实 验。先将单克隆抗体包被固相载体，形成固相抗体，加入待检血清标本，形成固相抗原抗体 复合物，再加酶标单克隆抗体与复合物中的NNMT抗原结合，形成固相抗体-待测抗原-酶 标抗体夹心复合物，最后用底物显色剂显色。具体方法如下：
[0109] (1)包被：用包被缓冲液将NNMT抗体（分别将Zj/2D8,1E7和2F8分离的单克隆 抗体进行实验）稀释至10 μ g/mL，在每个聚苯乙稀板的反应孔中加入0. lml，4°C过夜。次 日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。
[0110] (2)加样：加待检血清样品0.1 ml于上述已包被的反应孔中，放置37°C孵育1小 时。然后洗涤3次。
[0111] (3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的NNMT抗 体0. lml。37°C孵育0. 5~1小时，洗涤3次。
[0112] (4)加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液0· 1ml，37°C，15分钟。
[0113] (5)终止反应：于各反应孔中加入终止液0. 05ml。
[0114] (6)用Elisa检测仪于450nm处测定OD值。
[0115] 根据国外文献报道（Markus Roe β ler, Wolfgang Rollinger, Stefan Palme, et al. Identification of Nicotinamide N-Methyltransferase as a Novel Serum Tumor Marker for Colorectal Cancer, Clinical Cancer Research, 2005)，使用 Elisa 方法检 测正常人血清中的NNMT抗原含量，最低者含量位于169pg/ml，部分肿瘤患者血清浓度升 高。所以，我们将 NNMT 抗原标准品稀释成 0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、 lng/ml、5ng/ml，10ng/ml 和 lOOng/ml 的浓度，检测结果如表 4。
[0116] 表4 Zj/2D8,1E7和2F8单克隆抗体检测不同NNMT抗原浓度的OD值
[0117]
[0118] 从结果中我们看到，Zj/2D8分离的单抗可以检测到50pg/ml，而1E7和2F8检测到 200pg/ml时已经分辨能力不强了。所以，Zj/2D8分离的单克隆抗体适合制成各类试剂和试 剂盒检测人血清中NNMT的浓度，对NNMT抗原进行检测。
【主权项】
1. 一株杂交瘤细胞株Zj/2D8,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10 月22日，保藏编号为CCTCCNO!C2013149,保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。2. -种权利要求1所述杂交瘤细胞株Zj/2D8在检测尼克酰胺-N-甲基化酶抗原中的 应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是提取杂交瘤细胞株Zj/2D8中 的尼克酰胺-N-甲基化酶抗体，再用尼克酰胺-N-甲基化酶抗体检测待测样品中尼克酰 胺-N-甲基化酶抗原含量。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述尼克酰胺-N-甲基化酶抗体的提取方法 为：（1)将杂交瘤细胞株Zj/2D8用含10%胎牛血清的1640培养液，在37°C，含5%0)2的 细胞培养箱内扩大培养，收集细胞，用PBS配制成0. 4 XIO6Ail的细胞液，再将细胞液腹腔 注射石蜡致敏的BALB/c小鼠，每只注射lml，接种后9天收获腹水，1200转/分钟离心，除 去沉淀，收集上清液； (2)向步骤（1)收集的上清液中加入2倍体积的pH5.0、0.06mol/L醋酸钠缓冲液，再 用lmol/LHCl调pH至4. 8,制成稀释上清液；然后按每毫升稀释上清液中加11y1辛酸的 比例，室温搅拌下向稀释上清液中逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4°C静置2小时，取出， 15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经125ym尼龙筛过滤后，滤液加入1/10体积的0.Olmol/ 1^85，用1111〇1/1恥011调？11至7.2;在41：下加入硫酸铵至45%饱和度，搅拌30分钟，静置 1 小时，1000 Og离心 30 分钟，弃上清，沉淀以含 137mmol/LNaCl+2. 6mol/LKC1+0. 2mmol/L EDTA的PBS为透析液进行透析，4°C过夜，直至用lOg/LBaCl2水溶液检测截留液无SO4离 子，取出截留液，1000 Og离心30分钟，除去不溶性沉澄，上清即为尼克酰胺-N-甲基化酶抗 体。
【专利摘要】本发明公开了一种杂交瘤细胞株Zj/2D8及在检测尼克酰胺-N-甲基化酶抗原中的应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月22日，保藏编号为CCTCC NO：C2013149，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072；本发明提供的杂交瘤细胞株Zj/2D8能够高效分泌NNMT单克隆抗体蛋白，对NNMT抗原具有很高的抗体效价，较好的亲和力和较高的纯度，可应用于临床检测，通过对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测该组织中NNMT蛋白的表达情况。CCTCC NO：C201314920131022CCTCC NO:C20116720110831CCTCC NO:C20150620150115
【IPC分类】G01N33/573, C12N5/20, C07K16/40
【公开号】CN104894073
【申请号】CN201510084356
【发明人】张钧, 谢鑫友, 杨肃文, 王燕忠
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年2月16日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白免疫学检测方法，具体涉及一种可以抗尼克酰胺-N-甲基化 酶蛋白的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株、制备方法及该单克隆抗体的用途。 (二）
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病。据世界卫生组织最新数据显示，每年 全球癌症新发病例1000多万，死亡700多万，占总死亡人数的12%。到2020年前，每年将 新增1500万癌症患者，不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅速上升，2030年这个数字可 能会增至1320万。
[0003] 肿瘤的早期诊断是肿瘤防治的关键，肿瘤的死亡和复发的危险性与初诊时的分期 密切相关，且化疗、放疗的敏感性一定程度上取决于癌细胞内的酶或蛋白分子。生物标志物 是细胞处于特定条件下代表该细胞生物学状态的重要信号指示分子。为了降低肿瘤的死亡 率或提高治疗的效果，许多研宄致力于肿瘤关键生物标准物的发现和筛选。因此，寻求肿瘤 早期诊断、分期或/和指示化疗、放疗的敏感性、预后以及潜在治疗靶点的肿瘤标志物一直 是肿瘤学的研宄热点。
[0004] 尼克酰胺-N-甲基化酶（NNMT，EC2. I. I. 1)正常表达于人肝脏组织中，其他组织如 肠、肺、肾、胎盘、心脏、骨骼肌、脑、胰腺表达很低或者没有表达。NNMT在不同人的肝脏中活 性差异较大，活性的高低取决于胞浆中NNMT的浓度，NNMT的浓度与NNMT的mRNA水平有关， 与基因的多态性无关，通常认为NNMT过表达的机制是由于基因翻译后调控异常所致，可能 受肝细胞核因子-I (HNF-I)、TGF- β 1、STAT3等激活。
[0005] NNMT的主要功能是以S-腺苷-L蛋氨酸（SAM)为供体，催化尼克酰胺和吡啶类物 质的甲基化，形成吡啶盐，在正常肝细胞中参与药物的生物转化，是催化药物、异型生物质 代谢的一种酶。NNMT是维持尼克酰胺平衡的关键酶，所以可以推测NNMT的增高可影响尼 克酰胺参与细胞的功能。尼克酰胺是NAD分子的组成部分，可通过补救合成途径生产NAD， 而NAD参与细胞的很多基本可能如能力代谢，对应和损伤的抵抗，细胞的寿命等。帕金森综 合症被认为与NNMT增高引起的尼克酰胺代谢异常有关，在脑组织中该酶活性过度增高通 过两条途径导致帕金森综合症，一是生成神经毒物N-甲基吡啶（如N-甲基-4苯基吡啶 (ΜΡΡ+))激活导致线粒体复合体1受损，二是降低了尼克酰胺导致能量代谢障碍。尼克酰胺 还能抑制多聚ADP聚合酶（PARP)，而PRAP通过碱基切除修复、坏死、凋亡等多细胞调节来 保持基因组的完整性。因此有理由推测NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的 发生和发展有关，或可影响化，放疗效果。如能明确NNMT在肿瘤细胞中的作用，并阐明NNMT 在肿瘤中的作用机制或分析其下游相关分子组成的模块或通路，必将进一步明确NNMT作 为在肿瘤防治中的价值。
[0006] 近年来，用蛋白助学和基因芯片技术比较不同癌组织和癌旁组织差异时发现NNMT 在多种癌组织中异常表达。与正常组织和癌旁组织相比，NNMT在结直肠癌、肺癌、膀胱癌、胃 癌、甲状腺乳头状癌、肾透明细胞癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌和胰腺等肿瘤组织有过表达， 并在多种肿瘤患者的血清中升高。这些研宄提示NNMT与肿瘤发生密切相关，推测NNMT可 能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响化、放疗效果。 (三）
【发明内容】
[0007] 本发明采用尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作为免疫原免疫小鼠制备了能稳定分泌 抗NNMT单克隆抗体的细胞株，然后通过NNMT蛋白的间接ELISA法筛选并进一步纯化获得 了能分泌NNMT抗体的细胞系及由所属细胞系提取的单克隆抗体，因此本发明目的是提供 一株高效分泌抗NNMT (尼克酰胺-N-甲基化酶）抗体的杂交瘤细胞株，利用该细胞株提取 NNMT抗体，采用NNMT抗体对待测组织中的NNMT抗原进行检测，进而确定待测组织中NNMT 抗原的含量，有助于临床诊断。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一株杂交瘤细胞株Zj/2D8,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日 期为2013年10月22日，保藏编号为CCTCC NO !C2013149,保藏地址为中国武汉，武汉大学， 邮编：430072。
[0010] 本发明还涉及一种所述杂交瘤细胞株Zj/2D8在检测尼克酰胺-N-甲基化酶 (NNMT)抗原中的应用，具体所述的应用是提取杂交瘤细胞株Zj/2D8中的NNMT抗体，再根据 抗原抗体特异性结合原理，利用NNMT抗体检测待测样品中NNMT抗原含量。
[0011] 本发明所述NNMT抗体的提取方法为：（1)将杂交瘤细胞株Zj/2D8用含10 %胎牛 血清的1640培养液，在37°C，含5% CO2的细胞培养箱内扩大培养，收集细胞，用PBS (pH值 为7. 4)配制成0. 4X IO6Ail的细胞液，再将细胞液腹腔注射石蜡致敏的BALB/c小鼠（不 限于BALB/c小鼠，本领域公知的小鼠型号均可），每只注射Iml，接种后9天收获腹水，1200 转/分钟离心，除去沉淀，收集上清液；
[0012] (2)向步骤⑴收集的上清液中加入2倍体积的pH 5.0、0.06mol/L醋酸钠缓冲 液，再用lmol/L HCl调pH至4. 8,制成稀释上清液；然后按每毫升稀释上清液中加11 μ 1 辛酸的比例，室温搅拌下向稀释上清液中逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4°C静置2小时， 取出，15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经125 μ m尼龙筛过滤后，滤液加入1/10体积的 0· Olmol/L PBS，用lmol/L NaOH调pH至7. 2 ;在4°C下加入硫酸铵至45%饱和度（所述 45%饱和度是指质量浓度），搅拌30分钟，静置1小时，1000 Og离心30分钟，弃上清，沉淀 以含 137mmol/L NaCl+2. 6mol/LKCl+0. 2mmol/L EDTA 的 PBS 为透析液进行透析，4°C过夜， 直至用l〇g/L BaCljK溶液检测截留液无 SO 4离子，取出截留液，1000 Og离心30分钟，除去 不溶性沉渣，上清即为NNMT抗体。
[0013] 本发明提供的杂交瘤细胞Zj/2D8所产生的单克隆NNMT抗体对于NNMT抗原均有 高水平的抗体效价，因此单克隆NNMT抗体、其活性片段或其保守性突变体以及标记的活性 片段或其保守性突变体，或其任意组合均可用于制备检测NNMT抗原的试剂、药剂或试剂 盒。本发明所述制备检测NNMT抗原的试剂、药剂或试剂盒优选采用双抗夹心法检测NNMT 抗原。
[0014] 对于本发明所述标记的活性片段或其保守性突变体，是指本领域公知的生物标记 或化学标记。例如酶标记、荧光标记（例如荧光素标记）或化学发光标记。优选地，所述酶 标记为辣根过氧化物、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记。
[0015] 本发明所述单克隆抗体优选为人源化的单克隆抗体（人源化抗体主要指鼠源单 克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源 序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性）。
[0016] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0017] (1)本发明提供的单克隆杂交瘤细胞株Zj/2D8能够高效分泌（是指在实施例1的 1. 3中培养液上清稀释1000倍后检测细胞分泌到上清液中的抗体亦为阳性）NNMT单克隆抗 体蛋白。
[0018] (2)本发明从单克隆杂交瘤细胞株Zj/2D8提取的NNMT单克隆抗体对NNMT抗原具 有很高的（I :1000000)抗体效价，较好的亲和力和较高的纯度，提示该单克隆抗体可应用 于检测NNMT抗原的科研研宄领域。
[0019] (2)本发明的从单克隆杂交瘤细胞株Zj/2D8提取的NNMT单克隆抗体可应用于临 床检测，通过对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测该组织中NNMT蛋白的表达情况。 (四）
【附图说明】
[0020] 图 1 为 Zj/2D8、1E7 和 2F8 纯品抗体 SDS-PAGE 电泳图，M !Marker，I :Zj/2D8 纯品 抗体，2 :1E7纯品抗体，3 :2F8纯品抗体。
[0021] 图2为Zj/2D8、1E7和2F8细胞株分泌抗体的亚类、轻链型图，A为Zj/2D8、B为 1E7, C 为 2F8C。
[0022] 图3为Z j/2D8纯品抗体凝胶扫描图。
[0023] 图4为Zj/2D8、2F8和1E7细胞株纯品抗体的亲和力反应曲线图。
[0024] 图5为Zj/2D8细胞株单抗的免疫印迹，I :GST蛋白，2 !NNMT-GST融合蛋白，3 :NNMT 蛋白。
[0025] 图6为10条合成短肽的免疫印迹。
[0026] 图7为大肠癌细胞株及阳性细胞株HT-29细胞NNMT慢病毒干扰后的免疫印迹。< br>[0027] 图8为裸鼠移植瘤HT-29细胞（A)及NNMT干扰后HT-29细胞⑶的免疫组化 (X100) 〇 (五）
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0029] 本发明百分浓度，若没有特殊指明，皆是质量浓度，溶剂皆是水。
[0030] 实施例1 :杂交瘤细胞系的获得、单克隆抗体的筛选、制备及鉴定
[0031] 1、单克隆抗体的制备
[0032] 按照本领域已知的常规方法制备本发明抗NNMT的单克隆抗体杂交瘤细胞株 Zj/2D8,主要参照美国专利5585089中所述的原则和方法制备人源化形式的抗NNMT的单克 隆抗体杂交瘤细胞株Zj/2D8(常见Kohler and MIlrtein, Nature 256:495-96, 1975)，方法 中将提到如下试剂：
[0033] (1)包被液！Na2CO3L 5g，NaHC032. 9g，NaN3O. 2g，溶于 IL 水中，调 pH 至 9. 6。
[0034] (2)封闭液：I %小牛血清白蛋白。
[0035] (3)洗涤液：0· 5mlTween-20 溶于 1000ml IXPBS 中。
[0036] (4) TMB显色液（包括底物显色A液和B液），底物显色A液：醋酸钠13. 6g、柠檬 酸1.6g、30%双氧水0. 3ml，蒸馏水加至500ml ;底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0. 2g、柠 檬酸〇.95g、甘油50ml、取0. 15g四甲基联苯胺（TMB)溶于3ml DMSO中，蒸馏水加至500ml。 使用时各取50 μ 1混合即可。
[0037] (5)终止液：2. Omol/L H2SO4水溶液。
[0038] 1. 1、免疫原的制备
[0039] 免疫原为GST-NNMT融合蛋白及NNMT蛋白，利用基因工程技术制备NNMT蛋白：根 据NCBI核苷酸数据库编码为gi : 12652950人NNMT cDNA序列，合成NNMT基因的PCR引物，
[0040] Pl (sense):3，-CG' GGATCC' ATGGAATCAGGCTTCACCTCC-5，；
[0041] P2 (antisense):3，-G'CTCGAG'AATTGAGGTCACAGGCATCACAG-S，〇
[0042] 在Pl的5'端和P2的3'端设计BamHI和XhoI位点。以肝c DNA为模板（序 列与上述NCBI核苷酸数据库编码为gi :12652950人NNMT cDNA序列一致），在引物P1、 P2作用下进行PCR扩增NNMT片段，反应参数为94°C预变性2min，94°C 20s、60°C 30s、 72°C45s。20次循环之后，立即加入0. 8μ1 Taq酶，72°C延长10min，4°C保存。PCR产物 经胶回收后，T-A克隆至PGEM-Teasy载体，得pGEM-T-Easy-NNMT质粒，质粒经测序验证后 用BamHI和XhoI酶切，回收DNA片段，连接到p GEX-4T-2载体，构建pGEX-4T-2/NNMT质 粒，转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3)中以表达GST-NNMT融合蛋白，获得重组大肠杆菌 BL-21-STAR(DE3) -GST-NNMT，37°C培养 2h 后，用终浓度 0· ImM 的 IPTG 在 30°C诱导 3h，4°C， 5000rpm离心10分钟，收集菌体，使用scientz- II D超声波细胞粉碎机，在100瓦，超声10 秒，停10秒，60个循环的条件下超声破碎菌体，13000rpm离心3分钟后，留取上清液，将上 清液经Glutathione Sepharose 4B (购自美国Pharmacia公司）亲和层析柱纯化GST-NNMT 蛋白。然后向GST-NNMT蛋白中加入凝血酶（每Img蛋白加入IOU凝血酶）使其充分酶切，再 次经过Glutathione Sepharose 4B(购自美国Pharmacia公司）亲和层析柱，室温轻摇30 分钟，使GST蛋白与亲和层析柱充分结合，收集流出液，500g离心5分钟，收集上清，上清中 仅含有NNMT蛋白，获得纯化后的NNMT蛋白。用邻苯三酸红法测定蛋白浓度，10 % SDS-PAGE 电泳和Western-blot鉴定NNMT蛋白，上清液中仅含有NNMT蛋白。
[0043] 1. 2、动物免疫：免疫程序为：初次免疫取8周龄BALB/C雌性小鼠，将NNMT蛋白与 弗氏完全佐剂等体积混匀后，在小鼠背部皮下多点注射，剂量为每只小鼠140 μ g。30天后， 再次用NNMT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀后，在小鼠背部皮下多点注射，剂量为每只 小鼠140 μ g。之后每隔10天再用NNMT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混勾物免疫一次，共 三次，作为加强免疫。最后进行细胞融合前三天，NNMT蛋白与生理盐水等体积混匀后腹腔 注射，剂量为每只小鼠80 μ g。弗氏不完全佐剂组成为液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分体 积比为2 :1，弗氏完全佐剂组成为弗氏不完全佐剂中加卡介苗（浓度5mg/ml)。
[0044] 1. 3、细胞融合：取免疫BALB/C鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤（购自中科院细胞库） 按比例（5:1)融合，1200rpm离心5分钟，弃上清。37°C下，1分钟内向细胞沉淀加入50% PEG(0. 8ml每IO8脾细胞），静置融合90秒，1200rpm离心5分钟，弃上清，加入20ml HAT 选择培养液（每500ml HAT选择培养液中含1640培养基400ml，胎牛血清100ml，50 X HAT IOml (sigma))，铺96孔细胞培养板，采用HAT选择培养液培养杂交瘤细胞（正常的细胞培 养，37°C，5% CO2的细胞培养孵箱内），选择存活下来的即是杂交瘤细胞。BALB/C小鼠脾细 胞与SP2/0骨髓瘤细胞完成细胞融合，细胞融合率为96. 7%。第七天采用间接ELISA法检 测细胞上清，以筛选阳性细胞。间接ELISA法如下：将NNMT蛋白用包被液稀释成0. 025 μ g/ ml，每孔100 μ 1包被酶标板，GST-NNMT蛋白用包被液稀释成0. 04 μ g/ml，每孔100 μ 1包被 酶标板，4°C放置过夜。次日，洗涤液洗涤3次，加封闭液约350 μ 1/孔，37°C、1小时，洗涤液 洗涤后拍干。每孔加入杂交瘤上清100μΙ，设阳性血清对照（免疫后小鼠的血清，多抗）、 阴性血清对照（未免疫小鼠的血清），同时设置空白对照孔（IXPBS)，37°C反应2小时后， 洗绦液洗绦酶标板，加入IOOyl兔抗小鼠 IG-HRP(Cell signaling Technology)(用PBSl : 4000稀释），37°C反应1小时后洗涤酶标板，加入TMB显色液，37°C显色15分钟，加终止液 终止反应，分光光度计（BIO RAD，Model 680，Japan)上读取0045(|的吸光度。融合细胞的初 筛阳性率为62. 4%。在大约一百例初筛阳性中选择抗NNMT滴度高（达到I :1000)且抗 GST-NNMT滴度很低（低于1 :10)的杂交瘤细胞株21例，进一步克隆化（将一个阳性孔内 的细胞挑取单克隆到96孔板中扩大培养，再进行上述鉴定，直到这个孔的细胞挑出来的全 为阳性，即为单克隆抗体株）直至阳性率达到100%，从而筛选到单克隆抗体杂交瘤细胞株 Zj/2D8、杂交瘤细胞株1E7和杂交瘤细胞株2F8,杂交瘤细胞株1E7保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏日期2011年8月31日，保藏编号CCTCC N0:C201167,保藏地址为中国武汉 武汉大学，邮编430072 ;杂交瘤细胞株2F8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2015 年1月15日，保藏编号CCTCC NO:C201506,保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。
[0045] 结果，阳性血清对照的OD值为2. 192，阴性血清对照的OD值为0. 101，空白孔OD 值为0. 097,经过筛选，所获得的目的细胞株所对应的OD值如表1所示。
[0046] 表1单克隆抗体细胞株筛选细胞上清OD值
[0047]
[0048] 由此筛选出的3株杂交瘤细胞株均能分泌抗NNMT蛋白的抗体且OD值大于1. 4。 而且抗GST-NNMT的OD值均很低，几乎与空白孔的OD值一致。其中杂交瘤细胞株Zj/2D8 的抗NNMT蛋白OD值明显高于杂交瘤细胞株1E7和杂交瘤细胞株2F8,且抗GST-NNMT的OD 值更低。
[0049] 1. 4、腹水制备：将杂交瘤细胞株Zj/2D8扩大培养（正常的细胞培养，37°C，5% CO2 的细胞培养孵箱内），收集细胞后用PBS配制成0. 4 X 106/ml细胞液，将细胞液腹腔注射石 蜡致敏（石蜡致敏是指腹腔注射Iml石蜡/只）的BALB/c小鼠，每只注射Iml，接种后9天 收获腹水，1200转/分钟离心，除去沉淀，收集上清液，即为上层单克隆抗体腹水。
[0050] 1. 5、抗体纯化：1份上 清液（步骤1. 4制备）中加入2份醋酸钠缓冲液（0· 06mol/ L，pH 5. 0)，用lmol/L HCl调pH至4. 8,制成稀释上清液。按每毫升稀释上清液加11 μ 1 辛酸的比例，室温搅拌下向稀释上清液中逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4°C静置2小 时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125 μm)后，滤液加入1/10体 积的0.01111〇1/1?85，用1111〇1/1恥0!1调？!1至7.2;在4°0下加入硫酸铵至45%饱和度，搅 拌30分钟，静置1小时；1000 Og离心30分钟，弃上清；沉淀以含137mmol/L NaCl+2. 6mol/ L KC1+0. 2mmol/L EDTA的PBS为透析液（透析袋的截留分子量为14000)，用50-100倍沉 淀体积的透析液进行透析，4°C过夜，其间换透析液3次以上，直至用10g/L的BaCl 2水溶液 检测截留液无 SO4离子。取出截留液，1000 Og离心30分钟，除去不溶性沉渣，上清即为纯化 的NNMT单克隆抗体，紫外分光光度法测定蛋白质含量后，加入0. 02%似队分装保存备用。 腹水粗品经4%辛酸提取与50%硫酸铵盐析，主要的杂蛋白，如白蛋白等几乎全部被去除。 SDS-PAGE电泳显示（图1)纯化后除抗体的重链（50KD)及轻链（25KD)条带之外的杂带较 少，表明纯化效果较好。
[0051] 1.6、抗体的鉴定
[0052] 1. 6. 1、杂交瘤细胞分泌的抗体的亚类及轻链型，使用sigma-aldrich公司的 IsoQuick Kits for Mouse Monoclonal Isotyping检测：（后文提到的本实验制备的抗体 或者是Zj/2D8皆是指1.，5纯化制备所得）1. 5纯化制备所得Z j/2D8分泌的NNMT抗体，为 IgG2a κ类（图2中A)，与1E7杂交瘤细胞株类型相同（图2中B)，但与2F8分泌的抗体为 IgG2bK类不同（图2中C)。
[0053] 1. 6. 2、纯品抗体的纯度及分子量：1. 5纯化制备所得NNMT抗体经SDS-PAGE电泳 和凝胶扫描分析后，抗体纯度为91. 4% (图3)。轻链分子量约为25KD，重链分子量约为 50KD，与抗体分子的特性相符。
[0054] 1. 6. 3、纯品抗体效价与亲和力分析：1· 5纯化制备所得NNMT抗体、1E7、2F8细胞株 纯品抗体经间接法ELISA分析后，抗体效价均在100000以上，但ZJ/2D8分离的NNMT抗体 要高于1E7和2F8(如表2和图4)分离的抗体。具体方法如下：将NNMT蛋白用包被液稀 释至0. 025 μ g/ml后包酶标板，4°C过夜。酶标板中加封闭液，37°C封闭1小时后，洗涤液洗 涤。洗涤拍干后，分别加 Zj/2D8分离的NNMT抗体、1E7分离的抗体、2F8分离的抗体（IOmg/ ml)，按1:100~I: IO7的10倍比例（表2)和2倍比例（图4)稀释量入孔，37°C洗涤2小 时后，加入100 μ 1二抗兔抗鼠 HRP-IgG 1小时后洗涤。最后TMB显色液显色15分钟，加入 终止液终止反应，测定波长450nm的OD值（表2)。表明经纯化后，抗体的效价有所增高，并 保持了抗体的免疫活性。
[0055] 表2 Zj/2D8、1E7和2F8提取的单克隆抗体对NNMT蛋白间接法抗体效价结果
[0056]
[0057] 结果以抗体浓度的对数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制单抗亲和力的测定曲线 (如图4)。Zj/2D8细胞株达到最大结合50%时的抗体浓度（单位μ g/ml)为0· 11 μ g/ml， 比1E7的0. 34 μ g/ml和2F8的0. 22 μ g/ml都要低，表明Zj/2D8细胞株所分泌抗体的相对 亲和力比1E7和2F8株都要高，其亲和力已能满足于生产各类检测试剂和试剂盒。
[0058] 1. 7、抗体特异性鉴定（采用Western-blot)
[0059] 1.7.1、方法
[0060] a.聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
[0061]
[0063] (1)按表配制聚丙烯酰胺15%分离胶。最后一步加入TEMED，混匀后，小心地将分 离胶注入准备好的玻璃凝胶模中，上面要为浓缩胶留I. 5-2cm的空隙。在顶层加水覆盖，使 界面平整，并防止空气中的氧气对凝胶聚合起抑制作用，室温下放置约30分钟，使之聚合。 聚合完成后，倾去分离胶上的水，尽量用吸水纸吸干凝胶顶端的残存液体。
[0064] (2)按表配制5%浓缩胶，混匀后加入玻璃凝胶模，插上梳子，室温下放置30分钟。 将凝胶电泳板放入电泳槽，浸没于IXTris甘氨酸电泳缓冲液中，小心移去梳子。
[0065] (3)准备样品：取上样缓冲液8 μ 1，IM DTT 2 μ 1，蛋白样品10 μ 1，置于0. 5ml的 离心管中，沸水浴10分钟后立刻置于冰上。
[0066] (4)上样：每个泳道分别用微量加样器加样10 μ 1。
[0067] (5)接通电源，35mA电泳10~15分钟，使蛋白质快速泳动至分离胶上层并浓缩成 一条窄带；电压改为25mA，继续电泳约1. 5小时，直至示踪染料接近凝胶的底端。
[0068] b.转膜及显影
[0069] (1)取4张与电泳凝胶大小一致的滤纸和一张氟化聚偏二乙烯滤膜（PVDF， Polyvinylidene-Fluoride)，用甲醇浸泡15分钟至滤膜呈透明。
[0070] (2)将两层滤纸放在固定的转移装置上，将己电泳好的聚丙烯酰胺凝胶放在滤纸 上，然后将PVDF滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，PVDF滤膜上再覆盖两层滤纸，每一步都要用 玻璃棒赶去气泡，然后固定装置。
[0071] (3)将整个装置置于电泳槽中，注意使凝胶层位于负极，滤膜层位于正极，在转移 电泳槽中加入预冷的转移缓冲液。
[0072] (4)接通电源，250mA转移2小时。
[0073] (5)封闭：在封闭液中室温转动60分钟。
[0074] (6)加一抗：一抗（抗NNMT单抗）用封闭液稀释，配稀释后一抗2ml (体积比1 : 12000)，将膜放入其中，4°C转动过夜。
[0075] (7)用封闭液室温浸洗膜3次，每次10分钟。
[0076] (8)加二抗：将二抗兔抗小鼠（IgG-HRP) (Cell signaling Technology)，用封闭液 1:5000稀释，配稀释后二抗2ml，将膜放入其中，室温转动2小时。
[0077] (9)用浸洗液室温浸洗条带3次，每次10分钟。
[0078] (10)加 ECL显影液后显影。
[0079] 结果经 Western-blot 鉴定单克隆抗体，在 PVDF(Polyvinylidene-Fluoride)膜 上，只有NNMT-GST融合蛋白（55KD)及NNMT蛋白（29KD)泳道相应分子量区域出现一条明 显的特异性条带，而在GST蛋白（26KD)泳道未出现相应条带（如图5所示）。
[0080] 1. 8、抗体抗原表位鉴定
[0081] 1.8.1、方法
[0082] a. NNMT短肽的合成：根据NNMT蛋白氨基酸序列（mesgftskdt ylshfnprdy lekyykfgsr hsaesqilkh llknlfkifc ldgvkgdlli digsgptiyq llsacesfke ivvtdysdqn lqelekwlkk epeafdwspv vtyvcdlegn rvkgpekeek lrqavkqvlk cdvtqsqplg avplppadcv lstlcldaac pdlptycral rnlgsllkpg gflvimdalk ssyymigeqk fsslplgrea veaavkeagy tiewfevisq sysstmanne glfslvarkl srpl)及结构分析，委托杭州中肽生化有限公司设计 并化学合成10条短肽（Nl-NlO)(表3)。
[0083] b. Western-blot和Elisa方法鉴定抗体识别抗原表位：利用Elisa方法进行 抗原表位鉴定，将合成的10条短肽作为包被抗原，以作为阴性对照，按照间接Elisa方 法（如1. 6. 3)进行，结果显示Zj/2D8组的第3条短肽呈阳性，说明Zj/2D8识别的抗原 表位为N3(SGPTIYQLLSACESFKEIVVTD)，而1E7和2F8均无响应短肽与其对应。同时利用 Western-blot进行验证，将这些短肽进行SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜上，分别用3株单 抗作为一抗，羊抗鼠 HRP-IgG作为二抗，经DAB显色，结果与Elisa实验结果一致（图6)。因 为Zj/2D8有明确的抗原识别表位，而1E7和2F8还没有明确的抗原识别表位，所以Zj/2D8 更适合于生产各类检测试剂和试剂盒，用于各类检测和研宄。
[0084] 表3 10条合成短肽序列信息
[0085]
[0086] I. 10、饥件Z刀、泌榻疋性的测疋
[0087] 将制备的3株杂交瘤细胞在冻存6个月以及12个月复苏，生长状态良好，用间接 Elisa方法鉴定，OD45tol值为1. 3~2. 0,表明分泌抗体的能力均稳定。
[0088] 实施例2 :单克隆抗体应用于免疫组化检测临床标本（采用二步间接法）
[0089] 1、本实验生产的抗NNMT单克隆抗体可以应用于临床病理标本的免疫组化实验。 我们选用杂交瘤细胞株Zj/2D8分离的NNMT单克隆抗体（实施例1中1. 5纯化后制备所 得）对不同组织进行免疫组化实验。先将一抗（特异性抗体一NNMT单克隆抗体）与相应 的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗（酶标记的抗体）与复合物中的特异抗体 结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。具体方法如下：
[0090] (1)石蜡NNMT干扰后的HT-29细胞（购自中科院细胞库）移植裸鼠，移植瘤的组 织切片脱腊至水（常规术语，就是用二甲苯-无水酒精脱去石蜡，然后经过无水酒精70 %酒 精，50%酒精依次过渡到水）。
[0091] (2) I XPBS冲洗，每次5分钟，共3次。
[0092] (3) 3%过氧化氢甲醇溶液作用20分钟，阻断内源性过氧化物酶活性。
[0093] (4) I XPBS冲洗，每次5分钟，共3次。
[0094] (5)封闭液封闭10分钟。
[0095] (6)用枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复。
[0096] (7)每张切片滴加实施例1制备的NNMT抗体作为一抗（I XPBS I :16000稀释）， 37 °C、60分钟或4°C冰箱过夜。
[0097] (8) I XPBS冲洗，每次5分钟，共3次。
[0098] (9)滴加辣根过氧化物酶（HRP)标记的兔抗小鼠的二抗（1:5000)，37°C、40分钟。
[0099] (10) I X PBS冲洗，每次5分钟，共3次。
[0100] (11)加入100 μ 1新鲜配制的3, 3-二氨基联苯胺（DAB)显色溶液（美国GENMEM 公司），10分钟。
[0101] (12)自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。
[0102] 同样条件以HCE8693细胞作为对照。
[0103] 2、大肠癌细胞株的免疫印记
[0104] 其中HCE8693和ΗΤ-29细胞显示NNMT阳性（图7)，ΗΤ-29细胞慢病毒干扰NNMT 表达后NNMT阳性减弱（图7)。
[0105] 3、ΗΤ-29细胞及NNMT干扰后的ΗΤ-29细胞移植裸鼠的免疫组化
[0106] ΗΤ-29细胞移植的裸鼠明显比NNMT干扰后的ΗΤ-29细胞移植的裸鼠阳性要强（图 8) 〇
[0107] 实施例3 :单克隆抗体应用于临床血清标本检测（采用双抗体夹心法）
[0108] 实施例1中1. 5最终纯化的NNMT单克隆抗体可以应用于临床血清标本中NNMT 抗原的检测实验。我们选用Zj/2D8,1Ε7和2F8分离的单克隆抗体对用血清稀释液（购自 Prospec公司的NNMT抗原标准品（ENZ-418))稀释的不同浓度标本进行NNMT抗原检测实 验。先将单克隆抗体包被固相载体，形成固相抗体，加入待检血清标本，形成固相抗原抗体 复合物，再加酶标单克隆抗体与复合物中的NNMT抗原结合，形成固相抗体-待测抗原-酶 标抗体夹心复合物，最后用底物显色剂显色。具体方法如下：
[0109] (1)包被：用包被缓冲液将NNMT抗体（分别将Zj/2D8,1E7和2F8分离的单克隆 抗体进行实验）稀释至10 μ g/mL，在每个聚苯乙稀板的反应孔中加入0. lml，4°C过夜。次 日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。
[0110] (2)加样：加待检血清样品0.1 ml于上述已包被的反应孔中，放置37°C孵育1小 时。然后洗涤3次。
[0111] (3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的NNMT抗 体0. lml。37°C孵育0. 5~1小时，洗涤3次。
[0112] (4)加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液0· 1ml，37°C，15分钟。
[0113] (5)终止反应：于各反应孔中加入终止液0. 05ml。
[0114] (6)用Elisa检测仪于450nm处测定OD值。
[0115] 根据国外文献报道（Markus Roe β ler, Wolfgang Rollinger, Stefan Palme, et al. Identification of Nicotinamide N-Methyltransferase as a Novel Serum Tumor Marker for Colorectal Cancer, Clinical Cancer Research, 2005)，使用 Elisa 方法检 测正常人血清中的NNMT抗原含量，最低者含量位于169pg/ml，部分肿瘤患者血清浓度升 高。所以，我们将 NNMT 抗原标准品稀释成 0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、 lng/ml、5ng/ml，10ng/ml 和 lOOng/ml 的浓度，检测结果如表 4。
[0116] 表4 Zj/2D8,1E7和2F8单克隆抗体检测不同NNMT抗原浓度的OD值
[0117]
[0118] 从结果中我们看到，Zj/2D8分离的单抗可以检测到50pg/ml，而1E7和2F8检测到 200pg/ml时已经分辨能力不强了。所以，Zj/2D8分离的单克隆抗体适合制成各类试剂和试 剂盒检测人血清中NNMT的浓度，对NNMT抗原进行检测。
【主权项】
1. 一株杂交瘤细胞株Zj/2D8,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10 月22日，保藏编号为CCTCCNO!C2013149,保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。2. -种权利要求1所述杂交瘤细胞株Zj/2D8在检测尼克酰胺-N-甲基化酶抗原中的 应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是提取杂交瘤细胞株Zj/2D8中 的尼克酰胺-N-甲基化酶抗体，再用尼克酰胺-N-甲基化酶抗体检测待测样品中尼克酰 胺-N-甲基化酶抗原含量。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述尼克酰胺-N-甲基化酶抗体的提取方法 为：（1)将杂交瘤细胞株Zj/2D8用含10%胎牛血清的1640培养液，在37°C，含5%0)2的 细胞培养箱内扩大培养，收集细胞，用PBS配制成0. 4 XIO6Ail的细胞液，再将细胞液腹腔 注射石蜡致敏的BALB/c小鼠，每只注射lml，接种后9天收获腹水，1200转/分钟离心，除 去沉淀，收集上清液； (2)向步骤（1)收集的上清液中加入2倍体积的pH5.0、0.06mol/L醋酸钠缓冲液，再 用lmol/LHCl调pH至4. 8,制成稀释上清液；然后按每毫升稀释上清液中加11y1辛酸的 比例，室温搅拌下向稀释上清液中逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4°C静置2小时，取出， 15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经125ym尼龙筛过滤后，滤液加入1/10体积的0.Olmol/ 1^85，用1111〇1/1恥011调？11至7.2;在41：下加入硫酸铵至45%饱和度，搅拌30分钟，静置 1 小时，1000 Og离心 30 分钟，弃上清，沉淀以含 137mmol/LNaCl+2. 6mol/LKC1+0. 2mmol/L EDTA的PBS为透析液进行透析，4°C过夜，直至用lOg/LBaCl2水溶液检测截留液无SO4离 子，取出截留液，1000 Og离心30分钟，除去不溶性沉澄，上清即为尼克酰胺-N-甲基化酶抗 体。
【专利摘要】本发明公开了一种杂交瘤细胞株Zj/2D8及在检测尼克酰胺-N-甲基化酶抗原中的应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月22日，保藏编号为CCTCC NO：C2013149，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072；本发明提供的杂交瘤细胞株Zj/2D8能够高效分泌NNMT单克隆抗体蛋白，对NNMT抗原具有很高的抗体效价，较好的亲和力和较高的纯度，可应用于临床检测，通过对不同组织的病理切片进行免疫组化，检测该组织中NNMT蛋白的表达情况。CCTCC NO：C201314920131022CCTCC NO:C20116720110831CCTCC NO:C20150620150115
【IPC分类】G01N33/573, C12N5/20, C07K16/40
【公开号】CN104894073
【申请号】CN201510084356
【发明人】张钧, 谢鑫友, 杨肃文, 王燕忠
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年2月16日
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