木质素降解液及制备方法以及用其降解木质素的方法
木质素降解液及制备方法以及用其降解木质素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学和生物炼制方法，具体涉及一种木质素降解液及制备方法以 及用其降解木质素的方法。
【背景技术】
[0002] 随着化石资源不断枯竭，利用生物炼制技术从木质纤维素原料中获取乙醇、丁醇 等液体燃料以及化学材料和化学品将成为石油炼制的重要补充。由多种苯丙烷基结构单元 高度交联而成的木质素是木质纤维素中的主要成分，也是地球上含量最丰富的生物高分子 之一，木质素的生物转化极为困难，它不仅限制了木质纤维素中纤维素和半纤维素等多糖 组分的转化，也是生物炼制废弃物的主要成分。因此，木质素的高效降解转化是当前生物炼 制工业的发展重点和必然趋势。
[0003] 白腐菌（white rot fungus)是自然界中木质素的主要分解者，也是唯一可以完全 降解木质素的一类微生物。白腐菌通过胞外分泌的锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶 等木质素酶降解木质素。当前，已经从Phanerochae te sp·、Echinodon tium sp·、Irpex sp、Pleuro tus sp.、Trame tes sp.、Ganoderma sp.等白腐菌中分离出多种木质素酶。但 是，大多数研宄仅将漆酶或漆酶/介体系统用于体外催化木质素的降解。研宄表明，在漆酶 作用下，木质素大分子的主要结构骨架降解甚微，漆酶催化过程中木质素片段的再聚合也 会对木质素降解产生不利影响。因此，通常先用理化方法将木质素大分子降解为简单的小 分子木质素片段或使木质素改性，再利用漆酶或漆酶/介体催化系统降解。如在造纸制浆 工艺中，常先利用化学制浆工艺去除木材中大部分木质素，再利用漆酶或漆酶/介体系统 降解纸浆残余木质素片段进行生物漂白；中国科学院过程工程研宄所陈洪章等先将玉米秸 杆蒸汽爆破，使木质素大分子解聚或改性，再利用漆酶降解，木质素降解率可达10-25 %。而 直接利用漆酶等木质素酶降解木质素则很少见报道。
[0004] 在天然环境下，白腐菌对木质素的降解通常依赖于几种木质素酶的共同作用。依 据其菌株来源、种类不同，白腐菌产生的木质素酶对不同木质素结构单元的降解具有偏好 性，且不同木质素酶对木质素底物的降解具有叠加增效作用，如锰过氧化物酶主要降解木 质素中的非酚型结构，而漆酶主要降解木质素中的酚型结构，漆酶在介体存在时对非酚型 结构也具有降解作用。木质素酶的复合作用不仅有利于木质素大分子中多样化的木质素结 构基团的同步降解，而且有利于抑制木质素降解产物的再聚合。因此，既然现有单一的漆酶 或漆酶/介体系统很难实现大分子木质素的高效降解，那么利用不同木质素酶构建复合催 化体系降解木质素应是一个可行的技术途径。当前，已有少数工艺利用几种木质素酶复合 降解木质素。但这些工艺通常利用粗酶液进行木质素的降解，如河南天冠企业集团有限公 司利用白腐菌粗漆酶和粗过氧化物酶协同降解秸杆木质素促进燃料乙醇的转化效率。但由 于粗酶液中成分非常复杂，很难确定木质素降解是木质素酶还是其它成分的作用，且每批 次酶液的成分都不可能保持一致，因此可能导致处理效果不稳定。而利用纯化的白腐菌漆 酶和锰过氧化物酶复合降解木质素的研宄尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种木质素降解液，同时提供其制备方法以及用于降解木质素的方 法，解决现有采用漆酶等单一木质素酶难以实现木质素高效生物降解的问题。
[0006] 本发明所提供的一种木质素降解液，包括漆酶和锰过氧化物酶，其特征在于：
[0007] 所述木质素降解液中，将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷比例， 溶于pH4~6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~ 50U/ml 和 lU/ml ~50U/ml，然后加入 1 ~IOmM MnSOjP 0. 1 ~ImM H2O2;
[0008] 所述漆酶和锰过氧化物酶分别由白腐菌发酵获取胞外粗酶液，再经分离纯化后得 到。
[0009] 所述的木质素降解液制备方法，依次包括制备木质素酶步骤和制备降解液步骤， 其特征在于：
[0010] (1)所述制备木质素酶步骤：将白腐菌分别接种于漆酶产酶培养基和锰过氧化 物酶产酶培养基，发酵后分别获得胞外粗酶液，分别经分离纯化后得到漆酶和锰过氧化物 酶；
[0011] ⑵所述制备降解液步骤：将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷 比例，溶于PH4~6的醋酸缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~50U/ ml和lU/ml~50U/ml，再加入1~IOmM MnSOjP 0· 1~ImM H2O2，得到木质素降解液。
[0012] 所述的木质素降解液制备方法，其进一步特征在于，所述制备木质素酶步骤中：
[0013] (I. 1)所述漆酶的制备包括下述子步骤：
[0014] A.从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇 床以50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种；
[0015] B.将所述液体菌种以体积比10 %~50 %的接种量接入漆酶产酶培养基，25°C~ 37°C下静置培养2~6d后，加入1~IOmM藜芦醇，继续培养3d~15d后，培养物过滤获得 漆酶粗酶液；
[0016] C.漆酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换柱层析和超滤管浓缩后得 到电泳纯的漆酶；
[0017] (1. 2)所述锰过氧化物酶的制备包括下述子步骤：
[0018] A.从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇 床以50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种；
[0019] B.将所述液体菌种以体积比10%~50%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养 基，25°C~37°C培养IOd~60d后，按质量体积比1 : 5~1 : 50加入蒸馏水浸泡培养物 Ih~8h，过滤获得锰过氧化物酶粗酶液；
[0020] C.锰过氧化物酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换柱层析和超滤管 浓缩后得到电泳纯的锰过氧化物酶。
[0021] 所述的木质素降解液制备方法，其更进一步特征在于，
[0022] 所述白腐菌为灵芝、乳白耙菌、糙皮侧耳、射脉菌、多孔菌中的一种或多种；
[0023] 所述漆酶产酶培养基组成为：每IOOmLKirk限氮液体培养基中加入0. 1~20g麸 皮，100°C~125°C灭菌 10 ~40min ;
[0024] 所述锰过氧化物酶产酶培养基组成为：将20目~80目的木质纤维素类生物质，按 质量体积比I : 1~1 : 5加入蒸馏水，pH自然，100°C~125°C灭菌10~40min;所述木 质纤维素类生物质包括竹粉、农业秸杆粉或木肩。
[0025] 利用所述木质素降解液降解木质素的方法，其特征在于：
[0026] 对于从生物质中分离获得的木质素高分子，添加所述木质素降解液，使木质素质 量浓度达到0. 2 %~5 %，于25 °C~50 °C通氧或不通氧反应2h~48h ;
[0027] 对于含有木质素的木质纤维素生物质，添加所述木质素降解液，使木质素质量浓 度达到1%~10%，于25°C~50°C通氧或不通氧反应12h~48h。
[0028] 所述木质素包括从生物质中分离获取的木质素高分子及木质纤维素生物质中的 木质素，从生物质中分离获取的木质素包括碱木素、酶解木质素、磺化木质素、磨木木质素 等；所述木质纤维素生物质包括草本类植物秸杆和木材，其中草本类植物秸杆包括荻竹、玉 米杆、麦杆、稻杆、高粱杆、棉杆、油菜杆、芒草等；木材包括各类木材加工后的木肩。
[0029] 本发明基于不同木质素酶对各种木质素结构单元降解的偏好性及降解作用的协 同增效，实现结构多样性丰富的大分子木质素各基团和连键的协同氧化降解，与现有单一 木质素酶降解反应体系相比，木质素高分子的降解率可达到30~50%，显著提高木质素降 解转化效率，尤其显著提升非酚型木质素的降解效率，适用于不同来源的木质素和木质纤 维素中木质素的高效降解，可用于木质纤维素生物炼制、生物制浆或环境处理等领域。
【附图说明】
[0030] 图1为木质素降解液LacP-MnpI降解玉米秸杆木质纤维素中的木质素效果示意 图。
【具体实施方式】
[0031] 为了便于理解，以下通过具体实施例对本发明进行详细描述。
[0032] 实施例1制备来源于多孔菌的漆酶LacT :
[0033] A.从多孔菌斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中，放 置于摇床以200r/min速度震荡培养8d，温度25°C，获得液体菌种；
[0034] B.将制备好的液体菌种以体积比10%的接种量接入漆酶产 酶培养基，将培养物 置于25°C下静置培养6d后，加入ImM藜芦醇，分别继续培养3、10、15d后，培养物过滤获得 漆酶粗酶液；
[0035] 漆酶产酶培养基配置方法为：每100mLKirk限氮液体培养基加入20g麸皮，100°C 灭菌40min〇
[0036] C.测定漆酶酶活，结果见表1所示，选取酶活最高的3d漆酶粗酶液，进行分离纯 化；
[0037] 表1多孔菌不同培养时间漆酶粗酶液中的酶活
[0038]
[0039] 首先将漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在 20mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经 Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层 析、Millipore超滤管浓缩后得到电泳纯的漆酶LacT。
[0040] 实施例2制备来源于灵芝的漆酶LacG :
[0041] A.从灵芝斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中，放置 于摇床以50r/min速度震荡培养2d，温度37°C，获得液体菌种；
[0042] B.将制备好的液体菌种以体积比50%的接种量接入漆酶产酶培养基。将培养物 置于37°C下静置培养2d后，加入4mM藜芦醇，分别继续培养3、10、15d后，培养物过滤获得 粗酶液；
[0043] 漆酶产酶培养基配置方法为：每100mLKirk限氮液体培养基加入0.1 g麸皮，125°C 灭菌IOmin0
[0044] C.测定漆酶酶活，结果见表2所示，选取酶活最高的15d漆酶粗酶液，进行分离纯 化；
[0045] 表2灵芝不同培养时间漆酶粗酶液中的酶活
[0046]
[0047] 首先将漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在 20mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经 Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层 析、Millipore超滤管浓缩后得到电泳纯的漆酶LacG。
[0048] 实施例3制备来源于糙皮侧耳的漆酶LacP :
[0049] A.从糙皮侧耳斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中， 放置于摇床以150r/min速度震荡培养4d，温度28°C，获得液体菌种；
[0050] B.将制备好的液体菌种以体积比20%的接种量接入漆酶产酶培养基。将培养物 置于28°C下静置培养4d后，加入IOmM藜芦醇，分别继续培养3、10、15d后，培养物过滤获得 粗酶液；
[0051] 漆酶产酶培养基配置方法为：每100mLKirk限氮液体培养基加入2g麸皮，121°C灭 菌 30min。
[0052] C.测定漆酶酶活，结果见表3所示，选取酶活最高的IOd漆酶粗酶液，进行分离纯 化；
[0053] 表3糙皮侧耳不同培养时间漆酶粗酶液中的酶活
[0054]
[0055] 首先将粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在20mM的 醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层析、 Millipore超滤管浓缩后得到电泳纯的漆酶LacP。
[0056] 实施例4制备来源于射脉菌的锰过氧化物酶MnpR :
[0057] A.将射脉菌斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中，放 置于摇床以50r/min速度震荡培养2d，温度25°C，获得液体菌种；
[0058] B.将制备好的液体菌种以体积比50%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养基， 25°C分别培养10、45、60d后，按照质量体积比1 : 5加入30ml蒸馏水浸泡培养物8h，过滤 获得粗酶液；
[0059] 锰过氧化物酶产酶培养基组成为：20-80目竹粉6g，按质量体积比I : 1加入蒸馏 水，pH自然，125°C灭菌lOmin。
[0060] C.测定锰过氧化物酶酶活，结果如表4所示，选取酶活最高的IOd粗酶液，进行分 离纯化；
[0061] 表4射脉菌不同培养时间锰过氧化物酶粗酶液中的酶活
[0062]
[0063] 首先进行粗酶液的硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在20mM的 醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层析、 Millipore超滤管浓缩后得到电泳纯的锰过氧化物酶MnpR。
[0064] 实施例5制备来源于乳白耙菌的锰过氧化物酶MnpI :
[0065] A.将乳白耙菌斜面培养物上划取接种块，接种到IOOrnl 土豆液体种子培养基中， 放置于摇床以200r/min速度震荡培养8d，温度37°C，获得液体菌种；
[0066] B.将制备好的液体菌种以体积比10%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养基， 37°C分别培养10、45、60d后，按照质量体积比1 : 50加入300ml蒸馏水浸泡培养物lh，过 滤获得粗酶液；
[0067] 锰过氧化物酶产酶培养基组成为：20-80目农业秸杆粉6g，按质量体积比1 : 5加 入蒸馏水，pH自然，100°C灭菌40min。
[0068] C.测定锰过氧化物酶酶活，结果如表5所示，选取酶活最高的60d粗酶液，进行分 离纯化；
[0069] 表5乳白耙菌不同培养时间锰过氧化物酶粗酶液中的酶活
[0070]
[0071] 首先进行粗酶液的硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在20mM的 醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层析、 Mi 11 ipore超滤管浓缩后得到电泳纯的锰过氧化物酶MnpI。
[0072] 实施例6制备来源于糙皮侧耳的锰过氧化物酶MnpP :
[0073] A.将糙皮侧耳斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中， 放置于摇床以150r/min速度震荡培养5d，温度28°C，获得液体菌种；
[0074] B.将制备好的液体菌种以体积比20%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养基， 28°C分别培养10、45、60d后，按照质量体积比I : 10加入60ml蒸馏水浸泡培养物3h，过滤 获得粗酶液；
[0075] 锰过氧化物酶产酶培养基组成为：20-80目木肩6g，按固液比1 : 2加入蒸馏水， pH 自然，121°C灭菌 30min。
[0076] C.测定锰过氧化物酶酶活，结果如表6所示，选取酶活最高的45d粗酶液，进行分 离纯化；
[0077] 表6木齿菌不同培养时间锰过氧化物酶粗酶液中的酶活
[0078]
[0079] 首先进行粗酶液的硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在20mM的 醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层析、 Mi 11 ipore超滤管浓缩后得到电泳纯的锰过氧化物酶MnpI。
[0080] 实施例7制备木质素降解液LacP-MnpP :
[0081] 将漆酶LacP和锰过氧化物酶MnpP以1 : 5的酶负荷比例，溶于pH6的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/mL和5U/mL，再加入ImM MnSO4 和ImM H2O2，获得木质素降解液LacP-MnpP，可用于碱木素降解。
[0082] 利用非酚型木质素模型化合物4-甲氧基肉桂酸评价降解液的性质：向木质素降 解液中加入ImM 4-甲氧基肉桂酸，30°C反应48小时，然后用HPLC检测木质素模型化合 物的剩余率（％)，然后用HPLC检测木质素模型化合物的剩余率。HPLC条件为：流动相 为 0.1% (v:v)的甲醇溶液，色谱柱为 A WondaSil-18column(250mmX4.6mm，5ym)，流速 是lmL/min，进样量是10 μ L。结果表明与单一锰过氧化物酶相比，非酚型木质素降解率由 42. 6%增加到84. 3%，表明该木质素降解液对可以提升非酚型木质素 结构的降解效率。
[0083] 实施例8制备木质素降解液LacG-MnpR :
[0084] 将漆酶LacG和锰过氧化物酶MnpR以10 : 1的酶负荷比例，溶于ρΗ4的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lOU/mL和lU/mL，再加入IOmM MnSO4 和0.1 mM H2O2，获得木质素降解液LacG-MnpR，可用于酶解木质素降解。
[0085] 实施例9制备木质素降解液LacT-MnpP :
[0086] 将漆酶LacT和锰过氧化物酶MnpP以10 : 1的酶负荷比例，溶于pH4. 5的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为50U/mL和5U/mL，再加入2mM MnSO4 和0. 5mM H2O2，获得木质素降解液LacT-MnpP，可用于麦杆、稻杆、木肩木质纤维素中木质素 降解。
[0087] 实施例10制备木质素降解液LacP-MnpI :
[0088] 将漆酶LacP和锰过氧化物酶MnpI以1 : 5的酶负荷比例，溶于pH4. 8的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lOU/mL和50U/mL，再加入3mM MnSO4 和0. 6mM H2O2，获得木质素降解液LacP-MnpI，可用于玉米秸杆木质纤维素中木质素降解。
[0089] 实施例11木质素降解液LacP-MnpP降解碱木素
[0090] 向碱木素中添加木质素降解液LacP-MnpP，使碱木素浓度达到5%，于25°C不通氧 反应48小时，并分别以单独漆酶LacP和单独锰过氧化物酶MnpP为对照，进行木质素的降 解反应。反应后酸洗沉淀残余碱木素，沉淀冷冻干燥后称重，计算碱木素降解率，结果如表 7所示。
[0091 ] 表7木质素降解液LacP-MnpP降解碱木素
[0092]
[0093] 实施例12木质素降解液LacG-MnpR降解酶解木质素：
[0094] 向酶解木质素中添加木质素降解液LacG-MnpR，使酶解木质素浓度达到0. 2%， 50°C通氧反应2小时，并分别以单独漆酶LacG和单独锰过氧化物酶MnpR为对照，进行木质 素的降解反应。反应后将反应物冷冻干燥，利用Klason木质素测定法测定反应物中木质素 含量，计算降解率，结果如表8所示。
[0095] 表8木质素降解液LacG-MnpR降解酶解木质素
[0096]
[0097] 实施例13木质素降解液LacT-MnpP的降解麦杆、稻杆和木肩木质纤维素中的木质 素：
[0098] 分别向麦杆、稻杆和木肩木质纤维素中添加木质素降解液LacT-MnpP，使木质纤维 素浓度达到10%，在不通氧条件下25°C反应48小时，并分别以单独漆酶LacT和单独锰过 氧化物酶MnpP为对照，降解木质纤维素中的木质素。反应后过滤沉淀，测定沉淀中残余木 质素含量，木质素含量采用Klason木质素的测定方法，结果如表9所示。
[0099] 表9木质素降解液LacT-MnpP降解麦杆、稻杆和木肩中木质素的降解率
[0100]
[0101] 实施例14木质素降解液LacP-MnpI的降解玉米秸杆木质纤维素中的木质素：
[0102] 向玉米秸杆中添加木质素降解液LacP-MnpI，使玉米秸杆木质纤维素浓度达到 1 %，在加氧条件下50°C反应12小时，并分别以单独漆酶LacP和单独锰过氧化物酶MnpI为 对照，进行木质素的降解反应。反应后过滤沉淀，测定秸杆中残余木质素含量，木质素含量 采用Klason木质素的测定方法，同时测定秸杆木质纤维素在木质素降解后的糖化率。结果 如图1所示，经过复合酶木质素降解液降解秸杆中的木质素后，木质素降解效率增强，秸杆 木质纤维素糖化率提升。
【主权项】
1. 一种木质素降解液，包括漆酶和锰过氧化物酶，其特征在于： 所述木质素降解液中，将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷比例，溶于PH4~6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~50U/ ml和lU/ml~50U/ml，然后加入 1~IOmMMnSO4^P0? 1 ~ImMH2O2; 所述漆酶和锰过氧化物酶分别由白腐菌发酵获取胞外粗酶液，再经分离纯化后得到。2. 权利要求1所述木质素降解液的制备方法，依次包括制备木质素酶步骤和制备降解 液步骤，其特征在于： (1) 所述制备木质素酶步骤：将白腐菌分别接种于漆酶产酶培养基和锰过氧化物酶产 酶培养基，发酵后分别获得胞外粗酶液，分别经分离纯化后得到漆酶和锰过氧化物酶； (2) 所述制备降解液步骤：将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷比例， 溶于pH4~6的醋酸缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~50U/ml和 lU/ml~50U/ml，再加入1~IOmMMnSOjP0. 1~ImMH2O2，得到木质素降解液。3. 如权利要求2所述的制备方法，其进一步特征在于，所述制备木质素酶步骤中： (I. 1)所述漆酶的制备包括下述子步骤： A. 从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇床以 50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种； B. 将所述液体菌种以体积比10 %~50 %的接种量接入漆酶产酶培养基，25°C~37°C 下静置培养2~6d后，加入1~IOmM藜芦醇，继续培养3d~15d后，培养物过滤获得漆酶 粗酶液； C. 漆酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏层析、离子交换柱层析和超滤管浓缩后得到电泳 纯的漆酶； (1. 2)所述锰过氧化物酶的制备包括下述子步骤： A. 从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇床以 50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种； B. 将所述液体菌种以体积比10%~50%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养基， 25°C~37°C培养IOd~60d后，按质量体积比1 : 5~1 : 50加入蒸馏水浸泡培养物Ih~ 8h，过滤获得锰过氧化物酶粗酶液； C. 锰过氧化物酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换柱层析和超滤管浓缩 后得到电泳纯的锰过氧化物酶。4. 如权利要求2或3所述的制备方法，其更进一步特征在于， 所述白腐菌为灵芝、乳白耙菌、糙皮侧耳、射脉菌、多孔菌中的一种或多种； 所述漆酶产酶培养基组成为：每IOOmLKirk限氮液体培养基中加入0. 1~20g麸皮， 10CTC~125°C灭菌 10 ~40min; 所述锰过氧化物酶产酶培养基组成为：将20目~80目的木质纤维素类生物质，按质量 体积比I: 1~1 : 5加入蒸馏水，pH自然，100°C~125°C灭菌10~40min;所述木质纤 维素类生物质包括竹粉、农业秸杆粉或木肩。5. 利用权利要求1所述木质素降解液降解木质素的方法，其特征在于： 对于从生物质中分离获得的木质素高分子，添加所述木质素降解液，使木质素质量浓 度达到0.2%~5%，于25°C~50°C通氧或不通氧反应2h~48h; 对于含有木质素的木质纤维素生物质，添加所述木质素降解液，使木质素质量浓度达 到1%~10%，于25°C~50°C通氧或不通氧反应12h~48h。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于： 所述木质素包括从生物质中分离获取的木质素高分子及木质纤维素生物质中的木质 素，从生物质中分离获取的木质素高分子包括碱木素、酶解木质素、磺化木质素、磨木木质 素等；所述木质纤维素生物质包括草本类植物秸杆和木材，其中草本类植物秸杆包括荻竹、 玉米杆、麦杆、稻杆、高粱杆、棉杆、油菜杆、芒草等；木材包括各类木材加工后的木肩。
【专利摘要】木质素降解液及制备方法以及用其降解木质素的方法，属于生物化学和生物炼制方法，解决现有采用漆酶等单一木质素酶难以实现木质素高效生物降解的问题。所述木质素降解液由漆酶和锰过氧化物酶，以10∶1～1∶5的酶负荷比例，溶于pH4～6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为1U/ml～50U/ml和1U/ml～50U/ml，然后加入1～10mM MnSO4和0.1～1mM H2O2；所述漆酶和锰过氧化物酶分别由白腐菌发酵获取胞外粗酶液，再经分离纯化后得到。本发明实现结构多样性丰富的大分子木质素协同氧化降解，与单一木质素酶降解反应体系相比，木质素高分子的降解率可达到30～50％，显著提高降解转化效率，可用于木质纤维素生物炼制、生物制浆或环境处理等领域。
【IPC分类】C12P19/00, C12N9/08, C12N9/02
【公开号】CN104894079
【申请号】CN201510278306
【发明人】余洪波, 孔雯, 倪浩翔, 张晓昱
【申请人】华中科技大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学和生物炼制方法，具体涉及一种木质素降解液及制备方法以 及用其降解木质素的方法。
【背景技术】
[0002] 随着化石资源不断枯竭，利用生物炼制技术从木质纤维素原料中获取乙醇、丁醇 等液体燃料以及化学材料和化学品将成为石油炼制的重要补充。由多种苯丙烷基结构单元 高度交联而成的木质素是木质纤维素中的主要成分，也是地球上含量最丰富的生物高分子 之一，木质素的生物转化极为困难，它不仅限制了木质纤维素中纤维素和半纤维素等多糖 组分的转化，也是生物炼制废弃物的主要成分。因此，木质素的高效降解转化是当前生物炼 制工业的发展重点和必然趋势。
[0003] 白腐菌（white rot fungus)是自然界中木质素的主要分解者，也是唯一可以完全 降解木质素的一类微生物。白腐菌通过胞外分泌的锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶 等木质素酶降解木质素。当前，已经从Phanerochae te sp·、Echinodon tium sp·、Irpex sp、Pleuro tus sp.、Trame tes sp.、Ganoderma sp.等白腐菌中分离出多种木质素酶。但 是，大多数研宄仅将漆酶或漆酶/介体系统用于体外催化木质素的降解。研宄表明，在漆酶 作用下，木质素大分子的主要结构骨架降解甚微，漆酶催化过程中木质素片段的再聚合也 会对木质素降解产生不利影响。因此，通常先用理化方法将木质素大分子降解为简单的小 分子木质素片段或使木质素改性，再利用漆酶或漆酶/介体催化系统降解。如在造纸制浆 工艺中，常先利用化学制浆工艺去除木材中大部分木质素，再利用漆酶或漆酶/介体系统 降解纸浆残余木质素片段进行生物漂白；中国科学院过程工程研宄所陈洪章等先将玉米秸 杆蒸汽爆破，使木质素大分子解聚或改性，再利用漆酶降解，木质素降解率可达10-25 %。而 直接利用漆酶等木质素酶降解木质素则很少见报道。
[0004] 在天然环境下，白腐菌对木质素的降解通常依赖于几种木质素酶的共同作用。依 据其菌株来源、种类不同，白腐菌产生的木质素酶对不同木质素结构单元的降解具有偏好 性，且不同木质素酶对木质素底物的降解具有叠加增效作用，如锰过氧化物酶主要降解木 质素中的非酚型结构，而漆酶主要降解木质素中的酚型结构，漆酶在介体存在时对非酚型 结构也具有降解作用。木质素酶的复合作用不仅有利于木质素大分子中多样化的木质素结 构基团的同步降解，而且有利于抑制木质素降解产物的再聚合。因此，既然现有单一的漆酶 或漆酶/介体系统很难实现大分子木质素的高效降解，那么利用不同木质素酶构建复合催 化体系降解木质素应是一个可行的技术途径。当前，已有少数工艺利用几种木质素酶复合 降解木质素。但这些工艺通常利用粗酶液进行木质素的降解，如河南天冠企业集团有限公 司利用白腐菌粗漆酶和粗过氧化物酶协同降解秸杆木质素促进燃料乙醇的转化效率。但由 于粗酶液中成分非常复杂，很难确定木质素降解是木质素酶还是其它成分的作用，且每批 次酶液的成分都不可能保持一致，因此可能导致处理效果不稳定。而利用纯化的白腐菌漆 酶和锰过氧化物酶复合降解木质素的研宄尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种木质素降解液，同时提供其制备方法以及用于降解木质素的方 法，解决现有采用漆酶等单一木质素酶难以实现木质素高效生物降解的问题。
[0006] 本发明所提供的一种木质素降解液，包括漆酶和锰过氧化物酶，其特征在于：
[0007] 所述木质素降解液中，将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷比例， 溶于pH4~6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~ 50U/ml 和 lU/ml ~50U/ml，然后加入 1 ~IOmM MnSOjP 0. 1 ~ImM H2O2;
[0008] 所述漆酶和锰过氧化物酶分别由白腐菌发酵获取胞外粗酶液，再经分离纯化后得 到。
[0009] 所述的木质素降解液制备方法，依次包括制备木质素酶步骤和制备降解液步骤， 其特征在于：
[0010] (1)所述制备木质素酶步骤：将白腐菌分别接种于漆酶产酶培养基和锰过氧化 物酶产酶培养基，发酵后分别获得胞外粗酶液，分别经分离纯化后得到漆酶和锰过氧化物 酶；
[0011] ⑵所述制备降解液步骤：将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷 比例，溶于PH4~6的醋酸缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~50U/ ml和lU/ml~50U/ml，再加入1~IOmM MnSOjP 0· 1~ImM H2O2，得到木质素降解液。
[0012] 所述的木质素降解液制备方法，其进一步特征在于，所述制备木质素酶步骤中：
[0013] (I. 1)所述漆酶的制备包括下述子步骤：
[0014] A.从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇 床以50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种；
[0015] B.将所述液体菌种以体积比10 %~50 %的接种量接入漆酶产酶培养基，25°C~ 37°C下静置培养2~6d后，加入1~IOmM藜芦醇，继续培养3d~15d后，培养物过滤获得 漆酶粗酶液；
[0016] C.漆酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换柱层析和超滤管浓缩后得 到电泳纯的漆酶；
[0017] (1. 2)所述锰过氧化物酶的制备包括下述子步骤：
[0018] A.从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇 床以50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种；
[0019] B.将所述液体菌种以体积比10%~50%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养 基，25°C~37°C培养IOd~60d后，按质量体积比1 : 5~1 : 50加入蒸馏水浸泡培养物 Ih~8h，过滤获得锰过氧化物酶粗酶液；
[0020] C.锰过氧化物酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换柱层析和超滤管 浓缩后得到电泳纯的锰过氧化物酶。
[0021] 所述的木质素降解液制备方法，其更进一步特征在于，
[0022] 所述白腐菌为灵芝、乳白耙菌、糙皮侧耳、射脉菌、多孔菌中的一种或多种；
[0023] 所述漆酶产酶培养基组成为：每IOOmLKirk限氮液体培养基中加入0. 1~20g麸 皮，100°C~125°C灭菌 10 ~40min ;
[0024] 所述锰过氧化物酶产酶培养基组成为：将20目~80目的木质纤维素类生物质，按 质量体积比I : 1~1 : 5加入蒸馏水，pH自然，100°C~125°C灭菌10~40min;所述木 质纤维素类生物质包括竹粉、农业秸杆粉或木肩。
[0025] 利用所述木质素降解液降解木质素的方法，其特征在于：
[0026] 对于从生物质中分离获得的木质素高分子，添加所述木质素降解液，使木质素质 量浓度达到0. 2 %~5 %，于25 °C~50 °C通氧或不通氧反应2h~48h ;
[0027] 对于含有木质素的木质纤维素生物质，添加所述木质素降解液，使木质素质量浓 度达到1%~10%，于25°C~50°C通氧或不通氧反应12h~48h。
[0028] 所述木质素包括从生物质中分离获取的木质素高分子及木质纤维素生物质中的 木质素，从生物质中分离获取的木质素包括碱木素、酶解木质素、磺化木质素、磨木木质素 等；所述木质纤维素生物质包括草本类植物秸杆和木材，其中草本类植物秸杆包括荻竹、玉 米杆、麦杆、稻杆、高粱杆、棉杆、油菜杆、芒草等；木材包括各类木材加工后的木肩。
[0029] 本发明基于不同木质素酶对各种木质素结构单元降解的偏好性及降解作用的协 同增效，实现结构多样性丰富的大分子木质素各基团和连键的协同氧化降解，与现有单一 木质素酶降解反应体系相比，木质素高分子的降解率可达到30~50%，显著提高木质素降 解转化效率，尤其显著提升非酚型木质素的降解效率，适用于不同来源的木质素和木质纤 维素中木质素的高效降解，可用于木质纤维素生物炼制、生物制浆或环境处理等领域。
【附图说明】
[0030] 图1为木质素降解液LacP-MnpI降解玉米秸杆木质纤维素中的木质素效果示意 图。
【具体实施方式】
[0031] 为了便于理解，以下通过具体实施例对本发明进行详细描述。
[0032] 实施例1制备来源于多孔菌的漆酶LacT :
[0033] A.从多孔菌斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中，放 置于摇床以200r/min速度震荡培养8d，温度25°C，获得液体菌种；
[0034] B.将制备好的液体菌种以体积比10%的接种量接入漆酶产 酶培养基，将培养物 置于25°C下静置培养6d后，加入ImM藜芦醇，分别继续培养3、10、15d后，培养物过滤获得 漆酶粗酶液；
[0035] 漆酶产酶培养基配置方法为：每100mLKirk限氮液体培养基加入20g麸皮，100°C 灭菌40min〇
[0036] C.测定漆酶酶活，结果见表1所示，选取酶活最高的3d漆酶粗酶液，进行分离纯 化；
[0037] 表1多孔菌不同培养时间漆酶粗酶液中的酶活
[0038]
[0039] 首先将漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在 20mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经 Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层 析、Millipore超滤管浓缩后得到电泳纯的漆酶LacT。
[0040] 实施例2制备来源于灵芝的漆酶LacG :
[0041] A.从灵芝斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中，放置 于摇床以50r/min速度震荡培养2d，温度37°C，获得液体菌种；
[0042] B.将制备好的液体菌种以体积比50%的接种量接入漆酶产酶培养基。将培养物 置于37°C下静置培养2d后，加入4mM藜芦醇，分别继续培养3、10、15d后，培养物过滤获得 粗酶液；
[0043] 漆酶产酶培养基配置方法为：每100mLKirk限氮液体培养基加入0.1 g麸皮，125°C 灭菌IOmin0
[0044] C.测定漆酶酶活，结果见表2所示，选取酶活最高的15d漆酶粗酶液，进行分离纯 化；
[0045] 表2灵芝不同培养时间漆酶粗酶液中的酶活
[0046]
[0047] 首先将漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在 20mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经 Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层 析、Millipore超滤管浓缩后得到电泳纯的漆酶LacG。
[0048] 实施例3制备来源于糙皮侧耳的漆酶LacP :
[0049] A.从糙皮侧耳斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中， 放置于摇床以150r/min速度震荡培养4d，温度28°C，获得液体菌种；
[0050] B.将制备好的液体菌种以体积比20%的接种量接入漆酶产酶培养基。将培养物 置于28°C下静置培养4d后，加入IOmM藜芦醇，分别继续培养3、10、15d后，培养物过滤获得 粗酶液；
[0051] 漆酶产酶培养基配置方法为：每100mLKirk限氮液体培养基加入2g麸皮，121°C灭 菌 30min。
[0052] C.测定漆酶酶活，结果见表3所示，选取酶活最高的IOd漆酶粗酶液，进行分离纯 化；
[0053] 表3糙皮侧耳不同培养时间漆酶粗酶液中的酶活
[0054]
[0055] 首先将粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在20mM的 醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层析、 Millipore超滤管浓缩后得到电泳纯的漆酶LacP。
[0056] 实施例4制备来源于射脉菌的锰过氧化物酶MnpR :
[0057] A.将射脉菌斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中，放 置于摇床以50r/min速度震荡培养2d，温度25°C，获得液体菌种；
[0058] B.将制备好的液体菌种以体积比50%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养基， 25°C分别培养10、45、60d后，按照质量体积比1 : 5加入30ml蒸馏水浸泡培养物8h，过滤 获得粗酶液；
[0059] 锰过氧化物酶产酶培养基组成为：20-80目竹粉6g，按质量体积比I : 1加入蒸馏 水，pH自然，125°C灭菌lOmin。
[0060] C.测定锰过氧化物酶酶活，结果如表4所示，选取酶活最高的IOd粗酶液，进行分 离纯化；
[0061] 表4射脉菌不同培养时间锰过氧化物酶粗酶液中的酶活
[0062]
[0063] 首先进行粗酶液的硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在20mM的 醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层析、 Millipore超滤管浓缩后得到电泳纯的锰过氧化物酶MnpR。
[0064] 实施例5制备来源于乳白耙菌的锰过氧化物酶MnpI :
[0065] A.将乳白耙菌斜面培养物上划取接种块，接种到IOOrnl 土豆液体种子培养基中， 放置于摇床以200r/min速度震荡培养8d，温度37°C，获得液体菌种；
[0066] B.将制备好的液体菌种以体积比10%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养基， 37°C分别培养10、45、60d后，按照质量体积比1 : 50加入300ml蒸馏水浸泡培养物lh，过 滤获得粗酶液；
[0067] 锰过氧化物酶产酶培养基组成为：20-80目农业秸杆粉6g，按质量体积比1 : 5加 入蒸馏水，pH自然，100°C灭菌40min。
[0068] C.测定锰过氧化物酶酶活，结果如表5所示，选取酶活最高的60d粗酶液，进行分 离纯化；
[0069] 表5乳白耙菌不同培养时间锰过氧化物酶粗酶液中的酶活
[0070]
[0071] 首先进行粗酶液的硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在20mM的 醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层析、 Mi 11 ipore超滤管浓缩后得到电泳纯的锰过氧化物酶MnpI。
[0072] 实施例6制备来源于糙皮侧耳的锰过氧化物酶MnpP :
[0073] A.将糙皮侧耳斜面培养物上划取接种块，接种到100mL 土豆液体种子培养基中， 放置于摇床以150r/min速度震荡培养5d，温度28°C，获得液体菌种；
[0074] B.将制备好的液体菌种以体积比20%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养基， 28°C分别培养10、45、60d后，按照质量体积比I : 10加入60ml蒸馏水浸泡培养物3h，过滤 获得粗酶液；
[0075] 锰过氧化物酶产酶培养基组成为：20-80目木肩6g，按固液比1 : 2加入蒸馏水， pH 自然，121°C灭菌 30min。
[0076] C.测定锰过氧化物酶酶活，结果如表6所示，选取酶活最高的45d粗酶液，进行分 离纯化；
[0077] 表6木齿菌不同培养时间锰过氧化物酶粗酶液中的酶活
[0078]
[0079] 首先进行粗酶液的硫酸铵分级沉淀，收集酶活最高部分的沉淀物于4°C在20mM的 醋酸-醋酸钠缓冲液中透析除去硫酸铵，获得浓缩粗酶液；浓缩后的粗酶液分别经Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow 疏水层析、DEAE SepharoseTM Fast Flow 离子交换柱层析、 Mi 11 ipore超滤管浓缩后得到电泳纯的锰过氧化物酶MnpI。
[0080] 实施例7制备木质素降解液LacP-MnpP :
[0081] 将漆酶LacP和锰过氧化物酶MnpP以1 : 5的酶负荷比例，溶于pH6的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/mL和5U/mL，再加入ImM MnSO4 和ImM H2O2，获得木质素降解液LacP-MnpP，可用于碱木素降解。
[0082] 利用非酚型木质素模型化合物4-甲氧基肉桂酸评价降解液的性质：向木质素降 解液中加入ImM 4-甲氧基肉桂酸，30°C反应48小时，然后用HPLC检测木质素模型化合 物的剩余率（％)，然后用HPLC检测木质素模型化合物的剩余率。HPLC条件为：流动相 为 0.1% (v:v)的甲醇溶液，色谱柱为 A WondaSil-18column(250mmX4.6mm，5ym)，流速 是lmL/min，进样量是10 μ L。结果表明与单一锰过氧化物酶相比，非酚型木质素降解率由 42. 6%增加到84. 3%，表明该木质素降解液对可以提升非酚型木质素 结构的降解效率。
[0083] 实施例8制备木质素降解液LacG-MnpR :
[0084] 将漆酶LacG和锰过氧化物酶MnpR以10 : 1的酶负荷比例，溶于ρΗ4的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lOU/mL和lU/mL，再加入IOmM MnSO4 和0.1 mM H2O2，获得木质素降解液LacG-MnpR，可用于酶解木质素降解。
[0085] 实施例9制备木质素降解液LacT-MnpP :
[0086] 将漆酶LacT和锰过氧化物酶MnpP以10 : 1的酶负荷比例，溶于pH4. 5的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为50U/mL和5U/mL，再加入2mM MnSO4 和0. 5mM H2O2，获得木质素降解液LacT-MnpP，可用于麦杆、稻杆、木肩木质纤维素中木质素 降解。
[0087] 实施例10制备木质素降解液LacP-MnpI :
[0088] 将漆酶LacP和锰过氧化物酶MnpI以1 : 5的酶负荷比例，溶于pH4. 8的醋酸-醋 酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lOU/mL和50U/mL，再加入3mM MnSO4 和0. 6mM H2O2，获得木质素降解液LacP-MnpI，可用于玉米秸杆木质纤维素中木质素降解。
[0089] 实施例11木质素降解液LacP-MnpP降解碱木素
[0090] 向碱木素中添加木质素降解液LacP-MnpP，使碱木素浓度达到5%，于25°C不通氧 反应48小时，并分别以单独漆酶LacP和单独锰过氧化物酶MnpP为对照，进行木质素的降 解反应。反应后酸洗沉淀残余碱木素，沉淀冷冻干燥后称重，计算碱木素降解率，结果如表 7所示。
[0091 ] 表7木质素降解液LacP-MnpP降解碱木素
[0092]
[0093] 实施例12木质素降解液LacG-MnpR降解酶解木质素：
[0094] 向酶解木质素中添加木质素降解液LacG-MnpR，使酶解木质素浓度达到0. 2%， 50°C通氧反应2小时，并分别以单独漆酶LacG和单独锰过氧化物酶MnpR为对照，进行木质 素的降解反应。反应后将反应物冷冻干燥，利用Klason木质素测定法测定反应物中木质素 含量，计算降解率，结果如表8所示。
[0095] 表8木质素降解液LacG-MnpR降解酶解木质素
[0096]
[0097] 实施例13木质素降解液LacT-MnpP的降解麦杆、稻杆和木肩木质纤维素中的木质 素：
[0098] 分别向麦杆、稻杆和木肩木质纤维素中添加木质素降解液LacT-MnpP，使木质纤维 素浓度达到10%，在不通氧条件下25°C反应48小时，并分别以单独漆酶LacT和单独锰过 氧化物酶MnpP为对照，降解木质纤维素中的木质素。反应后过滤沉淀，测定沉淀中残余木 质素含量，木质素含量采用Klason木质素的测定方法，结果如表9所示。
[0099] 表9木质素降解液LacT-MnpP降解麦杆、稻杆和木肩中木质素的降解率
[0100]
[0101] 实施例14木质素降解液LacP-MnpI的降解玉米秸杆木质纤维素中的木质素：
[0102] 向玉米秸杆中添加木质素降解液LacP-MnpI，使玉米秸杆木质纤维素浓度达到 1 %，在加氧条件下50°C反应12小时，并分别以单独漆酶LacP和单独锰过氧化物酶MnpI为 对照，进行木质素的降解反应。反应后过滤沉淀，测定秸杆中残余木质素含量，木质素含量 采用Klason木质素的测定方法，同时测定秸杆木质纤维素在木质素降解后的糖化率。结果 如图1所示，经过复合酶木质素降解液降解秸杆中的木质素后，木质素降解效率增强，秸杆 木质纤维素糖化率提升。
【主权项】
1. 一种木质素降解液，包括漆酶和锰过氧化物酶，其特征在于： 所述木质素降解液中，将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷比例，溶于PH4~6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~50U/ ml和lU/ml~50U/ml，然后加入 1~IOmMMnSO4^P0? 1 ~ImMH2O2; 所述漆酶和锰过氧化物酶分别由白腐菌发酵获取胞外粗酶液，再经分离纯化后得到。2. 权利要求1所述木质素降解液的制备方法，依次包括制备木质素酶步骤和制备降解 液步骤，其特征在于： (1) 所述制备木质素酶步骤：将白腐菌分别接种于漆酶产酶培养基和锰过氧化物酶产 酶培养基，发酵后分别获得胞外粗酶液，分别经分离纯化后得到漆酶和锰过氧化物酶； (2) 所述制备降解液步骤：将漆酶和锰过氧化物酶，以10 : 1~1 : 5的酶负荷比例， 溶于pH4~6的醋酸缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为lU/ml~50U/ml和 lU/ml~50U/ml，再加入1~IOmMMnSOjP0. 1~ImMH2O2，得到木质素降解液。3. 如权利要求2所述的制备方法，其进一步特征在于，所述制备木质素酶步骤中： (I. 1)所述漆酶的制备包括下述子步骤： A. 从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇床以 50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种； B. 将所述液体菌种以体积比10 %~50 %的接种量接入漆酶产酶培养基，25°C~37°C 下静置培养2~6d后，加入1~IOmM藜芦醇，继续培养3d~15d后，培养物过滤获得漆酶 粗酶液； C. 漆酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏层析、离子交换柱层析和超滤管浓缩后得到电泳 纯的漆酶； (1. 2)所述锰过氧化物酶的制备包括下述子步骤： A. 从白腐菌斜面培养物上划取接种块，接种到土豆液体种子培养基中，放置于摇床以 50r/min~200r/min速度震荡培养2d~8d，温度25°C~37°C，获得液体菌种； B. 将所述液体菌种以体积比10%~50%的接种量接入锰过氧化物酶产酶培养基， 25°C~37°C培养IOd~60d后，按质量体积比1 : 5~1 : 50加入蒸馏水浸泡培养物Ih~ 8h，过滤获得锰过氧化物酶粗酶液； C. 锰过氧化物酶粗酶液分别经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换柱层析和超滤管浓缩 后得到电泳纯的锰过氧化物酶。4. 如权利要求2或3所述的制备方法，其更进一步特征在于， 所述白腐菌为灵芝、乳白耙菌、糙皮侧耳、射脉菌、多孔菌中的一种或多种； 所述漆酶产酶培养基组成为：每IOOmLKirk限氮液体培养基中加入0. 1~20g麸皮， 10CTC~125°C灭菌 10 ~40min; 所述锰过氧化物酶产酶培养基组成为：将20目~80目的木质纤维素类生物质，按质量 体积比I: 1~1 : 5加入蒸馏水，pH自然，100°C~125°C灭菌10~40min;所述木质纤 维素类生物质包括竹粉、农业秸杆粉或木肩。5. 利用权利要求1所述木质素降解液降解木质素的方法，其特征在于： 对于从生物质中分离获得的木质素高分子，添加所述木质素降解液，使木质素质量浓 度达到0.2%~5%，于25°C~50°C通氧或不通氧反应2h~48h; 对于含有木质素的木质纤维素生物质，添加所述木质素降解液，使木质素质量浓度达 到1%~10%，于25°C~50°C通氧或不通氧反应12h~48h。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于： 所述木质素包括从生物质中分离获取的木质素高分子及木质纤维素生物质中的木质 素，从生物质中分离获取的木质素高分子包括碱木素、酶解木质素、磺化木质素、磨木木质 素等；所述木质纤维素生物质包括草本类植物秸杆和木材，其中草本类植物秸杆包括荻竹、 玉米杆、麦杆、稻杆、高粱杆、棉杆、油菜杆、芒草等；木材包括各类木材加工后的木肩。
【专利摘要】木质素降解液及制备方法以及用其降解木质素的方法，属于生物化学和生物炼制方法，解决现有采用漆酶等单一木质素酶难以实现木质素高效生物降解的问题。所述木质素降解液由漆酶和锰过氧化物酶，以10∶1～1∶5的酶负荷比例，溶于pH4～6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使得漆酶和锰过氧化物酶酶负荷分别为1U/ml～50U/ml和1U/ml～50U/ml，然后加入1～10mM MnSO4和0.1～1mM H2O2；所述漆酶和锰过氧化物酶分别由白腐菌发酵获取胞外粗酶液，再经分离纯化后得到。本发明实现结构多样性丰富的大分子木质素协同氧化降解，与单一木质素酶降解反应体系相比，木质素高分子的降解率可达到30～50％，显著提高降解转化效率，可用于木质纤维素生物炼制、生物制浆或环境处理等领域。
【IPC分类】C12P19/00, C12N9/08, C12N9/02
【公开号】CN104894079
【申请号】CN201510278306
【发明人】余洪波, 孔雯, 倪浩翔, 张晓昱
【申请人】华中科技大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日
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