一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1及其基因的制作方法
一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1及其基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，及其编码基因，以及在7-ACA脱 乙酰化中的应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] SGNH家族酯酶（esterase, EC 3. I. I. 1)是一类具有广泛底物特异性的水解酶，包 含脂肪酶、蛋白酶、硫酯酶、芳香酯酶、溶血磷脂酶、碳水化合物酯酶、酰基转移酶活性。该 家族大约在1995年被鉴定，但是其成员仍然很少被定性，它们不同于大部分含有典型的 GxSxG的保守序列的α/β水解酶超家族酯酶，而是含有独特的GDSL的保守序列，是一类 新家族的醋酶。⑶SL家族的醋酶含有5段保守序列区（five consensus sequence blocks I-V)，在5段保守序列区中含有4个较保守的催化位点Ser，Gly，ASn和His，因此又可以分 为SGNH亚家族酯酶。SGNH家族酯酶参与细菌毒力，植物发育和形态发生以及植物防御机制 (Asler IL, et al.，Chembiochem. 2010, 11:2158 - 2167)，本发明的醋酶 EstDl 属于微生物 来源的⑶SL酯酶家族中SGNH亚家族酯酶。
[0003] 脱乙酰化的头孢菌素是工业上合成β-内酰胺类抗生素的重要原料，而脱乙酰化 的头孢菌素通常由头孢菌素 C和7-ACA经化学途径或酶途径脱乙酰化作用得到，酶法因其 反应较温和，产量较高而且伴有较少的副反应而得到重视（Irene Martinez-Martinez, et al.，Analytical Biochemistry. 2007, 369:210 - 217)。因此寻找能够将头抱菌素高效脱乙 酰化的酯酶具有重要的工业价值。
[0004] 然而，天然菌株发酵周期长，产酶量低，纯化困难，生产成本高，难以大量生产，限 制了其推广应用。利用分子生物学手段构建高效生物反应器，可以提高SGNH家族酯酶的表 达量，实现其大规模工业化生产。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明提供了一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，及其编 码基因，以及含有该基因的重组表达载体、重组菌株，以及EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应 用。本发明从嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I基因组中克隆SGNH家族酯酶基因 EstDl，与表达载 体pEASY?-E2连接后，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达并对EstDl酶学性质及其对 7-ACA脱乙酰化进行了初步研宄，本发明对了解微生物来源的SGNH酯酶家族的特性具有重 要意义。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，其氨基酸序列为以下序列之一：
[0008] (1)如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
[0009] (2) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸 的序列。
[0010] 一种编码上述碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl，其核苷酸序列为以 下序列之一：
[0011] ⑴如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；
[0012] (2) SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸 的序列；
[0013] (3)在严格条件下，与（1)或（2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
[0014] (4)由于遗传密码子的简并性区别于（1)、（2)、（3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
[0015] 一种重组载体，其含上述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl的 完整编码阅读框序列。
[0016] 上述重组载体，载体优选pEASY?-E2。
[0017] 一种重组菌株，其含上述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl或 上述重组载体。
[0018] 上述重组菌株的受体菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)。受体菌内含有上述的重组载体，编码碱性热稳定SGNH家 族酯酶EstDl的核苷酸序列被可操作地连接于受体细胞中引起碱性热稳定SGNH家族酯酶 EstDl充分表达的启动子，从而赋予了受体菌产生碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的能力。
[0019] 一种利用上述重组菌株生产碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的方法：培养发酵重 组菌株，诱导SGNH家族酯酶EstDl表达，收集菌体，分离纯化得到SGNH家族酯酶EstDl。
[0020] 上述碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应用。具体应用时， 按以下方法进行：取100 μ L纯化的SGNH家族酯酶EstDl加入到含有浓度为4. 5g/L7-ACA 的l/15mol/L、pH7. 3的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400 yL，25°C反 应，对7-ACA进行降解。
[0021] 本发明的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl可得自嗜热脂环芽孢杆菌 (thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504) 〇 本发明的 SGNH 家族酯酶EstDl总共含有215个氨基酸，理论分子量为25. 31kDa，理论等电点为6. 68。以 乙酸-4-硝基苯酯（PNPC2)为底物：最适温度65°C ;最适pH 8. 5 ;终浓度ImM的金属离子 Hg2+、Mg2+和Cu 2+及化学试剂SDS、TWeen-80、β -巯基乙醇对酶有较强的激活作用，K +、A13+、 Ni2+、EDTA等对酶有抑制作用；在37°C下保温60min，酶活基本保持稳定，在50°C和65°C下 保温60min后，酶活均保持在50%以上；经pH4. 0至pHll. 0的缓冲液在37°C下处理60min 后，均保持50%以上的活性；同时还可以水解α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、丁酸-4-硝基苯 酯。
[0022] 本发明通过PCR方法克隆了 SGNH家族酯酶EstDl的编码基因 EstDl，其全长 648bp，起始密码为 ATG，终止密码为 TAG。经BLAST 在 GeneBank (http: //www. Ncbi. Nlm. Nih. gov)数据库进行比对分析，该SGNH家族酯酶的基因 EstDl编码的氨基酸序列与GeneBank 中 Alicyclobacillus hesperidum 来源的 GDSL 家族脂酶（WP_006447773)具有 98 % 序 列一致性（2013-5-29);与 Alicyclobacillus acidocaldarius 来源的 GDSL 家族脂酶 (WP_012811841)具有68%的序列一致性（2013-5-26)，但二者至今均未被鉴定。
[0023] 本发明的SGNH家族醋酶基因来源于嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)，通过在大肠杆菌中进行异源表 达，用IPTG诱导就可以获得大量可溶性蛋白，经Nickel-NTA Agarose纯化即可获得较纯蛋 白。虽然与已申请专利的枯草芽孢杆菌SHS0133来源的头孢菌素乙酰水解酶（光岛健二， 龙本明生，八木兹雄，园山高康，1998,由头孢菌素乙酰水解酶基因编码的酶的制备方法， CN98103932)相比该酶对7-ACA脱乙酰化的活力较低，应用到工业上还需要进一步的发酵 工艺上的优化，如使用大规模培养装置，在适当的培养条件下培养本发明中的重组菌株增 加该酶的产量。但培养周期短、易于获得纯蛋白，并具有优良的酶学性质，而且除头孢菌素 乙酰水解酶外，用于水解7-ACA的其他酶类鲜被报道，因此本发明为工业上生产β -内酰胺 类药物提供了新思路。此外，由于SGNH家族酯酶的成员被定性的很少，所以该家族还没有 被完全了解，本发明对了解微生物来源的SGNH酯酶家族的特性具有重要意义。
【附图说明】
[0024] 图1 :在大肠杆菌中表达的重组SGNH家族酯酶EstDl的SDS-PAGE分析，其中，M : 低分子量蛋白质Marker ;1 :BL21(DE3)/pEASY?-E2诱导后表达的总蛋白；2 :BL21(DE3)/ EstDl诱导后表达的总蛋白；3 :纯化的重组SGNH家族酯酶EstDl。
[0025] 图2 :重组SGNH家族酯酶EstDl的最适温度示意图。
[0026] 图3 :重组SGNH家族酯酶EstDl的热稳定性示意图。
[0027] 图4 :重组SGNH家族酯酶EstDl的最适pH示意图。
[0028] 图5 :重组SGNH家族酯酶EstDl的pH稳定性示意图。
[0029] 图6 :lmM金属离子及部分化学试剂对重组SGNH家族酯酶EstDl活性的影响。
[0030] 图7 :重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC2为底物时，1/[S]与1/V的关系。
[0031] 图8 :重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC4为底物时，1/[S]与1/V的关系。
[0032] 图9 :重组SGNH家族酯酶EstDl以α -乙酸萘酯为底物时，1/[S]与1/V的关系。
[0033] 图10 :重组SGNH家族酯酶EstDl以β-乙酸萘酯为底物时，1/[S]与1/V的关系。
[0034] 图11 :重组SGNH家族酯酶EstDl对7-ACA降解产物的质谱图，其中，（a)为实验 组；(b)为对照组。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0036] 实验材料和试剂
[0037] 1、菌株及载体：
[0038] 嗜热脂环芽抱杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)为实验室筛选菌株；（该菌株与授权公告号为CN102787107B中涉及的嗜热脂环 酸芽孢杆菌为同一菌株）。
[0039] 大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3)购于 Novagen 公司；
[0040] 表达载体pEASYTM-E2购于全式金生物有限（TransGen)公司。
[0041] 2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；其它试剂均购自国 药集团。坚固蓝Β、α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、丁酸-4-硝基 苯酯（pNPC4)、7-氨基头孢烷酸（7-ACA)购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。
[0042] 3、培养基：
[0043] LB培养基：胰蛋白胨1 %，酵母粉0. 5%，氯化钠1 %，pH自然（约为7. 0)。固体培 养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0044] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0045] 实施例1 :SGNH家族酯酶基因 EstDl的克隆
[0046] 提取嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I基因组DNA :CTAB裂解法，具体步骤为：将液体培养 12h的新鲜菌液离心取菌体，加入800 μ L溶液I (20mM Tris, ρΗ8· 0, 2mM Na2-EDTA,终浓度 20mg/mL溶菌酶），37°C保温30min，加100 μ L 10% SDS上下颠倒混勾，再加10 μ L 10mg/mL 的蛋白酶K，37°C保温30min，加150 yL 5M NaCl和150 yL 10% CTAB溶液上下颠倒混匀， 65°〇保温201^11，分装成600以1^每管，再加入600以1^酚/氯仿/异丙醇（体积比25 :24:1) 进行抽提，在4°C下12000rpm离心10min，取上清300 μ L于300 μ L氯仿/异丙醇（体积比 24 :1)中再次抽提除去杂蛋白，4°C下12000rpm离心10min，再取上清并加入2倍体积无水 乙醇和1/10体积的ρΗ5· 23M NaAc，_70°C沉淀lh，4°C下13500rpm离心20min，弃上清，再 用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20°C备用。
[0047] 根据嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I全基因组测序及基因注释分析SGNH家族酯酶基因 EstDl并设计表达引物EstF和EstR :
[0048] 上游引物 EstF: 5 ' -CGCTTAGAAGCAAACAGCAAAC-3 ' ；
[0049] 下游引物EstR:5'-GCATTGCGAGCCAATTTCGC-3'；
[0050] 上游引物 T7:5 ' -TAATACGACTCACTATAGGG-3 ' ；
[0051] 下游引物 T7ter:5' -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' ；为 PCR 检测阳性克隆子引物。
[0052] 以嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为： 95°C预变性5min ;然后95°C变性30sec ;57°C退火（每个循环降0.5°C )30sec ;72°C延伸 Imin ;30个循环后95°C变性30sec ;43°C退火30sec ;72°C延伸Imin ;7个循环后72°C保温 10min。取4μLPCR产物与lμL表达载体pEASYTM-E2进行T-A连接，25°C连接10min，连接 产物全部转入Trans-I感受态细胞中，37 °C温箱过夜培养。从转化板上挑取几株单菌落，使 用引物EstF和T7ter进行菌落PCR扩增筛选正向连接的阳性克隆子。对菌落PCR验证正确 的克隆子采用T7和T7ter引物测序，由北京华大基因测序完成。测序正确的阳性克隆子接 种提取质粒 pEASY?-E2-EstDl，取 0· IuL pEASY?-E2-EstDl 质粒转化到 IOOyL BL21(DE3) 表达感受态细胞中，涂布于含Amplr的LB固体平板上，37°C温箱过夜培养，从转化板上挑取 几株单菌落，进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株BL21 (DE3) / EstDl0
[0053] 实施例2 :重组SGNH家族酯酶EstDl的制备
[0054] 取含有重组质粒pEASY?-E2-EstDl的BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY?-E2的空 质粒BL21 (DE3)菌株，以0. 1 %的接种量接种于LB (含100 μ g/mL Amp1O培养液中，37°C快 速振荡16h。然后将此活化的菌液以1 %接种量接种到新鲜的LB(含100 μ g/mL Amp1O培 养液中，快速振荡培养约2 - 3h (OD6c?达到0. 4-0. 6)后，加入终浓度0. 7mM的IPTG进行诱 导，于20°C继续振荡培养约20h。12000rpm离心10min，收集菌体。用适量的pH7. 0柠檬 酸-Na2HPO4缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经 12, OOOrpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结 果（图1)表明，重组SGNH家族酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯 化后为单一条带。
[0055] 实施例3 :纯化的重组SGNH家族酯酶EstDl的性质测定
[0056] (1)重组SGNH家族酯酶EstDl的活性分析
[0057] 纯化的重组SGNH家族醋酶EstDl采用对硝基苯酷法（p-nitrophenol)进行活性 测定：取4只1.5mL离心管，分别编号1、2、3、4,其中1、2、3号试管为实验组（3个重复），4 号为对照组。向四只离心管中分别加入420 μ L pH8. 0的50mM Tris-HCL缓冲液和30 μ L 1〇禮底物口即(：2,37°〇预热51^11后，每隔1〇8分别向1、2和3号管中加入5(^1^稀释适当 倍数的酶液，4号对照管加等量水，37°〇反应511^11后每隔10 8向1、2、3实验管中加入501^ 0.1 M Na2CO3终止反应，4号对照管同样加入等体积终止液后立即将4只离心管插到冰上，酶 标仪405nm读取OD值。1个酶活单位（U/mL)定义为一定条件下，每分钟分解底物卩即(： 2生 成I μ m〇L对硝基苯酚所需要的酶量。以PNPC4为底物测定方法及酶活力计算同pNPC 2。
[0058] (2)重组SGNH家族酯酶EstDl的最适温度和热稳定性的测定
[0059] 酶的最适温度测定：将SGNH家族酯酶EstDl在50mM pH8. 5的Tris-HCL缓冲液 条件下，分别在 20°〇、30°〇、37°〇、40°〇、50°〇、60°〇、65°〇、70°〇、80°〇、90°〇下进行酶促反应。 温度稳定性的测定：将SGNH家族酯酶EstDl在50mM pH8. 5的Tris-HCL缓冲液条件下，在 37°C、50°C和65°C三个温度下分别保温5min、10min、20min、30min和60min后进行酶促反 应，以未处理的酶液作为对照。以PNPC 2为底物，反应5min，测定纯化SGNH家族酯酶EstDl 的酶学性质。结果表明：EstDl的最适温度65°C (图2);在37°C下保温60min，基本保持稳 定，在50°C和65°C下保温60min后，酶活均保持在50%以上（图3)，说 明重组SGNH家族酯 酶EstDl最有很强的热稳定性。
[0060] (3)重组SGNH家族酯酶EstDl的最适pH和pH稳定性的测定
[0061] 酶的最适pH的测定：将SGNH家族酯酶EstDl在37°C，分别在0.1 M柠檬酸-Na2HPO4 缓冲液不同 pH6. 0、7. 0、8. 0 ;50mM Tris-HCL 缓冲液不同 pH8. 0、8. 5、9. 0、9. 5 ;50mM 硼 砂-NaOH缓冲液不同pH9. 5、10. 0、11. 0、12. 0条件下进行酶促反应。pH稳定性的测定：将 SGNH 家族酯酶 EstDl 在 37°C，ρΗ2· 0、3· 0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0 的 0· IM 柠檬酸-Na2HPO4 缓冲液；ρΗ8· 0、8· 5、9· 0、9· 5 的 50mM Tris-HCL 缓冲液；ρΗ9· 5、10· 0、11· 0、12· 0 的 50mM 硼 砂-NaOH缓冲液中耐受60min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以PNPC2为底 物，反应5min，测定纯化SGNH家族酯酶EstDl的酶学性质。结果表明：EstDl的最适pH为 8. 5 (图4);经pH4. 0至pHll. 0的缓冲液在37°C下处理60min后，均保持50%以上的活性 (图5)，说明重组SGNH家族酯酶EstDl具有很好的pH稳定性。
[0062] (4)不同金属离子及化学试剂对重组SGNH家族酯酶EstDl活性的影响
[0063] 在酶促反应体系中加入终浓度ImM的金属离子及化学试剂，研宄其对酶活性的影 响。以PNPC 2为底物，在65°C，pH8. 5条件下，反应5min，测定纯化SGNH家族酯酶EstDl的 酶活力。结果表明，终浓度ImM的金属离子Hg2+、Mg 2+和Cu 2+及化学试剂SDS、Tween-80、 β -巯基乙醇对酶有较强的激活作用，K+、Al3+、Ni2+、EDTA等有抑制作用（图6)。
[0064] (5)重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC2S底物时的动力学参数的测定
[0065] 在65°C，pH8. 5条件下，以PNPC2为底物，依次在酶促反应的l-12min内终止反应 并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时 间为一级反应时间。用0.1 mM-l. ImM的PNPC2为底物（[S])，在65°C，pH8. 5和一级反应时 间下测定酶活，计算出相应的反应速度（V )，如图7,根据Lineweaver-Burk方法测定Km和 Vmax。经测定，在65°C，pH8. 5条件下，重组SGNH家族酯酶EstDl对pNPCj^J Km和Vmax分 别为 0· 3188mM 和 144. 9275U/mg。
[0066] (6)重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC4为底物时的动力学参数的测定
[0067] 在65°C，ρΗ8· 5条件下，重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC4为底物时的动力学参 数的测定方法同5所述，结果如图8,根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定， 在65°C，pH8. 5条件下，重组SGNH家族酯酶EstDl对pNPCj^J Km和Vmax分别为0. 1525mM 和 2.6709U/mg。
[0068] (7)重组SGNH家族酯酶EstDl以α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯为底物时的动力学 参数的测定
[0069] 在37°C，ρΗ7. 3条件下（由于底物α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯在高温高碱条件 下不稳定），重组SGNH家族酯酶EstDl以α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯为底物时的动力学 参数的测定方法同5所述，结果如图9 (该酶对α -乙酸萘酯的双倒数曲线）、图10 (该酶对 β -乙酸萘醋的双倒数曲线），根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定，在37°C， pH7. 3条件下，重组SGNH家族酯酶EstDl对α -乙酸萘酯的Km和Vmax分别为0. 4417mM和 83. 3333U/mg ;对 β -乙酸萘酯的 Km 和 Vmax 分别为 0. 2525mM 和 101. 0101U/mg
[0070] 实施例4 :重组SGNH家族酯酶EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应用
[0071] 取100 μ L纯化的SGNH家族酯酶EstDl加入到含有浓度为4. 5g/L7-ACA的 l/15mol/L、pH7. 3的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400 yL，25°C反应10min后，质谱检测到反应液中有分子量为230 (正谱图加 Na+，显示为253)的产物生成， 而对照组（用缓冲液代替酶液）没有此物质产生（图11)，而脱乙酰化的7-ACA(D-7-ACA) 分子量为230. 24,表明该酶对7-ACA具有脱乙酰化作用。进一步进行定量实验，取反应液 100 μ L严格按照乙酸试剂盒（Megazyme International Ireland 2011)说明书进行定量分 析，测得IOmin内有0· 18g/L的乙酸释放，即重组SGNH家族酯酶EstDl对7-ACA的比活力 为 2.706U/mg。
【主权项】
1. 一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，其特征在于：其氨基酸序列为以下序列之 (1) 如SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列； (2) SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸的序 列。2. -种编码权利要求1所述的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因EstDL其特征 在于：其核苷酸序列为以下序列之一： (1) 如SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列； (2) SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序 列； (3) 在严格条件下，与（1)或（2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列； (4) 由于遗传密码子的简并性区别于（1)、（2)、（3)的核苷酸序列的核苷酸序列。3. -种重组载体，其特征在于：其含权利要求2所述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶 EstDl的基因EstDl的完整编码阅读框序列。4. 根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的空白载体选自 pEASY?-E2〇5. -种重组菌株，其特征在于：其含权利要求2所述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶 EstDl的基因EstDl或权利要求3或4所述的重组载体。6. 根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株的受体菌为大肠杆菌、 酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。7. 根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于：，所述重组菌株的受体菌为大肠杆菌 EscherichiacoliBL21(DE3)〇8. 利用权利要求5或6或7所述的重组菌株生产碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的 方法，其特征在于：培养发酵重组菌株，诱导SGNH家族酯酶EstDl表达，收集菌体，分离纯化 得到SGNH家族酯酶EstDl。9. 权利要求1所述的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：具体应用时，按以下方法进行：取 100yL纯化的SGNH家族酯酶EstDl加入到含有浓度为4. 5g/L7-ACA的l/15mol/L、pH7. 3 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400yL，25°C反应，对7-ACA进行降解。
【专利摘要】本发明公开了一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1，其氨基酸序列为以下序列之一：(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸的序列。本发明还公开了编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因EstD1，其核苷酸序列为以下序列之一：(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列；(3)在严格条件下，与(1)或(2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(4)由于遗传密码子的简并性区别于(1)、(2)、(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1可用于7-ACA的脱乙酰化。
【IPC分类】C12N15/70, C12N1/19, C12N1/21, C12P35/06, C12N15/74, C12N15/81, C12R1/19, C12N15/75, C12N9/14, C12N15/55
【公开号】CN104894081
【申请号】CN201510181731
【发明人】丁俊美, 于婷婷, 黄遵锡, 李俊俊, 慕跃林, 杨云娟
【申请人】云南师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月15日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，及其编码基因，以及在7-ACA脱 乙酰化中的应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] SGNH家族酯酶（esterase, EC 3. I. I. 1)是一类具有广泛底物特异性的水解酶，包 含脂肪酶、蛋白酶、硫酯酶、芳香酯酶、溶血磷脂酶、碳水化合物酯酶、酰基转移酶活性。该 家族大约在1995年被鉴定，但是其成员仍然很少被定性，它们不同于大部分含有典型的 GxSxG的保守序列的α/β水解酶超家族酯酶，而是含有独特的GDSL的保守序列，是一类 新家族的醋酶。⑶SL家族的醋酶含有5段保守序列区（five consensus sequence blocks I-V)，在5段保守序列区中含有4个较保守的催化位点Ser，Gly，ASn和His，因此又可以分 为SGNH亚家族酯酶。SGNH家族酯酶参与细菌毒力，植物发育和形态发生以及植物防御机制 (Asler IL, et al.，Chembiochem. 2010, 11:2158 - 2167)，本发明的醋酶 EstDl 属于微生物 来源的⑶SL酯酶家族中SGNH亚家族酯酶。
[0003] 脱乙酰化的头孢菌素是工业上合成β-内酰胺类抗生素的重要原料，而脱乙酰化 的头孢菌素通常由头孢菌素 C和7-ACA经化学途径或酶途径脱乙酰化作用得到，酶法因其 反应较温和，产量较高而且伴有较少的副反应而得到重视（Irene Martinez-Martinez, et al.，Analytical Biochemistry. 2007, 369:210 - 217)。因此寻找能够将头抱菌素高效脱乙 酰化的酯酶具有重要的工业价值。
[0004] 然而，天然菌株发酵周期长，产酶量低，纯化困难，生产成本高，难以大量生产，限 制了其推广应用。利用分子生物学手段构建高效生物反应器，可以提高SGNH家族酯酶的表 达量，实现其大规模工业化生产。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明提供了一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，及其编 码基因，以及含有该基因的重组表达载体、重组菌株，以及EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应 用。本发明从嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I基因组中克隆SGNH家族酯酶基因 EstDl，与表达载 体pEASY?-E2连接后，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达并对EstDl酶学性质及其对 7-ACA脱乙酰化进行了初步研宄，本发明对了解微生物来源的SGNH酯酶家族的特性具有重 要意义。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，其氨基酸序列为以下序列之一：
[0008] (1)如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
[0009] (2) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸 的序列。
[0010] 一种编码上述碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl，其核苷酸序列为以 下序列之一：
[0011] ⑴如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；
[0012] (2) SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸 的序列；
[0013] (3)在严格条件下，与（1)或（2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
[0014] (4)由于遗传密码子的简并性区别于（1)、（2)、（3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
[0015] 一种重组载体，其含上述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl的 完整编码阅读框序列。
[0016] 上述重组载体，载体优选pEASY?-E2。
[0017] 一种重组菌株，其含上述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因 EstDl或 上述重组载体。
[0018] 上述重组菌株的受体菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)。受体菌内含有上述的重组载体，编码碱性热稳定SGNH家 族酯酶EstDl的核苷酸序列被可操作地连接于受体细胞中引起碱性热稳定SGNH家族酯酶 EstDl充分表达的启动子，从而赋予了受体菌产生碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的能力。
[0019] 一种利用上述重组菌株生产碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的方法：培养发酵重 组菌株，诱导SGNH家族酯酶EstDl表达，收集菌体，分离纯化得到SGNH家族酯酶EstDl。
[0020] 上述碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应用。具体应用时， 按以下方法进行：取100 μ L纯化的SGNH家族酯酶EstDl加入到含有浓度为4. 5g/L7-ACA 的l/15mol/L、pH7. 3的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400 yL，25°C反 应，对7-ACA进行降解。
[0021] 本发明的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl可得自嗜热脂环芽孢杆菌 (thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504) 〇 本发明的 SGNH 家族酯酶EstDl总共含有215个氨基酸，理论分子量为25. 31kDa，理论等电点为6. 68。以 乙酸-4-硝基苯酯（PNPC2)为底物：最适温度65°C ;最适pH 8. 5 ;终浓度ImM的金属离子 Hg2+、Mg2+和Cu 2+及化学试剂SDS、TWeen-80、β -巯基乙醇对酶有较强的激活作用，K +、A13+、 Ni2+、EDTA等对酶有抑制作用；在37°C下保温60min，酶活基本保持稳定，在50°C和65°C下 保温60min后，酶活均保持在50%以上；经pH4. 0至pHll. 0的缓冲液在37°C下处理60min 后，均保持50%以上的活性；同时还可以水解α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、丁酸-4-硝基苯 酯。
[0022] 本发明通过PCR方法克隆了 SGNH家族酯酶EstDl的编码基因 EstDl，其全长 648bp，起始密码为 ATG，终止密码为 TAG。经BLAST 在 GeneBank (http: //www. Ncbi. Nlm. Nih. gov)数据库进行比对分析，该SGNH家族酯酶的基因 EstDl编码的氨基酸序列与GeneBank 中 Alicyclobacillus hesperidum 来源的 GDSL 家族脂酶（WP_006447773)具有 98 % 序 列一致性（2013-5-29);与 Alicyclobacillus acidocaldarius 来源的 GDSL 家族脂酶 (WP_012811841)具有68%的序列一致性（2013-5-26)，但二者至今均未被鉴定。
[0023] 本发明的SGNH家族醋酶基因来源于嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)，通过在大肠杆菌中进行异源表 达，用IPTG诱导就可以获得大量可溶性蛋白，经Nickel-NTA Agarose纯化即可获得较纯蛋 白。虽然与已申请专利的枯草芽孢杆菌SHS0133来源的头孢菌素乙酰水解酶（光岛健二， 龙本明生，八木兹雄，园山高康，1998,由头孢菌素乙酰水解酶基因编码的酶的制备方法， CN98103932)相比该酶对7-ACA脱乙酰化的活力较低，应用到工业上还需要进一步的发酵 工艺上的优化，如使用大规模培养装置，在适当的培养条件下培养本发明中的重组菌株增 加该酶的产量。但培养周期短、易于获得纯蛋白，并具有优良的酶学性质，而且除头孢菌素 乙酰水解酶外，用于水解7-ACA的其他酶类鲜被报道，因此本发明为工业上生产β -内酰胺 类药物提供了新思路。此外，由于SGNH家族酯酶的成员被定性的很少，所以该家族还没有 被完全了解，本发明对了解微生物来源的SGNH酯酶家族的特性具有重要意义。
【附图说明】
[0024] 图1 :在大肠杆菌中表达的重组SGNH家族酯酶EstDl的SDS-PAGE分析，其中，M : 低分子量蛋白质Marker ;1 :BL21(DE3)/pEASY?-E2诱导后表达的总蛋白；2 :BL21(DE3)/ EstDl诱导后表达的总蛋白；3 :纯化的重组SGNH家族酯酶EstDl。
[0025] 图2 :重组SGNH家族酯酶EstDl的最适温度示意图。
[0026] 图3 :重组SGNH家族酯酶EstDl的热稳定性示意图。
[0027] 图4 :重组SGNH家族酯酶EstDl的最适pH示意图。
[0028] 图5 :重组SGNH家族酯酶EstDl的pH稳定性示意图。
[0029] 图6 :lmM金属离子及部分化学试剂对重组SGNH家族酯酶EstDl活性的影响。
[0030] 图7 :重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC2为底物时，1/[S]与1/V的关系。
[0031] 图8 :重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC4为底物时，1/[S]与1/V的关系。
[0032] 图9 :重组SGNH家族酯酶EstDl以α -乙酸萘酯为底物时，1/[S]与1/V的关系。
[0033] 图10 :重组SGNH家族酯酶EstDl以β-乙酸萘酯为底物时，1/[S]与1/V的关系。
[0034] 图11 :重组SGNH家族酯酶EstDl对7-ACA降解产物的质谱图，其中，（a)为实验 组；(b)为对照组。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0036] 实验材料和试剂
[0037] 1、菌株及载体：
[0038] 嗜热脂环芽抱杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)为实验室筛选菌株；（该菌株与授权公告号为CN102787107B中涉及的嗜热脂环 酸芽孢杆菌为同一菌株）。
[0039] 大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3)购于 Novagen 公司；
[0040] 表达载体pEASYTM-E2购于全式金生物有限（TransGen)公司。
[0041] 2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；其它试剂均购自国 药集团。坚固蓝Β、α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、丁酸-4-硝基 苯酯（pNPC4)、7-氨基头孢烷酸（7-ACA)购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。
[0042] 3、培养基：
[0043] LB培养基：胰蛋白胨1 %，酵母粉0. 5%，氯化钠1 %，pH自然（约为7. 0)。固体培 养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0044] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0045] 实施例1 :SGNH家族酯酶基因 EstDl的克隆
[0046] 提取嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I基因组DNA :CTAB裂解法，具体步骤为：将液体培养 12h的新鲜菌液离心取菌体，加入800 μ L溶液I (20mM Tris, ρΗ8· 0, 2mM Na2-EDTA,终浓度 20mg/mL溶菌酶），37°C保温30min，加100 μ L 10% SDS上下颠倒混勾，再加10 μ L 10mg/mL 的蛋白酶K，37°C保温30min，加150 yL 5M NaCl和150 yL 10% CTAB溶液上下颠倒混匀， 65°〇保温201^11，分装成600以1^每管，再加入600以1^酚/氯仿/异丙醇（体积比25 :24:1) 进行抽提，在4°C下12000rpm离心10min，取上清300 μ L于300 μ L氯仿/异丙醇（体积比 24 :1)中再次抽提除去杂蛋白，4°C下12000rpm离心10min，再取上清并加入2倍体积无水 乙醇和1/10体积的ρΗ5· 23M NaAc，_70°C沉淀lh，4°C下13500rpm离心20min，弃上清，再 用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20°C备用。
[0047] 根据嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I全基因组测序及基因注释分析SGNH家族酯酶基因 EstDl并设计表达引物EstF和EstR :
[0048] 上游引物 EstF: 5 ' -CGCTTAGAAGCAAACAGCAAAC-3 ' ；
[0049] 下游引物EstR:5'-GCATTGCGAGCCAATTTCGC-3'；
[0050] 上游引物 T7:5 ' -TAATACGACTCACTATAGGG-3 ' ；
[0051] 下游引物 T7ter:5' -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' ；为 PCR 检测阳性克隆子引物。
[0052] 以嗜热脂环酸芽孢杆菌D-I基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为： 95°C预变性5min ;然后95°C变性30sec ;57°C退火（每个循环降0.5°C )30sec ;72°C延伸 Imin ;30个循环后95°C变性30sec ;43°C退火30sec ;72°C延伸Imin ;7个循环后72°C保温 10min。取4μLPCR产物与lμL表达载体pEASYTM-E2进行T-A连接，25°C连接10min，连接 产物全部转入Trans-I感受态细胞中，37 °C温箱过夜培养。从转化板上挑取几株单菌落，使 用引物EstF和T7ter进行菌落PCR扩增筛选正向连接的阳性克隆子。对菌落PCR验证正确 的克隆子采用T7和T7ter引物测序，由北京华大基因测序完成。测序正确的阳性克隆子接 种提取质粒 pEASY?-E2-EstDl，取 0· IuL pEASY?-E2-EstDl 质粒转化到 IOOyL BL21(DE3) 表达感受态细胞中，涂布于含Amplr的LB固体平板上，37°C温箱过夜培养，从转化板上挑取 几株单菌落，进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株BL21 (DE3) / EstDl0
[0053] 实施例2 :重组SGNH家族酯酶EstDl的制备
[0054] 取含有重组质粒pEASY?-E2-EstDl的BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY?-E2的空 质粒BL21 (DE3)菌株，以0. 1 %的接种量接种于LB (含100 μ g/mL Amp1O培养液中，37°C快 速振荡16h。然后将此活化的菌液以1 %接种量接种到新鲜的LB(含100 μ g/mL Amp1O培 养液中，快速振荡培养约2 - 3h (OD6c?达到0. 4-0. 6)后，加入终浓度0. 7mM的IPTG进行诱 导，于20°C继续振荡培养约20h。12000rpm离心10min，收集菌体。用适量的pH7. 0柠檬 酸-Na2HPO4缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经 12, OOOrpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结 果（图1)表明，重组SGNH家族酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯 化后为单一条带。
[0055] 实施例3 :纯化的重组SGNH家族酯酶EstDl的性质测定
[0056] (1)重组SGNH家族酯酶EstDl的活性分析
[0057] 纯化的重组SGNH家族醋酶EstDl采用对硝基苯酷法（p-nitrophenol)进行活性 测定：取4只1.5mL离心管，分别编号1、2、3、4,其中1、2、3号试管为实验组（3个重复），4 号为对照组。向四只离心管中分别加入420 μ L pH8. 0的50mM Tris-HCL缓冲液和30 μ L 1〇禮底物口即(：2,37°〇预热51^11后，每隔1〇8分别向1、2和3号管中加入5(^1^稀释适当 倍数的酶液，4号对照管加等量水，37°〇反应511^11后每隔10 8向1、2、3实验管中加入501^ 0.1 M Na2CO3终止反应，4号对照管同样加入等体积终止液后立即将4只离心管插到冰上，酶 标仪405nm读取OD值。1个酶活单位（U/mL)定义为一定条件下，每分钟分解底物卩即(： 2生 成I μ m〇L对硝基苯酚所需要的酶量。以PNPC4为底物测定方法及酶活力计算同pNPC 2。
[0058] (2)重组SGNH家族酯酶EstDl的最适温度和热稳定性的测定
[0059] 酶的最适温度测定：将SGNH家族酯酶EstDl在50mM pH8. 5的Tris-HCL缓冲液 条件下，分别在 20°〇、30°〇、37°〇、40°〇、50°〇、60°〇、65°〇、70°〇、80°〇、90°〇下进行酶促反应。 温度稳定性的测定：将SGNH家族酯酶EstDl在50mM pH8. 5的Tris-HCL缓冲液条件下，在 37°C、50°C和65°C三个温度下分别保温5min、10min、20min、30min和60min后进行酶促反 应，以未处理的酶液作为对照。以PNPC 2为底物，反应5min，测定纯化SGNH家族酯酶EstDl 的酶学性质。结果表明：EstDl的最适温度65°C (图2);在37°C下保温60min，基本保持稳 定，在50°C和65°C下保温60min后，酶活均保持在50%以上（图3)，说 明重组SGNH家族酯 酶EstDl最有很强的热稳定性。
[0060] (3)重组SGNH家族酯酶EstDl的最适pH和pH稳定性的测定
[0061] 酶的最适pH的测定：将SGNH家族酯酶EstDl在37°C，分别在0.1 M柠檬酸-Na2HPO4 缓冲液不同 pH6. 0、7. 0、8. 0 ;50mM Tris-HCL 缓冲液不同 pH8. 0、8. 5、9. 0、9. 5 ;50mM 硼 砂-NaOH缓冲液不同pH9. 5、10. 0、11. 0、12. 0条件下进行酶促反应。pH稳定性的测定：将 SGNH 家族酯酶 EstDl 在 37°C，ρΗ2· 0、3· 0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0 的 0· IM 柠檬酸-Na2HPO4 缓冲液；ρΗ8· 0、8· 5、9· 0、9· 5 的 50mM Tris-HCL 缓冲液；ρΗ9· 5、10· 0、11· 0、12· 0 的 50mM 硼 砂-NaOH缓冲液中耐受60min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以PNPC2为底 物，反应5min，测定纯化SGNH家族酯酶EstDl的酶学性质。结果表明：EstDl的最适pH为 8. 5 (图4);经pH4. 0至pHll. 0的缓冲液在37°C下处理60min后，均保持50%以上的活性 (图5)，说明重组SGNH家族酯酶EstDl具有很好的pH稳定性。
[0062] (4)不同金属离子及化学试剂对重组SGNH家族酯酶EstDl活性的影响
[0063] 在酶促反应体系中加入终浓度ImM的金属离子及化学试剂，研宄其对酶活性的影 响。以PNPC 2为底物，在65°C，pH8. 5条件下，反应5min，测定纯化SGNH家族酯酶EstDl的 酶活力。结果表明，终浓度ImM的金属离子Hg2+、Mg 2+和Cu 2+及化学试剂SDS、Tween-80、 β -巯基乙醇对酶有较强的激活作用，K+、Al3+、Ni2+、EDTA等有抑制作用（图6)。
[0064] (5)重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC2S底物时的动力学参数的测定
[0065] 在65°C，pH8. 5条件下，以PNPC2为底物，依次在酶促反应的l-12min内终止反应 并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时 间为一级反应时间。用0.1 mM-l. ImM的PNPC2为底物（[S])，在65°C，pH8. 5和一级反应时 间下测定酶活，计算出相应的反应速度（V )，如图7,根据Lineweaver-Burk方法测定Km和 Vmax。经测定，在65°C，pH8. 5条件下，重组SGNH家族酯酶EstDl对pNPCj^J Km和Vmax分 别为 0· 3188mM 和 144. 9275U/mg。
[0066] (6)重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC4为底物时的动力学参数的测定
[0067] 在65°C，ρΗ8· 5条件下，重组SGNH家族酯酶EstDl以PNPC4为底物时的动力学参 数的测定方法同5所述，结果如图8,根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定， 在65°C，pH8. 5条件下，重组SGNH家族酯酶EstDl对pNPCj^J Km和Vmax分别为0. 1525mM 和 2.6709U/mg。
[0068] (7)重组SGNH家族酯酶EstDl以α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯为底物时的动力学 参数的测定
[0069] 在37°C，ρΗ7. 3条件下（由于底物α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯在高温高碱条件 下不稳定），重组SGNH家族酯酶EstDl以α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯为底物时的动力学 参数的测定方法同5所述，结果如图9 (该酶对α -乙酸萘酯的双倒数曲线）、图10 (该酶对 β -乙酸萘醋的双倒数曲线），根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定，在37°C， pH7. 3条件下，重组SGNH家族酯酶EstDl对α -乙酸萘酯的Km和Vmax分别为0. 4417mM和 83. 3333U/mg ;对 β -乙酸萘酯的 Km 和 Vmax 分别为 0. 2525mM 和 101. 0101U/mg
[0070] 实施例4 :重组SGNH家族酯酶EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应用
[0071] 取100 μ L纯化的SGNH家族酯酶EstDl加入到含有浓度为4. 5g/L7-ACA的 l/15mol/L、pH7. 3的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400 yL，25°C反应10min后，质谱检测到反应液中有分子量为230 (正谱图加 Na+，显示为253)的产物生成， 而对照组（用缓冲液代替酶液）没有此物质产生（图11)，而脱乙酰化的7-ACA(D-7-ACA) 分子量为230. 24,表明该酶对7-ACA具有脱乙酰化作用。进一步进行定量实验，取反应液 100 μ L严格按照乙酸试剂盒（Megazyme International Ireland 2011)说明书进行定量分 析，测得IOmin内有0· 18g/L的乙酸释放，即重组SGNH家族酯酶EstDl对7-ACA的比活力 为 2.706U/mg。
【主权项】
1. 一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl，其特征在于：其氨基酸序列为以下序列之 (1) 如SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列； (2) SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸的序 列。2. -种编码权利要求1所述的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的基因EstDL其特征 在于：其核苷酸序列为以下序列之一： (1) 如SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列； (2) SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序 列； (3) 在严格条件下，与（1)或（2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列； (4) 由于遗传密码子的简并性区别于（1)、（2)、（3)的核苷酸序列的核苷酸序列。3. -种重组载体，其特征在于：其含权利要求2所述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶 EstDl的基因EstDl的完整编码阅读框序列。4. 根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的空白载体选自 pEASY?-E2〇5. -种重组菌株，其特征在于：其含权利要求2所述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶 EstDl的基因EstDl或权利要求3或4所述的重组载体。6. 根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株的受体菌为大肠杆菌、 酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。7. 根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于：，所述重组菌株的受体菌为大肠杆菌 EscherichiacoliBL21(DE3)〇8. 利用权利要求5或6或7所述的重组菌株生产碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl的 方法，其特征在于：培养发酵重组菌株，诱导SGNH家族酯酶EstDl表达，收集菌体，分离纯化 得到SGNH家族酯酶EstDl。9. 权利要求1所述的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstDl在7-ACA脱乙酰化中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：具体应用时，按以下方法进行：取 100yL纯化的SGNH家族酯酶EstDl加入到含有浓度为4. 5g/L7-ACA的l/15mol/L、pH7. 3 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400yL，25°C反应，对7-ACA进行降解。
【专利摘要】本发明公开了一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1，其氨基酸序列为以下序列之一：(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸的序列。本发明还公开了编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因EstD1，其核苷酸序列为以下序列之一：(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列；(3)在严格条件下，与(1)或(2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(4)由于遗传密码子的简并性区别于(1)、(2)、(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1可用于7-ACA的脱乙酰化。
【IPC分类】C12N15/70, C12N1/19, C12N1/21, C12P35/06, C12N15/74, C12N15/81, C12R1/19, C12N15/75, C12N9/14, C12N15/55
【公开号】CN104894081
【申请号】CN201510181731
【发明人】丁俊美, 于婷婷, 黄遵锡, 李俊俊, 慕跃林, 杨云娟
【申请人】云南师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月15日
最新回复(0)