一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法
一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备 耐热阿魏酸酯酶的方法。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸（ferulic acid，FA)是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，是多种植 物中的一种酚酸，具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特 的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物不能直接吸收这类阿魏酸， 必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。另一方面，在植物细胞壁中，阿魏酸或二聚体 阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，增强阿拉伯木聚糖链的 强度，但从空间上限制了动物和微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。
[0003] 阿魏酸醋酶（EC 3. I. 1. 73，feruloyl esterase)又称肉桂酸醋酶或肉桂酰醋酶， 可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来。它能与其他水解酶如木聚糖 酶、纤维素酶和木质素酶相互联合作用，较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素。因此， 阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的 应用潜能。
[0004] 自首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但 主要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等，而且 它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生长、酶产量以 及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产。故寻求以细菌为发 酵菌株生产阿魏酸酯酶具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活 化、种子液培养、三角瓶发酵、酶制剂制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶制剂，所得到的 阿魏酸酯酶耐热性好、PH适用范围宽、酶活产量高。
[0006] 所述的地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)DBM12,已于2014年1月2日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC (地址为：中国北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No. 8672。
[0007] 所述深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤1，一级种子的制备：首先将液体种子培养基在三角瓶中装液30mL-50mL，调 节pH至7. 0,经121°C灭菌20min，冷却后，按照体积比为4-6v/v%的接种量接种菌株，于 40-45°C的摇床上培养18-24h，得到一级种子液；
[0009] 步骤2,二级种子的制备：按照6-10v/v %的接种量将培养好的一级种子液接种到 二级种子培养基中，32-37°C培养18-24h，得到二级种子液；
[0010] 步骤3,自动发酵罐发酵工艺：将发酵培养基装入发酵罐中，121°C下灭菌25min， 将步骤2所得二级种子液倒入罐体，开始发酵培养，发酵罐罐压0. 05Mpa，发酵开始到发 酵24h，发酵温度控制在40-45°C，通气量为3L/mm，搅拌转速150r/min，发酵培养基初始 pH7. 0。发酵24-48h，发酵温度提高到45-50°C，通气量增加到4L/mm，搅拌转速维持150r/ min，发酵48h时，向发酵液中添加发酵促进剂15mL，发酵至60h时，向发酵液中添加营养液 200mL，发酵48h-72h，发酵温度降为35-40°C，通风量降至3L/mm，发酵至72h，发酵罐放出一 半体积发酵液，然后添加补料培养基和发酵促进剂，35-40°C条件下继续发酵36h后终止发 酵；
[0011] 步骤4,酶制剂的制备：将步骤3所得发酵液在4°C、8000r/min、离心20min，所得 上清进行超滤浓缩，向浓缩后的粗酶液中添加2-3wt%可溶性淀粉，搅拌，再添加8-12wt% 麦芽糊精，搅拌均匀后喷雾干燥，即得阿魏酸酯酶制剂。
[0012] 作为上述发明的进一步改进，步骤1中一级种子培养基配方为：牛肉膏0. 4g、蛋白 胨 0· 8g、酵母粉 lg、NaCl 0· 5g、KH2P04 0· lg、MgS04 ·7Η20 0· 04、蒸馏水 100mL、pH7. 0,121°C 灭菌20min。
[0013] 作为上述发明的进一步改进，步骤2中二级种子培养基配方为：豆饼粉lg，玉米粉 2g，葡萄糖 2. 5g，蛋白胨 lg，硫酸铵 0· 2g，MgSO4 · 7H20 0· 015g，KH2PO4 0· 008g，定容 100ml， pH 7· 0-7. 4,121°C 灭菌 20min。
[0014] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中发酵培养基配方为：豆饼粉10g，玉米粉 20g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，（NH 4)2SO4 5g，KH2PO4 lg，微量元素10mL，泡 敌 O.OOlg，定容至 lOOOmL，调节 pH7.0-7.5，121°C灭菌 15min ;其中，微量元素：CaCl2 2g/ L，MnSO4 · 4H20 0· lg/L，FeSO4 · 7H20 0· 6g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 5g/L，CoCl2 · 6H20 2g/L，NaCl lg/L，CuSO4 2g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5/L。
[0015] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中补料培养基配方为：大豆秸杆粉10g、麸皮 粉20g、玉米皮粉10g、豆腐澄20g，定容至1000mL，121°C灭菌15min。
[0016] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中发酵促进剂配方为：Tween 8010g，阿魏酸 乙醋0. 8g，去离子水100mL，121°C灭菌15min。
[0017] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中营养液配方：尿素20g、鹿糖50g、玉米衆 100mL、胡萝卜衆 500mL、土?浸出液 500mL，121°C灭菌 15min。
[0018] 本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本发明的发酵方法不仅发酵液后 续处理简便、生产成本低廉，而且发酵获得的地衣芽孢杆菌活力在218U/mL以上，与国内外 其他发酵罐规模的阿魏酸酯酶生产方法相比，阿魏酸酯酶总产量和酶活力都达到了较高的 水平，具有极好的工业化应用前景；第二，本发明得到固体阿魏酸酯酶酶制剂稳定性好、适 用范围广，酶制剂在37°C温度下，保存100d，酶活保存在80%以上，阿魏酸酯酶适合在高 温下酶解，在35°C~65°C之间降解酶活较高，相对酶活都在80%以上，酶的最适pH范围在 5. 0-8. 0之间，酶活都在90%以上；第三，本发明所采用的液体发酵工艺简单，环保无毒，原 材料使用豆饼粉、玉米粉、大豆秸杆分、麸皮粉等农副产物，成本低廉，整个发酵过程可控， 不受外部环境条件限制，非常适合工业规模化发酵罐培养生产；第四，本发明的阿魏酸酯酶 固体酶制剂制备工艺简单，酶活高，酶活力可达378U/g，总回收率达到了 81. 5%。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例3中温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响；
[0020] 图2为实施例3中室温条件下湿度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响；
[0021] 图3为实施例3中温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂酶解活性的影响；
[0022] 图4为实施例3中pH对阿魏酸酯酶固体酶制剂酶解活性的影响。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1
[0024] 地衣芽孢杆菌DBM12的筛选方法，包括以下步骤：
[0025] 步骤1，土样采集及处理
[0026] 土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土 样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。
[0027] 取5-10g 土样放入装有20_40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上， 120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80°C水浴加热15-30min，期间每 隔5min中震荡一次。
[0028] 步骤2,富集培养
[0029] 取l_2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-180r/ min转速50-60°C下震荡培养20-24h。然后取l-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10% 的富集培养基二中，继续在160_180r/min转速50-60°C下震荡培养18-20h。
[0030] 富集培养基一：酵母提取物 0· 5g，KH2PO4 0· lg，NH4NO3 0· lg，NaCl 0· lg， MgSO4 · 7H20 0. 25g，微量元素 lmL，阿魏酸乙醋lg，去离子水100mL，调节pH4. 0。
[0031] 富集培养基二：NH4N03 (λ 5g，尿素 (λ lg，KH2PO4 (λ lg，NaCl (λ lg，阿魏酸乙酯 lg， 去离子水100mL，调节pH3. 0。
[0032] 微量元素：EDTA 5g，CaCl2 · 2H20 6g，FeSO4 · 7H20 6g，MnCl2 · 4H20 I. 15g， CoCl2 · 6H20 0· 8g，ZnSO4 · 7H20 0· 7g，CuCl2 · 2H20 0· 3g，H3BO3 0· 3g，（NH4)6Mo7O2 · 4H20 0. 25g，去离子水 1000mL。
[0033] 步骤3,初筛
[0034] 对第二次富集的培养液无 菌水稀释，分别取稀释到10' 10' 10' 10' KT6的稀释 液150-250 μ L涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封 口，将培养皿置于40-45°C培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20°C培养箱中继续 培养6-12h。
[0035] 挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60°C恒温培养24-48h。挑选出 在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化 培养基，于45-50°C培养l-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连 续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜 面保藏培养基中4°C保存，接着进一步复筛。
[0036] 初筛培养基一：蛋白胨 0· 5g，酵母提取物(λ lg，NaNO3 (λ 3g，K2HPO4 (λ lg，KCl 0· 5g，MgSO4 · 7H20 0· 025g，FeSO4 · 7H20 0· 001g，琼脂 2· 5,去离子水 100mL，调节 ρΗ4· 5。
[0037] 初筛培养基二！KH2PO4 0· 2g，（NH4)2SO4 0· 4g，MgSO4 · 7Η20 0· 03g，FeSO4 · 7Η20 0· OOlg，MnSO4 (λ OOlg，ZnCl2 (λ OOlg，琼脂 2. 5g，去离子水 lOOmL，ρΗ4· 0。培养基 121°C、 15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀后，平均倒至3个直径 90mm的培养皿中。
[0038] 阿魏酸乙酯溶液：0. 2g阿魏酸乙酯加到I. 5mL无菌离心管中，再加入500 yLN、 N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0039] 步骤4,复筛
[0040] 将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45 °C恒温培养箱培养 16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为 40-45°C，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10%的接种量接种 到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床 震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50°C，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以 6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。
[0041] 复筛种子培养基：蛋白胨lg、牛肉膏〇· 5g、酵母粉0· 5g、NaCl 0· 5g、K2HP04 0· 02g、 加去离子水至100mL，ρΗ4· 5,121°C灭菌15min。
[0042] 发酵培养基配方：可溶性淀粉0. 5g、蛋白胨lg、牛肉膏0. 5g、NaCl 0. 5g、KH2PO4 0· lg、MgS04 · 7H20 0· 04g、去离子水 100mL，ρΗ4· 5,121°C灭菌 15min。
[0043] 酶活平板检测方法：0. 02mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH4. 5) 100mL， 琼脂粉2. 5g，121°C、15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀 后，平均倒至3个直径90_的培养皿中。琼脂充分凝固后用直径6_的打孔器均匀打孔约 3-10个。将发酵液离心后取上清100 μ L加到孔中，45°C过夜，查看透明圈情况。
[0044] 所得菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24h，菌落圆形，直径2. 4-3. 2mm ;菌 落为白色，不透明，表面较平且干燥，牢固附着培养基，难以挑取。在牛肉膏蛋白胨液体培养 基中静止培养，无沉淀，液体清亮，培养基表面形成白色皱皮膜，表面有颗粒，膜较薄。观察 菌体形态，革兰氏染色阳性，生长过程产生芽孢，孢囊无膨大，无伴孢晶体，菌体杆状，具有 运动性。菌株DBM12具体的形态学及生理生化特征见下表。
[0045] 菌株DBMl2形态学及生理生化特性
[0046]
[0047] 提取本申请菌株DBM12基因组，依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物，其 中正向引物为F:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（如SEQ ID NO. 2所示）；反向引物为R : 5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）。PCR 反应体系为（20 μ L) : CldH2O 12.7yL，10XPCR buffer 2.0yL，dNTP mix(2.5mmol/L)2.0yL，正向引物（ΙΟμ mol/ L) I. 0 μ L，反向引物（10 μ mol/L) I. 0 μ L，Taq FlexiPolymerase (5U/ μ L) 0· 3 μ L，模板 I. 0 μ L。热循环参数94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，循环30 次，72°C延伸10min。用pGM-T载体克隆测序。测得序列如SEQ ID NO. I所示，与从NCBI中 比对获得的相近细菌的16S rDNA序列采用ClustalXl. 83进行多序列比对，显示菌株DBM12 的 16S rDNA核苷酸序列与Bacillus licheniformis(EU162839)的 16S rDNA核苷酸序列同 源性最高，最大相似性（maxident)达到99. 2%。综合DBM12菌株的形态学特征、生理生化 特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株DBM12鉴定为地衣芽孢杆菌Bacillus Iicheniformis0
[0048] 实施例2
[0049] 本实施例说明采用深层液体通风发酵制备耐热阿魏酸酯酶制剂，包括以下步骤：
[0050] 步骤1，一级种子的制备：将液体种子培养基在250mL的三角瓶中装液30mL-50mL， 调节pH至7. 0,经121°C灭菌20min，冷却后，按照体积比为4-6v/v%的接种量接种，于 40-45°C的摇床上培养18-24h，得到一级种子液。
[0051] 一级种子培养基：牛肉膏〇.4g、蛋白胨0.8g、酵母粉lg、NaCl 0.5g、KH2PO4 0. lg、 MgSO4 · 7H20 0· 04、蒸馏水 100mL、pH7. 0,121°C 灭菌 20min。
[0052] 步骤2,二级种子的制备：按照6-10v/v%的接种量接种培养好的一级种子液到二 级种子培养基中，1000 mL三角瓶装100-120mL二级种子培养基。32-37°C培养18-24h。
[0053] 二级种子培养基：豆饼粉lg，玉米粉2g，葡萄糖2. 5g，蛋白胨lg，硫酸按0. 2g， MgSO4 · 7H20 0· 015g，KH2PO4 0· 008g，定容 100ml，pH 7. 0-7. 4,121°C 灭菌 20min。
[0054] 步骤3,15L自动发酵罐发酵工艺：配制8L发酵培养基，装入15L的发酵罐中，装好 标定好的溶氧电极和PH电极，连接好管路后在121°C下灭菌25min。接种时，将制备好的二 级种子液火焰保护下由发酵罐接种口倾倒入罐体，开始发酵培养，发酵罐罐压〇. 〇5Mpa。发 酵开始到发酵24h，发酵温度控制在40-45°C，通气量为3L/mm，搅拌转速150r/min，发酵培 养基初始PH7. 0。发酵24-48h，发酵温度提高到45-50°C，通气量增加到4L/mm，搅拌转速维 持150r/min。发酵48h时，向发酵液中添加发酵促进剂15mL。发酵至60h时，向发酵液中 添加营养液200ml。发酵48h-72h，发酵温度降为35-40 °C，通风量降至3L/mm，发酵至72h， 发酵罐放出4L发酵液，然后添加补料培养基4L，发酵促进剂30mL，发酵条件不变继续发酵 36h后终止发酵。在此条件下，阿魏酸酯酶酶活达到218U/L。
[0055] 发酵培养基配方：豆饼粉10g，玉米粉20g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，可溶性淀粉 10g，（NH 4)2SO4 5g，KH2PO4 lg，微量元素 10mL，泡敌 O.OOlg，最后定容至 1000mL。调节 ρΗ7· 0-7. 5,121°C 灭菌 15min。
[0056] 补料培养基：大豆秸杆粉10g、麸皮粉20g、玉米皮粉10g、豆腐渣20g，定容至 1000mL，121°C 灭菌 15min。
[0057] 微量元素：CaCl2 2g/L，MnSO4 · 4H20 0· lg/L，FeSO4 · 7H20 0· 6g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 5g/L，CoCl2 · 6H20 2g/L，NaCl lg/L，CuSO4 2g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5/L。
[0058] 发酵促进剂：Tween 80 10g，阿魏酸乙醋0· 8g，去离子水100ml，121°C灭菌15min。
[0059] 营养液配方：尿素20g、蔗糖50g、玉米浆IOOmU胡萝卜浆500mL、土豆浸出液 500mL，121°C 灭菌 15min。
[0060] 步骤4，酶制剂的制备
[0061] 发酵液的离心除菌：发酵结束后的发酵液4°C、8000r/min、离心20min，弃去沉淀 菌体，倒出上清并保留，得到粗酶液。
[0062] 超滤浓缩：利用截留分子量为200kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0. 09m2)对离 心除菌后的粗酶液超滤分离，超滤截留液的体积减少至原体积的10~20%时，添加去离子 水至原体积的40%，继续超滤至截留液为原体积的4-5%。收集两次的滤出液。 超滤条件： 进口压力〇· 35MPa,出口压力0· 2MPa,流速I. 5L/h。
[0063] 利用截留分子量为20kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2)对上部获得的滤 出液进行超滤浓缩，当超滤至截留液为原体积的30%时，停止超滤，收集截留液。分离条件： 进口压力〇· 4MPa，出口压力0· 3MPa，流速I. lL/h。
[0064] 粗酶液喷雾干燥：向浓缩后的粗酶液中，添加可溶性淀粉至2_3wt%，充分搅拌 30min，然后添加麦芽糊精至浓度为8-12wt %，搅拌均匀后进行喷雾干燥。喷雾干燥条件为： 进风量4. 5m3/min，进风温度100°C，进料速度150mL/h，出风温度60°C，通针3秒/次，进料 速度170mL/h，雾化器压力0. 4MPa。采用上述工艺条件进行喷雾干燥，阿魏酸酯酶回收率达 到 84. 6%。
[0065] 以本发明的发酵罐深层通风发酵制备酶制剂的制备工艺步骤得到的阿魏酸酯酶 酶活力可达378U/g，总回收率达到了 81. 5%，酶制剂含水量为7. 2%。
[0066] 实施例3
[0067] 本实施例说明本发明说得阿魏酸酯酶制剂的特性。
[0068] (1)温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
[0069] 将制备好的固体阿魏酸酯酶酶制剂分别储藏在_20°0、4°0、28°0、37°0和50°〇这 五个温度环境下，储藏l〇〇d，每20d测定一次酶活力。考察温度对阿魏酸酯酶酶稳定性的影 响。图4是阿魏酸酯酶固体酶制剂在不同温度储藏条件下的酶活力变化曲线。酶活是经过 不同温度储存后的酶制剂活力和对应的储存前的阿魏酸酯酶酶活力的比值。
[0070] 由图1可知，温度对阿魏酸酯酶活力在储存过程中的稳定性有一定影响。-20°C、 4°C和28°C储藏80d时酶活都在保持90%以上，储藏IOOd时，-20°C、4°C、28°C和37°C温度 下，保存酶活液在80%以上。由此表明阿魏酸酯酶的温度稳定性非常好。但在50°C温度条 件下，经过60d和IOOd的储存，酶活下降明显，酶活保留率为70%和60%。整体看，阿魏酸 酯酶在低温和室温条件下表现出很好的稳定性，IOOd的保存时间酶活力基本没有损失。
[0071] (2)室温条件下湿度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
[0072] 为确定相对潮湿和相对干燥的室内条件下阿魏酸酯酶固体酶制剂的稳定性，进行 了室内条件（温度8_25°C范围内变化）下，相对干燥（相对湿度0% )和相对潮湿（相对 湿度95%)的环境对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性影响的实验。酶制剂样品用1.5mL 塑料离心管敞口分装，每管相同量，分别在加干燥剂和加水的密闭容器中保存，每隔20d取 出一管，进行酶活测定。
[0073] 由图2可知，相对潮湿的室内环境下储藏的酶制剂样品活力损失速度比较快，在 潮湿环境下保存60d和IOOd时保留酶活及分别下降至85%和70%。保存而干燥环境下的 样品酶活基本没有变化。这说明湿度条件对酶制剂的储藏稳定性影响很大，而且在实验过 程中发现，室内干燥环境保存的酶制剂状态比较稳定，而在潮湿环境下的固体酶制剂会很 快吸收环境中的水分，发生结块现象，保存40d之后有染菌现象出现，这些现象都大大加快 了酶制剂的失活。说明湿度越大对酶制剂的储藏稳定性的负面影响越明显。鉴于以上实验 结果，实际使用阿魏酸酯酶酶制剂过程中应尽量避免酶制剂在湿度较大的环境中长时间放 置。
[0074] (3)阿魏酸酯酶固体酶制剂的最适作用温度
[0075] 按照酶活力测定的方法，分别在 30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、 70°C、75°C、80°C下酶解反应。以温度为横坐标，以相对酶活力为纵坐标作图，以酶活最高者 为 100%〇
[0076] 由图3可知，阿魏酸酯酶固体酶制剂在35°C~65°C之间酶活较高，相对酶活都在 80 %以上，其中最适反应温度为50°C，反应温度超过65°C之后，酶活下降较快，但在70°C仍 具有一定74%的催化反应活力。整体看酶在高温下酶活力较高。
[0077] (4)阿魏酸酯酶固体酶制剂最适作用pH
[0078] 分别用 ρΗ4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、9· 0、9· 5、10· 0 的缓冲液 作为反应缓冲液，按照酶活力测定方法，测定在不同pH时的酶活力，以pH值为横坐标，以相 对酶活力为纵坐标作图，以酶活最高者为100%。
[0079] 由图4可知，阿魏酸酯酶固体酶制剂在所检测的pH范围内，酶活较高。在pH4. 0时 酶活最低，但也在75 %。酶的最适pH范围在5. 0-8.0之间，酶活都在90 %以上。当pH高 于7. 5时，酶活开始逐渐回落。整体看阿魏酸酯酶pH的适应范围较广。
【主权项】
1. 一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：包括以 下步骤： 步骤1，一级种子的制备：首先将液体种子培养基在三角瓶中装液30mL-50mL，调节pH至7. 0,经121°C灭菌20min，冷却后，按照体积比为4-6v/v%的接种量接种菌株，于40-45°C 的摇床上培养18_24h，得到一级种子液； 步骤2,二级种子的制备：按照6-10v/v%的接种量将培养好的一级种子液接种到二级 种子培养基中，32-37°C培养18-24h，得到二级种子液； 步骤3,自动发酵罐发酵工艺：将发酵培养基装入发酵罐中，121°C下灭菌25min，将步 骤2所得二级种子液倒入罐体，开始发酵培养，发酵罐罐压0. 05Mpa，发酵开始到发酵24h， 发酵温度控制在40-45°C，通气量为3L/mm，搅拌转速150r/min，发酵培养基初始pH7. 0 ; 发酵24-48h，发酵温度提高到45-50°C，通气量增加到4L/mm，搅拌转速维持150r/min，发酵48h时，向发酵液中添加发酵促进剂15mL，发酵至60h时，向发酵液中添加营养液 200mL，发酵48h-72h，发酵温度降为35-40°C，通风量降至3L/mm，发酵至72h，发酵罐放出一 半体积发酵液，然后添加补料培养基和发酵促进剂，35-40°C条件下继续发酵36h后终止发 酵； 步骤4,酶制剂的制备：将步骤3所得发酵液在4°C、8000r/min、离心20min，所得上清 进行超滤浓缩，向浓缩后的粗酶液中添加2-3wt%可溶性淀粉，搅拌，再添加8-12wt%麦芽糊 精，搅拌均匀后喷雾干燥，即得阿魏酸酯酶制剂。2. 根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法， 其特征在于：步骤1中一级种子培养基配方为：牛肉膏0. 4g、蛋白胨0. 8g、酵母粉lg、NaCl 0? 5g、KH2PO4 0?lg、MgSO4 ? 7H20 0? 04、蒸馏水 100mL、pH7. 0,121°C灭菌 20min。3. 根据权利要求I所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法， 其特征在于：步骤2中二级种子培养基配方为：豆饼粉lg，玉米粉2g，葡萄糖2. 5g，蛋白胨 lg，硫酸铵 〇? 2g，MgSO4 ? 7H20 0? 015g，KH2PO4 0? 008g，定容 100ml，pH7. 0-7. 4,121°C灭菌 20min〇4.根据权利要求I所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其 特征在于：步骤3中发酵培养基配方为：豆饼粉10g，玉米粉20g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，可 溶性淀粉l〇g，（NH4)2SO4 5g，KH2PO4 lg，微量元素10mL，泡敌O.OOlg，定容至lOOOmL，调节 pH7. 0-7. 5,121°C灭菌15min ;其中，微量元素：CaCl2 2g/L，MnS04.4H20 0? lg/L，FeS04.7H20 0? 6g/L，ZnS04.7H20 0? 5g/L，CoCl2 ? 6H20 2g/L，NaCl lg/L，CuSO4 2g/L，MgSO4 ? 7H20 0? 5/ L05. 根据权利要求I所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其 特征在于：步骤3中补料培养基配方为：大豆秸杆粉10g、麸皮粉20g、玉米皮粉10g、豆腐渣 20g，定容至 1000mL，121°C灭菌 15min。6. 根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其 特征在于：步骤3中发酵促进剂配方为：Tween80 10g，阿魏酸乙醋0. 8g，去离子水lOOmL， 121°C灭菌 15min。7. 根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其 特征在于：步骤3中营养液配方：尿素20g、鹿糖50g、玉米衆IOOmU胡萝卜衆500mL、土豆浸
【专利摘要】本发明公开了一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活化、种子液培养、发酵罐深层液体通风发酵、酶制剂制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶制剂，得到固体阿魏酸酯酶酶制剂稳定性好、适用范围广，制备工艺简单，酶活高，制备得到的酶制剂酶活力可达378U/g，总回收率达到了81.5%，具有极好的工业化应用前景。CGMCC No.867220140102
【IPC分类】C12N9/18, C12N1/20, C12R1/10
【公开号】CN104894083
【申请号】CN201510267916
【发明人】高兆建, 刘恩岐, 孙会刚, 侯进慧, 曹泽虹, 徐大伟, 杨宪瑶
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备 耐热阿魏酸酯酶的方法。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸（ferulic acid，FA)是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，是多种植 物中的一种酚酸，具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特 的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物不能直接吸收这类阿魏酸， 必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。另一方面，在植物细胞壁中，阿魏酸或二聚体 阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，增强阿拉伯木聚糖链的 强度，但从空间上限制了动物和微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。
[0003] 阿魏酸醋酶（EC 3. I. 1. 73，feruloyl esterase)又称肉桂酸醋酶或肉桂酰醋酶， 可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来。它能与其他水解酶如木聚糖 酶、纤维素酶和木质素酶相互联合作用，较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素。因此， 阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的 应用潜能。
[0004] 自首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但 主要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等，而且 它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生长、酶产量以 及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产。故寻求以细菌为发 酵菌株生产阿魏酸酯酶具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活 化、种子液培养、三角瓶发酵、酶制剂制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶制剂，所得到的 阿魏酸酯酶耐热性好、PH适用范围宽、酶活产量高。
[0006] 所述的地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)DBM12,已于2014年1月2日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC (地址为：中国北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No. 8672。
[0007] 所述深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤1，一级种子的制备：首先将液体种子培养基在三角瓶中装液30mL-50mL，调 节pH至7. 0,经121°C灭菌20min，冷却后，按照体积比为4-6v/v%的接种量接种菌株，于 40-45°C的摇床上培养18-24h，得到一级种子液；
[0009] 步骤2,二级种子的制备：按照6-10v/v %的接种量将培养好的一级种子液接种到 二级种子培养基中，32-37°C培养18-24h，得到二级种子液；
[0010] 步骤3,自动发酵罐发酵工艺：将发酵培养基装入发酵罐中，121°C下灭菌25min， 将步骤2所得二级种子液倒入罐体，开始发酵培养，发酵罐罐压0. 05Mpa，发酵开始到发 酵24h，发酵温度控制在40-45°C，通气量为3L/mm，搅拌转速150r/min，发酵培养基初始 pH7. 0。发酵24-48h，发酵温度提高到45-50°C，通气量增加到4L/mm，搅拌转速维持150r/ min，发酵48h时，向发酵液中添加发酵促进剂15mL，发酵至60h时，向发酵液中添加营养液 200mL，发酵48h-72h，发酵温度降为35-40°C，通风量降至3L/mm，发酵至72h，发酵罐放出一 半体积发酵液，然后添加补料培养基和发酵促进剂，35-40°C条件下继续发酵36h后终止发 酵；
[0011] 步骤4,酶制剂的制备：将步骤3所得发酵液在4°C、8000r/min、离心20min，所得 上清进行超滤浓缩，向浓缩后的粗酶液中添加2-3wt%可溶性淀粉，搅拌，再添加8-12wt% 麦芽糊精，搅拌均匀后喷雾干燥，即得阿魏酸酯酶制剂。
[0012] 作为上述发明的进一步改进，步骤1中一级种子培养基配方为：牛肉膏0. 4g、蛋白 胨 0· 8g、酵母粉 lg、NaCl 0· 5g、KH2P04 0· lg、MgS04 ·7Η20 0· 04、蒸馏水 100mL、pH7. 0,121°C 灭菌20min。
[0013] 作为上述发明的进一步改进，步骤2中二级种子培养基配方为：豆饼粉lg，玉米粉 2g，葡萄糖 2. 5g，蛋白胨 lg，硫酸铵 0· 2g，MgSO4 · 7H20 0· 015g，KH2PO4 0· 008g，定容 100ml， pH 7· 0-7. 4,121°C 灭菌 20min。
[0014] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中发酵培养基配方为：豆饼粉10g，玉米粉 20g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，（NH 4)2SO4 5g，KH2PO4 lg，微量元素10mL，泡 敌 O.OOlg，定容至 lOOOmL，调节 pH7.0-7.5，121°C灭菌 15min ;其中，微量元素：CaCl2 2g/ L，MnSO4 · 4H20 0· lg/L，FeSO4 · 7H20 0· 6g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 5g/L，CoCl2 · 6H20 2g/L，NaCl lg/L，CuSO4 2g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5/L。
[0015] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中补料培养基配方为：大豆秸杆粉10g、麸皮 粉20g、玉米皮粉10g、豆腐澄20g，定容至1000mL，121°C灭菌15min。
[0016] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中发酵促进剂配方为：Tween 8010g，阿魏酸 乙醋0. 8g，去离子水100mL，121°C灭菌15min。
[0017] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中营养液配方：尿素20g、鹿糖50g、玉米衆 100mL、胡萝卜衆 500mL、土?浸出液 500mL，121°C灭菌 15min。
[0018] 本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本发明的发酵方法不仅发酵液后 续处理简便、生产成本低廉，而且发酵获得的地衣芽孢杆菌活力在218U/mL以上，与国内外 其他发酵罐规模的阿魏酸酯酶生产方法相比，阿魏酸酯酶总产量和酶活力都达到了较高的 水平，具有极好的工业化应用前景；第二，本发明得到固体阿魏酸酯酶酶制剂稳定性好、适 用范围广，酶制剂在37°C温度下，保存100d，酶活保存在80%以上，阿魏酸酯酶适合在高 温下酶解，在35°C~65°C之间降解酶活较高，相对酶活都在80%以上，酶的最适pH范围在 5. 0-8. 0之间，酶活都在90%以上；第三，本发明所采用的液体发酵工艺简单，环保无毒，原 材料使用豆饼粉、玉米粉、大豆秸杆分、麸皮粉等农副产物，成本低廉，整个发酵过程可控， 不受外部环境条件限制，非常适合工业规模化发酵罐培养生产；第四，本发明的阿魏酸酯酶 固体酶制剂制备工艺简单，酶活高，酶活力可达378U/g，总回收率达到了 81. 5%。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例3中温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响；
[0020] 图2为实施例3中室温条件下湿度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响；
[0021] 图3为实施例3中温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂酶解活性的影响；
[0022] 图4为实施例3中pH对阿魏酸酯酶固体酶制剂酶解活性的影响。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1
[0024] 地衣芽孢杆菌DBM12的筛选方法，包括以下步骤：
[0025] 步骤1，土样采集及处理
[0026] 土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土 样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。
[0027] 取5-10g 土样放入装有20_40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上， 120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80°C水浴加热15-30min，期间每 隔5min中震荡一次。
[0028] 步骤2,富集培养
[0029] 取l_2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-180r/ min转速50-60°C下震荡培养20-24h。然后取l-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10% 的富集培养基二中，继续在160_180r/min转速50-60°C下震荡培养18-20h。
[0030] 富集培养基一：酵母提取物 0· 5g，KH2PO4 0· lg，NH4NO3 0· lg，NaCl 0· lg， MgSO4 · 7H20 0. 25g，微量元素 lmL，阿魏酸乙醋lg，去离子水100mL，调节pH4. 0。
[0031] 富集培养基二：NH4N03 (λ 5g，尿素 (λ lg，KH2PO4 (λ lg，NaCl (λ lg，阿魏酸乙酯 lg， 去离子水100mL，调节pH3. 0。
[0032] 微量元素：EDTA 5g，CaCl2 · 2H20 6g，FeSO4 · 7H20 6g，MnCl2 · 4H20 I. 15g， CoCl2 · 6H20 0· 8g，ZnSO4 · 7H20 0· 7g，CuCl2 · 2H20 0· 3g，H3BO3 0· 3g，（NH4)6Mo7O2 · 4H20 0. 25g，去离子水 1000mL。
[0033] 步骤3,初筛
[0034] 对第二次富集的培养液无 菌水稀释，分别取稀释到10' 10' 10' 10' KT6的稀释 液150-250 μ L涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封 口，将培养皿置于40-45°C培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20°C培养箱中继续 培养6-12h。
[0035] 挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60°C恒温培养24-48h。挑选出 在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化 培养基，于45-50°C培养l-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连 续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜 面保藏培养基中4°C保存，接着进一步复筛。
[0036] 初筛培养基一：蛋白胨 0· 5g，酵母提取物(λ lg，NaNO3 (λ 3g，K2HPO4 (λ lg，KCl 0· 5g，MgSO4 · 7H20 0· 025g，FeSO4 · 7H20 0· 001g，琼脂 2· 5,去离子水 100mL，调节 ρΗ4· 5。
[0037] 初筛培养基二！KH2PO4 0· 2g，（NH4)2SO4 0· 4g，MgSO4 · 7Η20 0· 03g，FeSO4 · 7Η20 0· OOlg，MnSO4 (λ OOlg，ZnCl2 (λ OOlg，琼脂 2. 5g，去离子水 lOOmL，ρΗ4· 0。培养基 121°C、 15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀后，平均倒至3个直径 90mm的培养皿中。
[0038] 阿魏酸乙酯溶液：0. 2g阿魏酸乙酯加到I. 5mL无菌离心管中，再加入500 yLN、 N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0039] 步骤4,复筛
[0040] 将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45 °C恒温培养箱培养 16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为 40-45°C，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10%的接种量接种 到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床 震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50°C，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以 6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。
[0041] 复筛种子培养基：蛋白胨lg、牛肉膏〇· 5g、酵母粉0· 5g、NaCl 0· 5g、K2HP04 0· 02g、 加去离子水至100mL，ρΗ4· 5,121°C灭菌15min。
[0042] 发酵培养基配方：可溶性淀粉0. 5g、蛋白胨lg、牛肉膏0. 5g、NaCl 0. 5g、KH2PO4 0· lg、MgS04 · 7H20 0· 04g、去离子水 100mL，ρΗ4· 5,121°C灭菌 15min。
[0043] 酶活平板检测方法：0. 02mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH4. 5) 100mL， 琼脂粉2. 5g，121°C、15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀 后，平均倒至3个直径90_的培养皿中。琼脂充分凝固后用直径6_的打孔器均匀打孔约 3-10个。将发酵液离心后取上清100 μ L加到孔中，45°C过夜，查看透明圈情况。
[0044] 所得菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24h，菌落圆形，直径2. 4-3. 2mm ;菌 落为白色，不透明，表面较平且干燥，牢固附着培养基，难以挑取。在牛肉膏蛋白胨液体培养 基中静止培养，无沉淀，液体清亮，培养基表面形成白色皱皮膜，表面有颗粒，膜较薄。观察 菌体形态，革兰氏染色阳性，生长过程产生芽孢，孢囊无膨大，无伴孢晶体，菌体杆状，具有 运动性。菌株DBM12具体的形态学及生理生化特征见下表。
[0045] 菌株DBMl2形态学及生理生化特性
[0046]
[0047] 提取本申请菌株DBM12基因组，依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物，其 中正向引物为F:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（如SEQ ID NO. 2所示）；反向引物为R : 5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）。PCR 反应体系为（20 μ L) : CldH2O 12.7yL，10XPCR buffer 2.0yL，dNTP mix(2.5mmol/L)2.0yL，正向引物（ΙΟμ mol/ L) I. 0 μ L，反向引物（10 μ mol/L) I. 0 μ L，Taq FlexiPolymerase (5U/ μ L) 0· 3 μ L，模板 I. 0 μ L。热循环参数94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，循环30 次，72°C延伸10min。用pGM-T载体克隆测序。测得序列如SEQ ID NO. I所示，与从NCBI中 比对获得的相近细菌的16S rDNA序列采用ClustalXl. 83进行多序列比对，显示菌株DBM12 的 16S rDNA核苷酸序列与Bacillus licheniformis(EU162839)的 16S rDNA核苷酸序列同 源性最高，最大相似性（maxident)达到99. 2%。综合DBM12菌株的形态学特征、生理生化 特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株DBM12鉴定为地衣芽孢杆菌Bacillus Iicheniformis0
[0048] 实施例2
[0049] 本实施例说明采用深层液体通风发酵制备耐热阿魏酸酯酶制剂，包括以下步骤：
[0050] 步骤1，一级种子的制备：将液体种子培养基在250mL的三角瓶中装液30mL-50mL， 调节pH至7. 0,经121°C灭菌20min，冷却后，按照体积比为4-6v/v%的接种量接种，于 40-45°C的摇床上培养18-24h，得到一级种子液。
[0051] 一级种子培养基：牛肉膏〇.4g、蛋白胨0.8g、酵母粉lg、NaCl 0.5g、KH2PO4 0. lg、 MgSO4 · 7H20 0· 04、蒸馏水 100mL、pH7. 0,121°C 灭菌 20min。
[0052] 步骤2,二级种子的制备：按照6-10v/v%的接种量接种培养好的一级种子液到二 级种子培养基中，1000 mL三角瓶装100-120mL二级种子培养基。32-37°C培养18-24h。
[0053] 二级种子培养基：豆饼粉lg，玉米粉2g，葡萄糖2. 5g，蛋白胨lg，硫酸按0. 2g， MgSO4 · 7H20 0· 015g，KH2PO4 0· 008g，定容 100ml，pH 7. 0-7. 4,121°C 灭菌 20min。
[0054] 步骤3,15L自动发酵罐发酵工艺：配制8L发酵培养基，装入15L的发酵罐中，装好 标定好的溶氧电极和PH电极，连接好管路后在121°C下灭菌25min。接种时，将制备好的二 级种子液火焰保护下由发酵罐接种口倾倒入罐体，开始发酵培养，发酵罐罐压〇. 〇5Mpa。发 酵开始到发酵24h，发酵温度控制在40-45°C，通气量为3L/mm，搅拌转速150r/min，发酵培 养基初始PH7. 0。发酵24-48h，发酵温度提高到45-50°C，通气量增加到4L/mm，搅拌转速维 持150r/min。发酵48h时，向发酵液中添加发酵促进剂15mL。发酵至60h时，向发酵液中 添加营养液200ml。发酵48h-72h，发酵温度降为35-40 °C，通风量降至3L/mm，发酵至72h， 发酵罐放出4L发酵液，然后添加补料培养基4L，发酵促进剂30mL，发酵条件不变继续发酵 36h后终止发酵。在此条件下，阿魏酸酯酶酶活达到218U/L。
[0055] 发酵培养基配方：豆饼粉10g，玉米粉20g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，可溶性淀粉 10g，（NH 4)2SO4 5g，KH2PO4 lg，微量元素 10mL，泡敌 O.OOlg，最后定容至 1000mL。调节 ρΗ7· 0-7. 5,121°C 灭菌 15min。
[0056] 补料培养基：大豆秸杆粉10g、麸皮粉20g、玉米皮粉10g、豆腐渣20g，定容至 1000mL，121°C 灭菌 15min。
[0057] 微量元素：CaCl2 2g/L，MnSO4 · 4H20 0· lg/L，FeSO4 · 7H20 0· 6g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 5g/L，CoCl2 · 6H20 2g/L，NaCl lg/L，CuSO4 2g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5/L。
[0058] 发酵促进剂：Tween 80 10g，阿魏酸乙醋0· 8g，去离子水100ml，121°C灭菌15min。
[0059] 营养液配方：尿素20g、蔗糖50g、玉米浆IOOmU胡萝卜浆500mL、土豆浸出液 500mL，121°C 灭菌 15min。
[0060] 步骤4，酶制剂的制备
[0061] 发酵液的离心除菌：发酵结束后的发酵液4°C、8000r/min、离心20min，弃去沉淀 菌体，倒出上清并保留，得到粗酶液。
[0062] 超滤浓缩：利用截留分子量为200kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0. 09m2)对离 心除菌后的粗酶液超滤分离，超滤截留液的体积减少至原体积的10~20%时，添加去离子 水至原体积的40%，继续超滤至截留液为原体积的4-5%。收集两次的滤出液。 超滤条件： 进口压力〇· 35MPa,出口压力0· 2MPa,流速I. 5L/h。
[0063] 利用截留分子量为20kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2)对上部获得的滤 出液进行超滤浓缩，当超滤至截留液为原体积的30%时，停止超滤，收集截留液。分离条件： 进口压力〇· 4MPa，出口压力0· 3MPa，流速I. lL/h。
[0064] 粗酶液喷雾干燥：向浓缩后的粗酶液中，添加可溶性淀粉至2_3wt%，充分搅拌 30min，然后添加麦芽糊精至浓度为8-12wt %，搅拌均匀后进行喷雾干燥。喷雾干燥条件为： 进风量4. 5m3/min，进风温度100°C，进料速度150mL/h，出风温度60°C，通针3秒/次，进料 速度170mL/h，雾化器压力0. 4MPa。采用上述工艺条件进行喷雾干燥，阿魏酸酯酶回收率达 到 84. 6%。
[0065] 以本发明的发酵罐深层通风发酵制备酶制剂的制备工艺步骤得到的阿魏酸酯酶 酶活力可达378U/g，总回收率达到了 81. 5%，酶制剂含水量为7. 2%。
[0066] 实施例3
[0067] 本实施例说明本发明说得阿魏酸酯酶制剂的特性。
[0068] (1)温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
[0069] 将制备好的固体阿魏酸酯酶酶制剂分别储藏在_20°0、4°0、28°0、37°0和50°〇这 五个温度环境下，储藏l〇〇d，每20d测定一次酶活力。考察温度对阿魏酸酯酶酶稳定性的影 响。图4是阿魏酸酯酶固体酶制剂在不同温度储藏条件下的酶活力变化曲线。酶活是经过 不同温度储存后的酶制剂活力和对应的储存前的阿魏酸酯酶酶活力的比值。
[0070] 由图1可知，温度对阿魏酸酯酶活力在储存过程中的稳定性有一定影响。-20°C、 4°C和28°C储藏80d时酶活都在保持90%以上，储藏IOOd时，-20°C、4°C、28°C和37°C温度 下，保存酶活液在80%以上。由此表明阿魏酸酯酶的温度稳定性非常好。但在50°C温度条 件下，经过60d和IOOd的储存，酶活下降明显，酶活保留率为70%和60%。整体看，阿魏酸 酯酶在低温和室温条件下表现出很好的稳定性，IOOd的保存时间酶活力基本没有损失。
[0071] (2)室温条件下湿度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
[0072] 为确定相对潮湿和相对干燥的室内条件下阿魏酸酯酶固体酶制剂的稳定性，进行 了室内条件（温度8_25°C范围内变化）下，相对干燥（相对湿度0% )和相对潮湿（相对 湿度95%)的环境对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性影响的实验。酶制剂样品用1.5mL 塑料离心管敞口分装，每管相同量，分别在加干燥剂和加水的密闭容器中保存，每隔20d取 出一管，进行酶活测定。
[0073] 由图2可知，相对潮湿的室内环境下储藏的酶制剂样品活力损失速度比较快，在 潮湿环境下保存60d和IOOd时保留酶活及分别下降至85%和70%。保存而干燥环境下的 样品酶活基本没有变化。这说明湿度条件对酶制剂的储藏稳定性影响很大，而且在实验过 程中发现，室内干燥环境保存的酶制剂状态比较稳定，而在潮湿环境下的固体酶制剂会很 快吸收环境中的水分，发生结块现象，保存40d之后有染菌现象出现，这些现象都大大加快 了酶制剂的失活。说明湿度越大对酶制剂的储藏稳定性的负面影响越明显。鉴于以上实验 结果，实际使用阿魏酸酯酶酶制剂过程中应尽量避免酶制剂在湿度较大的环境中长时间放 置。
[0074] (3)阿魏酸酯酶固体酶制剂的最适作用温度
[0075] 按照酶活力测定的方法，分别在 30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、 70°C、75°C、80°C下酶解反应。以温度为横坐标，以相对酶活力为纵坐标作图，以酶活最高者 为 100%〇
[0076] 由图3可知，阿魏酸酯酶固体酶制剂在35°C~65°C之间酶活较高，相对酶活都在 80 %以上，其中最适反应温度为50°C，反应温度超过65°C之后，酶活下降较快，但在70°C仍 具有一定74%的催化反应活力。整体看酶在高温下酶活力较高。
[0077] (4)阿魏酸酯酶固体酶制剂最适作用pH
[0078] 分别用 ρΗ4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、9· 0、9· 5、10· 0 的缓冲液 作为反应缓冲液，按照酶活力测定方法，测定在不同pH时的酶活力，以pH值为横坐标，以相 对酶活力为纵坐标作图，以酶活最高者为100%。
[0079] 由图4可知，阿魏酸酯酶固体酶制剂在所检测的pH范围内，酶活较高。在pH4. 0时 酶活最低，但也在75 %。酶的最适pH范围在5. 0-8.0之间，酶活都在90 %以上。当pH高 于7. 5时，酶活开始逐渐回落。整体看阿魏酸酯酶pH的适应范围较广。
【主权项】
1. 一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：包括以 下步骤： 步骤1，一级种子的制备：首先将液体种子培养基在三角瓶中装液30mL-50mL，调节pH至7. 0,经121°C灭菌20min，冷却后，按照体积比为4-6v/v%的接种量接种菌株，于40-45°C 的摇床上培养18_24h，得到一级种子液； 步骤2,二级种子的制备：按照6-10v/v%的接种量将培养好的一级种子液接种到二级 种子培养基中，32-37°C培养18-24h，得到二级种子液； 步骤3,自动发酵罐发酵工艺：将发酵培养基装入发酵罐中，121°C下灭菌25min，将步 骤2所得二级种子液倒入罐体，开始发酵培养，发酵罐罐压0. 05Mpa，发酵开始到发酵24h， 发酵温度控制在40-45°C，通气量为3L/mm，搅拌转速150r/min，发酵培养基初始pH7. 0 ; 发酵24-48h，发酵温度提高到45-50°C，通气量增加到4L/mm，搅拌转速维持150r/min，发酵48h时，向发酵液中添加发酵促进剂15mL，发酵至60h时，向发酵液中添加营养液 200mL，发酵48h-72h，发酵温度降为35-40°C，通风量降至3L/mm，发酵至72h，发酵罐放出一 半体积发酵液，然后添加补料培养基和发酵促进剂，35-40°C条件下继续发酵36h后终止发 酵； 步骤4,酶制剂的制备：将步骤3所得发酵液在4°C、8000r/min、离心20min，所得上清 进行超滤浓缩，向浓缩后的粗酶液中添加2-3wt%可溶性淀粉，搅拌，再添加8-12wt%麦芽糊 精，搅拌均匀后喷雾干燥，即得阿魏酸酯酶制剂。2. 根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法， 其特征在于：步骤1中一级种子培养基配方为：牛肉膏0. 4g、蛋白胨0. 8g、酵母粉lg、NaCl 0? 5g、KH2PO4 0?lg、MgSO4 ? 7H20 0? 04、蒸馏水 100mL、pH7. 0,121°C灭菌 20min。3. 根据权利要求I所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法， 其特征在于：步骤2中二级种子培养基配方为：豆饼粉lg，玉米粉2g，葡萄糖2. 5g，蛋白胨 lg，硫酸铵 〇? 2g，MgSO4 ? 7H20 0? 015g，KH2PO4 0? 008g，定容 100ml，pH7. 0-7. 4,121°C灭菌 20min〇4.根据权利要求I所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其 特征在于：步骤3中发酵培养基配方为：豆饼粉10g，玉米粉20g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，可 溶性淀粉l〇g，（NH4)2SO4 5g，KH2PO4 lg，微量元素10mL，泡敌O.OOlg，定容至lOOOmL，调节 pH7. 0-7. 5,121°C灭菌15min ;其中，微量元素：CaCl2 2g/L，MnS04.4H20 0? lg/L，FeS04.7H20 0? 6g/L，ZnS04.7H20 0? 5g/L，CoCl2 ? 6H20 2g/L，NaCl lg/L，CuSO4 2g/L，MgSO4 ? 7H20 0? 5/ L05. 根据权利要求I所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其 特征在于：步骤3中补料培养基配方为：大豆秸杆粉10g、麸皮粉20g、玉米皮粉10g、豆腐渣 20g，定容至 1000mL，121°C灭菌 15min。6. 根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其 特征在于：步骤3中发酵促进剂配方为：Tween80 10g，阿魏酸乙醋0. 8g，去离子水lOOmL， 121°C灭菌 15min。7. 根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其 特征在于：步骤3中营养液配方：尿素20g、鹿糖50g、玉米衆IOOmU胡萝卜衆500mL、土豆浸
【专利摘要】本发明公开了一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活化、种子液培养、发酵罐深层液体通风发酵、酶制剂制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶制剂，得到固体阿魏酸酯酶酶制剂稳定性好、适用范围广，制备工艺简单，酶活高，制备得到的酶制剂酶活力可达378U/g，总回收率达到了81.5%，具有极好的工业化应用前景。CGMCC No.867220140102
【IPC分类】C12N9/18, C12N1/20, C12R1/10
【公开号】CN104894083
【申请号】CN201510267916
【发明人】高兆建, 刘恩岐, 孙会刚, 侯进慧, 曹泽虹, 徐大伟, 杨宪瑶
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
最新回复(0)