一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法
一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯 酶的方法。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸醋酶（E. C13. I. L 73, feruloyl esterase，FAE)是近来研宄较热的一种羧 酸酯酶，它是一种胞外酶，可以水解阿魏酸甲酯、多糖阿魏酸酯等中的酯键，将释放出游离 的阿魏酸单体或二聚体。在食品和医药领域中，利用阿魏酸酯酶来降解植物细胞壁中的阿 魏酸酯键，可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。阿魏酸是桂皮酸的一种衍生物， 其化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，也是一种天然的抗氧化剂，对心血管疾病、糖尿 病、老年痴呆症和肿瘤等疾病有治疗作用。
[0003] 在饲料工业中，农作物秸杆等饲料细胞壁中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等木 质素分子以醋键方式与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上限制了瘤胃微生 物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。经阿魏酸酯酶处理后，饲料原料变得较为疏 松，能加快植物细胞壁等成分在瘤胃的降解速度，提高反刍动物对饲料的消化程度。在造纸 工业中，经阿魏酸酯酶处理的原料，木质素更容易脱除，因而可以减少制浆工序中化学药品 的使用量。
[0004] 作用深绿木霉阿魏酸酯酶作为耐热性耐酸阿魏酸酯酶，可以弥补阿魏酸酯酶应用 上的不足，其最适PH为6. 5-7. 5,可适用于一些消化道程酸性的家畜。同时，该酶具有良好 的耐热性，可有效抵御饲料制粒膨化过程中高温引起的酶失活。因此耐热性耐酸阿魏酸酯 酶具有重要的应用价值。
[0005] 目前阿魏酸的生产方法主要包括化学合成法和碱解法，但这两种方法均存在一定 的缺陷。化学合成法反应步骤多、周期长；碱解法的原料谷维素在米糠中含量低，产量受限； 此外，这两种方法都具有污染性，因此酶法生产阿魏酸成为近年来研宄的热点。固态发酵生 产酶制剂作为酶制剂工业一个重要发展方向，以其发酵周期短、能耗少、水的消耗量较低、 对环境污染程度低、单位产量大等优点受到广泛的重视。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的 准备、三角瓶固态发酵、曲盘固态发酵、粗酶制剂制备、粗酶制剂纯化的工艺步骤制备耐热 阿魏酸酯酶，所得酶制剂不仅耐酸性好，而且具有较强的耐热能力。
[0007] 所述的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26,已于2014年1月2日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号：CGMCC No. 8673。
[0008] 所述深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤1，菌种制备：挑取菌种孢子接种于活化斜面培养基上活化，30-35?培养箱 培养3-5天，用生理盐水将活化好的深绿木霉稀释至孢子浓度为IO7个/mL，再接种所得孢 子悬浮液2mL到50g固态孢子培养基中，30-40°C培养箱培养3-4天，用生理盐水将孢子浓 度稀释至I. 2-1. 6X 108cfu/mL，然后接种2mL孢子悬液到IOOmL液体种子培养基，置于摇床 30-40°C培养 l-2d，摇床转速 160-250r/min ;
[0010] 步骤2,深绿木霉三角瓶固态发酵：将步骤1所得深绿木霉液体种子2mL接种到固 态培养基50g，35-40°C培养2-3d，将温度提高至40-45°C继续培养2天，添加补料液体营养 液10-20mL，再将温度降至30-37°C下培养7-8d ;
[0011] 步骤3,深绿木霉曲盘固态发酵：在三角瓶固态发酵的基础上进行曲盘放大试验， 曲盘大小为36cmX20cmX6cm，装料量为180克培养基/曲盘，固液比1.2:1，初始？册.5， 33-35 °C下静止培养72h，期间翻曲3-4次，然后添加补料液体营养液20mL，温度调至 35-40°C，继续培养24h，中间翻曲2次，最后将温度降至28-32°C，再培养24h，得粗酶液；
[0012] 步骤4,阿魏酸酯酶粗酶制剂制备：将步骤3所得粗酶液依次经过浸提、超滤、旋转 蒸发，得粗酶浓缩液；
[0013] 步骤5,粗酶制剂纯化：将步骤4所得粗酶浓缩液依次经过硫酸铵分级沉淀、脱盐、 脱色、超滤、离子交换层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析后，冷冻干燥，得纯品。
[0014] 作为上述发明的进一步改进，步骤1中活化斜面培养基配方：土豆浸出液100mL， 麸皮浸出液100mL，无机盐液lmL，鹿糖lg，琼脂粉3g，pH5. 0-6. 0,121°C灭菌15min ;固态孢 子培养基配方：麸皮5g，玉米粉lg，谷糠 lg，豆饼粉2g，无机盐溶液lmL，土豆浸出液8mL， 121°C灭菌15min ;液体种子培养基配方：麸皮浸出液100mL，土豆浸出液100mL，蔗糖lg，无 机盐溶液 lmL，ρΗ5· 0,121°C 灭菌 20min。
[0015] 作为上述发明的进一步改进，步骤2中固态发酵培养基配方：玉米秸杆粉lg，大豆 秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无 机盐液 10mL，121°C 灭菌 20min。
[0016] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中曲盘固态培养基配方为：大豆秸杆粉2g，地 瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL， 121°C 灭菌 20min。
[0017] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中所述补料液体营养液的制备方法为：玉米 秸杆、黄豆秸杆、地瓜秧均粉碎至40目，按照质量比1:1:1混合，然后向固体混合物中加入 去离子水至浓度为1〇?七％，煮沸3〇!1^11，过滤去除深褐色滤液，向滤渣中加入浓度为1 ￥八％ 的稀硫酸，固体混合物和稀硫酸的质量体积比为1:10,于121°C水解2h，冷却至60°C并在该 温度下用Ca (OH) 2调节水解液至pH10. 0,60°C水浴保温30-40min，冷却至室温，过滤除去滤 渣并保留水解液，再用HCl调节pH至6. 0,即得到补料液体营养液。
[0018] 本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本发明采用营养液补料法，在原 发酵的基础上，进一步发酵产酶，显著提高了单位培养基产酶量，酶活高达：17. 92U/g ;第 二，该方法所得阿魏酸酯酶，不仅耐酸性好，而且具有较强的耐热能力，特别适合用作饲用 酶制剂；第三，粗酶制剂经过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、疏水柱层析以及凝胶过滤层析 等纯化步骤后，阿魏酸酯酶纯化了 219倍，活性回收率为27% ;第四，发酵周期短、能耗少、 水的消耗量低、对环境污染程度低、单位产量大。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例2中阿魏酸酯酶离子交换层析后洗脱图谱；
[0020] 图2为实施例2中阿魏酸酯酶分子筛凝胶过滤层析后洗脱图谱；
[0021] 图3为实施例2中阿魏酸酯酶纯化电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 本实施例说明深绿木霉AWS26的筛选方法，具体步骤如下：
[0024] 步骤1，采样及样品处理：
[0025] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，160r/min振荡30min，制成悬 液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，lOOr/min震荡处理20-30min，得土样 浑浊液。
[0026] 步骤2,富集培养 ：
[0027] 吸取2-4mL步骤1所得土样浑浊液，加至装有30-60mL富集培养基一的容量为 250mL的三角瓶中，于45-50°C、转速160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d，得富集培养液。 无菌操作量取30-50mL富集培养液，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，用富集培养 基二将离心后的沉淀洗至装有30-60mL富集培养基二的250mL三角瓶中，于45-50°C、转速 160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
[0028] 步骤3,初筛：
[0029] 将第二次富集后的培养液逐级稀释到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各级稀释的培养液 0. 2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿 口封好，并置于37-40°C恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45°C恒温培养 箱中继续倒置培养2-4d。
[0030] 将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分 别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基，接种好的培养皿40-45°C恒温培养箱 中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。 将纤维素酶初筛平板上加入一定量〇. 1 %的刚果红染液，染色Ι-lOmin，倒掉染色液，观察 菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯 酶初筛培养基平板上接种出来，进一步复筛。阿魏酸酯酶和纤维素酶初筛平板检测结果分 别如表1和表2所不。
[0031] 步骤4,复筛：
[0032] 将步骤3初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45 °C恒温培养箱中培 养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化。
[0033] 步骤5,菌种保藏：
[0034] 将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35_40°C下培养3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/ min转速下37-40°C进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10 % (v/v)的接种量，将液体 种子接种到液体发酵培养中，在160_180r/min转速下40-45°C进行液体震荡发酵培养。发 酵培养3-5d，取发酵液1200r/min，IOmin离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶 活性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高 酶活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面 培养基上，4°C保藏。复筛结果如表3所示，综合考虑阿魏酸酯酶和纤维素酶的酶活情况，选 择菌株AWS26作为目的菌株。
[0035] 其中，所使用的培养基配方如下：
[0036] 富集培养基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纤维素钠0. 5g，无机盐营养液lmL，补充 水至100mL，pH4. 5，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度 50mg/L〇
[0037] 富集培养基二：麸皮粉lg、玉米秸杆粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、无机盐营养液lmL，补 充水至100mL，pH4. 5，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓 度 50mg/L。
[0038] 霉菌筛选培养基：PDA培养基800mL，孟加拉红0. 02g，氯霉素0. lg，无机盐营养液 lmL，补水至1000mL，琼脂粉15g。121°C、15min灭菌。孟加拉红和氯霉素灭菌后加入。
[0039] 阿魏酸酯酶初筛培养基：PDA培养基100mL，无机盐营养液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，琼脂粉I. 5g，pH4. 5,121°C灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，培养基逐渐 变得不透明，在60-70°C下倒入平板中。其中，阿魏酸乙酯溶液：称取0. 22g阿魏酸乙酯于离 心管中，加入500 μ L N、N-二甲基酰胺溶液，震荡溶解后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0040] 纤维素酶初筛培养基：纤维素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，无机盐营养液lmL， 琼脂1. 5,加蒸馏水定容至100mL，pH值4. 5。121°C灭菌15min。
[0041] 固体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL，琼脂粉I. 5g，pH5. 0,121°C， 15min灭菌。
[0042] 液体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL。121°C，15min灭菌。
[0043] 液体发酵培养基：PDA培养基80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温80 0. 5mL， (NH4)2SO4 lg，补充去离子水至 100mL。121°C，15min 灭菌。
[0044] 上述培养基中，无机盐营养液：NaNO3 2. 0g，K2PO4 I. 5g，CaCl2 I. 5g，MgSO4 0· 3g， FeSO4 · 7H20 0· lg，MnSO4 · H2O I. 6mg，ZnSO4 · H2O 0· 05g，CoCl2 0· 5mg，（NH4)2SO4 5g，去离 子水 1000 mL。
[0045] PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。称取200g马铃薯，洗 净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，添加蔗糖20g，补充水至1000mL。
[0046] 表1产阿魏酸酯酶霉菌平板初筛结果
[0047]
[0048]
[0049] 表2产纤维素酶霉菌平板初筛结果
[0050]
[0051] 表3各菌株粗酶液酶活
[0052]
[0054] 本发明所得菌株AWS26,菌落在PDA平板上呈辐射状快速生长，初期菌丝表面疏 松、平坦，白色，因产生分生孢子而呈现淡绿色，以后逐渐增多，呈深绿色。菌丝层致密、较 厚，产孢丛束排列成同心轮纹状，菌落背面无色。在放大400倍的光学显微镜下观察，菌丝 体由具有横隔的分枝菌丝构成，孢子梗由菌丝直立生出，分枝繁复，近似直角伸出，对生或 互生，呈树枝状排列，孢子梗长5. 0-12. 0 μ m，中间宽2. 5-3. 7 μ m，基部宽L 5-3. 0。分生孢 子成簇着生于分生孢子梗的顶端。分生孢子球形或椭圆形，大小为3. 0-4. 5X2. 5-3. 8 μ m， 表面粗糙，布满小刺，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。对照《真菌鉴定手册》 和相关文献确定该菌株是深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0055] 提取本发明菌株AWS26基因组，依据真菌18SrDNA中最保守的序列设计引物， 扩增采用上游引物：5' -CCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（如SEQ ID NO. 2所示），下游引物： 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（如 SEQ ID NO. 30.所示）。反应条件为：95°C预变性 5min， 94°C变性40S，52°C退火40S，72°C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。 扩增产物连接 PMD18-T 载体。PCR 反应体系为：10XBuffer2yL，dNTP(2. 5mmol/L)2yL，上 游引物 I UL，下游引物 I yL，templatelO ~50ng，Taq 酶（2. 5U)0. 3μ 1，加水补足 20yL。 经PCR扩增得到其18S rDNA片段712bp。将该扩增片段凝胶回收并测序，提交GenBank进 行核酸同源性分析，测得序列如 SEQ ID NO. 1所示，与从NCBI中比对获得的相近霉菌的 18SrDNA序列采用ClustalXl. 83进行多序列比对，然后采用MEGA4. 0生物学软件构建系统 进化树，结果显不菌株AWS26的18SrDNA核苷酸序列与Trichodermaatroviride (JX462604) 的18S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性（maxident)达到99%。综合结合其形态 特征、培养特征观察，将菌株AWS26鉴定为深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0056] 实施例2
[0057] 本实施例说明以深绿木霉为菌株固态发酵法制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，包 括以下步骤：
[0058] 步骤1，菌种制备：首先，在无菌条件下挑取两环保藏的试管菌种孢子接种于活 化斜面培养基上活化，30-35?培养箱培养3-5天；然后，向活化好的深绿木霉斜面中注入 ImL无菌生理盐水，移液枪反复吹打斜面孢子，进一步将孢子浓度稀释至IO7个/mL，再接 种孢子数含量为以上浓度的孢子悬浮液2mL到装有50g固态孢子培养基的250mL三角瓶 中，充分摇动三角瓶使孢子同培养基充分混勾，30-40 °C培养箱培养3-4天，每天翻动一次 固态培养基；最后，在500mL三角瓶中装IOOmL液体种子培养基，灭菌冷却，接种2mL孢子 浓度为I. 2-1. 6X108cfu/mL的孢子悬液，置于旋转式摇床上30-40°C培养l-2d，摇床转速 16〇-250r/min。
[0059] 活化斜面培养基配方：土豆浸出液100mL，麸皮浸出液100mL，无机盐液lmL，蔗糖 lg，琼脂粉 3g，ρΗ5· 0-6. 0,121°C灭菌 15min。
[0060] 固态孢子培养基配方：麸皮5g，玉米粉lg，谷糠 lg，豆饼粉2g，无机盐溶液lmL，土 豆浸出液8mL，121°C灭菌15min。
[0061] 深绿木霉孢子悬液的制备：在无菌条件下，将无菌生理盐水倒入深绿木霉孢子培 养好的三角瓶中，使生理盐水完全覆盖固体培养基，然后将三角瓶置于磁力搅拌机上中速 搅拌30min，使得充分打碎菌丝体，从而释放孢子，然后将制备好的孢子悬液取样在雪球计 数板上计数，调节孢子浓度至1. 2-1. 6 X 108cfu/mL。
[0062] 补料液体营养液的制备：玉米秸杆、黄豆秸杆、地瓜秧均粉碎至40目，按照质量 比1:1:1混合，然后向固体混合物中加入去离子水至浓度为10%，煮沸30min，过滤去除深 褐色滤液。向滤渣中加入浓度为1 %的稀硫酸，固体混合物：稀硫酸=1:10 (g/l〇〇mL)，于 121°0水解211，冷却至60°0并在该温度下用0&(0!1) 2调节水解液至？!110.0,60°0水浴保温 30-40min，冷却至室温，过滤除去滤渣并保留水解液，再用HCl调节pH至6. 0,即得到补料液 体营养液。
[0063] 步骤2,深绿木霉三角瓶固态发酵：在500mL三角瓶中加入固态培养基50g，121°C 灭菌后接入深绿木霉液体种子2ml，35-40 °C条件下培养2-3d，再将温度提高至40-45 °C条 件下继续培养2天后，无菌条件下向三角瓶中添加补料液体营养液10-20ml，将三角瓶摇晃 均匀，再将温度降至30-37?下继续培养至7-8d，每天晃动三角瓶2次，在该发酵条件下产 酶量为：176. 35U/g。
[0064] 固态发酵培养基：玉米秸杆粉lg，大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米 粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，无机盐液的起始pH5. 0,装 250mL三角瓶中，121°C，灭菌20min。
[0065] 无机盐液：（NH4)2SO4L 25g，尿素 lg，KH2PO4L 0g，MgSO4 · 7Η200· 5g，NaNO3O. 2g， FeCl30.0 2g，吐温-80 0· 5mL，水 500mL。
[0066] 土豆浸出液的制备方法：100g土豆切成Icm3方块，煮沸30min，4层纱布过滤后，补 充水至100mL。
[0067] 麸皮浸出液的制备方法：麸皮15g，加水100mL，煮沸30min，过滤得滤液，补充水至 IOOmL0
[0068] 步骤3,深绿木霉曲盘固态发酵：在三角瓶固态发酵的基础上进行了曲盘放大 试验。曲盘大小为：36cmX20cmX6cm，装料量为180克培养基/曲盘。固液比1.2: I (g/100mL)，初始pH5. 5, 33-35°C下静止培养72h，期间翻曲3-4次，然后添加补料液体营养 液20ml，温度调至35-40°C，继续培养24h，中间翻曲2次；最后将温度降至28-32°C，再培养 24h。酶活达到205. 14U/g干曲。
[0069] 曲盘固态培养基配方为：大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼 粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，无机盐液的起始pH5. 0,装三角瓶中， 121°C 灭菌 20min。
[0070] 无机盐液：（NH4)2SO4L 25g，尿素 lg，KH2PO4L Og，MgSO4 · 7Η200· 5g，NaNO3O. 2g， FeCl30.0 2g，吐温-80 0· 5mL，水 500mL。
[0071] 土豆浸出液的制备方法：100g土豆切成Icm3方块，煮沸30min，4层纱布过滤后，补 充水至100mL。
[0072] 步骤4,阿魏酸酯酶粗酶制剂制备：将步骤3所得粗酶液依次经过浸提、超滤、旋转 蒸发，得粗酶浓缩液。
[0073] 浸提：向培养后的固体曲中按浸提比（w/v) 1:10的量加入蒸馏水，于50°C浸提lh， 四层纱布过滤，虑液8000r/min离心10min，上清液保存备用。向上清液中中按20g/L的量 加入颗粒状活性炭，70°C脱色30min，然后过滤除去活性炭渣滓。
[0074] 超滤：利用截留分子量为120kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2)对脱色后 的粗酶液超滤分离，超滤截留液的体积减少至原体积的6~10%时，添加去离子水至原体 积的1/2,继续超滤至截留液为原体积的3-5%。收集两次的滤出液。超滤条件：进口压力 0· 3MPa，出口压力0· 2MPa，流速I. 4L/h。利用截留分子量为40kDa的平板式超滤膜（聚醚 砜材质，0. 09m2)对上部获得的滤出液进行超滤浓缩，当超滤至截留液为原体积的30%时， 停止超滤，收集截留液。分离条件：进口压力〇· 4MPa，出口压力0· 5MPa，流速I. lL/h。
[0075] 旋转蒸发浓缩：用旋转蒸发仪，0. 09MPa，50°C减压蒸发浓缩超滤后的阿魏酸酯酶 粗酶液，浓缩至浓缩前体积的20-30时，停止浓缩。
[0076] 步骤5,粗酶制剂制备：将步骤4所得粗酶浓缩液依次经过硫酸铵分级沉淀、脱盐、 脱色、超滤、离子交换层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析后，冷冻干燥，得纯品。
[0077] 硫酸铵分级沉淀：将盛有IOOmL粗酶的烧杯放在另一个装有冰水的大烧杯中，然 后将大烧杯置于磁力搅拌器上，一边搅拌一边慢慢加入烘干研磨后的硫酸铵至饱和度为 20%，加完后继续搅拌30min，使硫酸铵充分溶解，4°C冰箱中放置6h后，5000r/min离心 20min，除去沉淀。然后按着上述操作再加入硫酸铵至饱和度为80%。4°C冰箱中放置6h 后，5000r/min离心20min。沉淀用5-10体积的纯水溶解，上清液透析除盐后，测定其蛋白 含量和酶活力。
[0078] 脱盐柱脱盐：将硫酸铵80%饱和度的沉淀物用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl缓 冲液溶解，上Sephacryl S-100凝胶过滤柱脱盐。 过滤凝胶色谱柱的洗脱液为pH8. 6的 lOmmol/Tris-HCl 缓冲液。
[0079] 脱色：将粉末活性碳放入烘箱中IKTC烘lh，使其活化。在酶液中加入3%活性碳， 振荡混勾IOmin后，10000r/min、4°C离心10min后以除去沉淀。
[0080] 超滤：将50% -80%和80% -100%的沉淀下的蛋白溶液，脱色后，在10000r/min、 4°C下离心15min，用0. 45 μπι的微孔滤膜过滤后，进行超滤。
[0081] DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析：用三倍柱体积的 0· 05mol/L、ρΗ7· 0 的 Tris-HCl 缓冲溶液平衡 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析柱（40mmX 250mm)， 超滤后的粗酶液12000r/min离心5min，取5-10mL上清液上样。然后用0. 05mol/L、pH7. 0 的Tris-HCl缓冲溶液，以0. 5mL/min的速度冲洗3倍柱体积以除去未吸附杂质，再以 0-0· 8mol/L的NaCl (用0· 05mol/L，pH7. 1的Tris-HCl缓冲溶液配制）进行梯度洗脱，流速 0. 5mL/min，每管收集4mL，层析完成后收集阿魏酸酯酶活性管并测定蛋白含量，透析脱盐， 冷冻干燥后备用。深绿木霉阿魏酸醋酶经过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析后， 分别测定蛋白质含量和酶活力，结果见图1。其中酶活力主要集中在52~95管，但蛋白峰 主要集中在20-60管。可以看出，离子交换层析已经分离出大部分的杂蛋白，效果较好。收 集活性峰透析过夜，冷冻干燥后进行疏水层析。
[0082] Toyopearl Butyl_650C 疏水柱层析：用 Toyopearl Butyl_650C(Φ 1.0 cmX IOcm) 疏水相互作用柱进行分离，使用I. 〇~Omol/L的硫酸铵溶液进行梯度洗脱，活性组分合并， 并用lOmmol/L Tris-HCl，pH7. 5的缓冲液彻底透析脱盐后进一步凝胶过滤层析。
[0083] Sephacryl S-200凝胶过滤层析：经疏水层析后得到的样品进行Sephacryl S-200 分子筛层析（1.0 cmX 120cm)。用 0. 02mol/L pH7. 0 的 Tris-HCl 缓冲溶液平衡 Sephacryl S-200凝胶过滤层析柱过夜。疏水层析后的样品超滤浓缩，吸取l-2ml上样。用0. 05mol/L pH7. 1的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速0. 4mL/min，每管收集lmL，对收集管中的溶液进 行酶活和蛋白浓度测定。洗脱图谱见图2。阿魏酸酯酶活性峰集中在35~60管之间，分别 收集后透析除盐，冷冻干燥，得到阿魏酸酯酶纯品。
[0084] 深绿木霉所产阿魏酸醋酶经过硫酸按沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交 换层析，Toyopearl Butyl 650C疏水柱层析以及SephacrylS-200凝胶过滤层析等纯化步 骤后，阿魏酸酯酶纯化了 219倍，活性回收率为27%。变性和非变性凝胶电泳显示纯化后的 阿魏酸酯酶为单一条带，如图3泳道1箭头所示，说明该阿魏酸酯酶已经为电泳纯。通过与 标准分子量蛋白对照进行对比，分子量为94kD。
【主权项】
1. 一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤： 步骤1，菌种制备：挑取菌种孢子接种于活化斜面培养基上活化，30-35°C培养箱培养 3-5天，用生理盐水将活化好的深绿木霉稀释至孢子浓度为IO7个/mL，再接种所得孢子悬 浮液2mL到50g固态孢子培养基中，30-40 °C培养箱培养3-4天，用生理盐水将孢子浓度 稀释至I. 2-1. 6X108cfu/mL，然后接种2mL孢子悬液到IOOmL液体种子培养基，置于摇床 30-40°C培养l-2d，摇床转速 160-250r/min; 步骤2,深绿木霉三角瓶固态发酵：将步骤1所得深绿木霉液体种子2mL接种到固态 培养基50g，35-40°C培养2-3d，将温度提高至40-45°C继续培养2天，添加补料液体营养液 10-20mL，再将温度降至30-37 °C下培养7-8d; 步骤3,深绿木霉曲盘固态发酵：在三角瓶固态发酵的基础上进行曲盘放大试验，曲 盘大小为36cmX20cmX6cm，装料量为180克培养基/曲盘，固液比1. 2:1，初始pH5. 5， 33-35°C下静止培养72h，期间翻曲3-4次，然后添加补料液体营养液20mL，温度调至 35-40°C，继续培养24h，中间翻曲2次，最后将温度降至28-32°C，再培养24h，得粗酶液； 步骤4,阿魏酸酯酶粗酶制剂制备：将步骤3所得粗酶液依次经过浸提、超滤、旋转蒸 发，得粗酶浓缩液； 步骤5,粗酶制剂制备：将步骤4所得粗酶浓缩液依次经过硫酸铵分级沉淀、脱盐、脱 色、超滤、离子交换层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析后，冷冻干燥，得纯品。2. 根据权利要求1所述的深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步 骤1中活化斜面培养基配方：土豆浸出液100mL，麸皮浸出液100mL，无机盐液lmL，蔗糖lg， 琼脂粉3g，pH5.0-6.0，121°C灭菌15min;固态孢子培养基配方：麸皮5g，玉米粉lg，谷糠 lg，豆饼粉2g，无机盐溶液lmL，土豆浸出液8mL，121°C灭菌15min;液体种子培养基配方： 麸皮浸出液100mL，土豆浸出液100mL，鹿糖lg，无机盐溶液lmL，pH5. 0,121°C灭菌20min。3. 根据权利要求1所述的深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步 骤2中固态发酵培养基配方：玉米秸杆粉lg，大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米 粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，121°C灭菌20min。4. 根据权利要求1所述的深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步 骤3中曲盘固态培养基配方为：大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼粉 2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，121°C灭菌20min。5. 根据权利要求1所述的深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步 骤3中所述补料液体营养液的制备方法为：玉米秸杆、黄豆秸杆、地瓜秧均粉碎至40目，按 照质量比1: 1:1混合，然后向固体混合物中加入去离子水至浓度为l〇wt%，煮沸30min，过滤 去除深褐色滤液，向滤渣中加入浓度为lv/v%的稀硫酸，固体混合物和稀硫酸的质量体积 比为1:10,于121°C水解2h，冷却至60°C并在该温度下用0&(011)2调节水解液至？1110.0， 60°C水浴保温30-40min，冷却至室温，过滤除去滤渣并保留水解液，再用HCl调节pH至 6. 0,即得到补料液体营养液。
【专利摘要】本发明公开了一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的准备、三角瓶固态发酵、曲盘固态发酵、粗酶制剂制备、粗酶制剂纯化的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶，得到的酶制剂酶活力高、耐酸性好、耐热能力强，该制备方法发酵周期短、能耗少、水的消耗量低、对环境污染程度低、单位产量大，具有极好的工业化应用前景。CGMCC No.867320140102
【IPC分类】C12N9/18, C12R1/885, C12N1/14
【公开号】CN104894084
【申请号】CN201510268302
【发明人】高兆建, 刘恩岐, 唐仕荣, 张建萍, 孙会刚, 徐大伟, 杨宪瑶
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯 酶的方法。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸醋酶（E. C13. I. L 73, feruloyl esterase，FAE)是近来研宄较热的一种羧 酸酯酶，它是一种胞外酶，可以水解阿魏酸甲酯、多糖阿魏酸酯等中的酯键，将释放出游离 的阿魏酸单体或二聚体。在食品和医药领域中，利用阿魏酸酯酶来降解植物细胞壁中的阿 魏酸酯键，可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。阿魏酸是桂皮酸的一种衍生物， 其化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，也是一种天然的抗氧化剂，对心血管疾病、糖尿 病、老年痴呆症和肿瘤等疾病有治疗作用。
[0003] 在饲料工业中，农作物秸杆等饲料细胞壁中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等木 质素分子以醋键方式与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上限制了瘤胃微生 物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。经阿魏酸酯酶处理后，饲料原料变得较为疏 松，能加快植物细胞壁等成分在瘤胃的降解速度，提高反刍动物对饲料的消化程度。在造纸 工业中，经阿魏酸酯酶处理的原料，木质素更容易脱除，因而可以减少制浆工序中化学药品 的使用量。
[0004] 作用深绿木霉阿魏酸酯酶作为耐热性耐酸阿魏酸酯酶，可以弥补阿魏酸酯酶应用 上的不足，其最适PH为6. 5-7. 5,可适用于一些消化道程酸性的家畜。同时，该酶具有良好 的耐热性，可有效抵御饲料制粒膨化过程中高温引起的酶失活。因此耐热性耐酸阿魏酸酯 酶具有重要的应用价值。
[0005] 目前阿魏酸的生产方法主要包括化学合成法和碱解法，但这两种方法均存在一定 的缺陷。化学合成法反应步骤多、周期长；碱解法的原料谷维素在米糠中含量低，产量受限； 此外，这两种方法都具有污染性，因此酶法生产阿魏酸成为近年来研宄的热点。固态发酵生 产酶制剂作为酶制剂工业一个重要发展方向，以其发酵周期短、能耗少、水的消耗量较低、 对环境污染程度低、单位产量大等优点受到广泛的重视。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的 准备、三角瓶固态发酵、曲盘固态发酵、粗酶制剂制备、粗酶制剂纯化的工艺步骤制备耐热 阿魏酸酯酶，所得酶制剂不仅耐酸性好，而且具有较强的耐热能力。
[0007] 所述的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26,已于2014年1月2日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号：CGMCC No. 8673。
[0008] 所述深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤1，菌种制备：挑取菌种孢子接种于活化斜面培养基上活化，30-35?培养箱 培养3-5天，用生理盐水将活化好的深绿木霉稀释至孢子浓度为IO7个/mL，再接种所得孢 子悬浮液2mL到50g固态孢子培养基中，30-40°C培养箱培养3-4天，用生理盐水将孢子浓 度稀释至I. 2-1. 6X 108cfu/mL，然后接种2mL孢子悬液到IOOmL液体种子培养基，置于摇床 30-40°C培养 l-2d，摇床转速 160-250r/min ;
[0010] 步骤2,深绿木霉三角瓶固态发酵：将步骤1所得深绿木霉液体种子2mL接种到固 态培养基50g，35-40°C培养2-3d，将温度提高至40-45°C继续培养2天，添加补料液体营养 液10-20mL，再将温度降至30-37°C下培养7-8d ;
[0011] 步骤3,深绿木霉曲盘固态发酵：在三角瓶固态发酵的基础上进行曲盘放大试验， 曲盘大小为36cmX20cmX6cm，装料量为180克培养基/曲盘，固液比1.2:1，初始？册.5， 33-35 °C下静止培养72h，期间翻曲3-4次，然后添加补料液体营养液20mL，温度调至 35-40°C，继续培养24h，中间翻曲2次，最后将温度降至28-32°C，再培养24h，得粗酶液；
[0012] 步骤4,阿魏酸酯酶粗酶制剂制备：将步骤3所得粗酶液依次经过浸提、超滤、旋转 蒸发，得粗酶浓缩液；
[0013] 步骤5,粗酶制剂纯化：将步骤4所得粗酶浓缩液依次经过硫酸铵分级沉淀、脱盐、 脱色、超滤、离子交换层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析后，冷冻干燥，得纯品。
[0014] 作为上述发明的进一步改进，步骤1中活化斜面培养基配方：土豆浸出液100mL， 麸皮浸出液100mL，无机盐液lmL，鹿糖lg，琼脂粉3g，pH5. 0-6. 0,121°C灭菌15min ;固态孢 子培养基配方：麸皮5g，玉米粉lg，谷糠 lg，豆饼粉2g，无机盐溶液lmL，土豆浸出液8mL， 121°C灭菌15min ;液体种子培养基配方：麸皮浸出液100mL，土豆浸出液100mL，蔗糖lg，无 机盐溶液 lmL，ρΗ5· 0,121°C 灭菌 20min。
[0015] 作为上述发明的进一步改进，步骤2中固态发酵培养基配方：玉米秸杆粉lg，大豆 秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无 机盐液 10mL，121°C 灭菌 20min。
[0016] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中曲盘固态培养基配方为：大豆秸杆粉2g，地 瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL， 121°C 灭菌 20min。
[0017] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中所述补料液体营养液的制备方法为：玉米 秸杆、黄豆秸杆、地瓜秧均粉碎至40目，按照质量比1:1:1混合，然后向固体混合物中加入 去离子水至浓度为1〇?七％，煮沸3〇!1^11，过滤去除深褐色滤液，向滤渣中加入浓度为1 ￥八％ 的稀硫酸，固体混合物和稀硫酸的质量体积比为1:10,于121°C水解2h，冷却至60°C并在该 温度下用Ca (OH) 2调节水解液至pH10. 0,60°C水浴保温30-40min，冷却至室温，过滤除去滤 渣并保留水解液，再用HCl调节pH至6. 0,即得到补料液体营养液。
[0018] 本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本发明采用营养液补料法，在原 发酵的基础上，进一步发酵产酶，显著提高了单位培养基产酶量，酶活高达：17. 92U/g ;第 二，该方法所得阿魏酸酯酶，不仅耐酸性好，而且具有较强的耐热能力，特别适合用作饲用 酶制剂；第三，粗酶制剂经过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、疏水柱层析以及凝胶过滤层析 等纯化步骤后，阿魏酸酯酶纯化了 219倍，活性回收率为27% ;第四，发酵周期短、能耗少、 水的消耗量低、对环境污染程度低、单位产量大。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例2中阿魏酸酯酶离子交换层析后洗脱图谱；
[0020] 图2为实施例2中阿魏酸酯酶分子筛凝胶过滤层析后洗脱图谱；
[0021] 图3为实施例2中阿魏酸酯酶纯化电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 本实施例说明深绿木霉AWS26的筛选方法，具体步骤如下：
[0024] 步骤1，采样及样品处理：
[0025] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，160r/min振荡30min，制成悬 液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，lOOr/min震荡处理20-30min，得土样 浑浊液。
[0026] 步骤2,富集培养 ：
[0027] 吸取2-4mL步骤1所得土样浑浊液，加至装有30-60mL富集培养基一的容量为 250mL的三角瓶中，于45-50°C、转速160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d，得富集培养液。 无菌操作量取30-50mL富集培养液，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，用富集培养 基二将离心后的沉淀洗至装有30-60mL富集培养基二的250mL三角瓶中，于45-50°C、转速 160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
[0028] 步骤3,初筛：
[0029] 将第二次富集后的培养液逐级稀释到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各级稀释的培养液 0. 2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿 口封好，并置于37-40°C恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45°C恒温培养 箱中继续倒置培养2-4d。
[0030] 将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分 别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基，接种好的培养皿40-45°C恒温培养箱 中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。 将纤维素酶初筛平板上加入一定量〇. 1 %的刚果红染液，染色Ι-lOmin，倒掉染色液，观察 菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯 酶初筛培养基平板上接种出来，进一步复筛。阿魏酸酯酶和纤维素酶初筛平板检测结果分 别如表1和表2所不。
[0031] 步骤4,复筛：
[0032] 将步骤3初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45 °C恒温培养箱中培 养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化。
[0033] 步骤5,菌种保藏：
[0034] 将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35_40°C下培养3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/ min转速下37-40°C进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10 % (v/v)的接种量，将液体 种子接种到液体发酵培养中，在160_180r/min转速下40-45°C进行液体震荡发酵培养。发 酵培养3-5d，取发酵液1200r/min，IOmin离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶 活性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高 酶活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面 培养基上，4°C保藏。复筛结果如表3所示，综合考虑阿魏酸酯酶和纤维素酶的酶活情况，选 择菌株AWS26作为目的菌株。
[0035] 其中，所使用的培养基配方如下：
[0036] 富集培养基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纤维素钠0. 5g，无机盐营养液lmL，补充 水至100mL，pH4. 5，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度 50mg/L〇
[0037] 富集培养基二：麸皮粉lg、玉米秸杆粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、无机盐营养液lmL，补 充水至100mL，pH4. 5，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓 度 50mg/L。
[0038] 霉菌筛选培养基：PDA培养基800mL，孟加拉红0. 02g，氯霉素0. lg，无机盐营养液 lmL，补水至1000mL，琼脂粉15g。121°C、15min灭菌。孟加拉红和氯霉素灭菌后加入。
[0039] 阿魏酸酯酶初筛培养基：PDA培养基100mL，无机盐营养液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，琼脂粉I. 5g，pH4. 5,121°C灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，培养基逐渐 变得不透明，在60-70°C下倒入平板中。其中，阿魏酸乙酯溶液：称取0. 22g阿魏酸乙酯于离 心管中，加入500 μ L N、N-二甲基酰胺溶液，震荡溶解后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0040] 纤维素酶初筛培养基：纤维素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，无机盐营养液lmL， 琼脂1. 5,加蒸馏水定容至100mL，pH值4. 5。121°C灭菌15min。
[0041] 固体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL，琼脂粉I. 5g，pH5. 0,121°C， 15min灭菌。
[0042] 液体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL。121°C，15min灭菌。
[0043] 液体发酵培养基：PDA培养基80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温80 0. 5mL， (NH4)2SO4 lg，补充去离子水至 100mL。121°C，15min 灭菌。
[0044] 上述培养基中，无机盐营养液：NaNO3 2. 0g，K2PO4 I. 5g，CaCl2 I. 5g，MgSO4 0· 3g， FeSO4 · 7H20 0· lg，MnSO4 · H2O I. 6mg，ZnSO4 · H2O 0· 05g，CoCl2 0· 5mg，（NH4)2SO4 5g，去离 子水 1000 mL。
[0045] PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000mL。称取200g马铃薯，洗 净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，添加蔗糖20g，补充水至1000mL。
[0046] 表1产阿魏酸酯酶霉菌平板初筛结果
[0047]
[0048]
[0049] 表2产纤维素酶霉菌平板初筛结果
[0050]
[0051] 表3各菌株粗酶液酶活
[0052]
[0054] 本发明所得菌株AWS26,菌落在PDA平板上呈辐射状快速生长，初期菌丝表面疏 松、平坦，白色，因产生分生孢子而呈现淡绿色，以后逐渐增多，呈深绿色。菌丝层致密、较 厚，产孢丛束排列成同心轮纹状，菌落背面无色。在放大400倍的光学显微镜下观察，菌丝 体由具有横隔的分枝菌丝构成，孢子梗由菌丝直立生出，分枝繁复，近似直角伸出，对生或 互生，呈树枝状排列，孢子梗长5. 0-12. 0 μ m，中间宽2. 5-3. 7 μ m，基部宽L 5-3. 0。分生孢 子成簇着生于分生孢子梗的顶端。分生孢子球形或椭圆形，大小为3. 0-4. 5X2. 5-3. 8 μ m， 表面粗糙，布满小刺，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。对照《真菌鉴定手册》 和相关文献确定该菌株是深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0055] 提取本发明菌株AWS26基因组，依据真菌18SrDNA中最保守的序列设计引物， 扩增采用上游引物：5' -CCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（如SEQ ID NO. 2所示），下游引物： 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（如 SEQ ID NO. 30.所示）。反应条件为：95°C预变性 5min， 94°C变性40S，52°C退火40S，72°C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。 扩增产物连接 PMD18-T 载体。PCR 反应体系为：10XBuffer2yL，dNTP(2. 5mmol/L)2yL，上 游引物 I UL，下游引物 I yL，templatelO ~50ng，Taq 酶（2. 5U)0. 3μ 1，加水补足 20yL。 经PCR扩增得到其18S rDNA片段712bp。将该扩增片段凝胶回收并测序，提交GenBank进 行核酸同源性分析，测得序列如 SEQ ID NO. 1所示，与从NCBI中比对获得的相近霉菌的 18SrDNA序列采用ClustalXl. 83进行多序列比对，然后采用MEGA4. 0生物学软件构建系统 进化树，结果显不菌株AWS26的18SrDNA核苷酸序列与Trichodermaatroviride (JX462604) 的18S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性（maxident)达到99%。综合结合其形态 特征、培养特征观察，将菌株AWS26鉴定为深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0056] 实施例2
[0057] 本实施例说明以深绿木霉为菌株固态发酵法制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，包 括以下步骤：
[0058] 步骤1，菌种制备：首先，在无菌条件下挑取两环保藏的试管菌种孢子接种于活 化斜面培养基上活化，30-35?培养箱培养3-5天；然后，向活化好的深绿木霉斜面中注入 ImL无菌生理盐水，移液枪反复吹打斜面孢子，进一步将孢子浓度稀释至IO7个/mL，再接 种孢子数含量为以上浓度的孢子悬浮液2mL到装有50g固态孢子培养基的250mL三角瓶 中，充分摇动三角瓶使孢子同培养基充分混勾，30-40 °C培养箱培养3-4天，每天翻动一次 固态培养基；最后，在500mL三角瓶中装IOOmL液体种子培养基，灭菌冷却，接种2mL孢子 浓度为I. 2-1. 6X108cfu/mL的孢子悬液，置于旋转式摇床上30-40°C培养l-2d，摇床转速 16〇-250r/min。
[0059] 活化斜面培养基配方：土豆浸出液100mL，麸皮浸出液100mL，无机盐液lmL，蔗糖 lg，琼脂粉 3g，ρΗ5· 0-6. 0,121°C灭菌 15min。
[0060] 固态孢子培养基配方：麸皮5g，玉米粉lg，谷糠 lg，豆饼粉2g，无机盐溶液lmL，土 豆浸出液8mL，121°C灭菌15min。
[0061] 深绿木霉孢子悬液的制备：在无菌条件下，将无菌生理盐水倒入深绿木霉孢子培 养好的三角瓶中，使生理盐水完全覆盖固体培养基，然后将三角瓶置于磁力搅拌机上中速 搅拌30min，使得充分打碎菌丝体，从而释放孢子，然后将制备好的孢子悬液取样在雪球计 数板上计数，调节孢子浓度至1. 2-1. 6 X 108cfu/mL。
[0062] 补料液体营养液的制备：玉米秸杆、黄豆秸杆、地瓜秧均粉碎至40目，按照质量 比1:1:1混合，然后向固体混合物中加入去离子水至浓度为10%，煮沸30min，过滤去除深 褐色滤液。向滤渣中加入浓度为1 %的稀硫酸，固体混合物：稀硫酸=1:10 (g/l〇〇mL)，于 121°0水解211，冷却至60°0并在该温度下用0&(0!1) 2调节水解液至？!110.0,60°0水浴保温 30-40min，冷却至室温，过滤除去滤渣并保留水解液，再用HCl调节pH至6. 0,即得到补料液 体营养液。
[0063] 步骤2,深绿木霉三角瓶固态发酵：在500mL三角瓶中加入固态培养基50g，121°C 灭菌后接入深绿木霉液体种子2ml，35-40 °C条件下培养2-3d，再将温度提高至40-45 °C条 件下继续培养2天后，无菌条件下向三角瓶中添加补料液体营养液10-20ml，将三角瓶摇晃 均匀，再将温度降至30-37?下继续培养至7-8d，每天晃动三角瓶2次，在该发酵条件下产 酶量为：176. 35U/g。
[0064] 固态发酵培养基：玉米秸杆粉lg，大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米 粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，无机盐液的起始pH5. 0,装 250mL三角瓶中，121°C，灭菌20min。
[0065] 无机盐液：（NH4)2SO4L 25g，尿素 lg，KH2PO4L 0g，MgSO4 · 7Η200· 5g，NaNO3O. 2g， FeCl30.0 2g，吐温-80 0· 5mL，水 500mL。
[0066] 土豆浸出液的制备方法：100g土豆切成Icm3方块，煮沸30min，4层纱布过滤后，补 充水至100mL。
[0067] 麸皮浸出液的制备方法：麸皮15g，加水100mL，煮沸30min，过滤得滤液，补充水至 IOOmL0
[0068] 步骤3,深绿木霉曲盘固态发酵：在三角瓶固态发酵的基础上进行了曲盘放大 试验。曲盘大小为：36cmX20cmX6cm，装料量为180克培养基/曲盘。固液比1.2: I (g/100mL)，初始pH5. 5, 33-35°C下静止培养72h，期间翻曲3-4次，然后添加补料液体营养 液20ml，温度调至35-40°C，继续培养24h，中间翻曲2次；最后将温度降至28-32°C，再培养 24h。酶活达到205. 14U/g干曲。
[0069] 曲盘固态培养基配方为：大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼 粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，无机盐液的起始pH5. 0,装三角瓶中， 121°C 灭菌 20min。
[0070] 无机盐液：（NH4)2SO4L 25g，尿素 lg，KH2PO4L Og，MgSO4 · 7Η200· 5g，NaNO3O. 2g， FeCl30.0 2g，吐温-80 0· 5mL，水 500mL。
[0071] 土豆浸出液的制备方法：100g土豆切成Icm3方块，煮沸30min，4层纱布过滤后，补 充水至100mL。
[0072] 步骤4,阿魏酸酯酶粗酶制剂制备：将步骤3所得粗酶液依次经过浸提、超滤、旋转 蒸发，得粗酶浓缩液。
[0073] 浸提：向培养后的固体曲中按浸提比（w/v) 1:10的量加入蒸馏水，于50°C浸提lh， 四层纱布过滤，虑液8000r/min离心10min，上清液保存备用。向上清液中中按20g/L的量 加入颗粒状活性炭，70°C脱色30min，然后过滤除去活性炭渣滓。
[0074] 超滤：利用截留分子量为120kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2)对脱色后 的粗酶液超滤分离，超滤截留液的体积减少至原体积的6~10%时，添加去离子水至原体 积的1/2,继续超滤至截留液为原体积的3-5%。收集两次的滤出液。超滤条件：进口压力 0· 3MPa，出口压力0· 2MPa，流速I. 4L/h。利用截留分子量为40kDa的平板式超滤膜（聚醚 砜材质，0. 09m2)对上部获得的滤出液进行超滤浓缩，当超滤至截留液为原体积的30%时， 停止超滤，收集截留液。分离条件：进口压力〇· 4MPa，出口压力0· 5MPa，流速I. lL/h。
[0075] 旋转蒸发浓缩：用旋转蒸发仪，0. 09MPa，50°C减压蒸发浓缩超滤后的阿魏酸酯酶 粗酶液，浓缩至浓缩前体积的20-30时，停止浓缩。
[0076] 步骤5,粗酶制剂制备：将步骤4所得粗酶浓缩液依次经过硫酸铵分级沉淀、脱盐、 脱色、超滤、离子交换层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析后，冷冻干燥，得纯品。
[0077] 硫酸铵分级沉淀：将盛有IOOmL粗酶的烧杯放在另一个装有冰水的大烧杯中，然 后将大烧杯置于磁力搅拌器上，一边搅拌一边慢慢加入烘干研磨后的硫酸铵至饱和度为 20%，加完后继续搅拌30min，使硫酸铵充分溶解，4°C冰箱中放置6h后，5000r/min离心 20min，除去沉淀。然后按着上述操作再加入硫酸铵至饱和度为80%。4°C冰箱中放置6h 后，5000r/min离心20min。沉淀用5-10体积的纯水溶解，上清液透析除盐后，测定其蛋白 含量和酶活力。
[0078] 脱盐柱脱盐：将硫酸铵80%饱和度的沉淀物用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl缓 冲液溶解，上Sephacryl S-100凝胶过滤柱脱盐。 过滤凝胶色谱柱的洗脱液为pH8. 6的 lOmmol/Tris-HCl 缓冲液。
[0079] 脱色：将粉末活性碳放入烘箱中IKTC烘lh，使其活化。在酶液中加入3%活性碳， 振荡混勾IOmin后，10000r/min、4°C离心10min后以除去沉淀。
[0080] 超滤：将50% -80%和80% -100%的沉淀下的蛋白溶液，脱色后，在10000r/min、 4°C下离心15min，用0. 45 μπι的微孔滤膜过滤后，进行超滤。
[0081] DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析：用三倍柱体积的 0· 05mol/L、ρΗ7· 0 的 Tris-HCl 缓冲溶液平衡 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析柱（40mmX 250mm)， 超滤后的粗酶液12000r/min离心5min，取5-10mL上清液上样。然后用0. 05mol/L、pH7. 0 的Tris-HCl缓冲溶液，以0. 5mL/min的速度冲洗3倍柱体积以除去未吸附杂质，再以 0-0· 8mol/L的NaCl (用0· 05mol/L，pH7. 1的Tris-HCl缓冲溶液配制）进行梯度洗脱，流速 0. 5mL/min，每管收集4mL，层析完成后收集阿魏酸酯酶活性管并测定蛋白含量，透析脱盐， 冷冻干燥后备用。深绿木霉阿魏酸醋酶经过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析后， 分别测定蛋白质含量和酶活力，结果见图1。其中酶活力主要集中在52~95管，但蛋白峰 主要集中在20-60管。可以看出，离子交换层析已经分离出大部分的杂蛋白，效果较好。收 集活性峰透析过夜，冷冻干燥后进行疏水层析。
[0082] Toyopearl Butyl_650C 疏水柱层析：用 Toyopearl Butyl_650C(Φ 1.0 cmX IOcm) 疏水相互作用柱进行分离，使用I. 〇~Omol/L的硫酸铵溶液进行梯度洗脱，活性组分合并， 并用lOmmol/L Tris-HCl，pH7. 5的缓冲液彻底透析脱盐后进一步凝胶过滤层析。
[0083] Sephacryl S-200凝胶过滤层析：经疏水层析后得到的样品进行Sephacryl S-200 分子筛层析（1.0 cmX 120cm)。用 0. 02mol/L pH7. 0 的 Tris-HCl 缓冲溶液平衡 Sephacryl S-200凝胶过滤层析柱过夜。疏水层析后的样品超滤浓缩，吸取l-2ml上样。用0. 05mol/L pH7. 1的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速0. 4mL/min，每管收集lmL，对收集管中的溶液进 行酶活和蛋白浓度测定。洗脱图谱见图2。阿魏酸酯酶活性峰集中在35~60管之间，分别 收集后透析除盐，冷冻干燥，得到阿魏酸酯酶纯品。
[0084] 深绿木霉所产阿魏酸醋酶经过硫酸按沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交 换层析，Toyopearl Butyl 650C疏水柱层析以及SephacrylS-200凝胶过滤层析等纯化步 骤后，阿魏酸酯酶纯化了 219倍，活性回收率为27%。变性和非变性凝胶电泳显示纯化后的 阿魏酸酯酶为单一条带，如图3泳道1箭头所示，说明该阿魏酸酯酶已经为电泳纯。通过与 标准分子量蛋白对照进行对比，分子量为94kD。
【主权项】
1. 一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤： 步骤1，菌种制备：挑取菌种孢子接种于活化斜面培养基上活化，30-35°C培养箱培养 3-5天，用生理盐水将活化好的深绿木霉稀释至孢子浓度为IO7个/mL，再接种所得孢子悬 浮液2mL到50g固态孢子培养基中，30-40 °C培养箱培养3-4天，用生理盐水将孢子浓度 稀释至I. 2-1. 6X108cfu/mL，然后接种2mL孢子悬液到IOOmL液体种子培养基，置于摇床 30-40°C培养l-2d，摇床转速 160-250r/min; 步骤2,深绿木霉三角瓶固态发酵：将步骤1所得深绿木霉液体种子2mL接种到固态 培养基50g，35-40°C培养2-3d，将温度提高至40-45°C继续培养2天，添加补料液体营养液 10-20mL，再将温度降至30-37 °C下培养7-8d; 步骤3,深绿木霉曲盘固态发酵：在三角瓶固态发酵的基础上进行曲盘放大试验，曲 盘大小为36cmX20cmX6cm，装料量为180克培养基/曲盘，固液比1. 2:1，初始pH5. 5， 33-35°C下静止培养72h，期间翻曲3-4次，然后添加补料液体营养液20mL，温度调至 35-40°C，继续培养24h，中间翻曲2次，最后将温度降至28-32°C，再培养24h，得粗酶液； 步骤4,阿魏酸酯酶粗酶制剂制备：将步骤3所得粗酶液依次经过浸提、超滤、旋转蒸 发，得粗酶浓缩液； 步骤5,粗酶制剂制备：将步骤4所得粗酶浓缩液依次经过硫酸铵分级沉淀、脱盐、脱 色、超滤、离子交换层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析后，冷冻干燥，得纯品。2. 根据权利要求1所述的深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步 骤1中活化斜面培养基配方：土豆浸出液100mL，麸皮浸出液100mL，无机盐液lmL，蔗糖lg， 琼脂粉3g，pH5.0-6.0，121°C灭菌15min;固态孢子培养基配方：麸皮5g，玉米粉lg，谷糠 lg，豆饼粉2g，无机盐溶液lmL，土豆浸出液8mL，121°C灭菌15min;液体种子培养基配方： 麸皮浸出液100mL，土豆浸出液100mL，鹿糖lg，无机盐溶液lmL，pH5. 0,121°C灭菌20min。3. 根据权利要求1所述的深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步 骤2中固态发酵培养基配方：玉米秸杆粉lg，大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米 粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，121°C灭菌20min。4. 根据权利要求1所述的深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步 骤3中曲盘固态培养基配方为：大豆秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼粉 2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL，121°C灭菌20min。5. 根据权利要求1所述的深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步 骤3中所述补料液体营养液的制备方法为：玉米秸杆、黄豆秸杆、地瓜秧均粉碎至40目，按 照质量比1: 1:1混合，然后向固体混合物中加入去离子水至浓度为l〇wt%，煮沸30min，过滤 去除深褐色滤液，向滤渣中加入浓度为lv/v%的稀硫酸，固体混合物和稀硫酸的质量体积 比为1:10,于121°C水解2h，冷却至60°C并在该温度下用0&(011)2调节水解液至？1110.0， 60°C水浴保温30-40min，冷却至室温，过滤除去滤渣并保留水解液，再用HCl调节pH至 6. 0,即得到补料液体营养液。
【专利摘要】本发明公开了一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的准备、三角瓶固态发酵、曲盘固态发酵、粗酶制剂制备、粗酶制剂纯化的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶，得到的酶制剂酶活力高、耐酸性好、耐热能力强，该制备方法发酵周期短、能耗少、水的消耗量低、对环境污染程度低、单位产量大，具有极好的工业化应用前景。CGMCC No.867320140102
【IPC分类】C12N9/18, C12R1/885, C12N1/14
【公开号】CN104894084
【申请号】CN201510268302
【发明人】高兆建, 刘恩岐, 唐仕荣, 张建萍, 孙会刚, 徐大伟, 杨宪瑶
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
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