一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法
一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，属于生物技术酶制剂技术领域。
【背景技术】
[0002] 几丁质酶（Chitinase，EC3. 2. 1. 14)是催化几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖或低 聚合度几丁寡糖的水解酶（Henrissat，1999)，从而把不溶性几丁质变成可利用的碳源。几 丁质酶在自然界中分布广泛，目前已从多种植物（Santos et al·，2004; Patel et al·， 2010; Zhang et al·，2013)、真菌（Gruber et al·，2011; Narayanan et al·，2013)、细 菌（Dai et al. , 2011; Frederiksen et al. , 2013)、昆虫（Arakane & Muthukrishnan, 2010)甚至脊椎动物动物中发现几丁质酶（Guan et al.，2009)。但每种几丁质酶所发挥 的作用不径相同，细菌和真菌产几丁质酶主要是由于养分的需求，几丁质酶对于真菌除养 分的需求外，在菌体生长及形态形成方面也起着重要的作用，而几丁质酶在动物及植物当 中主要作用为抵御外界致病因素的侵入。研宄发现在动物和植物当中，几丁质酶除了防御 相关功能外，在生长及应激机制中均发挥着重要的作用（Kasprzewska, 2003)。近年来，由 于几丁寡糖制备、几丁质生物转化和生物防治等方面的应用，几丁质酶成为研宄的热点和 趋势。
[0003] 众所周知，在酶法制备几丁寡糖过程中，需先用无机酸与粉末几丁质制得胶体几 丁质，用水将其洗涤至适当的PH后加入几丁质酶反应，将反应产物通过膜过滤和层析等手 段得到不同聚合度几丁寡糖以满足不同用途的需求，反应温度一般控制在40 - 90°C，pH - 般控制在2. 5 - 7. 5范围内。制备几丁质寡糖普遍遇到的难题是高活力酶的获得和几丁质 胶体大量制备这两大瓶颈，由此可以看出获得具有较高反应温度及较低反应PH的高效几 丁质酶是提高几丁寡糖生产效率和降低生产成本的关键因素。
[0004] 在至今发现的几丁质酶当中，来源于微生物的几丁质酶的最适温度一般在 40-50°C，最适pH大部分在 5 左右（Lee et al·，2009; Li et al·，2010; Okay et al·， 2013)，相对而言，植物来源的几丁质酶最适温度较高，一般在40 - 60°C，最适pH与微生物来 源的几丁质酶相近，但部分植物来源的几丁质酶具有较低的最适pH(<4)(Santos et al.， 2004; Wang et al·，2012; Zhang et al·，2013)。但同时具有较高反应温度和较低反应 PH特性的几丁质酶较为罕见，所以获得具有适宜工业化生产的优良特性的几丁质酶任是人 们关注的热点。
[0005] 由于几丁质与壳聚糖（脱乙酰几丁质）是许多病原真菌和昆虫的基本结构成份， 所以几丁质酶在生物防治中发挥着重要作用。在抗真菌研宄当中，人们已获得多种来源的 具有抗真菌特性的几丁质酶，其中来源于植物的几丁质酶具有较广泛的抗真菌能力，研宄 证明提纯的烟草、马铃薯、黄瓜、菜豆、豌豆、鹰嘴豆、甜菜、水稻、小麦、大麦、玉米等的几丁 质酶对20多种真菌的菌丝生长或抱子萌发具有抑制作用（Brogue et al.，1991)，但每种 几丁质酶的抗菌谱是不同的。例如：膜夹黄芪来源的几丁质酶对茄病镰刀菌、灰霉病、尖孢 镰刀菌和绿色木霉有抑制作用（Kopparapu et al.，2011);而柿子来源的几丁质酶仅对绿 色木霉有抑制作用（Zhang et al.，2013)。所以获得具有广泛抗真菌特性且抗菌能力强的 几丁质酶将为生物防治提供有力的支持，减少农药残留给环境和人们所带来的危害。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供一种制备宝珠梨几丁质酶纯化 产物的方法。本发明特异性高，工艺简单，蛋白不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具 有很好的推广应用价值，本发明通过以下技术方案实现。
[0007] -种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，其具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固 体硫酸铵至饱和度20%~40%，然后放入冰水浴中搅拌0. 5~lh，搅拌完成后进行冷冻离心 10~20min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80~100%，放入冰水 浴中搅拌〇. 5~lh、冷冻离心10~20min获取沉淀物，将沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗 酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF 强阴离子交换柱，流速为I. 〇~2. OmL . mirT1，用含0~100mMNaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液 线性洗脱，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。
[0008] 所述步骤1和步骤2中的Tris-HCl缓冲液pH为7. 4~8. 5,步骤1和步骤2中 Tris-HCl缓冲液的加入量分别为5~10mL、10~20个柱体积。
[0009] 上述洗脱液收集的柱体积和缓冲液的柱体积所选择的规格一致。
[0010] 上述制备得到的宝珠梨几丁质酶分子量为28. 9kDa，最适pH为5. 0,在pH2. 5~6. 0 的范围内稳定，酶的最适反应温度为70° C，在低于70° C温度条件下稳定。
[0011] 上述制备得到的宝珠梨几丁质酶可将胶体几丁质水解为几丁二糖、几丁三糖和 ，乙酰葡萄糖胺，其中几丁二糖为主要降解产物中的应用，并能水解几丁二糖为，乙酰葡 萄糖胺的功能。
[0012] 上述制备得到的宝珠梨几丁质酶能抑制尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、绿色木霉、水稻纹 枯菌、腐皮镰孢菌等真菌致病。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明提供一种特异性高，工艺简单，蛋白不易失活，纯化 效果好，回收率高，成本低的宝珠梨几丁质酶纯化方法，同时研宄了纯酶的酶学特性、水解 特性及抑菌特性，为该酶的应用提供了一定的理论依据。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶纯化过程电泳图； 图2是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶最适pH测试图， 图3是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶pH稳定性测试图； 图4是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶最适温度测试图； 图5是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶温度稳定性测试图； 图6是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶水解胶体几丁质和几丁寡糖(几丁 二糖、几丁三糖、几丁四糖）的水解进程图； 图7是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶抑制尖孢镰刀菌（a)、灰葡萄孢 (b )、绿色木霉（c )、水稻纹枯菌（d)、腐皮镰孢菌（e )致病真菌图。
[0015] 上述图2、图3、图4和图5中?为氯化钾/盐酸（pHl. 0 - 2. 0)、为甘氨酸/ 盐酸缓冲液（pH2. 0 - 3. 5)、Λ为磷酸/柠檬酸缓冲液（pH2. 5 - 5. 0)、▲为MES缓冲液 (ρΗ4· 5 - 7. 0)、·为醋酸缓冲液（pH4. 0 - 5. 5)、〇为 MOPS 冲液（ρΗ6· 5 - 8. 0)，?为 CHES 缓 冲液（pH8. 0 - 10. 0); 上述图6中a为胶体几丁质水解进程TLC图，b，c，d分别为几丁二糖、几丁三糖及几丁 四糖的水解进程TLC图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和【具体实施方式】，对本发明作进一步说明。
[0017] 下述实施例的主要原料及试剂乙酰葡萄糖、几丁二糖、几丁三糖和几丁四糖 购自Megazyme公司；粉末几丁质、壳聚糖和乙二醇壳聚糖(底物）均购自Sigma公司；KC1、 MgSO4. 7!120、0&(：12、恥0!1、苯酚、(：1150 4.5!120以及酒石酸钾钠等购自北京化工厂；3,5-二硝基 水杨酸购自上海远帆制剂厂。
[0018] 实施例1 该宝珠梨几丁质酶的纯化方法，其具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体 硫酸铵至饱和度40%，然后放入冰水浴中搅拌I. 0h，搅拌完成后进行冷冻离心（离心速率为 1000 OXg) lOmin，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸按粉末至饱和度为80%，放入 冰水浴中搅拌1.0 K冷冻离心（离心速率为1000 OXg) IOmin获取沉淀物，将沉淀用20mM、 pH7. 4、5mL的Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF 强阴离子交换柱，流速为l.OmL . rnirT1(前后均一致)，用含0~100mMNaCl的20mMTris-HCl 缓冲溶液线性洗脱10个柱体积，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。
[0019] 对实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶纯化产物进行如下检测及测试： (一）对上述实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶采用DNS法（Miller. 1959)测定酶活 力，采用Lowry法（Lowery et al.，1951)测定蛋白质含量，纯化表如表1所示(表中的比酶 活=总酶活/总蛋白）。
[0020] 表1宝珠梨几丁质酶纯化表
其中酶活力测定方法：几丁质酶活力测定为100 μ L适当稀释的酶液加入到100 μ L浓 度为l〇g . L-1的胶体几丁质（用50mM、pH5. 0 MES缓冲液配置）中，70° C水浴反应30min 后采用DNS法测定产生的还原糖量，以葡萄糖为标准。酶活力单位（U)定义为在以上条件 下，每分钟反应生成Iymol，乙酰葡萄糖所需要的酶量。
[0021] 胶体几丁质参照Lee等（Lee et al.，2007)的方法自制：将IOg几丁质称于烧杯 中，搅拌着加入IOOmL浓盐酸，于4° C放置24 h。将被盐酸溶解的糊状几丁质置于研钵中， 再加 IOOmL浓盐酸，研磨均勾，加入500mL 50%乙醇，不断搅拌至胶体充分析出。将胶体置 于低速离心机，3000rpm离心10min，倒去上清，在胶体中加蒸馏水，搅拌离心，重复此步骤 直至pH至7左右。最后将胶体加蒸馏水至浓度4%，4° C保存。
[0022] 从表1中可以看出纯化产物中几丁质酶含量较高，回收率也较高。
[0023] (二）SDS-PAGE法检测蛋白大小 将实施例1得到的宝珠梨几丁质酶纯化产物用SDS-PAGE法检测蛋白纯度，结果如图 1所示，其中泳道标记M为标准品，1为宝珠梨汁，2为40-80%饱和度的硫酸铵沉淀产物， 3为经过QSFF纯化后收集的纯化产物，从图1可以看出3为较明显的单一条带，大 小为 28. 9kDa，与已知的几丁质酶的大小一致，进一步说明，得到的纯化产物是几丁质酶。
[0024] (三）宝珠梨几丁质酶纯化产物的测序 质谱条件及测定方法：采用ESI-MS/MS法进行几丁质酶(纯化产物）的肽段序列分 析，对几丁质酶(纯化产物）进行SDS-PAGE电泳，上样量为10 μ g，将几丁质酶(纯化产物） 条带切下放入试样管中，送往国家生物医学分析中心进行质谱测定。获得的四个肽段的 序列分别为，肽段 I :VLLSIGGASGSYSLTSADDAR，肽段 2 :SQVLPTIK，肽段 3 !YGGVMLWSR，肽 段 4 :WYDINSGYSASIK。经 NCBI 数据库比对，4 个肽段与来源于 等真菌的III型几丁质酶内部肽段具有较高的同源性。因 此，该几丁质酶很可能属于III型几丁质酶。
[0025] (四）宝珠梨几丁质酶纯化产物的酶学性质、底物特异性及水解特性 1、宝珠梨几丁质酶纯化产物最适pH和pH稳定性检测 宝珠梨几丁质酶纯化产物最适PH的测定：将上述得到的宝珠梨几丁质酶(纯化产 物）溶于不同pH值的7种不同缓冲液体系中（氯化钾/盐酸（pHl. O - 2. 0)、甘氨酸/盐酸 (口!12.0-3.5)、磷酸/柠檬酸（？!12.5-5.0)、醋酸（？!14.0-5.5)、1^3(2-(^吗啉代）乙 磺酸）（pH 4.5-7.0)、M0PS (3- (N-吗啉基）丙磺酸）（pH6.5-8.0)、CHES (N-2-环已胺 基乙磺酸)(pH8. O - 10. 0))，然后在60° C条件下测定几丁质酶的酶活力，酶活力测定方法 同上。
[0026] pH稳定性的测定：用上述不同的pH值缓冲液分别稀释纯酶液，将稀释好的酶液置 于40° C水浴中分别处理30min，迅速将样品置于冰水中冷却30min，然后测定残余酶活力， 酶活力测定方法同上。以未经处理的酶液作为对照，最后计算残余酶活力占未处理对照酶 活力的百分比。
[0027] 最适pH及pH稳定性的结果如图2和3所示，从图2和3可以看出，测得宝珠梨几 丁质酶纯化产物最适pH为5. 0,该酶在pH2. 5 - 6. O的范围内稳定，在pH2. O时，酶活力保持 75%以上。说明该酶能够在极酸性pH范围下具有较高的催化能力，适用于几丁寡糖生产，简 化几丁寡糖生产中胶体几丁质的处理步骤。
[0028] 2、宝珠梨几丁质酶纯化产物最适反应温度和温度稳定性检测 宝珠梨几丁质酶纯化产物最适反应温度的测定：将上述得到的几丁质酶(纯化产物）适 当稀释于50mM、pH5. O的MES缓冲液中，然后分别在30 - 90° C下按照上述方法测定几丁 质酶的酶活力，酶活力测定方法同上。
[0029] 宝珠梨几丁质酶纯化产物温度稳定性测定：将宝珠梨几丁质酶纯化产物分别在 不同的温度下处理30min，缓冲液为50mM、pH5. O的MES缓冲液，然后置于冰水浴中冷却 30min，最后按标准的方法测定残余酶活力，酶活力测定方法同上。以未经处理的酶液作为 对照。
[0030] 宝珠梨几丁质酶纯化产物的最适温度及温度稳定性的结果如图4和5所示，该酶 的最适温度为70° C，在<70° C时保持稳定。
[0031] 3、宝珠梨几丁质酶纯化产物底物特异性测定 底物特异性：选择壳聚糖、粉末几丁质、乙二醇几丁质、乙二醇壳聚糖和羧甲基纤维素 为底物，测定酶活，底物终浓度采用1% (W/V)。结果表明该酶仅对胶体几丁质具有活性，对 粉末几丁质、壳聚糖以及其衍生物和纤维素均不具有活性。
[0032] 4、宝珠梨几丁质酶纯化产物水解特性 用50mM，pH5. OMES缓冲液配置1% (w/v)的各种相关底物，在底物中按照0· 2?!/1的 量加入由一得到的宝珠梨几丁质酶纯化产物，65° C水解8h，每隔一定时间取样，样品煮沸 5min终止水解反应，水解生成的产物通过Kieselgel60 (Merck)薄层层析（TLC)法进行定 性分析（图6, a为胶体几丁质水解进程TLC图，b，c，d分别为几丁二糖、几丁三糖及几丁四 糖的水解进程TLC图，其中M为标准品：Cl为，乙酰葡萄糖胺；C2为几丁二糖；C3为几丁 三糖；C4为几丁四糖)。薄层层析的展层系统为正丁醇：乙酸：水=2 :l:l(v/v)，样品点完 后将硅胶板用展层剂展开两次，吹干后用显色。显色方法如下：试剂：对二甲氨基苯甲醛/ 乙酰丙酮，检出物：氨基糖类。
[0033] 溶液I :5mL 50%氢氧化钾溶液与20mL无水乙醇混勾，取此溶液0. 5mL，加乙酰丙 酮0. 5mL与正丁醇50mL的混合液10mL，此两种溶液均需新鲜配制，临用前混合； 溶液II :lg对二甲氨基苯甲醛溶于30mL无水乙醇中，再加30mL浓盐酸，需要时此溶液 可用正丁醇180mL稀释。
[0034] 定性分析方法：先喷溶液I后于105° C加热5min，再喷溶液II，然后于90° C干 燥 5min〇
[0035] 宝珠梨几丁质酶纯化产物水解特性如图6所示，结果表明水解胶体几丁质，主要 产生N-乙酰葡萄糖胺及几丁二糖，并有少量几丁三糖生成。水解几丁三糖和几丁四糖主要 产物与胶体几丁质类似，能够一定程度水解几丁二糖生成，乙酰葡萄糖胺。说明此酶同时 具有几丁二糖酶和N-乙酰胺基葡萄糖苷酶活性。
[0036] 5、宝珠梨几丁质酶纯化产物抗菌特性 菌种绿色木霉（斤icAoofe/ma ririofe)、灰葡萄孢（ciflerea)、腐皮镰孢 菌{Fusarium solani)、尖魏Hj]魯{Fusarium oxysporum)、：/]f、爆级祐魯{Rhizoctonia sWmi )均购于广东省微生物研宄所微生物菌种保藏中心。将真菌接种在直径为9cm的PDA 培养皿中心，置于28° C培养，待菌丝向外蔓延的圆面直径约2 - 3cm时，在离菌丝生长边 缘约0. 5cm处放置灭菌的牛津杯，在牛津杯中分别滴加约不同量的待测样品（C为20mMol、 pH5. 0的MES缓冲液；A、B分别为相同缓冲液稀释的5(^g和15(^g的样品），置28° C下培 养1 - 2d后观察并记录菌丝生长被抑制的情况。抑制致病真菌图如图7所示，宝珠梨几丁质 酶对受试菌株均有抑制作用，其中对尖孢镰刀菌（a)有较强的抑制作用，对灰葡萄孢（b)、 绿色木霉（c)、水稻纹枯菌（d)、腐皮镰孢菌（e)在几丁质酶含量为15(^g时有明显的抑制作 用。
[0037] 实施例2 该制备宝珠梨几丁质酶纯化产物的方法，其具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体 硫酸铵至饱和度20%，然后放入冰水浴中搅拌0. 5h，搅拌完成后进行冷冻离心（离心速率为 10000 X g) 15min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为100%，放入 冰水浴中搅拌0. 5h、冷冻离心（离心速率为1000 OXg) 15min获取沉淀物，将沉淀用20mM、 pH8. OUOmL的Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过 QSFF强阴离子交换柱，流速为1.5mL . miiT1 (前后均一致)，用含0~100mM NaCl的20mM、 pH8. OTris-HCl缓冲溶液线性洗脱20个柱体积，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁 质酶纯化产物。
[0038] 实施例3 该制备宝珠梨几丁质酶纯化产物的方法，其具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固 体硫酸铵至饱和度30%，然后放入冰水浴中搅拌0. 75h，搅拌完成后进行冷冻离心（离心速 率为1000 OXg) 20min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为90%， 放入冰水浴中搅拌0. 75h、冷冻离心（离心速率为1000 OXg) 20min获取沉淀物，将沉淀用 20mM、pH8. 5、8mL的Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过 QSFF强阴离子交换柱，流速为2. OmL . miiT1 (前后均一致)，用含0~100mM NaCl的20mM、 pH8. 5Tris-HCl缓冲溶液线性洗脱15个柱体积，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁 质酶纯化产物。
[0039] 以上结合附图对本发明的【具体实施方式】作了详细说明，但是本发明并不限于上述 实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前 提下作出各种变化。
【主权项】
1. 一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，其特征在于具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固 体硫酸铵至饱和度20%~40%，然后放入冰水浴中搅拌0. 5~lh，搅拌完成后进行冷冻离心 10~20min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80~100%，放入冰水 浴中搅拌〇. 5~lh、冷冻离心10~20min获取沉淀物，将沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗 酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF强阴离子交换柱，流速为I. 〇~2.OmL.mirT1，用含0~100mMNaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液 线性洗脱，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。2. 根据权利要求1所述的制备宝珠梨几丁质酶纯化产物的方法，其特征在于：所述步 骤1和步骤2中的Tris-HCl缓冲液pH为7. 4~8. 5,步骤1和步骤2中Tris-HCl缓冲液的 加入量分别为5~10mL、10~20个柱体积。
【专利摘要】本发明涉及一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，属于生物技术酶制剂技术领域首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体硫酸铵至饱和度20%~40%，然后放入冰水浴中搅拌，搅拌完成后进行冷冻离心，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80~100%，放入冰水浴中搅、冷冻离心获取沉淀物，将沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液；将得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，然后用同样缓冲体系平衡的QSFF阴离子交换层析柱进行线性洗脱，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。本发明特异性高，工艺简单，蛋白不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。
【IPC分类】C12N9/42
【公开号】CN104894086
【申请号】CN201510250447
【发明人】韩鹏, 梁小波, 李莉蓉, 杨程程
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，属于生物技术酶制剂技术领域。
【背景技术】
[0002] 几丁质酶（Chitinase，EC3. 2. 1. 14)是催化几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖或低 聚合度几丁寡糖的水解酶（Henrissat，1999)，从而把不溶性几丁质变成可利用的碳源。几 丁质酶在自然界中分布广泛，目前已从多种植物（Santos et al·，2004; Patel et al·， 2010; Zhang et al·，2013)、真菌（Gruber et al·，2011; Narayanan et al·，2013)、细 菌（Dai et al. , 2011; Frederiksen et al. , 2013)、昆虫（Arakane & Muthukrishnan, 2010)甚至脊椎动物动物中发现几丁质酶（Guan et al.，2009)。但每种几丁质酶所发挥 的作用不径相同，细菌和真菌产几丁质酶主要是由于养分的需求，几丁质酶对于真菌除养 分的需求外，在菌体生长及形态形成方面也起着重要的作用，而几丁质酶在动物及植物当 中主要作用为抵御外界致病因素的侵入。研宄发现在动物和植物当中，几丁质酶除了防御 相关功能外，在生长及应激机制中均发挥着重要的作用（Kasprzewska, 2003)。近年来，由 于几丁寡糖制备、几丁质生物转化和生物防治等方面的应用，几丁质酶成为研宄的热点和 趋势。
[0003] 众所周知，在酶法制备几丁寡糖过程中，需先用无机酸与粉末几丁质制得胶体几 丁质，用水将其洗涤至适当的PH后加入几丁质酶反应，将反应产物通过膜过滤和层析等手 段得到不同聚合度几丁寡糖以满足不同用途的需求，反应温度一般控制在40 - 90°C，pH - 般控制在2. 5 - 7. 5范围内。制备几丁质寡糖普遍遇到的难题是高活力酶的获得和几丁质 胶体大量制备这两大瓶颈，由此可以看出获得具有较高反应温度及较低反应PH的高效几 丁质酶是提高几丁寡糖生产效率和降低生产成本的关键因素。
[0004] 在至今发现的几丁质酶当中，来源于微生物的几丁质酶的最适温度一般在 40-50°C，最适pH大部分在 5 左右（Lee et al·，2009; Li et al·，2010; Okay et al·， 2013)，相对而言，植物来源的几丁质酶最适温度较高，一般在40 - 60°C，最适pH与微生物来 源的几丁质酶相近，但部分植物来源的几丁质酶具有较低的最适pH(<4)(Santos et al.， 2004; Wang et al·，2012; Zhang et al·，2013)。但同时具有较高反应温度和较低反应 PH特性的几丁质酶较为罕见，所以获得具有适宜工业化生产的优良特性的几丁质酶任是人 们关注的热点。
[0005] 由于几丁质与壳聚糖（脱乙酰几丁质）是许多病原真菌和昆虫的基本结构成份， 所以几丁质酶在生物防治中发挥着重要作用。在抗真菌研宄当中，人们已获得多种来源的 具有抗真菌特性的几丁质酶，其中来源于植物的几丁质酶具有较广泛的抗真菌能力，研宄 证明提纯的烟草、马铃薯、黄瓜、菜豆、豌豆、鹰嘴豆、甜菜、水稻、小麦、大麦、玉米等的几丁 质酶对20多种真菌的菌丝生长或抱子萌发具有抑制作用（Brogue et al.，1991)，但每种 几丁质酶的抗菌谱是不同的。例如：膜夹黄芪来源的几丁质酶对茄病镰刀菌、灰霉病、尖孢 镰刀菌和绿色木霉有抑制作用（Kopparapu et al.，2011);而柿子来源的几丁质酶仅对绿 色木霉有抑制作用（Zhang et al.，2013)。所以获得具有广泛抗真菌特性且抗菌能力强的 几丁质酶将为生物防治提供有力的支持，减少农药残留给环境和人们所带来的危害。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供一种制备宝珠梨几丁质酶纯化 产物的方法。本发明特异性高，工艺简单，蛋白不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具 有很好的推广应用价值，本发明通过以下技术方案实现。
[0007] -种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，其具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固 体硫酸铵至饱和度20%~40%，然后放入冰水浴中搅拌0. 5~lh，搅拌完成后进行冷冻离心 10~20min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80~100%，放入冰水 浴中搅拌〇. 5~lh、冷冻离心10~20min获取沉淀物，将沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗 酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF 强阴离子交换柱，流速为I. 〇~2. OmL . mirT1，用含0~100mMNaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液 线性洗脱，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。
[0008] 所述步骤1和步骤2中的Tris-HCl缓冲液pH为7. 4~8. 5,步骤1和步骤2中 Tris-HCl缓冲液的加入量分别为5~10mL、10~20个柱体积。
[0009] 上述洗脱液收集的柱体积和缓冲液的柱体积所选择的规格一致。
[0010] 上述制备得到的宝珠梨几丁质酶分子量为28. 9kDa，最适pH为5. 0,在pH2. 5~6. 0 的范围内稳定，酶的最适反应温度为70° C，在低于70° C温度条件下稳定。
[0011] 上述制备得到的宝珠梨几丁质酶可将胶体几丁质水解为几丁二糖、几丁三糖和 ，乙酰葡萄糖胺，其中几丁二糖为主要降解产物中的应用，并能水解几丁二糖为，乙酰葡 萄糖胺的功能。
[0012] 上述制备得到的宝珠梨几丁质酶能抑制尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、绿色木霉、水稻纹 枯菌、腐皮镰孢菌等真菌致病。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明提供一种特异性高，工艺简单，蛋白不易失活，纯化 效果好，回收率高，成本低的宝珠梨几丁质酶纯化方法，同时研宄了纯酶的酶学特性、水解 特性及抑菌特性，为该酶的应用提供了一定的理论依据。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶纯化过程电泳图； 图2是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶最适pH测试图， 图3是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶pH稳定性测试图； 图4是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶最适温度测试图； 图5是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶温度稳定性测试图； 图6是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶水解胶体几丁质和几丁寡糖(几丁 二糖、几丁三糖、几丁四糖）的水解进程图； 图7是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶抑制尖孢镰刀菌（a)、灰葡萄孢 (b )、绿色木霉（c )、水稻纹枯菌（d)、腐皮镰孢菌（e )致病真菌图。
[0015] 上述图2、图3、图4和图5中?为氯化钾/盐酸（pHl. 0 - 2. 0)、为甘氨酸/ 盐酸缓冲液（pH2. 0 - 3. 5)、Λ为磷酸/柠檬酸缓冲液（pH2. 5 - 5. 0)、▲为MES缓冲液 (ρΗ4· 5 - 7. 0)、·为醋酸缓冲液（pH4. 0 - 5. 5)、〇为 MOPS 冲液（ρΗ6· 5 - 8. 0)，?为 CHES 缓 冲液（pH8. 0 - 10. 0); 上述图6中a为胶体几丁质水解进程TLC图，b，c，d分别为几丁二糖、几丁三糖及几丁 四糖的水解进程TLC图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和【具体实施方式】，对本发明作进一步说明。
[0017] 下述实施例的主要原料及试剂乙酰葡萄糖、几丁二糖、几丁三糖和几丁四糖 购自Megazyme公司；粉末几丁质、壳聚糖和乙二醇壳聚糖(底物）均购自Sigma公司；KC1、 MgSO4. 7!120、0&(：12、恥0!1、苯酚、(：1150 4.5!120以及酒石酸钾钠等购自北京化工厂；3,5-二硝基 水杨酸购自上海远帆制剂厂。
[0018] 实施例1 该宝珠梨几丁质酶的纯化方法，其具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体 硫酸铵至饱和度40%，然后放入冰水浴中搅拌I. 0h，搅拌完成后进行冷冻离心（离心速率为 1000 OXg) lOmin，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸按粉末至饱和度为80%，放入 冰水浴中搅拌1.0 K冷冻离心（离心速率为1000 OXg) IOmin获取沉淀物，将沉淀用20mM、 pH7. 4、5mL的Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF 强阴离子交换柱，流速为l.OmL . rnirT1(前后均一致)，用含0~100mMNaCl的20mMTris-HCl 缓冲溶液线性洗脱10个柱体积，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。
[0019] 对实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶纯化产物进行如下检测及测试： (一）对上述实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶采用DNS法（Miller. 1959)测定酶活 力，采用Lowry法（Lowery et al.，1951)测定蛋白质含量，纯化表如表1所示(表中的比酶 活=总酶活/总蛋白）。
[0020] 表1宝珠梨几丁质酶纯化表
其中酶活力测定方法：几丁质酶活力测定为100 μ L适当稀释的酶液加入到100 μ L浓 度为l〇g . L-1的胶体几丁质（用50mM、pH5. 0 MES缓冲液配置）中，70° C水浴反应30min 后采用DNS法测定产生的还原糖量，以葡萄糖为标准。酶活力单位（U)定义为在以上条件 下，每分钟反应生成Iymol，乙酰葡萄糖所需要的酶量。
[0021] 胶体几丁质参照Lee等（Lee et al.，2007)的方法自制：将IOg几丁质称于烧杯 中，搅拌着加入IOOmL浓盐酸，于4° C放置24 h。将被盐酸溶解的糊状几丁质置于研钵中， 再加 IOOmL浓盐酸，研磨均勾，加入500mL 50%乙醇，不断搅拌至胶体充分析出。将胶体置 于低速离心机，3000rpm离心10min，倒去上清，在胶体中加蒸馏水，搅拌离心，重复此步骤 直至pH至7左右。最后将胶体加蒸馏水至浓度4%，4° C保存。
[0022] 从表1中可以看出纯化产物中几丁质酶含量较高，回收率也较高。
[0023] (二）SDS-PAGE法检测蛋白大小 将实施例1得到的宝珠梨几丁质酶纯化产物用SDS-PAGE法检测蛋白纯度，结果如图 1所示，其中泳道标记M为标准品，1为宝珠梨汁，2为40-80%饱和度的硫酸铵沉淀产物， 3为经过QSFF纯化后收集的纯化产物，从图1可以看出3为较明显的单一条带，大 小为 28. 9kDa，与已知的几丁质酶的大小一致，进一步说明，得到的纯化产物是几丁质酶。
[0024] (三）宝珠梨几丁质酶纯化产物的测序 质谱条件及测定方法：采用ESI-MS/MS法进行几丁质酶(纯化产物）的肽段序列分 析，对几丁质酶(纯化产物）进行SDS-PAGE电泳，上样量为10 μ g，将几丁质酶(纯化产物） 条带切下放入试样管中，送往国家生物医学分析中心进行质谱测定。获得的四个肽段的 序列分别为，肽段 I :VLLSIGGASGSYSLTSADDAR，肽段 2 :SQVLPTIK，肽段 3 !YGGVMLWSR，肽 段 4 :WYDINSGYSASIK。经 NCBI 数据库比对，4 个肽段与来源于 等真菌的III型几丁质酶内部肽段具有较高的同源性。因 此，该几丁质酶很可能属于III型几丁质酶。
[0025] (四）宝珠梨几丁质酶纯化产物的酶学性质、底物特异性及水解特性 1、宝珠梨几丁质酶纯化产物最适pH和pH稳定性检测 宝珠梨几丁质酶纯化产物最适PH的测定：将上述得到的宝珠梨几丁质酶(纯化产 物）溶于不同pH值的7种不同缓冲液体系中（氯化钾/盐酸（pHl. O - 2. 0)、甘氨酸/盐酸 (口!12.0-3.5)、磷酸/柠檬酸（？!12.5-5.0)、醋酸（？!14.0-5.5)、1^3(2-(^吗啉代）乙 磺酸）（pH 4.5-7.0)、M0PS (3- (N-吗啉基）丙磺酸）（pH6.5-8.0)、CHES (N-2-环已胺 基乙磺酸)(pH8. O - 10. 0))，然后在60° C条件下测定几丁质酶的酶活力，酶活力测定方法 同上。
[0026] pH稳定性的测定：用上述不同的pH值缓冲液分别稀释纯酶液，将稀释好的酶液置 于40° C水浴中分别处理30min，迅速将样品置于冰水中冷却30min，然后测定残余酶活力， 酶活力测定方法同上。以未经处理的酶液作为对照，最后计算残余酶活力占未处理对照酶 活力的百分比。
[0027] 最适pH及pH稳定性的结果如图2和3所示，从图2和3可以看出，测得宝珠梨几 丁质酶纯化产物最适pH为5. 0,该酶在pH2. 5 - 6. O的范围内稳定，在pH2. O时，酶活力保持 75%以上。说明该酶能够在极酸性pH范围下具有较高的催化能力，适用于几丁寡糖生产，简 化几丁寡糖生产中胶体几丁质的处理步骤。
[0028] 2、宝珠梨几丁质酶纯化产物最适反应温度和温度稳定性检测 宝珠梨几丁质酶纯化产物最适反应温度的测定：将上述得到的几丁质酶(纯化产物）适 当稀释于50mM、pH5. O的MES缓冲液中，然后分别在30 - 90° C下按照上述方法测定几丁 质酶的酶活力，酶活力测定方法同上。
[0029] 宝珠梨几丁质酶纯化产物温度稳定性测定：将宝珠梨几丁质酶纯化产物分别在 不同的温度下处理30min，缓冲液为50mM、pH5. O的MES缓冲液，然后置于冰水浴中冷却 30min，最后按标准的方法测定残余酶活力，酶活力测定方法同上。以未经处理的酶液作为 对照。
[0030] 宝珠梨几丁质酶纯化产物的最适温度及温度稳定性的结果如图4和5所示，该酶 的最适温度为70° C，在<70° C时保持稳定。
[0031] 3、宝珠梨几丁质酶纯化产物底物特异性测定 底物特异性：选择壳聚糖、粉末几丁质、乙二醇几丁质、乙二醇壳聚糖和羧甲基纤维素 为底物，测定酶活，底物终浓度采用1% (W/V)。结果表明该酶仅对胶体几丁质具有活性，对 粉末几丁质、壳聚糖以及其衍生物和纤维素均不具有活性。
[0032] 4、宝珠梨几丁质酶纯化产物水解特性 用50mM，pH5. OMES缓冲液配置1% (w/v)的各种相关底物，在底物中按照0· 2?!/1的 量加入由一得到的宝珠梨几丁质酶纯化产物，65° C水解8h，每隔一定时间取样，样品煮沸 5min终止水解反应，水解生成的产物通过Kieselgel60 (Merck)薄层层析（TLC)法进行定 性分析（图6, a为胶体几丁质水解进程TLC图，b，c，d分别为几丁二糖、几丁三糖及几丁四 糖的水解进程TLC图，其中M为标准品：Cl为，乙酰葡萄糖胺；C2为几丁二糖；C3为几丁 三糖；C4为几丁四糖)。薄层层析的展层系统为正丁醇：乙酸：水=2 :l:l(v/v)，样品点完 后将硅胶板用展层剂展开两次，吹干后用显色。显色方法如下：试剂：对二甲氨基苯甲醛/ 乙酰丙酮，检出物：氨基糖类。
[0033] 溶液I :5mL 50%氢氧化钾溶液与20mL无水乙醇混勾，取此溶液0. 5mL，加乙酰丙 酮0. 5mL与正丁醇50mL的混合液10mL，此两种溶液均需新鲜配制，临用前混合； 溶液II :lg对二甲氨基苯甲醛溶于30mL无水乙醇中，再加30mL浓盐酸，需要时此溶液 可用正丁醇180mL稀释。
[0034] 定性分析方法：先喷溶液I后于105° C加热5min，再喷溶液II，然后于90° C干 燥 5min〇
[0035] 宝珠梨几丁质酶纯化产物水解特性如图6所示，结果表明水解胶体几丁质，主要 产生N-乙酰葡萄糖胺及几丁二糖，并有少量几丁三糖生成。水解几丁三糖和几丁四糖主要 产物与胶体几丁质类似，能够一定程度水解几丁二糖生成，乙酰葡萄糖胺。说明此酶同时 具有几丁二糖酶和N-乙酰胺基葡萄糖苷酶活性。
[0036] 5、宝珠梨几丁质酶纯化产物抗菌特性 菌种绿色木霉（斤icAoofe/ma ririofe)、灰葡萄孢（ciflerea)、腐皮镰孢 菌{Fusarium solani)、尖魏Hj]魯{Fusarium oxysporum)、：/]f、爆级祐魯{Rhizoctonia sWmi )均购于广东省微生物研宄所微生物菌种保藏中心。将真菌接种在直径为9cm的PDA 培养皿中心，置于28° C培养，待菌丝向外蔓延的圆面直径约2 - 3cm时，在离菌丝生长边 缘约0. 5cm处放置灭菌的牛津杯，在牛津杯中分别滴加约不同量的待测样品（C为20mMol、 pH5. 0的MES缓冲液；A、B分别为相同缓冲液稀释的5(^g和15(^g的样品），置28° C下培 养1 - 2d后观察并记录菌丝生长被抑制的情况。抑制致病真菌图如图7所示，宝珠梨几丁质 酶对受试菌株均有抑制作用，其中对尖孢镰刀菌（a)有较强的抑制作用，对灰葡萄孢（b)、 绿色木霉（c)、水稻纹枯菌（d)、腐皮镰孢菌（e)在几丁质酶含量为15(^g时有明显的抑制作 用。
[0037] 实施例2 该制备宝珠梨几丁质酶纯化产物的方法，其具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体 硫酸铵至饱和度20%，然后放入冰水浴中搅拌0. 5h，搅拌完成后进行冷冻离心（离心速率为 10000 X g) 15min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为100%，放入 冰水浴中搅拌0. 5h、冷冻离心（离心速率为1000 OXg) 15min获取沉淀物，将沉淀用20mM、 pH8. OUOmL的Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过 QSFF强阴离子交换柱，流速为1.5mL . miiT1 (前后均一致)，用含0~100mM NaCl的20mM、 pH8. OTris-HCl缓冲溶液线性洗脱20个柱体积，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁 质酶纯化产物。
[0038] 实施例3 该制备宝珠梨几丁质酶纯化产物的方法，其具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固 体硫酸铵至饱和度30%，然后放入冰水浴中搅拌0. 75h，搅拌完成后进行冷冻离心（离心速 率为1000 OXg) 20min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为90%， 放入冰水浴中搅拌0. 75h、冷冻离心（离心速率为1000 OXg) 20min获取沉淀物，将沉淀用 20mM、pH8. 5、8mL的Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过 QSFF强阴离子交换柱，流速为2. OmL . miiT1 (前后均一致)，用含0~100mM NaCl的20mM、 pH8. 5Tris-HCl缓冲溶液线性洗脱15个柱体积，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁 质酶纯化产物。
[0039] 以上结合附图对本发明的【具体实施方式】作了详细说明，但是本发明并不限于上述 实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前 提下作出各种变化。
【主权项】
1. 一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，其特征在于具体步骤如下： 步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固 体硫酸铵至饱和度20%~40%，然后放入冰水浴中搅拌0. 5~lh，搅拌完成后进行冷冻离心 10~20min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80~100%，放入冰水 浴中搅拌〇. 5~lh、冷冻离心10~20min获取沉淀物，将沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗 酶液； 步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF强阴离子交换柱，流速为I. 〇~2.OmL.mirT1，用含0~100mMNaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液 线性洗脱，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。2. 根据权利要求1所述的制备宝珠梨几丁质酶纯化产物的方法，其特征在于：所述步 骤1和步骤2中的Tris-HCl缓冲液pH为7. 4~8. 5,步骤1和步骤2中Tris-HCl缓冲液的 加入量分别为5~10mL、10~20个柱体积。
【专利摘要】本发明涉及一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，属于生物技术酶制剂技术领域首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体硫酸铵至饱和度20%~40%，然后放入冰水浴中搅拌，搅拌完成后进行冷冻离心，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80~100%，放入冰水浴中搅、冷冻离心获取沉淀物，将沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液；将得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，然后用同样缓冲体系平衡的QSFF阴离子交换层析柱进行线性洗脱，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。本发明特异性高，工艺简单，蛋白不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。
【IPC分类】C12N9/42
【公开号】CN104894086
【申请号】CN201510250447
【发明人】韩鹏, 梁小波, 李莉蓉, 杨程程
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
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