一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法
一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农林生物质原料资源化利用和生物技术领域，涉及一种经济高效水解 农林生物质原料制备纤维素糖的方法。 技术背景
[0002] 尽管生物炼制已经成为近年来的研宄热点，但真正的生物质经济时代尚未到来， 利用木质纤维素生产生物能源和生物基产品仍旧面临着许多瓶颈问题，其中基质水解产糖 问题尤为突出。农业废弃物（玉米秸杆、水稻和小麦等）、速生作物（柳枝稷和速生杨等） 和林木（云杉和松树）等生物质具有预处理选择性，导致同种属原料经不同预处理后在组 成和结构上存在显著差异性，而不同种属生物质原料经不同方法预处理后的差异性更大， 这就大大增加了后续酶解的难度。然而，当前商业纤维素酶主要由好氧的纤维素降解真菌 (Trichoderma reesei和Humicola insolens)生产后通过发酵酸预处理玉米稻杆制成，它 们在酶活性和组成方面极其相似，不能满足生物炼制中不同来源木质纤维素原料的需要， 且生产成本较高。
[0003] 尽管杰能科和诺维信两家公司近年几乎同时宣布已能把纤维素乙醇生产的纤维 素酶成本从原每桶5. 4美元降到0. 2美元左右，但许多报道认为酶成本仍然较高，必须继续 降低成本至每桶〇. 03~0. 05美元。由于，⑴不同种属和不同方法预处理木质纤维素的基 质差异性较大，目前来源相同和组成相似的商业纤维素酶制剂不能满足基质特异性需求； ⑵不同来源纤维素酶中的单酶种类及各组分间协同能力存在差异；⑶木质纤维素水解的关 键性酶组分/活性蛋白在总蛋白中含量偏低，比活力不高，这些原因造成了木质纤维素酶 解广糖成本较昂贵。
[0004] 在纤维素酶中添加一些辅助酶和添加剂能够部分解决上述所提出的问题，其原因 是，一些辅助酶能够提高纤维素酶之间的协同作用，更好的水解某一特定的木质纤维素原 料；一些添加剂能够提高原料的可及性、减少木质素的无效吸附以及提高酶的稳定性，达到 提高纤维素酶利用率的效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种经济高效水解农林生物质原料制备纤维素糖的方法。 通过在自产纤维素酶添加辅助酶和添加剂，对甘油有机溶剂预处理的麦草进行酶解，所用 的酶载量低，获得了高的麦草酶解率，为农林生物质原料的高效合理利用奠定了基础。
[0006] 本发明涉及的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法，包括 以下步骤：
[0007] 1、农林生物质原料粉碎：麦草经自然晒干后，切成长度1~5cm的小片段，60~ 80 °C烘干备用。
[0008] 2、原料甘油有机溶剂预处理：原料浓度为5%~15%，初始甘油水溶液浓度为 30~100%，蒸煮温度130~240°C维持1~4h。然后用50%的甘油水溶液洗涤两次，自来 水洗两次，获得的基质烘干测得含水量，用于酶解实验。
[0009] 3、纤维素酶的制备：从里氏木霉试管斜面上挑取一定量的孢子接种于种子培养基 中200~240印111、28~32°0培养24~3011。种子液按照8%~12%的比例接种至发酵培 养基中，220~240rpm、30°C发酵7~9天，所得发酵液经离心后冷冻储存作为实验用的纤 维素酶，并测得其滤纸酶活，CMC酶活，β -葡萄糖苷酶活和木聚糖酶活。
[0010] 种子培养基：土豆20g，葡萄糖20g，去离子水1000mL。
[0011] 发酵培养基为：微晶纤维素5~20g，花生饼粉1~5g，氯化铜0. 05~0. 3g，海 藻糖0· 001~0· 5g，L-抗坏血酸0· 01~0· 5g，PEG10, 0000. 5~5g，480mL柠檬酸缓冲液， 500mL微量元素液，20mL痕量元素液。
[0012] 所述的柠檬酸缓冲液（0· 1M) !Na2HPO4 · 2H20 17. 80g/L，柠檬酸 21. 01g/L。
[0013] 所述的微量元素盐溶液：（NH4)2SO4 2. 8g/L，KH2PCM 4. Og/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L， CaCl2 · 2H20 0· 8g/L。
[0014] 所述的痕量元素：FeS04 · 7H20 250mg/L，MnS04 · H20 85mg/L，ZnSO4 · 7H20 70mg/ L，CoCl2 · 2H20 100mg/L，浓硫酸调到pH为2,过滤除菌。
[0015] 所制得的纤维素酶酶液各种酶活分别为：FPA酶活0. 6~0. 8U/mL，CMC酶活10~ 25U/mL，β -葡萄糖苷酶活0. 6~I. 0U/mL，木聚糖酶酶活40~60U/mL。
[0016] 4、酶解产糖：在2~15%基质浓度中添加纤维素酶2~30FPU/g基质，β-葡萄糖 苷酶5~10U/g基质，木聚糖酶100~120U/g基质，溶菌酶50~100U/g基质，阳离子聚丙 稀酰胺1~l〇mg/g基质，茶阜素1~10mg/g基质，混合后在40~50°C、100~160rpm条 件下酶解48~96h。
[0017] 5、酶解率的测定：分别在预处理麦草酶解了 6h、12h、24h和48h时，取部分酶解液 稀释到合适倍数后用DNS法测定其中的还原糖浓度，并由此推算出酶解率。
[0018] 本发明的优点在于：
[0019] 1)基质处理所用的甘油有机溶剂预处理方法，去除了大部分木质素，纤维素保留 率尚，有利于尚效酶解。
[0020] 2)纤维素酶生产工艺简单，成本低。
[0021] 3)酶解时所用的酶载量小，酶解效率高。
【具体实施方式】
[0022] 以下为本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。
[0023] 实施例1
[0024] 1、甘油有机溶剂预处理麦草的制备：称取IOg烘干的麦草于500mL的三角烧瓶 中，加入147g工业甘油和53g去离子水（甘油浓度70% )。加热套上200rpm搅拌，加热到 220°C时加上冷凝管，维持3h。到达时间后，撤去加热套待温度降至120°C左右后加入150mL 沸水，150rpm搅拌10min，500mL煮沸的50%的甘油水溶液抽滤两次，然后500mL沸水抽滤 两次。
[0025] 2、纤维素酶的制备：从里氏木霉Rut C-30突变株的试管斜面上挑取一定量的孢 子接种于种子培养基中220rpm、30°C培养24h。种子液按照10%的比例接种至发酵培养基 中，220rpm、3(TC发酵7天，所得发酵液经离心后冷冻储存作为实验用的纤维素酶。
[0026] 种子培养基：土豆20g，葡萄糖20g，去离 子水1000mL。
[0027] 发酵培养基为：微晶纤维素15g，花生饼粉lg，氯化铜0. 276g，海藻糖0. 025g， PEG10000 2. 5g，L-抗坏血酸0. 025g，480mL柠檬酸缓冲液，500mL微量元素液，20mL痕量元 素液。
[0028] 所制得的纤维素酶产品的性能为，纤维素酶酶液的各种酶活分别为：FPA酶活 0. 61U/mL，CMC 酶活 18. 72U/mL，BG 酶活 0. 62U/mL，木聚糖酶酶活 51. 82U/mL。
[0029] 3、酶解：称取相当于0. 75g干重的甘油有机溶剂预处理麦草湿基（基质浓度为 5%)于50mL三角瓶中，按下述成分添加：纤维素酶2.5FPU/g基质，Novozyme 188 7.5U/g 基质，Htec 115U/g基质，溶菌酶75U/g基质，阳离子聚丙稀酰胺2mg/g基质，茶阜素8mg/g 基质，补加 pH 4. 8的缓冲溶液到15g，放置温度50°C和转速120rpm水浴摇床上进行酶解。
[0030] 4、测定方法：分别在甘油有机溶剂预处理麦草酶解6h、12h、24h、48h后取样，离心 取上清稀释到合适倍数，用DNS法测定上清液中的含糖量，并转化为甘油有机溶剂预处理 麦草的酶解率。
[0031] 实施例2
[0032] 纤维素酶和甘油有机溶剂预处理麦草的制备与实施例1相同，不同的是酶解时添 加的纤维素酶载量为5FPU/g基质。按照实施例1的方法酶解5%甘油有机溶剂预处理的麦 草。
[0033] 实施例3
[0034] 纤维素酶和甘油有机溶剂预处理麦草的制备与实施例1相同，不同的是酶解时添 加的是5FPU/g基质的商业纤维素酶（诺维信Cellic CTec2)。按照实施例1的方法酶解 5%甘油有机溶剂预处理的麦草。
[0035] 实施例1~3中，甘油有机溶剂预处理麦草的酶解率如表1所示。
[0036] 表1优化定制纤维素酶和商业纤维素酶的酶解
[0037]
[0038] 从实施例2和实施例3可以看出，相同滤纸酶活的复合纤维素酶制剂较商业纤维 素酶更能有效酶解木质纤维素。用5FPU/g基质的复合纤维素酶水解甘油有机溶剂预处理 的麦草，6h酶解率达到66. 3%，短时间内获得较高的酶解率；其12h的酶解效果超过48h商 业纤维素酶，达到91. 4% ;48h时基质内的纤维素和半纤维素几乎完全释放出来，酶解率达 到97. 3 %。从实施例1和实施例3可知，2. 5FPU/g基质的复合纤维素酶水解甘油有机溶剂 预处理麦草的效果优于5FPU/g基质的商业纤维素酶（Cellic CTec2)。因此，采用本发明提 供的一种经济高效水解农林生物质原料制备纤维素糖的方法能够在低酶载量的情况下获 得高的酶解率，有利于农林生物质原料的合理高效利用。
[0039] 需要理解到的是：以上实施例虽然对本发明作了比较详细的说明，但是这些说明， 只是对本发明的简单说明，而不是对本发明的限制，任何不超出本发明实质精神内的发明 创造，均落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法，其特征在于方法步骤 如下： 1) 农林生物质原料粉碎：农林生物质经自然晒干后，切成长度1~5cm的小片段，60~ 80 °C烘干备用。 2) 原料甘油有机溶剂预处理：将原料和甘油水溶液按一定比例混合，加热处理一段时 间后用甘油水溶液洗涤两次，再用自来水洗两次。 3) 纤维素酶发酵：在发酵培养基中外加一些产酶促进剂，灭菌后接入里氏木霉菌株， 在28~32°C和200~240rpm条件下发酵7~9天，发酵完毕后发酵液经6000~8000rpm 离心，上清液作为酶解所用的纤维素酶。 4) 酶解产糖：在2~15%基质浓度中添加纤维素酶2~30FPU/g基质，加入一定量辅 助酶和添加剂后在40~50°C和100~160rpm条件下酶解48~96h。2. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤1)中所述的农林生物质原料是指麦草、稻草、玉米秸杆、玉米芯、棉杆、甘蔗渣、 硬木、软木纤维质废弃物，和草本类植物及它们的任意混合。3. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤2)甘油有机溶剂预处理的原料浓度为5%~15%，初始甘油水溶液浓度为30~ 100%，蒸煮温度130~240°C维持1~4h。4. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤2)甘油有机溶剂预处理涉及自催化和外加催化剂，其中外加催化剂包括酸、碱 和金属盐。5. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤3)发酵培养基中外加促进剂是铜离子0. 3~2. 5mmol/L，海藻糖0. 001~0. 5g/ L，L-抗坏血酸0. 01~0. 5g/L，PEG系列表面活性剂0. 5~5g/L。6. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤4)中所用的辅助酶为0-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和溶菌酶。7. 根据权利要求6所述的辅助酶，其添加量分别为：0 -葡萄糖苷酶0. 5~20U/g基 质，木聚糖酶100~300U/g基质，溶菌酶30~150U/g基质。8. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤4)添加剂为阳离子聚丙烯酰胺和茶皂素。9. 根据权利要求7所述的添加剂，其添加量分别为：阳离子聚丙烯酰胺1~10mg/g基 质，茶阜素1~l〇mg/g基质。10. 根据权利要求1所述的一种酶解产糖糖液，其特性为：葡萄糖浓度10~150g/L，木 糖浓度2~50g/L，酶解率60~99%。
【专利摘要】本发明公开了一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法。本方法首先用甘油有机溶剂预处理打破农林生物质原料的复杂组成和致密结构，使之易于酶解。然后采用里氏木霉液体发酵方式获得纤维素酶。最后将自产纤维素酶与辅助酶和添加剂混合制得复合纤维素酶制剂，用于酶解甘油有机溶剂预处理的生物质基质。与商业纤维素酶相比，本方法所用纤维素酶来源经济，酶解时所需酶载量低，获得的基质酶解率高。
【IPC分类】C12N9/36, C12P19/02, C12N9/42
【公开号】CN104894087
【申请号】CN201510266804
【发明人】孙付保, 谭玲, 张震宇, 苏存生, 沈松
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001] 本发明属于农林生物质原料资源化利用和生物技术领域，涉及一种经济高效水解 农林生物质原料制备纤维素糖的方法。 技术背景
[0002] 尽管生物炼制已经成为近年来的研宄热点，但真正的生物质经济时代尚未到来， 利用木质纤维素生产生物能源和生物基产品仍旧面临着许多瓶颈问题，其中基质水解产糖 问题尤为突出。农业废弃物（玉米秸杆、水稻和小麦等）、速生作物（柳枝稷和速生杨等） 和林木（云杉和松树）等生物质具有预处理选择性，导致同种属原料经不同预处理后在组 成和结构上存在显著差异性，而不同种属生物质原料经不同方法预处理后的差异性更大， 这就大大增加了后续酶解的难度。然而，当前商业纤维素酶主要由好氧的纤维素降解真菌 (Trichoderma reesei和Humicola insolens)生产后通过发酵酸预处理玉米稻杆制成，它 们在酶活性和组成方面极其相似，不能满足生物炼制中不同来源木质纤维素原料的需要， 且生产成本较高。
[0003] 尽管杰能科和诺维信两家公司近年几乎同时宣布已能把纤维素乙醇生产的纤维 素酶成本从原每桶5. 4美元降到0. 2美元左右，但许多报道认为酶成本仍然较高，必须继续 降低成本至每桶〇. 03~0. 05美元。由于，⑴不同种属和不同方法预处理木质纤维素的基 质差异性较大，目前来源相同和组成相似的商业纤维素酶制剂不能满足基质特异性需求； ⑵不同来源纤维素酶中的单酶种类及各组分间协同能力存在差异；⑶木质纤维素水解的关 键性酶组分/活性蛋白在总蛋白中含量偏低，比活力不高，这些原因造成了木质纤维素酶 解广糖成本较昂贵。
[0004] 在纤维素酶中添加一些辅助酶和添加剂能够部分解决上述所提出的问题，其原因 是，一些辅助酶能够提高纤维素酶之间的协同作用，更好的水解某一特定的木质纤维素原 料；一些添加剂能够提高原料的可及性、减少木质素的无效吸附以及提高酶的稳定性，达到 提高纤维素酶利用率的效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种经济高效水解农林生物质原料制备纤维素糖的方法。 通过在自产纤维素酶添加辅助酶和添加剂，对甘油有机溶剂预处理的麦草进行酶解，所用 的酶载量低，获得了高的麦草酶解率，为农林生物质原料的高效合理利用奠定了基础。
[0006] 本发明涉及的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法，包括 以下步骤：
[0007] 1、农林生物质原料粉碎：麦草经自然晒干后，切成长度1~5cm的小片段，60~ 80 °C烘干备用。
[0008] 2、原料甘油有机溶剂预处理：原料浓度为5%~15%，初始甘油水溶液浓度为 30~100%，蒸煮温度130~240°C维持1~4h。然后用50%的甘油水溶液洗涤两次，自来 水洗两次，获得的基质烘干测得含水量，用于酶解实验。
[0009] 3、纤维素酶的制备：从里氏木霉试管斜面上挑取一定量的孢子接种于种子培养基 中200~240印111、28~32°0培养24~3011。种子液按照8%~12%的比例接种至发酵培 养基中，220~240rpm、30°C发酵7~9天，所得发酵液经离心后冷冻储存作为实验用的纤 维素酶，并测得其滤纸酶活，CMC酶活，β -葡萄糖苷酶活和木聚糖酶活。
[0010] 种子培养基：土豆20g，葡萄糖20g，去离子水1000mL。
[0011] 发酵培养基为：微晶纤维素5~20g，花生饼粉1~5g，氯化铜0. 05~0. 3g，海 藻糖0· 001~0· 5g，L-抗坏血酸0· 01~0· 5g，PEG10, 0000. 5~5g，480mL柠檬酸缓冲液， 500mL微量元素液，20mL痕量元素液。
[0012] 所述的柠檬酸缓冲液（0· 1M) !Na2HPO4 · 2H20 17. 80g/L，柠檬酸 21. 01g/L。
[0013] 所述的微量元素盐溶液：（NH4)2SO4 2. 8g/L，KH2PCM 4. Og/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L， CaCl2 · 2H20 0· 8g/L。
[0014] 所述的痕量元素：FeS04 · 7H20 250mg/L，MnS04 · H20 85mg/L，ZnSO4 · 7H20 70mg/ L，CoCl2 · 2H20 100mg/L，浓硫酸调到pH为2,过滤除菌。
[0015] 所制得的纤维素酶酶液各种酶活分别为：FPA酶活0. 6~0. 8U/mL，CMC酶活10~ 25U/mL，β -葡萄糖苷酶活0. 6~I. 0U/mL，木聚糖酶酶活40~60U/mL。
[0016] 4、酶解产糖：在2~15%基质浓度中添加纤维素酶2~30FPU/g基质，β-葡萄糖 苷酶5~10U/g基质，木聚糖酶100~120U/g基质，溶菌酶50~100U/g基质，阳离子聚丙 稀酰胺1~l〇mg/g基质，茶阜素1~10mg/g基质，混合后在40~50°C、100~160rpm条 件下酶解48~96h。
[0017] 5、酶解率的测定：分别在预处理麦草酶解了 6h、12h、24h和48h时，取部分酶解液 稀释到合适倍数后用DNS法测定其中的还原糖浓度，并由此推算出酶解率。
[0018] 本发明的优点在于：
[0019] 1)基质处理所用的甘油有机溶剂预处理方法，去除了大部分木质素，纤维素保留 率尚，有利于尚效酶解。
[0020] 2)纤维素酶生产工艺简单，成本低。
[0021] 3)酶解时所用的酶载量小，酶解效率高。
【具体实施方式】
[0022] 以下为本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。
[0023] 实施例1
[0024] 1、甘油有机溶剂预处理麦草的制备：称取IOg烘干的麦草于500mL的三角烧瓶 中，加入147g工业甘油和53g去离子水（甘油浓度70% )。加热套上200rpm搅拌，加热到 220°C时加上冷凝管，维持3h。到达时间后，撤去加热套待温度降至120°C左右后加入150mL 沸水，150rpm搅拌10min，500mL煮沸的50%的甘油水溶液抽滤两次，然后500mL沸水抽滤 两次。
[0025] 2、纤维素酶的制备：从里氏木霉Rut C-30突变株的试管斜面上挑取一定量的孢 子接种于种子培养基中220rpm、30°C培养24h。种子液按照10%的比例接种至发酵培养基 中，220rpm、3(TC发酵7天，所得发酵液经离心后冷冻储存作为实验用的纤维素酶。
[0026] 种子培养基：土豆20g，葡萄糖20g，去离 子水1000mL。
[0027] 发酵培养基为：微晶纤维素15g，花生饼粉lg，氯化铜0. 276g，海藻糖0. 025g， PEG10000 2. 5g，L-抗坏血酸0. 025g，480mL柠檬酸缓冲液，500mL微量元素液，20mL痕量元 素液。
[0028] 所制得的纤维素酶产品的性能为，纤维素酶酶液的各种酶活分别为：FPA酶活 0. 61U/mL，CMC 酶活 18. 72U/mL，BG 酶活 0. 62U/mL，木聚糖酶酶活 51. 82U/mL。
[0029] 3、酶解：称取相当于0. 75g干重的甘油有机溶剂预处理麦草湿基（基质浓度为 5%)于50mL三角瓶中，按下述成分添加：纤维素酶2.5FPU/g基质，Novozyme 188 7.5U/g 基质，Htec 115U/g基质，溶菌酶75U/g基质，阳离子聚丙稀酰胺2mg/g基质，茶阜素8mg/g 基质，补加 pH 4. 8的缓冲溶液到15g，放置温度50°C和转速120rpm水浴摇床上进行酶解。
[0030] 4、测定方法：分别在甘油有机溶剂预处理麦草酶解6h、12h、24h、48h后取样，离心 取上清稀释到合适倍数，用DNS法测定上清液中的含糖量，并转化为甘油有机溶剂预处理 麦草的酶解率。
[0031] 实施例2
[0032] 纤维素酶和甘油有机溶剂预处理麦草的制备与实施例1相同，不同的是酶解时添 加的纤维素酶载量为5FPU/g基质。按照实施例1的方法酶解5%甘油有机溶剂预处理的麦 草。
[0033] 实施例3
[0034] 纤维素酶和甘油有机溶剂预处理麦草的制备与实施例1相同，不同的是酶解时添 加的是5FPU/g基质的商业纤维素酶（诺维信Cellic CTec2)。按照实施例1的方法酶解 5%甘油有机溶剂预处理的麦草。
[0035] 实施例1~3中，甘油有机溶剂预处理麦草的酶解率如表1所示。
[0036] 表1优化定制纤维素酶和商业纤维素酶的酶解
[0037]
[0038] 从实施例2和实施例3可以看出，相同滤纸酶活的复合纤维素酶制剂较商业纤维 素酶更能有效酶解木质纤维素。用5FPU/g基质的复合纤维素酶水解甘油有机溶剂预处理 的麦草，6h酶解率达到66. 3%，短时间内获得较高的酶解率；其12h的酶解效果超过48h商 业纤维素酶，达到91. 4% ;48h时基质内的纤维素和半纤维素几乎完全释放出来，酶解率达 到97. 3 %。从实施例1和实施例3可知，2. 5FPU/g基质的复合纤维素酶水解甘油有机溶剂 预处理麦草的效果优于5FPU/g基质的商业纤维素酶（Cellic CTec2)。因此，采用本发明提 供的一种经济高效水解农林生物质原料制备纤维素糖的方法能够在低酶载量的情况下获 得高的酶解率，有利于农林生物质原料的合理高效利用。
[0039] 需要理解到的是：以上实施例虽然对本发明作了比较详细的说明，但是这些说明， 只是对本发明的简单说明，而不是对本发明的限制，任何不超出本发明实质精神内的发明 创造，均落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法，其特征在于方法步骤 如下： 1) 农林生物质原料粉碎：农林生物质经自然晒干后，切成长度1~5cm的小片段，60~ 80 °C烘干备用。 2) 原料甘油有机溶剂预处理：将原料和甘油水溶液按一定比例混合，加热处理一段时 间后用甘油水溶液洗涤两次，再用自来水洗两次。 3) 纤维素酶发酵：在发酵培养基中外加一些产酶促进剂，灭菌后接入里氏木霉菌株， 在28~32°C和200~240rpm条件下发酵7~9天，发酵完毕后发酵液经6000~8000rpm 离心，上清液作为酶解所用的纤维素酶。 4) 酶解产糖：在2~15%基质浓度中添加纤维素酶2~30FPU/g基质，加入一定量辅 助酶和添加剂后在40~50°C和100~160rpm条件下酶解48~96h。2. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤1)中所述的农林生物质原料是指麦草、稻草、玉米秸杆、玉米芯、棉杆、甘蔗渣、 硬木、软木纤维质废弃物，和草本类植物及它们的任意混合。3. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤2)甘油有机溶剂预处理的原料浓度为5%~15%，初始甘油水溶液浓度为30~ 100%，蒸煮温度130~240°C维持1~4h。4. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤2)甘油有机溶剂预处理涉及自催化和外加催化剂，其中外加催化剂包括酸、碱 和金属盐。5. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤3)发酵培养基中外加促进剂是铜离子0. 3~2. 5mmol/L，海藻糖0. 001~0. 5g/ L，L-抗坏血酸0. 01~0. 5g/L，PEG系列表面活性剂0. 5~5g/L。6. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤4)中所用的辅助酶为0-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和溶菌酶。7. 根据权利要求6所述的辅助酶，其添加量分别为：0 -葡萄糖苷酶0. 5~20U/g基 质，木聚糖酶100~300U/g基质，溶菌酶30~150U/g基质。8. 根据权利要求1所述的一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方 法，其步骤4)添加剂为阳离子聚丙烯酰胺和茶皂素。9. 根据权利要求7所述的添加剂，其添加量分别为：阳离子聚丙烯酰胺1~10mg/g基 质，茶阜素1~l〇mg/g基质。10. 根据权利要求1所述的一种酶解产糖糖液，其特性为：葡萄糖浓度10~150g/L，木 糖浓度2~50g/L，酶解率60~99%。
【专利摘要】本发明公开了一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法。本方法首先用甘油有机溶剂预处理打破农林生物质原料的复杂组成和致密结构，使之易于酶解。然后采用里氏木霉液体发酵方式获得纤维素酶。最后将自产纤维素酶与辅助酶和添加剂混合制得复合纤维素酶制剂，用于酶解甘油有机溶剂预处理的生物质基质。与商业纤维素酶相比，本方法所用纤维素酶来源经济，酶解时所需酶载量低，获得的基质酶解率高。
【IPC分类】C12N9/36, C12P19/02, C12N9/42
【公开号】CN104894087
【申请号】CN201510266804
【发明人】孙付保, 谭玲, 张震宇, 苏存生, 沈松
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
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