消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法
消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮 细胞的分离培养方法。
【背景技术】
[0002] 脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，原来是由羊膜包卷着卵黄囊和尿膜的柄状伸 长部而形成的。脐带中动静脉是通过尿膜的血管形成，卵黄囊的血管即形成脐肠系膜动脉 及脐肠系膜静脉。当卵黄囊及其血管退化，脐动脉和脐静脉就发达起来，在这些间隙中可以 看到疏松的胶状的间充质。脐带是母体和胎儿的血液间进行〇) 2和O2、代谢废物和营养物 质交换的地方。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将〇 2和营养物质从胎盘运送 给胎儿，最后由子宫静脉将来自胎儿的代谢废物运走。
[0003] 而某种激素和抗体等亦通过脐带从母体移交给胎儿，但运行机制尚未清楚。通过 体外培养分离和培养脐带上皮细胞，可对脐带上皮细胞的增殖特性，母婴之间的某些激素 和抗体的运转及机制等进行研宄。同时，分离出人脐带上皮细胞，也可应用于人体烧伤皮肤 的恢复应用，具有深远的医学研宄意义。
[0004] 目前，并无人脐带上皮细胞分离的相关技术方案，参考其他组织的上皮细胞分离 方案，均采用组织块培养法来分离上皮细胞。
[0005] 专利申请号为CN201210113304. X的发明报道了一种山羊乳腺上皮细胞的建系方 法，山羊乳腺上皮细胞的分离与纯化为：
[0006] (一）山羊乳腺上皮细胞的分离
[0007] (1)选用已经与妊娠期山羊相分离的乳房组织，经杀菌和清洗处理后放入含有青 霉素和链霉素的DPBS溶液中进行洗涤，然后去除脂肪和结缔组织，留下白色颗粒状腺泡组 织块，再放入含青霉素和链霉素的DPBS溶液中洗涤2遍，最后转入不含青霉素和链霉素的 DPBS溶液洗涤一遍；
[0008] (2)将适量组织块放入离心管，滴加数滴血清湿润，将其剪成Imm3小块，用移液器 吸出适量的剪碎后组织均匀涂布于培养皿，间距保持Icm 2左右；
[0009] (3)37°C、5% CO2、饱和湿度下倒扣干涸培养6~12h，期间勿翻动；
[0010] ⑷上述⑶倒扣干涸培养结束后，添加2mL乳腺上皮细胞培养液，于37°C、5% CO2、饱和湿度下正置培养；
[0011] (5)自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至4~6mL，自接种组织块 72h后补加乳腺上皮细胞培养液至8~IOmL ;以后每隔3d观察一次，注意观察细胞爬出情 况及污染情况，并酌情换液；所述乳腺上皮细胞培养液的成分为：DMEM/F12+10% FBS+1% ITS+10ng/mLEGF ；
[0012] (二）山羊乳腺上皮细胞的纯化
[0013] (6)当培养皿中贴壁混合细胞达到80~90 %汇合时，吸取培养基，DPBS洗涤2遍；
[0014] (7)加入乳腺上皮细胞消化液于37°C、5% CO2、饱和湿度下消化；所述乳腺上皮细 胞消化液的成分包括0. 02% EDTA和0. 25% Trypsin ;
[0015] (8)期间不断观察，当大部分成纤维细胞变圆且即将脱落时，迅速晃动培养皿用已 有的消化液带下即将脱落的细胞，并用移液器吸尽；
[0016] (9)迅速再次加入上述消化液于37°C、5% CO2、饱和湿度下消化；
[0017] (10)期间不断观察，当大部分上皮样细胞即将脱落时，加入乳腺上皮细胞终 止培养液终止消化；传代比例始终保持1 : 2 ;所述乳腺上皮细胞终止液成分为：DMEM/ F12+10% FBS ；
[0018] (11)重复（7)~（11)步骤，直至成纤维细胞去除干净。
[0019] 专利申请号为CN201410176073. 6的发明提供了一种前列腺组织分离和建立原代 上皮细胞和/或间质细胞的方法，具体步骤包括：
[0020] 第一步：将小鼠前列腺叶组织剪碎，用原代细胞培养液洗涤，将剪碎的组织转移到 离心管中，并离心；
[0021] 第二步：用原代细胞培养液重悬组织并转移到T-25培养瓶中，在37°C培养箱中培 养1~2天，当组织块粘附在瓶底之后，倒出培养液并重新加入原代细胞培养液培养，2~3 天后，小鼠前列腺上皮和间质细胞从组织块周围生长出；
[0022] 第三步：用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含 原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞和间质细胞：或者，在倒置显微 镜下辨别各种细胞和组织块的类型，用细胞刮刀将间质细胞和组织块刮掉或将上皮细胞和 组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转 移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞或间质细胞。
[0023] 然而，上述现有的组织上皮细胞的获取方法原代培养时间长，获得细胞总数低，细 胞纯度低掺杂成纤维细胞。因此，建立一种快速、细胞得率高、细胞纯度高的脐带上皮细胞 分离方法具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0024] 有鉴于此，本发明提供了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。 该方法采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化，消化酶组合物性质温和，对细胞损伤 小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
[0025] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0026] 本发明提供了一种消化酶组合物，包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶。
[0027] 在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化， 该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
[0028] 作为优选，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为（5~30) :(1~10) :(1~ 10) 〇
[0029] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :1 :1。
[0030] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :5 : 10。
[0031] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为10 : 10
[0032] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为30 : 1 :5〇
[0033] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶的规格为300U/mg。
[0034] 在本发明提供的一些实施例中，胶原酶VID的规格为125⑶U/mg。
[0035] 在本发明提供的一些实施例中，胰酶的规格为1800U/mg。
[0036] 本发明还提供了该消化酶组合物在分离脐带上皮细胞中的应用；该消化酶组合 物包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶；作为优选，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为 (5~30) :(1~10) :(1~10);在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与 胰酶的质量比为5 :1 :1 ;在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的 质量比为5 :5 :10 ;在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量 比为10 :10 :1 ;在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为 30 ：1 ：5〇
[0037] 本发明还提供了一种脐带上皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
[0038] 采用消化酶组合物对脐带表面外层膜进行消化，将获得脐带上皮细胞进行细胞培 养；该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶W和胰酶。
[0039] 作为优选，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为（5~30) :(1~10) :(1~ 10) 〇
[0040] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :1 :1。
[0041] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :5 : 10。
[0042] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为10 : 10 :1〇
[0043] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为30 : 1 :5〇
[0044] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶的规格为300U/mg，配制成浓度为 0. 05%~0. 30%。
[0045] 在本发明提供的一些实施例中，胶原酶VID的规格为125⑶U/mg，配制成浓度为 0· 01%~0· 10%〇
[0046] 在本发明提供的一些实施例中，胰酶的规格为1800U/mg，配制成浓度为0. 01 %~ 0· 10%〇
[0047] 在本发明提供的一些实施例中，根据脐带表面外层膜的面积，以mL/cm2计，消化酶 的加入量为：透明质酸酶的加入量为lmL/cm 2,胶原酶VID的加入量为lmL/cm2,胰酶的加入量 为 lmL/cm2。
[0048] 作为优选，细胞培养的培养基为添加 EGF的含10% FBS的DMEM/F12培养基。EGF 能够促进细胞增殖，缩短培养周期。
[0049] 作为优选，EGF的质量百分含量为0· 01~1%。
[0050] 在本发明提供的一些实施例中 ，EGF的质量百分含量为0. 1%。
[0051] 作为优选，细胞培养为在36~38°C、5% CO2条件下培养至融合度80%。
[0052] 在本发明提供的一些实施例中，细胞培养为在37°C、5 % CO2条件下培养至融合度 80%〇
[0053] 在本发明提供的一些实施例中，脐带上皮细胞的密度为（1~5) X 105/mL。
[0054] 作为优选，脐带上皮细胞的密度为I X 105/mL。
[0055] 在本发明提供的一些实施例中，脐带上皮细胞的接种量为lmL/cm2。
[0056] 作为优选，细胞培养的培养基采用明胶包被。脐带上皮细胞的原代培养，采用明胶 包被后的细胞培养皿，增加细胞的贴壁率，减少原代培养的时间，增加原代培养获得的细胞 总数。
[0057] 作为优选，消化的温度为36~38°C，消化的时间为0. 5~3h。
[0058] 在本发明提供的一些实施例中，消化的温度为37°C，消化的时间为lh。
[0059] 在本发明提供的一些实施例中，细胞培养为：取脐带上皮细胞用添加 EGF的含 10% FBS的DMEM/F12培养基重悬，调整细胞密度为（1~5) X 105/mL，按lmL/cm2的接种量 接种至细胞皿，于37°C、5% CO2条件下培养2h ;吸取培养上清液转移至明胶包被的细胞培 养皿于37°C、5 % CO2条件下培养，待细胞在皿底生长融合度为80 %时传代。
[0060] 作为优选，脐带上皮细胞的密度为IX 105/mL。
[0061] 本发明提供了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。该消化酶 组合物包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶。本发明至少具有如下优势之一：
[0062] 在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化， 该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升；
[0063] 本发明在细胞培养基中添加 EGF，可促进细胞增殖，缩短培养周期；
[0064] 本发明采用明胶包被后的细胞培养皿，可增加细胞的贴壁率，减少原代培养的时 间，增加原代培养获得的细胞总数。
【附图说明】
[0065] 图1示两种方法不同代数上皮细胞的增殖曲线。
【具体实施方式】
[0066] 本发明公开了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法，本领域技 术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及 应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围 内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0067] 本发明提供的消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法中所用试 剂、仪器均可由市场购得。其中，透明质酸酶的规格为5g/瓶，300U/mg;胶原酶VIII的规 格为Ig/瓶，125CDU/mg ;胰酶的规格为IOg/瓶，1800U/mg ;中性蛋白酶的规格为2g/瓶， 100000U/瓶；胶原酶IV的规格为5g/瓶，625000CDU/瓶。
[0068] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0069] 实施例1人脐带上皮细胞的原代分离与培养
[0070] (一）培养皿的明胶包被
[0071] 称取明胶粉末（Sigma)，用去离子水配成0. 1 % (W/V)溶液，37°C水浴溶解，并趁热 过滤0. 22 μ m的滤网，放置于4°C备用。
[0072] 取配制好的0. 1 %明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0. 3mL/ cm20. 1 %明胶溶液，均匀铺满皿底，在37°C细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶 吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
[0073] (二）人脐带上皮细胞的原代分离
[0074] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0075] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入lmL/cm20. 25% 透明质酸酶+〇. 05%胶原酶VID+0. 05%胰酶的联合酶液对膜消化（37°C ) Ih后，拿100 μm过 滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞培养 基重悬，调节细胞密度为1\105/11^，按111117(^2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°〇,5% CO2细胞培养箱中培养2小时。
[0076] 2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿（第一部分制得的明胶包被培养皿） 放置于37 °C，5 % CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80 %时，即可传代。 [0077](三）人脐带上皮细胞的传代
[0078] 去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液（PBS)洗3遍后，加入0. 02mL/cm20. 1 %胰 酶+0. 02% EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞 培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10% FBS+0. 1% EGF细胞培养基重悬，细胞密 度为I X 105/mL，根据培养皿面积，lmL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
[0079] 实施例2人脐带上皮细胞的原代分离与培养
[0080] (一）培养皿的明胶包被
[0081] 称取明胶粉末（Sigma)，用去离子水配成0. 1 % (W/V)溶液，37°C水浴溶解，并趁热 过滤0. 22 μ m的滤网，放置于4°C备用。
[0082] 取配制好的0. 1 %明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0. 3mL/ cm20. 1 %明胶溶液，均匀铺满皿底，在37°C细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶 吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
[0083] (二）人脐带上皮细胞的原代分离
[0084] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0085] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入lmL/cm20. 05% 透明质酸酶+0.05%胶原酶VID+0. 1%胰酶的联合酶液对膜消化（36°C )3h后，拿IOOymS 滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10% FBS+0. 01 % EGF细胞培养 基重悬，调节细胞密度为2\105/11^，按111117(^2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°〇、5% CO2细胞培养箱中培养2小时。
[0086] 2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿（第一部分制得的明胶包被培养皿） 放置于37 °C，5 % CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80 %时，即可传代。
[0087] (三）人脐带上皮细胞的传代
[0088] 去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液（PBS)洗3遍后，加入0. 02mL/cm20.1 %胰 酶+0. 02% EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞 培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10% FBS+0. 1% EGF细胞培养基重悬，细胞密 度为1-2X 105/mL，根据培养皿面积，lmL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
[0089] 实施例3人脐带上皮细胞的原代分离与培养
[0090] (一）培养皿的明胶包被
[0091] 称取明胶粉末（Sigma)，用去离子水配成0. 1 % (W/V)溶液，37°C水浴溶解，并趁热 过滤0. 22 μ m的滤网，放置于4°C备用。
[0092] 取配制好的0. 1 %明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0. 3mL/ cm20. 1 %明胶溶液，均匀铺满皿底，在37°C细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶 吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
[0093] (二）人脐带上皮细胞的原代分离
[0094] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0095] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入lmL/cm20. 10% 透明质酸酶+0.10%胶原酶麗+0.01%胰酶对膜消化（38°〇0.511后，拿100以111过滤网过 滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10% FBS+1 % EGF细胞培养基重悬，调 节细胞密度为5X 105/mL，按lmL/cm2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°C、5% C O2细胞培 养箱中培养2小时。
[0096] 2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿（第一部分制得的明胶包被培养皿） 放置于37 °C、5 % CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80 %时，即可传代。
[0097] (三）人脐带上皮细胞的传代
[0098] 去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液（PBS)洗3遍后，加入0. 02mL/cm20. 1 %胰 酶+0. 02% EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞 培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10% FBS+0. 1% EGF细胞培养基重悬，细胞密 度为1-2X 105/mL，根据培养皿面积，lmL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
[0099] 实施例4人脐带上皮细胞的原代分离与培养 [0100](一）培养皿的明胶包被
[0101] 称取明胶粉末（Sigma)，用去离子水配成0. 1 % (W/V)溶液，37°C水浴溶解，并趁热 过滤0. 22 μ m的滤网，放置于4°C备用。
[0102] 取配制好的0. 1 %明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0. 3mL/ cm20. 1 %明胶溶液，均匀铺满皿底，在37°C细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶 吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
[0103] (二）人脐带上皮细胞的原代分离
[0104] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0105] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入lmL/cm20. 3%透 明质酸酶+0.01%胶原酶VDI+0.05%胰酶的联合酶液对膜消化（37°C ) Ih后，拿100 μπι过 滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞培养 基重悬，调节细胞密度为1\105/11^，按111117(^2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°〇,5% CO2细胞培养箱中培养2小时。
[0106] 2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿（第一部分制得的明胶包被培养皿） 放置于37 °C，5 % CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80 %时，即可传代。
[0107] (三）人脐带上皮细胞的传代
[0108] 去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液（PBS)洗3遍后，加入0. 02mL/cm20. 1 %胰 酶+0. 02% EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞 培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10% FBS+0. 1% EGF细胞培养基重悬，细胞密 度为I X 105/mL，根据培养皿面积，lmL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
[0109] 实施例5脐带上皮细胞分离率计算
[0110] 选取15根脐带，随机均分成5组，为实验组和对照组，各组区别在于使用不同消化 酶，其余实验步骤与实施例1相同。
[0111] 实验组I :0.25%透明质酸酶+0.05%胶原酶VID+0.05%胰酶；
[0112] 实验组2 :0.05%透明质酸酶+0.05%胶原酶VID+0. 1 %胰酶；
[0113] 实验组3 :0· 10%透明质酸酶+0· 10%胶原酶VID+0.01 %胰酶；
[0114] 实验组4 :0. 3%透明质酸酶+0. 01 %胶原酶VID+0. 05%胰酶；
[0115] 对照组1 :0. 10%中性蛋白酶+0. 05%胶原酶IV。
[0116] 实验具体操作如下：
[0117] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0118] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入消化酶（实验 组I :0.25 %透明质酸酶+0.05 %胶原酶VID+0.05 %胰酶；实验组2 :0.05 %透明质酸酶 +0.05%胶原酶VID+0. 1 %胰酶；实验组3 :0. 10%透明质酸酶+0. 10%胶原酶VID+0.01 %胰 酶；实验组4:0.3%透明质酸酶+0.01%胶原酶VID +0. 05 %胰酶；对照组1 :0. 10 %中性蛋白 酶+0. 05%胶原酶IV)对膜消化Ih后，拿100 μ m过滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上 清液，加入DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞培养基重悬，调节细胞密度为I X 105/mL，按 lmL/cm2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养2小时。
[0119] 2小时后，吸取培养上清液，对上清液进行细胞计数A，转移至细胞培养皿（明胶包 被）放置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养24h，去除上清液，用胰酶消化细胞后，加入8倍 于消化液的DMEM/F12+10 % FBS+0. 1 % EGF细胞培养基终止消化，对培养液进行细胞计数B， 计算出上皮细胞贴壁率，计算公式为：上皮细胞贴壁率=B/AX 100%。
[0120] 两组上皮细胞分离率测定结果见下表：
[0121] 表1原代培养上皮细胞贴壁率
[0122]
[0123] 从表1可看出实验组1~4比对照组1贴壁率高，且实验组1~4接种时分离出 的细胞总数也高于对照组1，平行实验的贴壁率也较一致。证明实验组1~4所用的酶解方 法分离效率高，对细胞损伤小。
[0124] 实施例6不同培养方法的上皮细胞增殖曲线对比
[0125] 采用CCK-8法检测培养的脐带上皮细胞的增殖活力。选取6根脐带，随机均分为 两组，实验组1按照实例1的方法分离和培养上皮细胞，一直传至PlO代。实验组2不采用 明胶包被的培养皿和培养基中不添加 EGF，其余实验方法按照实例1，一直传至PlO代。两 组分别收集在P1、P5、P10的细胞，接种细胞于96孔板中，2000个/孔。在37°C，5% 0)2培 养箱中连续培养7d。分别在ld、3d、5d、7d对细胞进行检测。在待检测孔中加入10μL染色 剂，37°C，5% CO2培养此。用酶标仪测450nm处的吸光值，每个样本做6个重复，见图1。
[0126] 从图1可见，实验组1中的各代次细胞相比于实验组2均有较高的增殖曲线，实验 组2代次越高，增殖越趋于缓慢，证明实验组1中的EGF和明胶包被极大促进并保持了细胞 增殖的活力。
[0127] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种消化酶组合物，其特征在于，包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶。2. 根据权利要求1所述的消化酶组合物，其特征在于，所述透明质酸酶、所述胶原酶VDI 与所述胰酶的质量比为（5~30) : (1~10) : (1~10)。3. 根据权利要求1所述的消化酶组合物，其特征在于，所述透明质酸酶、所述胶原酶VDI 与所述胰酶的质量比为5 :1 :1。4. 如权利要求1至3中任一项所述消化酶组合物在分离脐带上皮细胞中的应用。5. -种脐带上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤： 采用如权利要求1至3中任一项所述消化酶组合物对脐带表面外层膜进行消化，将获 得脐带上皮细胞进行细胞培养。6. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养的培养基为添加 EGF的含10%FBS的DMEM/F12培养基。7. 根据权利要求6所述的分离培养方法，其特征在于，所述EGF的质量百分含量为 0? 01 ~1%〇8. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养为在36~38°C、 5%CO2条件下培养至融合度80%。9. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养的培养基采用明 胶包被。10. 根据权利要求5至9中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述消化的温度 为36~38°C，消化的时间为0. 5~3h。
【专利摘要】本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶。在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶联合消化，该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
【IPC分类】C12N5/071, C12N9/94, C12N9/50, C12N9/42
【公开号】CN104894088
【申请号】CN201510290339
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 吴子杰, 王小燕, 李平
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮 细胞的分离培养方法。
【背景技术】
[0002] 脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，原来是由羊膜包卷着卵黄囊和尿膜的柄状伸 长部而形成的。脐带中动静脉是通过尿膜的血管形成，卵黄囊的血管即形成脐肠系膜动脉 及脐肠系膜静脉。当卵黄囊及其血管退化，脐动脉和脐静脉就发达起来，在这些间隙中可以 看到疏松的胶状的间充质。脐带是母体和胎儿的血液间进行〇) 2和O2、代谢废物和营养物 质交换的地方。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将〇 2和营养物质从胎盘运送 给胎儿，最后由子宫静脉将来自胎儿的代谢废物运走。
[0003] 而某种激素和抗体等亦通过脐带从母体移交给胎儿，但运行机制尚未清楚。通过 体外培养分离和培养脐带上皮细胞，可对脐带上皮细胞的增殖特性，母婴之间的某些激素 和抗体的运转及机制等进行研宄。同时，分离出人脐带上皮细胞，也可应用于人体烧伤皮肤 的恢复应用，具有深远的医学研宄意义。
[0004] 目前，并无人脐带上皮细胞分离的相关技术方案，参考其他组织的上皮细胞分离 方案，均采用组织块培养法来分离上皮细胞。
[0005] 专利申请号为CN201210113304. X的发明报道了一种山羊乳腺上皮细胞的建系方 法，山羊乳腺上皮细胞的分离与纯化为：
[0006] (一）山羊乳腺上皮细胞的分离
[0007] (1)选用已经与妊娠期山羊相分离的乳房组织，经杀菌和清洗处理后放入含有青 霉素和链霉素的DPBS溶液中进行洗涤，然后去除脂肪和结缔组织，留下白色颗粒状腺泡组 织块，再放入含青霉素和链霉素的DPBS溶液中洗涤2遍，最后转入不含青霉素和链霉素的 DPBS溶液洗涤一遍；
[0008] (2)将适量组织块放入离心管，滴加数滴血清湿润，将其剪成Imm3小块，用移液器 吸出适量的剪碎后组织均匀涂布于培养皿，间距保持Icm 2左右；
[0009] (3)37°C、5% CO2、饱和湿度下倒扣干涸培养6~12h，期间勿翻动；
[0010] ⑷上述⑶倒扣干涸培养结束后，添加2mL乳腺上皮细胞培养液，于37°C、5% CO2、饱和湿度下正置培养；
[0011] (5)自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至4~6mL，自接种组织块 72h后补加乳腺上皮细胞培养液至8~IOmL ;以后每隔3d观察一次，注意观察细胞爬出情 况及污染情况，并酌情换液；所述乳腺上皮细胞培养液的成分为：DMEM/F12+10% FBS+1% ITS+10ng/mLEGF ；
[0012] (二）山羊乳腺上皮细胞的纯化
[0013] (6)当培养皿中贴壁混合细胞达到80~90 %汇合时，吸取培养基，DPBS洗涤2遍；
[0014] (7)加入乳腺上皮细胞消化液于37°C、5% CO2、饱和湿度下消化；所述乳腺上皮细 胞消化液的成分包括0. 02% EDTA和0. 25% Trypsin ;
[0015] (8)期间不断观察，当大部分成纤维细胞变圆且即将脱落时，迅速晃动培养皿用已 有的消化液带下即将脱落的细胞，并用移液器吸尽；
[0016] (9)迅速再次加入上述消化液于37°C、5% CO2、饱和湿度下消化；
[0017] (10)期间不断观察，当大部分上皮样细胞即将脱落时，加入乳腺上皮细胞终 止培养液终止消化；传代比例始终保持1 : 2 ;所述乳腺上皮细胞终止液成分为：DMEM/ F12+10% FBS ；
[0018] (11)重复（7)~（11)步骤，直至成纤维细胞去除干净。
[0019] 专利申请号为CN201410176073. 6的发明提供了一种前列腺组织分离和建立原代 上皮细胞和/或间质细胞的方法，具体步骤包括：
[0020] 第一步：将小鼠前列腺叶组织剪碎，用原代细胞培养液洗涤，将剪碎的组织转移到 离心管中，并离心；
[0021] 第二步：用原代细胞培养液重悬组织并转移到T-25培养瓶中，在37°C培养箱中培 养1~2天，当组织块粘附在瓶底之后，倒出培养液并重新加入原代细胞培养液培养，2~3 天后，小鼠前列腺上皮和间质细胞从组织块周围生长出；
[0022] 第三步：用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含 原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞和间质细胞：或者，在倒置显微 镜下辨别各种细胞和组织块的类型，用细胞刮刀将间质细胞和组织块刮掉或将上皮细胞和 组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转 移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞或间质细胞。
[0023] 然而，上述现有的组织上皮细胞的获取方法原代培养时间长，获得细胞总数低，细 胞纯度低掺杂成纤维细胞。因此，建立一种快速、细胞得率高、细胞纯度高的脐带上皮细胞 分离方法具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0024] 有鉴于此，本发明提供了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。 该方法采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化，消化酶组合物性质温和，对细胞损伤 小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
[0025] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0026] 本发明提供了一种消化酶组合物，包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶。
[0027] 在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化， 该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
[0028] 作为优选，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为（5~30) :(1~10) :(1~ 10) 〇
[0029] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :1 :1。
[0030] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :5 : 10。
[0031] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为10 : 10
[0032] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为30 : 1 :5〇
[0033] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶的规格为300U/mg。
[0034] 在本发明提供的一些实施例中，胶原酶VID的规格为125⑶U/mg。
[0035] 在本发明提供的一些实施例中，胰酶的规格为1800U/mg。
[0036] 本发明还提供了该消化酶组合物在分离脐带上皮细胞中的应用；该消化酶组合 物包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶；作为优选，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为 (5~30) :(1~10) :(1~10);在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与 胰酶的质量比为5 :1 :1 ;在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的 质量比为5 :5 :10 ;在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量 比为10 :10 :1 ;在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为 30 ：1 ：5〇
[0037] 本发明还提供了一种脐带上皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
[0038] 采用消化酶组合物对脐带表面外层膜进行消化，将获得脐带上皮细胞进行细胞培 养；该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶W和胰酶。
[0039] 作为优选，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为（5~30) :(1~10) :(1~ 10) 〇
[0040] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :1 :1。
[0041] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :5 : 10。
[0042] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为10 : 10 :1〇
[0043] 在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为30 : 1 :5〇
[0044] 在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶的规格为300U/mg，配制成浓度为 0. 05%~0. 30%。
[0045] 在本发明提供的一些实施例中，胶原酶VID的规格为125⑶U/mg，配制成浓度为 0· 01%~0· 10%〇
[0046] 在本发明提供的一些实施例中，胰酶的规格为1800U/mg，配制成浓度为0. 01 %~ 0· 10%〇
[0047] 在本发明提供的一些实施例中，根据脐带表面外层膜的面积，以mL/cm2计，消化酶 的加入量为：透明质酸酶的加入量为lmL/cm 2,胶原酶VID的加入量为lmL/cm2,胰酶的加入量 为 lmL/cm2。
[0048] 作为优选，细胞培养的培养基为添加 EGF的含10% FBS的DMEM/F12培养基。EGF 能够促进细胞增殖，缩短培养周期。
[0049] 作为优选，EGF的质量百分含量为0· 01~1%。
[0050] 在本发明提供的一些实施例中 ，EGF的质量百分含量为0. 1%。
[0051] 作为优选，细胞培养为在36~38°C、5% CO2条件下培养至融合度80%。
[0052] 在本发明提供的一些实施例中，细胞培养为在37°C、5 % CO2条件下培养至融合度 80%〇
[0053] 在本发明提供的一些实施例中，脐带上皮细胞的密度为（1~5) X 105/mL。
[0054] 作为优选，脐带上皮细胞的密度为I X 105/mL。
[0055] 在本发明提供的一些实施例中，脐带上皮细胞的接种量为lmL/cm2。
[0056] 作为优选，细胞培养的培养基采用明胶包被。脐带上皮细胞的原代培养，采用明胶 包被后的细胞培养皿，增加细胞的贴壁率，减少原代培养的时间，增加原代培养获得的细胞 总数。
[0057] 作为优选，消化的温度为36~38°C，消化的时间为0. 5~3h。
[0058] 在本发明提供的一些实施例中，消化的温度为37°C，消化的时间为lh。
[0059] 在本发明提供的一些实施例中，细胞培养为：取脐带上皮细胞用添加 EGF的含 10% FBS的DMEM/F12培养基重悬，调整细胞密度为（1~5) X 105/mL，按lmL/cm2的接种量 接种至细胞皿，于37°C、5% CO2条件下培养2h ;吸取培养上清液转移至明胶包被的细胞培 养皿于37°C、5 % CO2条件下培养，待细胞在皿底生长融合度为80 %时传代。
[0060] 作为优选，脐带上皮细胞的密度为IX 105/mL。
[0061] 本发明提供了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。该消化酶 组合物包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶。本发明至少具有如下优势之一：
[0062] 在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化， 该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升；
[0063] 本发明在细胞培养基中添加 EGF，可促进细胞增殖，缩短培养周期；
[0064] 本发明采用明胶包被后的细胞培养皿，可增加细胞的贴壁率，减少原代培养的时 间，增加原代培养获得的细胞总数。
【附图说明】
[0065] 图1示两种方法不同代数上皮细胞的增殖曲线。
【具体实施方式】
[0066] 本发明公开了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法，本领域技 术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及 应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围 内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0067] 本发明提供的消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法中所用试 剂、仪器均可由市场购得。其中，透明质酸酶的规格为5g/瓶，300U/mg;胶原酶VIII的规 格为Ig/瓶，125CDU/mg ;胰酶的规格为IOg/瓶，1800U/mg ;中性蛋白酶的规格为2g/瓶， 100000U/瓶；胶原酶IV的规格为5g/瓶，625000CDU/瓶。
[0068] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0069] 实施例1人脐带上皮细胞的原代分离与培养
[0070] (一）培养皿的明胶包被
[0071] 称取明胶粉末（Sigma)，用去离子水配成0. 1 % (W/V)溶液，37°C水浴溶解，并趁热 过滤0. 22 μ m的滤网，放置于4°C备用。
[0072] 取配制好的0. 1 %明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0. 3mL/ cm20. 1 %明胶溶液，均匀铺满皿底，在37°C细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶 吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
[0073] (二）人脐带上皮细胞的原代分离
[0074] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0075] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入lmL/cm20. 25% 透明质酸酶+〇. 05%胶原酶VID+0. 05%胰酶的联合酶液对膜消化（37°C ) Ih后，拿100 μm过 滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞培养 基重悬，调节细胞密度为1\105/11^，按111117(^2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°〇,5% CO2细胞培养箱中培养2小时。
[0076] 2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿（第一部分制得的明胶包被培养皿） 放置于37 °C，5 % CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80 %时，即可传代。 [0077](三）人脐带上皮细胞的传代
[0078] 去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液（PBS)洗3遍后，加入0. 02mL/cm20. 1 %胰 酶+0. 02% EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞 培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10% FBS+0. 1% EGF细胞培养基重悬，细胞密 度为I X 105/mL，根据培养皿面积，lmL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
[0079] 实施例2人脐带上皮细胞的原代分离与培养
[0080] (一）培养皿的明胶包被
[0081] 称取明胶粉末（Sigma)，用去离子水配成0. 1 % (W/V)溶液，37°C水浴溶解，并趁热 过滤0. 22 μ m的滤网，放置于4°C备用。
[0082] 取配制好的0. 1 %明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0. 3mL/ cm20. 1 %明胶溶液，均匀铺满皿底，在37°C细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶 吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
[0083] (二）人脐带上皮细胞的原代分离
[0084] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0085] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入lmL/cm20. 05% 透明质酸酶+0.05%胶原酶VID+0. 1%胰酶的联合酶液对膜消化（36°C )3h后，拿IOOymS 滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10% FBS+0. 01 % EGF细胞培养 基重悬，调节细胞密度为2\105/11^，按111117(^2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°〇、5% CO2细胞培养箱中培养2小时。
[0086] 2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿（第一部分制得的明胶包被培养皿） 放置于37 °C，5 % CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80 %时，即可传代。
[0087] (三）人脐带上皮细胞的传代
[0088] 去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液（PBS)洗3遍后，加入0. 02mL/cm20.1 %胰 酶+0. 02% EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞 培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10% FBS+0. 1% EGF细胞培养基重悬，细胞密 度为1-2X 105/mL，根据培养皿面积，lmL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
[0089] 实施例3人脐带上皮细胞的原代分离与培养
[0090] (一）培养皿的明胶包被
[0091] 称取明胶粉末（Sigma)，用去离子水配成0. 1 % (W/V)溶液，37°C水浴溶解，并趁热 过滤0. 22 μ m的滤网，放置于4°C备用。
[0092] 取配制好的0. 1 %明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0. 3mL/ cm20. 1 %明胶溶液，均匀铺满皿底，在37°C细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶 吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
[0093] (二）人脐带上皮细胞的原代分离
[0094] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0095] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入lmL/cm20. 10% 透明质酸酶+0.10%胶原酶麗+0.01%胰酶对膜消化（38°〇0.511后，拿100以111过滤网过 滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10% FBS+1 % EGF细胞培养基重悬，调 节细胞密度为5X 105/mL，按lmL/cm2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°C、5% C O2细胞培 养箱中培养2小时。
[0096] 2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿（第一部分制得的明胶包被培养皿） 放置于37 °C、5 % CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80 %时，即可传代。
[0097] (三）人脐带上皮细胞的传代
[0098] 去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液（PBS)洗3遍后，加入0. 02mL/cm20. 1 %胰 酶+0. 02% EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞 培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10% FBS+0. 1% EGF细胞培养基重悬，细胞密 度为1-2X 105/mL，根据培养皿面积，lmL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
[0099] 实施例4人脐带上皮细胞的原代分离与培养 [0100](一）培养皿的明胶包被
[0101] 称取明胶粉末（Sigma)，用去离子水配成0. 1 % (W/V)溶液，37°C水浴溶解，并趁热 过滤0. 22 μ m的滤网，放置于4°C备用。
[0102] 取配制好的0. 1 %明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0. 3mL/ cm20. 1 %明胶溶液，均匀铺满皿底，在37°C细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶 吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
[0103] (二）人脐带上皮细胞的原代分离
[0104] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0105] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入lmL/cm20. 3%透 明质酸酶+0.01%胶原酶VDI+0.05%胰酶的联合酶液对膜消化（37°C ) Ih后，拿100 μπι过 滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞培养 基重悬，调节细胞密度为1\105/11^，按111117(^2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°〇,5% CO2细胞培养箱中培养2小时。
[0106] 2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿（第一部分制得的明胶包被培养皿） 放置于37 °C，5 % CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80 %时，即可传代。
[0107] (三）人脐带上皮细胞的传代
[0108] 去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液（PBS)洗3遍后，加入0. 02mL/cm20. 1 %胰 酶+0. 02% EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞 培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10% FBS+0. 1% EGF细胞培养基重悬，细胞密 度为I X 105/mL，根据培养皿面积，lmL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
[0109] 实施例5脐带上皮细胞分离率计算
[0110] 选取15根脐带，随机均分成5组，为实验组和对照组，各组区别在于使用不同消化 酶，其余实验步骤与实施例1相同。
[0111] 实验组I :0.25%透明质酸酶+0.05%胶原酶VID+0.05%胰酶；
[0112] 实验组2 :0.05%透明质酸酶+0.05%胶原酶VID+0. 1 %胰酶；
[0113] 实验组3 :0· 10%透明质酸酶+0· 10%胶原酶VID+0.01 %胰酶；
[0114] 实验组4 :0. 3%透明质酸酶+0. 01 %胶原酶VID+0. 05%胰酶；
[0115] 对照组1 :0. 10%中性蛋白酶+0. 05%胶原酶IV。
[0116] 实验具体操作如下：
[0117] 收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用IOOmL无菌的磷 酸盐缓冲液（PBS)清洗脐带表面血迹，然后用IOOmL 75%乙醇消毒脐带表面，最后用IOOmL 无菌的磷酸盐缓冲液（PBS)将酒精和血迹清洗干净。
[0118] 剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入消化酶（实验 组I :0.25 %透明质酸酶+0.05 %胶原酶VID+0.05 %胰酶；实验组2 :0.05 %透明质酸酶 +0.05%胶原酶VID+0. 1 %胰酶；实验组3 :0. 10%透明质酸酶+0. 10%胶原酶VID+0.01 %胰 酶；实验组4:0.3%透明质酸酶+0.01%胶原酶VID +0. 05 %胰酶；对照组1 :0. 10 %中性蛋白 酶+0. 05%胶原酶IV)对膜消化Ih后，拿100 μ m过滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上 清液，加入DMEM/F12+10% FBS+0. 1 % EGF细胞培养基重悬，调节细胞密度为I X 105/mL，按 lmL/cm2密度细胞液接种至细胞皿放置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养2小时。
[0119] 2小时后，吸取培养上清液，对上清液进行细胞计数A，转移至细胞培养皿（明胶包 被）放置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养24h，去除上清液，用胰酶消化细胞后，加入8倍 于消化液的DMEM/F12+10 % FBS+0. 1 % EGF细胞培养基终止消化，对培养液进行细胞计数B， 计算出上皮细胞贴壁率，计算公式为：上皮细胞贴壁率=B/AX 100%。
[0120] 两组上皮细胞分离率测定结果见下表：
[0121] 表1原代培养上皮细胞贴壁率
[0122]
[0123] 从表1可看出实验组1~4比对照组1贴壁率高，且实验组1~4接种时分离出 的细胞总数也高于对照组1，平行实验的贴壁率也较一致。证明实验组1~4所用的酶解方 法分离效率高，对细胞损伤小。
[0124] 实施例6不同培养方法的上皮细胞增殖曲线对比
[0125] 采用CCK-8法检测培养的脐带上皮细胞的增殖活力。选取6根脐带，随机均分为 两组，实验组1按照实例1的方法分离和培养上皮细胞，一直传至PlO代。实验组2不采用 明胶包被的培养皿和培养基中不添加 EGF，其余实验方法按照实例1，一直传至PlO代。两 组分别收集在P1、P5、P10的细胞，接种细胞于96孔板中，2000个/孔。在37°C，5% 0)2培 养箱中连续培养7d。分别在ld、3d、5d、7d对细胞进行检测。在待检测孔中加入10μL染色 剂，37°C，5% CO2培养此。用酶标仪测450nm处的吸光值，每个样本做6个重复，见图1。
[0126] 从图1可见，实验组1中的各代次细胞相比于实验组2均有较高的增殖曲线，实验 组2代次越高，增殖越趋于缓慢，证明实验组1中的EGF和明胶包被极大促进并保持了细胞 增殖的活力。
[0127] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种消化酶组合物，其特征在于，包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶。2. 根据权利要求1所述的消化酶组合物，其特征在于，所述透明质酸酶、所述胶原酶VDI 与所述胰酶的质量比为（5~30) : (1~10) : (1~10)。3. 根据权利要求1所述的消化酶组合物，其特征在于，所述透明质酸酶、所述胶原酶VDI 与所述胰酶的质量比为5 :1 :1。4. 如权利要求1至3中任一项所述消化酶组合物在分离脐带上皮细胞中的应用。5. -种脐带上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤： 采用如权利要求1至3中任一项所述消化酶组合物对脐带表面外层膜进行消化，将获 得脐带上皮细胞进行细胞培养。6. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养的培养基为添加 EGF的含10%FBS的DMEM/F12培养基。7. 根据权利要求6所述的分离培养方法，其特征在于，所述EGF的质量百分含量为 0? 01 ~1%〇8. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养为在36~38°C、 5%CO2条件下培养至融合度80%。9. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养的培养基采用明 胶包被。10. 根据权利要求5至9中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述消化的温度 为36~38°C，消化的时间为0. 5~3h。
【专利摘要】本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶。在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶联合消化，该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
【IPC分类】C12N5/071, C12N9/94, C12N9/50, C12N9/42
【公开号】CN104894088
【申请号】CN201510290339
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 吴子杰, 王小燕, 李平
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
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