尘螨变应原及其应用
尘螨变应原及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种尘螨变应原及其应用。
【背景技术】：
[0002] 在引起过敏性疾病的众多变应原中，尘螨是最主要的变应原。尘螨在过敏性疾病 患者特异性免疫诊断中阳性率约70-80%。由于天然变应原提取液的组分非常复杂，恒定其 组分非常困难，且容易受外源性有毒物质、病原微生物的污染，影响其重复性与安全性。而 重组变应原疫苗具有纯度高、无杂蛋白、易标准化、无外源性毒性物质和病原微生物污染的 优势，临床上已有用于免疫治疗。
[0003] 由于尘螨系医学节肢动物，结构和成分复杂，尽管人们从数百种蛋白中已初步鉴 定出24中过敏原成分，而研宄显示尘螨含有过敏原多达30余种；此外，每种过敏原的氨基 酸序列和核苷酸序列还具有序列多型性（sequence polymorphisms)，比如具有146个氨 基酸残基的Der p2变应原具有8种变体，各变体各自具有独特的氨基酸残基取代（Hales BJ，Hazell LA，Smith W，Thomas WR. Genetic variation of Der p 2allergens ：effects on T cell responses and immunoglobulin E binding. Clin Exp Allergy 2002 ；32 (10)： 1461-7.)，这些变体对于研究尘螨过敏之免疫发病机制，以及研发用以诊断及治疗尘螨过 敏的试剂具有重要意义。
[0004] Chew, F. T.等人在《Cloning of cathepsin D homolog from Blomia tropicalis》 中公开了一种Blo t热带尘螨（Blomia tropicalis)变应原，该Blo t变应原属于组织蛋 白酶D(cath印sin D，CTSD)的同源物。此外，还未见其他属于CTSD同源物的尘螨变应原 的报道。
【发明内容】
：
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种尘螨变应原及其应用，本发明提供的尘螨变 应原属于组织蛋白酶D的同源物，可用于过敏性疾病的诊断、治疗、预防，特别是粉尘螨过 敏性疾病，尤其特别的，是用于粉尘螨变应原第34组分引起的过敏性疾病的诊断、治疗、预 防。
[0006] 第一方面，本发明提供了一种尘螨变应原，包含具有与SEQ ID NO: 1所示氨基酸序 列至少90%同源性的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有免疫交叉反 应性的尘螨变应原。
[0007] 如本发明所述的，术语"免疫交叉反应性"为行业内常规理解，当一种抗体可以与 分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应，称为免疫交叉反应；不 同抗原之间具有免疫交叉反应性。
[0008] 第二方面，本发明提供了一种尘螨变应原，包含至少一个T细胞受体特异性识别 的抗原表位，所述T细胞受体特异性识别的抗原表位为如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列 编码的多肽被T细胞受体特异性识别的抗原表位。
[0009] 在本发明一个实施例中，编码如第一方面或第二方面的所述尘螨变应原的氨基酸 序列与SEQ ID NO: 1-致的序列不低于95%，更进一步优选为不低于98%。
[0010] 在本发明一个优选实施例中，编码如第一方面或第二方面的所述尘螨变应原的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 如本发明所述的，"SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列编码的尘螨变应原"是发明人 首次从粉尘螨匀浆中分离纯化得到的一种新的过敏原蛋白，它属于一类组织蛋白酶D的类 似物；分子量约40KDa ;Der f 34是由378个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不O
[0012] 如本发明所述的，当"SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列编码的尘螨变应原"来源于 粉尘螨时，所述"SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列编码的尘螨变应原"与"尘螨Der f34"可 以互换。
[0013] 第三方面，本发明提供了一种诊断个体对尘螨过敏的组合物，包含如第一方面或 第二方面所述的粉尘螨变应原。
[0014] 在本发明一个实施例中，所述组合物还包括但不限于行业内在诊断个体对尘螨过 敏时采用的其他常规成分，比如稀释剂、免疫佐剂、医药可接受之赋形剂或载体。
[0015] 第四方面，本发明提供了一种诊断个体对尘螨过敏的方法，所述方法包含检测该 个体是否会与第一方面或第二方面所述的粉尘螨变应原产生免疫反应。
[0016] 第五方面，本发明提供了一种治疗或预防个体过敏性疾病的方法，所述方法包含 对所述个体投与第一方面或第二方面所述的粉尘螨变应原。
[0017] 第六方面，本发明提供了一种如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原在制备诊 断、预防、治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
[0018] 在本发明一个实施例中，所述应用为：如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原 在诊断、预防、治疗患者是否对粉尘螨变应原第34组分的过敏中的应用。
[0019] 第七方面，本发明提供了一种编码如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原的核 苷酸序列。
[0020] 如本发明所述的，不难理解，"编码如第一方面所述的尘螨变应原的核苷酸序列" 应该考虑简并碱基，比如，在如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的DNA编码序列包括SEQ ID N0:2,保护范围还应该保护与SEQ ID N0:2具有碱基简并性质的序列，这些核苷酸序列编码 的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO: 1。
[0021] 在本发明一个实施例中，所述编码如第一方面所述的尘螨变应原的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
[0022] 第八方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有编码如第一方面或第 二方面所述的尘螨变应原的基因表达盒。
[0023] 在本发明一个实施例中，所述重组载体为粉尘螨变应原Der f34基因编码的重组 表达载体，含有SEQ ID NO: 2所示的粉尘螨变应原Der f34基因序列。
[0024] 在本发明一个优选实施例中，所述重组表达载体，是将SEQ ID NO:2所示的粉尘螨 变应原Der f34基因插入至pET-28a的EcoR I与Xho I酶切位点之间。
[0025] 第九方面，本发明提供了一种制备粉尘螨Der f34变应原的方法，包括将如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的DNA编码序列克隆到表达载体中进行蛋白质表达、纯化，获得粉 尘螨Der f34变应原。
[0026] 在本发明一个实施例中，以粉尘螨总RNA为模板，进行反转录，后进行PCR扩增，获 得目的基因；PCR产物克隆入pMD-19T(Simple)载体，经测序鉴定正确后的阳性克隆连接至 原核表达载体PET28a，构建的重组质粒pET28a-Der f34,限制性内切酶EcoR I与Xho I双 酶切和测序鉴定后，再转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，培养，破碎后，对蛋白质进行分离纯化。
[0027] 第十方面，本发明提供了一种检测或制备粉尘螨Der f34变应原的编码基因或粉 尘螨Der f34变应原编码基因的变体的方法，包括以下步骤：1)提取粉尘螨总RNA，mRNA纯 化以及反转录得cDNA ;2)设计引物，以cDNA为模板，利用PCR方法扩增编码基因，获得所述 粉尘螨Der f34变应原的编码基因或粉尘螨Der f34变应原编码基因的变体；其中，所述引 物包括如SEQ ID NO: 3所示上游引物和如SEQ ID NO:4所示下游引物。
[0028] 在本发明一个实施例中，所述粉尘螨Der f34变应原的编码基因如SEQ ID NO: 2 所示。
[0029] 基因测序结果表明尘螨过敏原Der f 34的编码基因由1143个氨基酸组成，该基 因的5'端至3'端的序列SEQ ID NO:2所示。
[0030] 第十一方面，本发明提供了一种如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原、如第 八方面所述的重组载体、如第九方面或如第十方面所述的方法在制备诊断、预防、治疗尘螨 变应原引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
[0031] 优选地，在制备诊断、预防、治疗粉尘螨变应原（优选为第34组分引起的）过敏性 疾病的试剂中的应用。
[0032] 本发明的效益：
[0033] (1)本发明提供的粉尘螨变应原属于组织蛋白酶D的同源物，可用于过敏性疾病 的诊断、治疗、预防，特别是粉尘螨过敏性疾病，尤其特别的，是用于粉尘螨变应原第34组 分引起的过敏性疾病的诊断、治疗、预防；
[0034] (2)本发明通过基因克隆、蛋白质表达制备得到粉尘螨变应原重组蛋白，蛋白纯度 高、特异性较好、产量丰富；
[0035] (3)本发明提供的本发明粉尘螨变应原用于制备诊断、预防或治疗尘螨变应原引 起的过敏性疾病的试剂具有特异性高、成本低的特点；特别地，可高效用于诊断患者是否对 粉尘螨变应原第34组分的过敏。
【附图说明】：
[0036] 图1是本发明实施例提供的尘螨总蛋白SDS-PAGE ;
[0037] 图2是本发明实施例提供的尘螨总蛋白双向电泳结果；
[0038] 图3是本发明实施例提供的粉尘螨蛋白2D免疫印迹的结果；
[0039] 图4包括图4-1和图4-2,图4-1是本发明实施例提供的粉尘螨Der f 34基因 PCR 结果；图4-2是本发明实施例提供的Der f 34电泳图；
[0040] 图5为本发明实施例提供的Der f 31与尘螨过敏病人血清IgE作用的Elisa结 果。
【具体实施方式】：
[0041] 实施例一、尘螨过敏原的鉴定及其氨基酸序列测定
[0042] 一、尘螨的饲养和粉尘螨总蛋白的提取
[0043] 用液氮将粉尘螨研磨成粉末，称取2g样品加入1ml裂解液（9M尿素，4% CHAPS, 60mM DTT, 2% IPG缓冲液），冰上搅拌5min，15000g离心50min后，小心避开上层漂 浮的脂质层，吸取的上清液即为粉尘螨总蛋白。Bradford法定量总蛋白浓度，其余上清用来 蛋白质电泳分析。
[0044] 二、粉尘螨蛋白双向电泳的分离
[0045] 1)第一向等电聚焦电泳（IEF)将已水化的IPG胶条转移到通用型杯上样胶条槽， 在IPG胶条表面上盖适量矿物油，然后分别将两个用双蒸水浸湿过的IEF电极片放在IPG 胶条的两端，将电极压在两个电极片的外缘。架好上样杯，用水化液将样品稀释至终浓度 为lOOug，上样到样 品杯中。盖上IPGphor仪器的盖子。设置IPGphor仪器运行参数：恒压 300V lh, 600V lh,l〇〇〇V lh,8000V 3h〇
[0046] 2) IPG胶条的平衡将等电聚焦后的胶条放入IOml平衡缓冲液I (0. 05M Tris-HCl， 6M尿素，30%甘油，2% SDS，IOOmgDTT)，平衡15min，用滤纸吸取多余的平衡液。再将胶条 转入平衡缓冲液Π (0.05Μ Tris-HC1，6M尿素，30%甘油，2% SDS，400mg碘乙酰胺），缓慢 摇晃15min〇
[0047] 3)第二向SDS-PAGE电泳将平衡好的胶条推至12 %的分离胶上端靠紧，吸取IOul 预染蛋白Marker与等体积的1 %琼脂糖液混合后，加至上样滤纸片，然后将上样滤纸片放 置胶条末端一侧，并与分离胶的上端接触。覆盖上适量的1 %琼脂糖液（75°C )进行封顶， 使琼脂糖液5min内凝固。将凝胶转移至电泳槽中，开始电泳。
[0048] 三、粉尘螨蛋白双向电泳图谱的染色和分析
[0049] 电泳结束后，剥下胶用考马斯亮蓝R-250染色lh，脱色至凝胶背景变白。将脱色 后的胶用扫描仪进行扫描，并用TOQuest软件对凝胶进行分析处理。
[0050] 尘螨总蛋白SDS-PAGE如图1所示；在图1为步骤（一）结果，M为蛋白质marker， 1-2泳道为尘螨总蛋白。
[0051] 尘螨总蛋白双向电泳结果如图2所示；图2包括图2-1和图2-2 ;为不同pH胶条 的实验结果重复实验。
[0052] 四、粉尘螨过敏原的双向免疫印迹分析
[0053] 双向电泳后的凝胶按常规的方法转印至NC膜，取下膜用2 %牛血清白蛋 白（BSA)4°C封闭过夜；与1 :5稀释的过敏病人阳性血清37°C孵育2小时；加入经 TBST(TBS/0. 05% Tween-20)稀释（I :3000)生物素标记的抗人IgE抗体，37°C孵育2h ;再 加入经TBST稀释（I :1000)的HRP标记的链霉亲和素，37°C孵育I. 5h ;以上每个步骤进行 完后都用TBST洗3次（5min/次）。将膜放入新鲜配制的二氨基联苯胺（DAB)底物溶液中 显现，双蒸水洗涤终止显色反应，观察结果，并用扫描仪对其进行扫描。
[0054] 粉尘螨蛋白2D免疫印迹的结果如图3所示。
[0055] 五、粉尘螨过敏原斑点的胶内酶切和质谱分析
[0056] 用手术刀片切下胶上目标蛋白点，置于EP管中。加入200-400 yL lOOmmol/L NH4HC03/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干。冻干后，各加入5yL 2. 5-10ng/yL Trypsin溶液，置于4°C冰箱30-60分钟，使胶块充分吸胀。再加入20-30 μ L左右25mmol/ L NH4HC03缓冲液（无 Trypsin)没过胶块20 μ L左右。37°C反应过夜，20小时左右。吸出 酶解液，转移至新EP管中，原管加入IOOyL 60%ACN/0. 1%TFA，超声15分钟，吸出溶液， 并入前次溶液。
[0057] 利用质谱（MS)和二级质谱（MS/MS)或Edman降解法测定新过敏原蛋白的分子量 和部分氨基酸序列。
[0058] 实施例二、尘螨过敏原的分子克隆
[0059] -、粉尘螨总RNA的提取
[0060] 挑取干净的活粉尘螨，用Qicgen公司的RNeasy Mini Kit进行总RNA的提取，操 作步骤按说明书进行。
[0061] 二、Der f 34 全长 cDNA 克隆
[0062] 以提取的总RNA为模板，逆转录cDNA，进行PCR扩增反应。反应体系如下（50 μ L): IOXEx Taq Buffer 5 ULJaKaRa ExTaq 0.25 yL;dNTP Mixture，4yL;上下游引物各 2yL，cDNA为模板I yL ;加去离子水至50yL。PCR反应条件：94°C变性Imin ;50°C退火 Imin ; 72 °C延伸Imin ; 35个循环，PCR产物经1 %琼脂糖电泳验证并拍照。
[0063] 粉尘螨Der f 34基因 PCR结果如图4-1所示；M为DNA marker，泳道1为粉尘螨 Der f 34基因 PCR产物。
[0064] 三、重组质粒构建及酶切鉴定
[0065] 将上述PCR产物与pMD-19T(Simple)连接后，热转化至E. coli ToplO中，涂布于含 氨卞霉素（l〇〇mg ?L-l)的LB平板上，37°C培养过夜，从LB平板上挑选白色菌落进行菌落 PCR鉴定，阳性克隆委托华大基因工程（深圳）有限公司进行序列，测序正确后，提取阳性克 隆的质粒DNA，并与pET-28a表达载体同时分别用EcoR I与Xho I进行双酶切，两者的酶 切产物经琼脂糖凝胶电泳，回收后用T4DNA Ligase 16°水浴连接20h，然后转化至E. coli BL21，37 °C培养过夜。挑取单个菌落，提取质粒后双酶切鉴定。
[0066] 四、Der f 34的诱导表达及纯化
[0067] 将上述鉴定的pET28a_Der f 34转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，待细菌生 长处于对数生长期（A600nm = 0.6~0.9)时，加入20μ1 lmol/L的IPTG，诱导蛋白 表达。诱导4h后取ImL菌液，离心弃上清液，加100 μ 1去离子水后重悬菌体，加20~ 25 μ 1 10 X SDS-PAGE上样缓冲液混合，沸水与浴lOmin，按照5 μ 1，10 μ 1，20 μ 1上样，进 行SDS-PAGE电泳分析，以检测重组蛋白表达情况。诱导表达的重组蛋白，经裂解、溶菌、超 声，将上清液以2ml/min的速度上样于已平衡好的Ni-NTA柱。然后用平衡液充分洗柱，再 分别用含40mm 〇l/L、300mm〇l/L咪唑平衡缓冲液进行洗脱，收集各次洗脱液进行SDS-PAGE 分析。
[0068] 粉尘螨Der f 34SDS-PAGE电泳图结果如图4-2所示，M为蛋白质marker，1-3泳 道为纯化后的Der f 34尘螨蛋白。
[0069] 实施例三：尘螨过敏原的过敏原性检测
[0070] 一、Elisa 实验
[0071] 用包被液把过敏原稀释成10ug/ml，用IOOul 4°C包被过夜，病人血清按1 :5稀 释，二抗是按1:2000稀释，最终测0D450nm的光吸收值。Der f 34与尘螨过敏病人血清IgE 作用的Elisa结果如图5所示，其中，pl-p3为实验组，cl-c2为对照组，P1-P3为皮试阳性 病人血清，C1-C2为健康人血清；由图5可知，Der f 34阳性组在450nm处的吸收值都是阴 性对照组的4倍以上。
[0072] 二、皮肤针刺实验
[0073] 用生理盐水溶解的过敏原滴在患者前臂掌侧皮肤，用特制的点刺针刺破皮肤，使 少量的过敏原进入皮肤内，擦干遗留的过敏原，15min后读结果，分别用生理盐水和组胺做 阴性和阳性对照。结果如表1.
[0074] 表1. Der f 34对17名尘螨过敏病人的皮肤针刺实验结果
[0075]
[0077] 上述临床皮肤针刺实验显示，对于17位尘螨过敏患者，Der f 34与其中3位的皮 肤针刺实验呈阳性反应，阳性反应率为17. 6%。
[0078] 此外，上述过敏原检测表明，Der f 34具有较强的过敏原性，是来自尘螨的重要过 敏原，能应用于诊断患者是否因为粉尘螨变应原第34组分引起的过敏性疾病及制备因为 粉尘螨变应原第34组分引起的过敏性疾病的试剂。
[0079] 因此，本发明提供的粉尘螨变应原可用于过敏性疾病的诊断、治疗、预防，特别是 粉尘螨过敏性疾病的诊断、治疗、预防。
【主权项】
1. 一种尘螨变应原，其特征在于，包含具有与SEQIDNO: 1所示氨基酸序列至少95% 同源性的氨基酸序列，或与如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列具有免疫交叉反应性的尘螨 变应原。2. -种尘螨变应原，其特征在于，包含至少一个T细胞受体特异性识别的抗原表位，所 述T细胞受体特异性识别的抗原表位为如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列编码的多肽被T 细胞受体特异性识别的抗原表位。3. 如权利要求1或2所述的尘螨变应原，其特征在于，所述尘螨变应原的氨基酸序列如 SEQIDNO: 1 所示。4. 一种诊断个体对尘螨过敏的组合物，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的尘螨 变应原。5. -种编码如权利要求1或2所述的尘螨变应原的核苷酸序列。6. -种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有编码如权利要求1或2所述的尘螨变 应原的基因表达盒。7. -种制备粉尘螨变应原的方法，其特征在于，包括将如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序 列的DNA编码序列克隆到表达载体中进行蛋白质表达、纯化，获得粉尘螨Derf34变应原。8. -种检测或制备粉尘螨Derf34变应原的编码基因或粉尘螨Derf34变应原编码基 因的变体的方法，包括以下步骤：1)提取粉尘螨总RNA，经mRNA纯化以及反转录得cDNA;2) 设计引物，利用PCR方法扩增编码基因，获得所述粉尘螨Derf34变应原的编码基因或粉尘 螨Derf34变应原编码基因的变体；其中，所述引物包括如SEQIDN0:3所示上游引物和如 SEQIDNO:4所示下游引物。9. 如权利要求1或2所述的尘螨变应原、如权利要求6所述的重组载体、如权利要求 7或如权利要求8所述的方法在制备诊断、预防、治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂 中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种尘螨变应原及其应用。本发明提供的粉尘螨变应原属于组织蛋白酶D的同源物，可用于过敏性疾病的诊断、治疗、预防，特别是粉尘螨过敏性疾病，尤其特别的，是用于粉尘螨变应原第34组分引起的过敏性疾病的诊断、治疗、预防。本发明通过基因克隆、蛋白质表达制备得到粉尘螨变应原重组蛋白，蛋白纯度高、特异性较好、产量丰富。本发明提供的粉尘螨变应原用于制备诊断、预防或治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂，具有特异性高、成本低的特点；特别地，可高效用于诊断患者是否对粉尘螨变应原第34组分的过敏。
【IPC分类】C12N15/57, C12N15/63, A61K39/35, C12N9/64, C12Q1/68, A61P37/08
【公开号】CN104894089
【申请号】CN201510262317
【发明人】刘晓宇, 林建立, 王媛媛, 梁志林, 邬玉兰, 刘志刚
【申请人】深圳大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月21日
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种尘螨变应原及其应用。
【背景技术】：
[0002] 在引起过敏性疾病的众多变应原中，尘螨是最主要的变应原。尘螨在过敏性疾病 患者特异性免疫诊断中阳性率约70-80%。由于天然变应原提取液的组分非常复杂，恒定其 组分非常困难，且容易受外源性有毒物质、病原微生物的污染，影响其重复性与安全性。而 重组变应原疫苗具有纯度高、无杂蛋白、易标准化、无外源性毒性物质和病原微生物污染的 优势，临床上已有用于免疫治疗。
[0003] 由于尘螨系医学节肢动物，结构和成分复杂，尽管人们从数百种蛋白中已初步鉴 定出24中过敏原成分，而研宄显示尘螨含有过敏原多达30余种；此外，每种过敏原的氨基 酸序列和核苷酸序列还具有序列多型性（sequence polymorphisms)，比如具有146个氨 基酸残基的Der p2变应原具有8种变体，各变体各自具有独特的氨基酸残基取代（Hales BJ，Hazell LA，Smith W，Thomas WR. Genetic variation of Der p 2allergens ：effects on T cell responses and immunoglobulin E binding. Clin Exp Allergy 2002 ；32 (10)： 1461-7.)，这些变体对于研究尘螨过敏之免疫发病机制，以及研发用以诊断及治疗尘螨过 敏的试剂具有重要意义。
[0004] Chew, F. T.等人在《Cloning of cathepsin D homolog from Blomia tropicalis》 中公开了一种Blo t热带尘螨（Blomia tropicalis)变应原，该Blo t变应原属于组织蛋 白酶D(cath印sin D，CTSD)的同源物。此外，还未见其他属于CTSD同源物的尘螨变应原 的报道。
【发明内容】
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[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种尘螨变应原及其应用，本发明提供的尘螨变 应原属于组织蛋白酶D的同源物，可用于过敏性疾病的诊断、治疗、预防，特别是粉尘螨过 敏性疾病，尤其特别的，是用于粉尘螨变应原第34组分引起的过敏性疾病的诊断、治疗、预 防。
[0006] 第一方面，本发明提供了一种尘螨变应原，包含具有与SEQ ID NO: 1所示氨基酸序 列至少90%同源性的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有免疫交叉反 应性的尘螨变应原。
[0007] 如本发明所述的，术语"免疫交叉反应性"为行业内常规理解，当一种抗体可以与 分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应，称为免疫交叉反应；不 同抗原之间具有免疫交叉反应性。
[0008] 第二方面，本发明提供了一种尘螨变应原，包含至少一个T细胞受体特异性识别 的抗原表位，所述T细胞受体特异性识别的抗原表位为如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列 编码的多肽被T细胞受体特异性识别的抗原表位。
[0009] 在本发明一个实施例中，编码如第一方面或第二方面的所述尘螨变应原的氨基酸 序列与SEQ ID NO: 1-致的序列不低于95%，更进一步优选为不低于98%。
[0010] 在本发明一个优选实施例中，编码如第一方面或第二方面的所述尘螨变应原的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 如本发明所述的，"SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列编码的尘螨变应原"是发明人 首次从粉尘螨匀浆中分离纯化得到的一种新的过敏原蛋白，它属于一类组织蛋白酶D的类 似物；分子量约40KDa ;Der f 34是由378个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不O
[0012] 如本发明所述的，当"SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列编码的尘螨变应原"来源于 粉尘螨时，所述"SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列编码的尘螨变应原"与"尘螨Der f34"可 以互换。
[0013] 第三方面，本发明提供了一种诊断个体对尘螨过敏的组合物，包含如第一方面或 第二方面所述的粉尘螨变应原。
[0014] 在本发明一个实施例中，所述组合物还包括但不限于行业内在诊断个体对尘螨过 敏时采用的其他常规成分，比如稀释剂、免疫佐剂、医药可接受之赋形剂或载体。
[0015] 第四方面，本发明提供了一种诊断个体对尘螨过敏的方法，所述方法包含检测该 个体是否会与第一方面或第二方面所述的粉尘螨变应原产生免疫反应。
[0016] 第五方面，本发明提供了一种治疗或预防个体过敏性疾病的方法，所述方法包含 对所述个体投与第一方面或第二方面所述的粉尘螨变应原。
[0017] 第六方面，本发明提供了一种如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原在制备诊 断、预防、治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
[0018] 在本发明一个实施例中，所述应用为：如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原 在诊断、预防、治疗患者是否对粉尘螨变应原第34组分的过敏中的应用。
[0019] 第七方面，本发明提供了一种编码如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原的核 苷酸序列。
[0020] 如本发明所述的，不难理解，"编码如第一方面所述的尘螨变应原的核苷酸序列" 应该考虑简并碱基，比如，在如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的DNA编码序列包括SEQ ID N0:2,保护范围还应该保护与SEQ ID N0:2具有碱基简并性质的序列，这些核苷酸序列编码 的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO: 1。
[0021] 在本发明一个实施例中，所述编码如第一方面所述的尘螨变应原的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
[0022] 第八方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有编码如第一方面或第 二方面所述的尘螨变应原的基因表达盒。
[0023] 在本发明一个实施例中，所述重组载体为粉尘螨变应原Der f34基因编码的重组 表达载体，含有SEQ ID NO: 2所示的粉尘螨变应原Der f34基因序列。
[0024] 在本发明一个优选实施例中，所述重组表达载体，是将SEQ ID NO:2所示的粉尘螨 变应原Der f34基因插入至pET-28a的EcoR I与Xho I酶切位点之间。
[0025] 第九方面，本发明提供了一种制备粉尘螨Der f34变应原的方法，包括将如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的DNA编码序列克隆到表达载体中进行蛋白质表达、纯化，获得粉 尘螨Der f34变应原。
[0026] 在本发明一个实施例中，以粉尘螨总RNA为模板，进行反转录，后进行PCR扩增，获 得目的基因；PCR产物克隆入pMD-19T(Simple)载体，经测序鉴定正确后的阳性克隆连接至 原核表达载体PET28a，构建的重组质粒pET28a-Der f34,限制性内切酶EcoR I与Xho I双 酶切和测序鉴定后，再转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，培养，破碎后，对蛋白质进行分离纯化。
[0027] 第十方面，本发明提供了一种检测或制备粉尘螨Der f34变应原的编码基因或粉 尘螨Der f34变应原编码基因的变体的方法，包括以下步骤：1)提取粉尘螨总RNA，mRNA纯 化以及反转录得cDNA ;2)设计引物，以cDNA为模板，利用PCR方法扩增编码基因，获得所述 粉尘螨Der f34变应原的编码基因或粉尘螨Der f34变应原编码基因的变体；其中，所述引 物包括如SEQ ID NO: 3所示上游引物和如SEQ ID NO:4所示下游引物。
[0028] 在本发明一个实施例中，所述粉尘螨Der f34变应原的编码基因如SEQ ID NO: 2 所示。
[0029] 基因测序结果表明尘螨过敏原Der f 34的编码基因由1143个氨基酸组成，该基 因的5'端至3'端的序列SEQ ID NO:2所示。
[0030] 第十一方面，本发明提供了一种如第一方面或第二方面所述的尘螨变应原、如第 八方面所述的重组载体、如第九方面或如第十方面所述的方法在制备诊断、预防、治疗尘螨 变应原引起的过敏性疾病的试剂中的应用。
[0031] 优选地，在制备诊断、预防、治疗粉尘螨变应原（优选为第34组分引起的）过敏性 疾病的试剂中的应用。
[0032] 本发明的效益：
[0033] (1)本发明提供的粉尘螨变应原属于组织蛋白酶D的同源物，可用于过敏性疾病 的诊断、治疗、预防，特别是粉尘螨过敏性疾病，尤其特别的，是用于粉尘螨变应原第34组 分引起的过敏性疾病的诊断、治疗、预防；
[0034] (2)本发明通过基因克隆、蛋白质表达制备得到粉尘螨变应原重组蛋白，蛋白纯度 高、特异性较好、产量丰富；
[0035] (3)本发明提供的本发明粉尘螨变应原用于制备诊断、预防或治疗尘螨变应原引 起的过敏性疾病的试剂具有特异性高、成本低的特点；特别地，可高效用于诊断患者是否对 粉尘螨变应原第34组分的过敏。
【附图说明】：
[0036] 图1是本发明实施例提供的尘螨总蛋白SDS-PAGE ;
[0037] 图2是本发明实施例提供的尘螨总蛋白双向电泳结果；
[0038] 图3是本发明实施例提供的粉尘螨蛋白2D免疫印迹的结果；
[0039] 图4包括图4-1和图4-2,图4-1是本发明实施例提供的粉尘螨Der f 34基因 PCR 结果；图4-2是本发明实施例提供的Der f 34电泳图；
[0040] 图5为本发明实施例提供的Der f 31与尘螨过敏病人血清IgE作用的Elisa结 果。
【具体实施方式】：
[0041] 实施例一、尘螨过敏原的鉴定及其氨基酸序列测定
[0042] 一、尘螨的饲养和粉尘螨总蛋白的提取
[0043] 用液氮将粉尘螨研磨成粉末，称取2g样品加入1ml裂解液（9M尿素，4% CHAPS, 60mM DTT, 2% IPG缓冲液），冰上搅拌5min，15000g离心50min后，小心避开上层漂 浮的脂质层，吸取的上清液即为粉尘螨总蛋白。Bradford法定量总蛋白浓度，其余上清用来 蛋白质电泳分析。
[0044] 二、粉尘螨蛋白双向电泳的分离
[0045] 1)第一向等电聚焦电泳（IEF)将已水化的IPG胶条转移到通用型杯上样胶条槽， 在IPG胶条表面上盖适量矿物油，然后分别将两个用双蒸水浸湿过的IEF电极片放在IPG 胶条的两端，将电极压在两个电极片的外缘。架好上样杯，用水化液将样品稀释至终浓度 为lOOug，上样到样 品杯中。盖上IPGphor仪器的盖子。设置IPGphor仪器运行参数：恒压 300V lh, 600V lh,l〇〇〇V lh,8000V 3h〇
[0046] 2) IPG胶条的平衡将等电聚焦后的胶条放入IOml平衡缓冲液I (0. 05M Tris-HCl， 6M尿素，30%甘油，2% SDS，IOOmgDTT)，平衡15min，用滤纸吸取多余的平衡液。再将胶条 转入平衡缓冲液Π (0.05Μ Tris-HC1，6M尿素，30%甘油，2% SDS，400mg碘乙酰胺），缓慢 摇晃15min〇
[0047] 3)第二向SDS-PAGE电泳将平衡好的胶条推至12 %的分离胶上端靠紧，吸取IOul 预染蛋白Marker与等体积的1 %琼脂糖液混合后，加至上样滤纸片，然后将上样滤纸片放 置胶条末端一侧，并与分离胶的上端接触。覆盖上适量的1 %琼脂糖液（75°C )进行封顶， 使琼脂糖液5min内凝固。将凝胶转移至电泳槽中，开始电泳。
[0048] 三、粉尘螨蛋白双向电泳图谱的染色和分析
[0049] 电泳结束后，剥下胶用考马斯亮蓝R-250染色lh，脱色至凝胶背景变白。将脱色 后的胶用扫描仪进行扫描，并用TOQuest软件对凝胶进行分析处理。
[0050] 尘螨总蛋白SDS-PAGE如图1所示；在图1为步骤（一）结果，M为蛋白质marker， 1-2泳道为尘螨总蛋白。
[0051] 尘螨总蛋白双向电泳结果如图2所示；图2包括图2-1和图2-2 ;为不同pH胶条 的实验结果重复实验。
[0052] 四、粉尘螨过敏原的双向免疫印迹分析
[0053] 双向电泳后的凝胶按常规的方法转印至NC膜，取下膜用2 %牛血清白蛋 白（BSA)4°C封闭过夜；与1 :5稀释的过敏病人阳性血清37°C孵育2小时；加入经 TBST(TBS/0. 05% Tween-20)稀释（I :3000)生物素标记的抗人IgE抗体，37°C孵育2h ;再 加入经TBST稀释（I :1000)的HRP标记的链霉亲和素，37°C孵育I. 5h ;以上每个步骤进行 完后都用TBST洗3次（5min/次）。将膜放入新鲜配制的二氨基联苯胺（DAB)底物溶液中 显现，双蒸水洗涤终止显色反应，观察结果，并用扫描仪对其进行扫描。
[0054] 粉尘螨蛋白2D免疫印迹的结果如图3所示。
[0055] 五、粉尘螨过敏原斑点的胶内酶切和质谱分析
[0056] 用手术刀片切下胶上目标蛋白点，置于EP管中。加入200-400 yL lOOmmol/L NH4HC03/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干。冻干后，各加入5yL 2. 5-10ng/yL Trypsin溶液，置于4°C冰箱30-60分钟，使胶块充分吸胀。再加入20-30 μ L左右25mmol/ L NH4HC03缓冲液（无 Trypsin)没过胶块20 μ L左右。37°C反应过夜，20小时左右。吸出 酶解液，转移至新EP管中，原管加入IOOyL 60%ACN/0. 1%TFA，超声15分钟，吸出溶液， 并入前次溶液。
[0057] 利用质谱（MS)和二级质谱（MS/MS)或Edman降解法测定新过敏原蛋白的分子量 和部分氨基酸序列。
[0058] 实施例二、尘螨过敏原的分子克隆
[0059] -、粉尘螨总RNA的提取
[0060] 挑取干净的活粉尘螨，用Qicgen公司的RNeasy Mini Kit进行总RNA的提取，操 作步骤按说明书进行。
[0061] 二、Der f 34 全长 cDNA 克隆
[0062] 以提取的总RNA为模板，逆转录cDNA，进行PCR扩增反应。反应体系如下（50 μ L): IOXEx Taq Buffer 5 ULJaKaRa ExTaq 0.25 yL;dNTP Mixture，4yL;上下游引物各 2yL，cDNA为模板I yL ;加去离子水至50yL。PCR反应条件：94°C变性Imin ;50°C退火 Imin ; 72 °C延伸Imin ; 35个循环，PCR产物经1 %琼脂糖电泳验证并拍照。
[0063] 粉尘螨Der f 34基因 PCR结果如图4-1所示；M为DNA marker，泳道1为粉尘螨 Der f 34基因 PCR产物。
[0064] 三、重组质粒构建及酶切鉴定
[0065] 将上述PCR产物与pMD-19T(Simple)连接后，热转化至E. coli ToplO中，涂布于含 氨卞霉素（l〇〇mg ?L-l)的LB平板上，37°C培养过夜，从LB平板上挑选白色菌落进行菌落 PCR鉴定，阳性克隆委托华大基因工程（深圳）有限公司进行序列，测序正确后，提取阳性克 隆的质粒DNA，并与pET-28a表达载体同时分别用EcoR I与Xho I进行双酶切，两者的酶 切产物经琼脂糖凝胶电泳，回收后用T4DNA Ligase 16°水浴连接20h，然后转化至E. coli BL21，37 °C培养过夜。挑取单个菌落，提取质粒后双酶切鉴定。
[0066] 四、Der f 34的诱导表达及纯化
[0067] 将上述鉴定的pET28a_Der f 34转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，待细菌生 长处于对数生长期（A600nm = 0.6~0.9)时，加入20μ1 lmol/L的IPTG，诱导蛋白 表达。诱导4h后取ImL菌液，离心弃上清液，加100 μ 1去离子水后重悬菌体，加20~ 25 μ 1 10 X SDS-PAGE上样缓冲液混合，沸水与浴lOmin，按照5 μ 1，10 μ 1，20 μ 1上样，进 行SDS-PAGE电泳分析，以检测重组蛋白表达情况。诱导表达的重组蛋白，经裂解、溶菌、超 声，将上清液以2ml/min的速度上样于已平衡好的Ni-NTA柱。然后用平衡液充分洗柱，再 分别用含40mm 〇l/L、300mm〇l/L咪唑平衡缓冲液进行洗脱，收集各次洗脱液进行SDS-PAGE 分析。
[0068] 粉尘螨Der f 34SDS-PAGE电泳图结果如图4-2所示，M为蛋白质marker，1-3泳 道为纯化后的Der f 34尘螨蛋白。
[0069] 实施例三：尘螨过敏原的过敏原性检测
[0070] 一、Elisa 实验
[0071] 用包被液把过敏原稀释成10ug/ml，用IOOul 4°C包被过夜，病人血清按1 :5稀 释，二抗是按1:2000稀释，最终测0D450nm的光吸收值。Der f 34与尘螨过敏病人血清IgE 作用的Elisa结果如图5所示，其中，pl-p3为实验组，cl-c2为对照组，P1-P3为皮试阳性 病人血清，C1-C2为健康人血清；由图5可知，Der f 34阳性组在450nm处的吸收值都是阴 性对照组的4倍以上。
[0072] 二、皮肤针刺实验
[0073] 用生理盐水溶解的过敏原滴在患者前臂掌侧皮肤，用特制的点刺针刺破皮肤，使 少量的过敏原进入皮肤内，擦干遗留的过敏原，15min后读结果，分别用生理盐水和组胺做 阴性和阳性对照。结果如表1.
[0074] 表1. Der f 34对17名尘螨过敏病人的皮肤针刺实验结果
[0075]
[0077] 上述临床皮肤针刺实验显示，对于17位尘螨过敏患者，Der f 34与其中3位的皮 肤针刺实验呈阳性反应，阳性反应率为17. 6%。
[0078] 此外，上述过敏原检测表明，Der f 34具有较强的过敏原性，是来自尘螨的重要过 敏原，能应用于诊断患者是否因为粉尘螨变应原第34组分引起的过敏性疾病及制备因为 粉尘螨变应原第34组分引起的过敏性疾病的试剂。
[0079] 因此，本发明提供的粉尘螨变应原可用于过敏性疾病的诊断、治疗、预防，特别是 粉尘螨过敏性疾病的诊断、治疗、预防。
【主权项】
1. 一种尘螨变应原，其特征在于，包含具有与SEQIDNO: 1所示氨基酸序列至少95% 同源性的氨基酸序列，或与如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列具有免疫交叉反应性的尘螨 变应原。2. -种尘螨变应原，其特征在于，包含至少一个T细胞受体特异性识别的抗原表位，所 述T细胞受体特异性识别的抗原表位为如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列编码的多肽被T 细胞受体特异性识别的抗原表位。3. 如权利要求1或2所述的尘螨变应原，其特征在于，所述尘螨变应原的氨基酸序列如 SEQIDNO: 1 所示。4. 一种诊断个体对尘螨过敏的组合物，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的尘螨 变应原。5. -种编码如权利要求1或2所述的尘螨变应原的核苷酸序列。6. -种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有编码如权利要求1或2所述的尘螨变 应原的基因表达盒。7. -种制备粉尘螨变应原的方法，其特征在于，包括将如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序 列的DNA编码序列克隆到表达载体中进行蛋白质表达、纯化，获得粉尘螨Derf34变应原。8. -种检测或制备粉尘螨Derf34变应原的编码基因或粉尘螨Derf34变应原编码基 因的变体的方法，包括以下步骤：1)提取粉尘螨总RNA，经mRNA纯化以及反转录得cDNA;2) 设计引物，利用PCR方法扩增编码基因，获得所述粉尘螨Derf34变应原的编码基因或粉尘 螨Derf34变应原编码基因的变体；其中，所述引物包括如SEQIDN0:3所示上游引物和如 SEQIDNO:4所示下游引物。9. 如权利要求1或2所述的尘螨变应原、如权利要求6所述的重组载体、如权利要求 7或如权利要求8所述的方法在制备诊断、预防、治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂 中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种尘螨变应原及其应用。本发明提供的粉尘螨变应原属于组织蛋白酶D的同源物，可用于过敏性疾病的诊断、治疗、预防，特别是粉尘螨过敏性疾病，尤其特别的，是用于粉尘螨变应原第34组分引起的过敏性疾病的诊断、治疗、预防。本发明通过基因克隆、蛋白质表达制备得到粉尘螨变应原重组蛋白，蛋白纯度高、特异性较好、产量丰富。本发明提供的粉尘螨变应原用于制备诊断、预防或治疗尘螨变应原引起的过敏性疾病的试剂，具有特异性高、成本低的特点；特别地，可高效用于诊断患者是否对粉尘螨变应原第34组分的过敏。
【IPC分类】C12N15/57, C12N15/63, A61K39/35, C12N9/64, C12Q1/68, A61P37/08
【公开号】CN104894089
【申请号】CN201510262317
【发明人】刘晓宇, 林建立, 王媛媛, 梁志林, 邬玉兰, 刘志刚
【申请人】深圳大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月21日
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