一种酶固定化方法及酶制剂的制作方法
一种酶固定化方法及酶制剂的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种黑曲霉脂肪酶固定化方法。使用纳米四氧化三铁材料为基材，通过仿生材料多巴胺自聚合成聚多巴胺将酶粘合在基材表面，从而得到固定化的酶制剂。
【背景技术】
[0002]传统意义上固定化是指釆用物理或化学的方法将酶在空间上限制在一些水不溶性的载体周围，限制其自由活动但是不影响生物催化剂的活性。传统的固定化技术主要分为四种:吸附法、包埋法、共价结合法、交联法。通常吸附法和包埋法的固定化效率(小于40% )和酶活回收率较低(小于20% )，交联法由于要加入交联剂，酶活的损失比较大。随着生物技术和材料科技的进步，固定化技术正面临着一个非常重要的转型。越来越多的新型材料用于酶的固定化，尤其是纳米材料以其独特的理化特性在固定化领域有着越来越重要的应用。传统的多孔材料无法进一步提高其负载量，是因为增加载体比表面积的同时不可避免的会减小微孔的直径，从而降低其负载能力。而纳米材料具有很大的比表面积，因此具有很好的负载能力。然而，这些载体的表面往往缺乏活泼的官能团不利于蛋白的结合。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简单的基于仿生粘合的固定化方法，形成了纳米四氧化三铁-聚多巴胺-黑曲霉脂肪酶胺三层结构的固定化酶。具有固定化黑曲霉脂肪酶固定化效率高、酶活回收率高，操作简便，条件温和等特点。
[0004]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0005]一种酶固定化方法，包括如下步骤:
[0006](I)四氧化三铁纳米粒子分散在Tris-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液；
[0007](2)将(I)中所得的基材溶液中加入盐酸多巴胺，调pH为8.0到9.5，在室温下震荡I?90min，然后反复用去离子水冲洗，干燥；
[0008](3)将(2)所得到的材料在磷酸缓冲液中与酶进行震荡固定化，固定化温度为O?4°C，固定化时间I?12h ;
[0009](4)将(3)中所得的固定化酶冷冻干燥后即可。
[0010]步骤⑵中所述pH为8.5，步骤(3)中磷酸缓冲液的pH为8.0。
[0011]所述步骤(I)中的四氧化三铁纳米粒子是将四水合氯化亚铁和六水合氯化铁通过氨水共沉淀制得的。
[0012]所述四氧化三铁纳米粒子与多巴胺的质量比为1: (0.5?5)。
[0013]所述步骤⑵、(3)中震荡速率为100?500rpm。
[0014]所述步骤(2)中的酶为脂肪酶或蛋白酶。
[0015]所述脂肪酶为黑曲霉脂肪酶，黑曲霉脂肪酶为黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外产黑曲霉脂肪酶或细胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的发酵液。
[0016]上述方法制备的酶制剂，其适宜温度为20?60°C，pH为6.5?9.0。
[0017]优选地，该酶制剂的适宜温度为35?50°C，pH为7.0?8.0。
[0018]本发明原理:通过四水合氯化亚铁和六水合氯化铁与氨水共沉淀能够得到四氧化三铁纳米粒子，同时多巴胺在类似于海水的弱碱性(pH = 8.5)条件下，能够自聚合形成聚多巴胺，聚多巴胺分子中的邻苯二酚基团中的羟基能够与铁原子形成配位键，其作用力非常大，使得聚多巴胺分子能够紧紧包裹在纳米四氧化三铁表面，同时聚多巴胺分子中的邻苯二酚基团在碱性条件下极容易氧化成邻苯二醌，从而能够与酶分子中的氨基或者巯基发生反应，将蛋白质牢固“粘合”在四氧化三铁纳米粒子基体表面，实现了酶的固定化。
[0019]本发明相对于现有技术具有以下优点:
[0020](I)发明使用简单的仿生粘合技术，在固定化酶过程中不使用戊二醛、甲醛等双功能试剂，成本较低，反应温和，能够较大程度保持酶活(60%?90% )，提高酶活回收率。
[0021](2)本发明通过聚多巴胺的修饰有效改善了天然载体对蛋白的粘附能力，酶的固定化效果更好。
[0022](3)本发明的固定化酶方法，能够用于脂肪酶、蛋白酶等一系列含有丰富氨基或者巯基基团的酶，并具有作为蛋白质药物载体的潜质。
【附图说明】
[0023]图1为实施例1中所得到的酶制剂在不同温度之下的相对酶活曲线。
[0024]图2为实施例1中所得到的酶制剂在不同PH下的相对酶活曲线。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0026]实施例1
[0027]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入37.5mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡lh，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液lml，冰浴的条件下固定12h，固定化酶效率为74.1%，酶活回收率为56.3%，该载体的负载量为134mg酶/g载体。
[0028]实施例2
[0029]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入30mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡lh，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定12h,固定化酶效率为63.2%，酶活回收率为48.8%，该载体的负载量为114mg酶/g载体。
[0030]实施例3
[0031]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡lh，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定12h,固定化酶效率为64.1%，酶活回收率为46.2%，该载体的负载量为115mg酶/g载体。
[0032]实施例4
[0033]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡30min，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定12h，固定化酶效率为68.8%，酶活回收率为52.7%，该载体的负载量为124mg酶/g载体。
[0034]实施例5
[0035]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡1.5h，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定12h，固定化酶效率为69.7%，酶活回收率为54.5%，该载体的负载量为126mg酶/g载体。
[0036]实施例6
[0037]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡1.5h，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液lml，冰浴的条件下固定9h,固定化酶效率为58.0%，酶活回收率为30.3%，该载体的负载量为105mg酶/g载体。
[0038]实施例7
[0039]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡1.5h，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定10.5h,固定化酶效率为47.4%，酶活回收率为65.8%，该载体的负载量为119mg酶/g载体。
[0040]实施例8
[0041]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡1.5h，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定18h，固定化酶效率为65.3%，酶活回收率为39.2%，该载体的负载量为71mg酶/g载体。
【主权项】
1.一种酶固定化方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)四氧化三铁纳米粒子分散在TriS-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液； (2)将(I)中所得的基材溶液中加入盐酸多巴胺，调pH为8.0到9.5，在室温下震荡I?90min，然后反复用去离子水冲洗，干燥； (3)将(2)所得到的材料在磷酸缓冲液中与酶进行震荡固定化，固定化温度为O?4°C，固定化时间I?12h ; (4)将(3)中所得的固定化酶冷冻干燥后即可。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述pH为8.5，步骤(3)中磷酸缓冲液的pH为8.0。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的四氧化三铁纳米粒子是将四水合氯化亚铁和六水合氯化铁通过氨水共沉淀制得的。4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述四氧化三铁纳米粒子与多巴胺的质量比为1: (0.5?5)。5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)、(3)中震荡速率为 100 ?500rpmo6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的酶为脂肪酶或蛋白酶。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为黑曲霉脂肪酶，黑曲霉脂肪酶为黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外产黑曲霉脂肪酶或细胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的发酵液。8.根据权利要求1?6任意一项方法制备的酶制剂。9.根据权利要求6所述的酶制剂，其特征在于，该酶制剂的适宜温度为20?60°C，pH为 6.5 ?9.0。10.根据权利要求9所述的酶制剂，其特征在于，该酶制剂的适宜温度为35?50°C，pH为 7.0 ?8.0。
【专利摘要】本发明公开了一种酶固定化方法及酶制剂，包括如下步骤：(1)四氧化三铁纳米粒子分散在Tris-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液；(2)将(1)中所得的基材溶液中加入盐酸多巴胺，调pH为8.0到9.5，在室温下震荡1-90min，然后反复用去离子水冲洗，干燥；(3)将(2)所得到的材料在磷酸缓冲液中与酶进行震荡固定化，固定化温度为0～4℃，固定化时间1-12h；(4)将(3)中所得的固定化酶冷冻干燥后即可。本发明具有固定化黑曲霉脂肪酶固定化效率高、酶活回收率高，操作简便，条件温和等特点。
【IPC分类】C12N9/20, C12N11/08
【公开号】CN104894094
【申请号】CN201510250417
【发明人】娄文勇, 邓啸, 宗敏华, 曹诗林
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月15日
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种黑曲霉脂肪酶固定化方法。使用纳米四氧化三铁材料为基材，通过仿生材料多巴胺自聚合成聚多巴胺将酶粘合在基材表面，从而得到固定化的酶制剂。
【背景技术】
[0002]传统意义上固定化是指釆用物理或化学的方法将酶在空间上限制在一些水不溶性的载体周围，限制其自由活动但是不影响生物催化剂的活性。传统的固定化技术主要分为四种:吸附法、包埋法、共价结合法、交联法。通常吸附法和包埋法的固定化效率(小于40% )和酶活回收率较低(小于20% )，交联法由于要加入交联剂，酶活的损失比较大。随着生物技术和材料科技的进步，固定化技术正面临着一个非常重要的转型。越来越多的新型材料用于酶的固定化，尤其是纳米材料以其独特的理化特性在固定化领域有着越来越重要的应用。传统的多孔材料无法进一步提高其负载量，是因为增加载体比表面积的同时不可避免的会减小微孔的直径，从而降低其负载能力。而纳米材料具有很大的比表面积，因此具有很好的负载能力。然而，这些载体的表面往往缺乏活泼的官能团不利于蛋白的结合。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简单的基于仿生粘合的固定化方法，形成了纳米四氧化三铁-聚多巴胺-黑曲霉脂肪酶胺三层结构的固定化酶。具有固定化黑曲霉脂肪酶固定化效率高、酶活回收率高，操作简便，条件温和等特点。
[0004]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0005]一种酶固定化方法，包括如下步骤:
[0006](I)四氧化三铁纳米粒子分散在Tris-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液；
[0007](2)将(I)中所得的基材溶液中加入盐酸多巴胺，调pH为8.0到9.5，在室温下震荡I?90min，然后反复用去离子水冲洗，干燥；
[0008](3)将(2)所得到的材料在磷酸缓冲液中与酶进行震荡固定化，固定化温度为O?4°C，固定化时间I?12h ;
[0009](4)将(3)中所得的固定化酶冷冻干燥后即可。
[0010]步骤⑵中所述pH为8.5，步骤(3)中磷酸缓冲液的pH为8.0。
[0011]所述步骤(I)中的四氧化三铁纳米粒子是将四水合氯化亚铁和六水合氯化铁通过氨水共沉淀制得的。
[0012]所述四氧化三铁纳米粒子与多巴胺的质量比为1: (0.5?5)。
[0013]所述步骤⑵、(3)中震荡速率为100?500rpm。
[0014]所述步骤(2)中的酶为脂肪酶或蛋白酶。
[0015]所述脂肪酶为黑曲霉脂肪酶，黑曲霉脂肪酶为黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外产黑曲霉脂肪酶或细胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的发酵液。
[0016]上述方法制备的酶制剂，其适宜温度为20?60°C，pH为6.5?9.0。
[0017]优选地，该酶制剂的适宜温度为35?50°C，pH为7.0?8.0。
[0018]本发明原理:通过四水合氯化亚铁和六水合氯化铁与氨水共沉淀能够得到四氧化三铁纳米粒子，同时多巴胺在类似于海水的弱碱性(pH = 8.5)条件下，能够自聚合形成聚多巴胺，聚多巴胺分子中的邻苯二酚基团中的羟基能够与铁原子形成配位键，其作用力非常大，使得聚多巴胺分子能够紧紧包裹在纳米四氧化三铁表面，同时聚多巴胺分子中的邻苯二酚基团在碱性条件下极容易氧化成邻苯二醌，从而能够与酶分子中的氨基或者巯基发生反应，将蛋白质牢固“粘合”在四氧化三铁纳米粒子基体表面，实现了酶的固定化。
[0019]本发明相对于现有技术具有以下优点:
[0020](I)发明使用简单的仿生粘合技术，在固定化酶过程中不使用戊二醛、甲醛等双功能试剂，成本较低，反应温和，能够较大程度保持酶活(60%?90% )，提高酶活回收率。
[0021](2)本发明通过聚多巴胺的修饰有效改善了天然载体对蛋白的粘附能力，酶的固定化效果更好。
[0022](3)本发明的固定化酶方法，能够用于脂肪酶、蛋白酶等一系列含有丰富氨基或者巯基基团的酶，并具有作为蛋白质药物载体的潜质。
【附图说明】
[0023]图1为实施例1中所得到的酶制剂在不同温度之下的相对酶活曲线。
[0024]图2为实施例1中所得到的酶制剂在不同PH下的相对酶活曲线。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0026]实施例1
[0027]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入37.5mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡lh，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液lml，冰浴的条件下固定12h，固定化酶效率为74.1%，酶活回收率为56.3%，该载体的负载量为134mg酶/g载体。
[0028]实施例2
[0029]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入30mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡lh，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定12h,固定化酶效率为63.2%，酶活回收率为48.8%，该载体的负载量为114mg酶/g载体。
[0030]实施例3
[0031]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡lh，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定12h,固定化酶效率为64.1%，酶活回收率为46.2%，该载体的负载量为115mg酶/g载体。
[0032]实施例4
[0033]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡30min，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定12h，固定化酶效率为68.8%，酶活回收率为52.7%，该载体的负载量为124mg酶/g载体。
[0034]实施例5
[0035]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡1.5h，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定12h，固定化酶效率为69.7%，酶活回收率为54.5%，该载体的负载量为126mg酶/g载体。
[0036]实施例6
[0037]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡1.5h，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液lml，冰浴的条件下固定9h,固定化酶效率为58.0%，酶活回收率为30.3%，该载体的负载量为105mg酶/g载体。
[0038]实施例7
[0039]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡1.5h，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定10.5h,固定化酶效率为47.4%，酶活回收率为65.8%，该载体的负载量为119mg酶/g载体。
[0040]实施例8
[0041]将40mg纳米四氧化三铁分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL缓冲溶液中，加入45mg盐酸多巴胺，用10mM氢氧化钠调节pH到8.5，在室温下、速率200rpm下震荡1.5h，洗涤后干燥得到载体材料。取载体材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸缓冲液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的条件下固定18h，固定化酶效率为65.3%，酶活回收率为39.2%，该载体的负载量为71mg酶/g载体。
【主权项】
1.一种酶固定化方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)四氧化三铁纳米粒子分散在TriS-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液； (2)将(I)中所得的基材溶液中加入盐酸多巴胺，调pH为8.0到9.5，在室温下震荡I?90min，然后反复用去离子水冲洗，干燥； (3)将(2)所得到的材料在磷酸缓冲液中与酶进行震荡固定化，固定化温度为O?4°C，固定化时间I?12h ; (4)将(3)中所得的固定化酶冷冻干燥后即可。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述pH为8.5，步骤(3)中磷酸缓冲液的pH为8.0。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的四氧化三铁纳米粒子是将四水合氯化亚铁和六水合氯化铁通过氨水共沉淀制得的。4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述四氧化三铁纳米粒子与多巴胺的质量比为1: (0.5?5)。5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)、(3)中震荡速率为 100 ?500rpmo6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的酶为脂肪酶或蛋白酶。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为黑曲霉脂肪酶，黑曲霉脂肪酶为黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外产黑曲霉脂肪酶或细胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的发酵液。8.根据权利要求1?6任意一项方法制备的酶制剂。9.根据权利要求6所述的酶制剂，其特征在于，该酶制剂的适宜温度为20?60°C，pH为 6.5 ?9.0。10.根据权利要求9所述的酶制剂，其特征在于，该酶制剂的适宜温度为35?50°C，pH为 7.0 ?8.0。
【专利摘要】本发明公开了一种酶固定化方法及酶制剂，包括如下步骤：(1)四氧化三铁纳米粒子分散在Tris-HCL的缓冲溶液中，配置成基材溶液；(2)将(1)中所得的基材溶液中加入盐酸多巴胺，调pH为8.0到9.5，在室温下震荡1-90min，然后反复用去离子水冲洗，干燥；(3)将(2)所得到的材料在磷酸缓冲液中与酶进行震荡固定化，固定化温度为0～4℃，固定化时间1-12h；(4)将(3)中所得的固定化酶冷冻干燥后即可。本发明具有固定化黑曲霉脂肪酶固定化效率高、酶活回收率高，操作简便，条件温和等特点。
【IPC分类】C12N9/20, C12N11/08
【公开号】CN104894094
【申请号】CN201510250417
【发明人】娄文勇, 邓啸, 宗敏华, 曹诗林
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月15日
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