一种适用于提取香蕉不同组织的基因组dna的方法
一种适用于提取香蕉不同组织的基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA 的方法。
【背景技术】
[0002] DNA分子标记技术已广泛用于植物种质资源研宄。通过分子标记辅助育种可以大 大缩短育种周期，不受发育时期、组织器官和环境条件等因素影响。高效、快速制备高质量 的基因组DNA，并保证DNA的纯度和完整性，是进行分子标记和其他分子生物学试验的基 础。
[0003] 从植物组织中提取基因组DNA的常用方法有CTAB (十六烷基三乙基溴化铵）法和 SDS(十二烷基磺酸钠）法，以及基于这两种方法的改良法。这些方法适用于香蕉幼嫩组织 的基因组DNA提取，提取的DNA纯度能够满足一般分子生物学的需要，但对于富含多糖、多 酚的香蕉果实而言就需要通过分步离心，或加入醋酸钾和氯仿/异戊醇多次抽提，不仅提 取效果不能保证，而且操作步骤复杂，耗时长，易交叉污染。现有的实验操作中采用一种组 织对应一种方法的方式提取植物不同组织的基因组DNA，由于每种方法要配置的药品不同、 操作步骤各异，因此会增多实验步骤，加大工作量。
[0004] 鉴于上述情况，期望获得一种从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因 组DNA的方法，即，仅应用一种方法就可提取香蕉不同组织器官中的基因组DNA。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在解决上述问题。
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法。
[0007] 本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA方法包括如下步骤：步骤一：取 香蕉组织样品，加入液氮后研磨成粉末，转至离心管中；步骤二：在所述步骤一的所述香蕉 组织样品中加入提取缓冲液、10% SDS与氯化苄，充分混匀后水浴；步骤三：在经所述步骤 二得到的混合液中加入乙酸钠冰浴，然后离心分离；步骤四：取经所述步骤三所得的上清 至一干净离心管，加入预冷的异丙醇，混匀后离心分离，弃上清液；步骤五：取经所述步骤 四得到的沉淀用75%的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TE buffer或无菌水，再用适量 的RNase A消化，取出后于-20°C保存备用。
[0008] 进一步的，所述步骤一中所述香蕉组织样品的用量为0. 5g ;所述步骤二中所述提 取缓冲液的用量为ImU所述10% SDS的用量为150 yL、所述氯化苄的用量为200 yL~ 800 μ L ;所述步骤三中加入所述乙酸钠的含量为450 μ L ;所述步骤四中的所述异丙醇的用 量为0· lmL。
[0009] 进一步的，所述氯化苄为600 μ L。
[0010] 进一步的，所述提取缓冲液包括pH 9.0的IOOmmol · Llris-HCl、pH 8.0的 40mmo1 · L <EDTA。
[0011] 进一步的，所述步骤二中水浴温度为65°C，水浴时间为45min。
[0012] 进一步的，所述步骤三中所述乙酸钠冰浴所述混合液的时间为15min，且设定的离 心参数为13000 Xg离心8min。
[0013] 进一步的，所述步骤四中设定的离心参数为13500Xg离心10min。
[0014] 进一步的，所述步骤五中所述75%的乙醇洗涤所述沉淀的次数为两次。
[0015] 本发明的有益效果在于：本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA方法不 受取材限制，从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因组DNA，而且从单位香蕉组 织样品中提取的基因组DNA的纯度高并且收率高。
【附图说明】
[0016] 图1-1示出根据现有技术的CTAB常规法和CTAB改良法1提取香蕉各组织基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0017] 图1-2示出根据现有技术的CTAB改良法3和CTAB改良法2提取香蕉各组织基因 组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0018] 图1-3示出根据现有技术的SDS法和SDS结合蛋白酶K法提取香蕉各组织基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0019] 图1-4示出根据现有技术的改良尿素法和根据本发明的氯化苄法提取香蕉各组 织基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0020] 图2示出根据本发明的氯化苄法中不同浓度氯化苄提取香蕉各组织基因组DNA的 琼脂糖凝胶电泳结果；
[0021] 图3示出根据本发明的氯化苄法DNA的ITS扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技 术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的 技术效果。
[0023] 香蕉基因组DNA提取方法的比较实验
[0024] 在香蕉基因组DNA提取方法比较实验中，香蕉的叶、假茎、根和果实样品均采自国 内香蕉主栽品种'巴西蕉'（Musa Cavendish AAA)。此外，果实催熟后分别对果皮和果肉部 位进行采样。所有样品采集后迅速用95%的酒精清洗，分别置于-80°C超低温冰箱中保存 备用。
[0025] 取0. 5g上述各样品，加入适量液氮后研磨成粉末，迅速转至2mL离心管中，然后分 别按下述方法提取基因组DNA。
[0026] (1)氯化苄法（即本发明的方法）
[0027] 步骤如下：
[0028] 实施例1 :
[0029]①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄200 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔IOmin 摇匀一次；
[0030] ②加入450 μ L乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0031] ③取上清至一新离心管，加入0. lmL_20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混勾后在设定 的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0032] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴Ih)，取出后于-20°C保存备用。
[0033] 实施例2 :
[0034] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄600 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔15min 摇勾一次；
[0035] ②加入450 yL乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0036] ③取上清至一新离心管，加入0. lmL_20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定 的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0037] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0038] 实施例3 :
[0039] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄800 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔 10_15min 摇勾一次；
[0040] ②加入450 μ L乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0041] ③取上清至一新离心管，加入0. lmL-20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定 的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0042] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴l_2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0043] 实施例4 :
[0044] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄400 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔 10_15min 摇勾一次；
[0045] ②加入450 μ L乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0046] ③取上清至一新离心管，加入_20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定的离心 参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0047] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴l_2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0048] (2) CTAB 常规法
[0049] 步骤如下：
[0050] ①加入 ImL 65 °C 预热的 CTAB 提取缓冲液（IOOmmol · T1Tris-HCl pH 8. 0、 20mmol · T1EDTA pH 8. 0、L 4mol · L-1NaCl、3% CTAB、2% PVP、4% β -巯基乙醇），充分混 匀后65°C水浴lh，每隔10-15min摇匀一次；
[0051] ②取出离心管，室温下冷却，加入0.6mL苯酚：氯仿：异戊醇（体积比25:24:1)， 充分混匀后静置片刻，设定的离心参数为12000 Xg的条件下离心10min ;
[0052] ③取上清液至新离心管，加入0. 6mL的氯仿：异戊醇（体积比24:1)，混匀后设定 的离心参数为12000 Xg的条件下离心10min ;
[0053] ④取上清液至新离心管，加入0.1 mL的乙酸钠和0. lmL-20°C预冷的异丙醇，充分 混匀后-20°C放置Ih以上，设定的离心参数为12000Xg的条件下离心8min ;
[0054] ⑤弃上清液，取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌 水溶解DNA，再用适量的RNase A消化（37°C水浴l_2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0055] (3) CTAB 改良法 1
[0056] 操作步骤同CTAB常规法，区别在于步骤①抽提时CTAB提取缓冲液中NaCl浓度提 高至2. 50mol · I71，同时加入30 μ L蛋白酶K(浓度20mg · ml/1)。
[0057] (4) CTAB 改良法 2
[0058] 操作步骤基本同CTAB常规法，区别在于上述步骤③中加入少量无水乙醇，可以沉 淀多糖，并且利于去除蛋白质。
[0059] 上述步骤③具体改动如下：待利用CTAB提取缓冲液抽提、离心后，取上清液至新 离心管，加入0. 3mL无水乙醇和0. 4mL苯酷：氯仿：异戊醇（体积比25:24:1)，充分混勾后 静置片刻，离心取上清液；后续操作同上述CTAB常规法步骤④和⑤。
[0060] (5) CTAB 改良法 3
[0061] ①加入CTAB提取缓冲液于65°C水浴Ih后，加入0. 5mL氯仿：异戊醇（体积比 24:1)抽提去除蛋白质，设定的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，取上清液；
[0062] ②加入0. 6mL_20°C预冷的异丙醇用于沉淀核酸，充分混匀后设定的离心参数为 13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0063] ③沉淀用0· 8mL Imol · L-1NaCl溶解DNA，加入0· 8mL苯酚：氯仿（体积比1:1)， 充分混匀后在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心10min，取上清液；
[0064] ④再加入0. 8mL氯仿：异戊醇（体积比24:1)，充分混匀后在设定的离心参数为 13000 Xg的条件下离心8min，取上清液；
[0065] ⑤加入0. 8mL预冷的无水乙醇混匀再次去除杂质，在设定的离心参数为13500 Xg 的条件下离心10min，弃上清液；
[0066] ⑥沉淀用70%的乙醇洗涤1次，室温挥发乙醇，后续操作同上述CTAB常规法步骤 ⑤。
[0067] (6) SDS 法
[0068] 步骤如下：
[0069] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol .T1Tris-HCl pH 8. 0、50mmol .L-1EDTA pH 8. 0、 0· 5mol · L-1NaCld^ β巯基乙醇），混匀后加入0· 5mL 10% SDS，充分混匀后65°C水浴 60min，期间每隔10_15min摇勾一次；
[0070] ②加入ImL 5mol · Γ1乙酸钠，混匀后冰浴30min，在设定的离心参数为12000Xg 的条件下离心10min ;后续操作同上述CTAB常规法步骤③、④和⑤。
[0071 ] (7) SDS结合蛋白酶裂解法
[0072] 步骤如下：加入ImL 50 °C预热的提取缓冲液（IOmmol · T1Tris-HCl pH 8. 0、 IOOmmol · T1EDTA pH 8. 0、0· 5% SDS、75mg · Γ1 蛋白酶 K)，充分混匀后 50°C水浴 2h，每隔 10-15min摇匀一次；后续操作同上述CTAB常规法步骤②、③、④和⑤。
[0073] (8)改良尿素法
[0074] 步骤如下：
[0075] ①加入 ImL 提取缓冲液（7mol · I71 尿素、0· 3mol · L-1NaCl、0. 034mol · I71 十二烧 基肌氨酸钠、50mmol .L-1Tris-HCl pH 8.0、20mmol .L-1EDTA pH 8·0、2% β 疏基乙醇），充 分混匀后65°C水浴45min，期间每隔10-15min摇匀一次；②在设定的离心参数为13000Xg 的条件下离心l〇min，取上清加入100 μ L IOmol · I71乙酸胺，混勾后再加入2倍体积的无 水乙醇，混匀后在设定的离心参数为13000Xg的条件下离心10min ;
[0076] 后续操作同上述CTAB常规法步骤②、③、④和⑤。
[0077] 香蕉基因组DNA的质量检验
[0078] (1)①由上述各种方法提取的香蕉基因组DNA的凝胶电泳检测
[0079] 取按上述各种方法提取的香蕉基因组DNA样品3 μ L于1. 0%琼脂糖凝胶（含EB - 溴化乙锭）中分别进行电泳，在凝胶成像系统下观察、拍照。
[0080] 在图1(图1-1、图1-2、图1-3以及图1-4)中，1 :以香蕉果肉的基因组DNA为样品 的泳道；2 :以香蕉果皮的基因组DNA为样品的泳道；3 :以香蕉根的基因组DNA为样品的泳 道；4 :以香蕉假茎的基因组DNA为样品的泳道；5 :以香蕉叶的基因组DNA为样品的泳道；M : Maker (10000) ;A: CTAB 常规法；B: CTAB 改良法 I ;C: CTAB 改良法 3 ;D: CTAB 改良法 2 ;E: SDS 法；F:SDS结合蛋白酶裂解法；G:改良尿素法；Η:氯化苄法。如图1中所示，A(CTAB常规 法）与B(CTAB改良法1)下凝胶电泳图类似，香蕉果肉与果皮样品中未出现基因组DNA的 条带，根中条带不清晰，仅假茎与叶中出现较清晰的条带；C(CTAB改良法3)与D (CTAB改良 法2)下凝胶电泳图类似，香蕉果皮样品中未出现基因组DNA的条带，香蕉其它组织中出现 较清晰的基因组DNA的条带；E(SDS法）与F(SDS结合蛋白酶裂解法）下凝胶电泳图类似， 香蕉果肉与果皮样品中未出现基因组DNA的条带，而且香蕉其它组织中出现基因组DNA的 条带不清晰；G(改良尿素法）与H(氯化苄法）下凝胶电泳图类似，H(氯化苄法）提取的香 蕉的果肉、果皮、根、假茎以及叶中均有清晰的主条带，而且条带整齐明亮，几乎没有降解， 但是G(改良尿素法）下，香蕉果皮样品中未出现基因组DNA的条带。如上所述，仅H(氯化 苄法）能提取香蕉各组织中的基因组DNA，而且主条带清晰明亮可见，即，该方法提取的DNA 完整性较好、质量较高。
[0081] ②按加入不同浓度氯化苄的氯化苄法提取的香蕉基因组DNA的凝胶电泳检测
[0082] 取按不同体积氯化苄的氯化苄法提取的香蕉基因组DNA样品3 μ L于1. 0%琼脂糖 凝胶（含EB-溴化乙锭）中分别进行电泳，在凝胶成像系统下观察、拍照。
[0083] 在图2中，1 :以香蕉果肉的基因组DNA为样品的泳道；2 :以香蕉果皮的基因组DNA 为样品的泳道；3 :以香蕉根的基因组DNA为样品的泳道；4 :以香蕉假茎的基因组DNA为样 品的泳道；5 :以香蕉叶的基因组DNA为样品的泳道；M :Maker(10000) ;C1 :400 μ L氯化苄的 氯化苄法；C2 :200 μ L氯化苄的氯化苄法；C3 :60 0 μ L氯化苄的氯化苄法；C4 :800 μ L氯化 苄的氯化苄法。如图2中所示，在C4下，1泳道（果肉）中条带明显与其它泳道中的条带 跑得慢，而且条带模糊，这可能是该果肉基因组DNA中含有较多的蛋白质以及酚类；在CU C2与C3下，条带状况基本相似，但Cl与C2下，泳道2中条带非常淡，而C3中，各泳道的带 比较清晰、整齐。综上所示，C3(600 yL氯化苄的氯化苄法）最适于提取香蕉各组织中的基 因组DNA。
[0084] (2)吸光度检测
[0085] 利用核酸蛋白测定仪（Eppendorf BioPhotometer Plus)检测按上述各种方法提 取的香蕉基因组DNA样品的质量浓度（单位样品中提取出的基因组DNA的质量，单位：μ g/ mL)以及在波长260nm、280nm处的吸收值A260和A280,计算A260/A280用以判断DNA的纯 度。表1示出不同方法提取香蕉各组织DNA的质量浓度（μ g/mL)。表2示出不同DNA提取 方法提取香蕉各组织DNA的A260/A280值。表3示出氯化苄法中添加不同浓度氯化苄提取 香蕉各组织DNA的质量浓度（μ g/mL)、A260/A280值。
[0086] 纯DNA的A260/A280比值为1 · 8，若A260/A280比值在1 · 7~1 · 9之间，则表明DNA 的纯度较高；若比值在1. 5及以下则表示DNA溶液中含50%以上的蛋白质，即，DNA受到蛋 白（芳香族）或酚类物质的污染。
[0087] 表1中明显可见氯化苄法^OOyL)无论在香蕉的叶、假茎与根中，还是在果皮以 及果肉中提取出的基因组DNA的质量浓度均高于其它方法中提取的基因组DNA。
[0088] 如表2中所示，仅CTAB改良法2与氯化苄法（600 μ L)能从香蕉各组织（叶、假茎、 根、果皮以及果肉）中提取出基因组DNA ;并且仅氯化苄法（600 μ L)的Α260/Α280比值均 在1. 7~1. 9之间，如上所述，上述方法中仅氯化苄法（600 μ L)能从香蕉各组织中提取出 纯度高的基因组DNA。
[0089] 如表3中所示，600 μ L氯化苄的氯化苄法在香蕉叶、假茎、根中提取的基因组DNA 的质量浓度均高于其它浓度的氯化苄法，而且Α260/Α280比值均在1. 7~1. 9之间；虽然 600 μ L氯化苄的氯化苄法在香蕉果肉中提取的基因组DNA的质量浓度低于800 μ L氯化苄 的氯化苄法，但是600 μ L氯化苄的氯化苄法的Α260/Α280比值高于800 μ L氯化苄的氯化 苄法的Α260/Α280比值，并且小于1. 8,另外，600 μ L氯化苄的氯化苄法在香蕉果皮、果肉中 提取的基因组DNA的质量浓度均明显高于200 μ L、400 μ L的氯化苄的氯化苄法中提取的基 因组DNA的质量浓度。
[0090] 综上所述，在综合考虑基因组DNA质量浓度与纯度的情况下，600 μ L氯化苄的氯 化苄法是提取香蕉不同组织的基因组DNA的最优方法。
[0091] 表1不同方法提取香蕉各组织DNA的质量浓度对比
[0092]
[0093] 表2不同DNA提取方法提取香蕉各组织DNA的A260/A280值对比
[0094]
[0095] 表3氯化苄法中添加不同浓度氯化苄提取香蕉各组织DNA的质量浓度对比
[0096]
[0097] (3) PCR扩增检测
[0098] 分别从香蕉品种：Calcutta 4 ;巴西蕉（香牙蕉类）；Mbwazirume (东非高原香 蕉）；Mbi Egomel(Plantain);过山香；东莞大蕉（大蕉类）；广粉1号（粉蕉类）；贡蕉中 取样，然后将所有样品迅速用95%的酒精清洗，分别置于-80°C超低温冰箱中保存备用。
[0099] 取0. 5g上述各样品，加入适量液氮后研磨成粉末，迅速转至2mL离心管中，然后分 别按氯化苄法（添加600 μ L氯化苄）提取基因组DNA。
[0100] 以上述基因组DNA为模板，采用香蕉内转录间隔区通用引物ITS4/ITSL进行PCR 扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后EB染色，在紫外光下观察、拍照。
[0101] 在图3中，M :Maker(2000)的泳道；附图标记1、2、3、4、5、6、7以及8分别 表示香蕉品种Calcutta 4、巴西蕉（香牙蕉类）、Mbwazirume(东非高原香蕉）、Mbi Egomel (Plantain)、过山香、东莞大蕉（大蕉类）、广粉1号（粉蕉类）以及贡蕉的基因组 DNA的PCR产物的泳道。如图3中所示，电泳条带均清晰可见，为单一的700bp左右大小的 带，符合香蕉种质资源ITS特有片段，由此可见，由氯化苄法（添加600 μ L氯化苄）提取的 DNA符合PCR操作的需求。
[0102] 综上所述，采用氯化苄法可简便、快速地提取香蕉不同组织的基因组DNA，而且所 提取的基因组DNA完整性好、纯度高，适于PCR操作的需求；与提取基因组DNA的其它方法 相比，就提取香蕉果皮、果肉的基因组DNA而言，600 yL氯化苄的氯化苄法效果尤其凸显。
[0103] 本文虽然已经给出了本发明的具体实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在 不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不 应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
【主权项】
1. 一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一：取香蕉组织样品，加入液氮后研磨成粉末，转至离心管中； 步骤二：在所述步骤一中所得的所述香蕉组织样品中加入提取缓冲液、10%SDS与氯 化苄，充分混匀后水浴； 步骤三：在经所述步骤二得到的混合液中加入乙酸钠冰浴后离心分离； 步骤四：取经所述步骤三所得的上清液至离心管中，加入预冷的异丙醇，混匀后离心分 离，弃上清液； 步骤五：取经所述步骤四得到的沉淀用75%的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TEbuffer或无菌水，再用RNaseA消化后于-20°C保存备用。2.如权利要求1所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在 于，所述步骤一中所述香蕉组织样品的用量为〇.5g ;所述步骤二中所述提取缓冲液的用量 为ImU所述10%SDS的用量为150yL、所述氯化苄的用量为200yL~800yL;所述步骤 三中加入所述乙酸钠的含量为450yL;所述步骤四中所述异丙醇的用量为0.lmL。3. 如权利要求2所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在 于，所述氯化苄的用量为600yL。4. 如权利要求2所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在 于，所述提取缓冲液包括pH9. 0 的IOOmmol? !/1Tris-HCl与pH8. 0 的 40mmol?LlDTA。5. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤二中水浴温度为65 °C，水浴时间为45min。6. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤三中所述乙酸钠冰浴所述混合液的时间为15min，且设定的离心 参数为13000Xg离心8min。7. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤四中设定的离心参数为13500Xg离心lOmin。8. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤五中所述75%的乙醇洗涤所述沉淀的次数为两次。
【专利摘要】本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法包括：取香蕉组织样品，加入液氮研磨成粉末，迅速转至离心管中；然后，加入提取缓冲液、10％SDS与氯化苄，充分混匀后水浴；接着，加入乙酸钠冰浴，然后离心；取经上一步骤所得的上清至一干净离心管，加入预冷的异丙醇，混匀后离心，弃上清液；取经上一步骤得到的沉淀用75％的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TE buffer，再用适量的RNase A消化，取出后于-20℃保存备用。上述方法不受取材限制，从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因组DNA，而且从单位香蕉组织样品中提取的基因组DNA的纯度高并且量大。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104894104
【申请号】CN201510202596
【发明人】盛鸥, 邓贵明, 魏岳荣, 邝瑞彬, 李春雨, 易干军
【申请人】广东省农业科学院果树研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月23日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA 的方法。
【背景技术】
[0002] DNA分子标记技术已广泛用于植物种质资源研宄。通过分子标记辅助育种可以大 大缩短育种周期，不受发育时期、组织器官和环境条件等因素影响。高效、快速制备高质量 的基因组DNA，并保证DNA的纯度和完整性，是进行分子标记和其他分子生物学试验的基 础。
[0003] 从植物组织中提取基因组DNA的常用方法有CTAB (十六烷基三乙基溴化铵）法和 SDS(十二烷基磺酸钠）法，以及基于这两种方法的改良法。这些方法适用于香蕉幼嫩组织 的基因组DNA提取，提取的DNA纯度能够满足一般分子生物学的需要，但对于富含多糖、多 酚的香蕉果实而言就需要通过分步离心，或加入醋酸钾和氯仿/异戊醇多次抽提，不仅提 取效果不能保证，而且操作步骤复杂，耗时长，易交叉污染。现有的实验操作中采用一种组 织对应一种方法的方式提取植物不同组织的基因组DNA，由于每种方法要配置的药品不同、 操作步骤各异，因此会增多实验步骤，加大工作量。
[0004] 鉴于上述情况，期望获得一种从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因 组DNA的方法，即，仅应用一种方法就可提取香蕉不同组织器官中的基因组DNA。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在解决上述问题。
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法。
[0007] 本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA方法包括如下步骤：步骤一：取 香蕉组织样品，加入液氮后研磨成粉末，转至离心管中；步骤二：在所述步骤一的所述香蕉 组织样品中加入提取缓冲液、10% SDS与氯化苄，充分混匀后水浴；步骤三：在经所述步骤 二得到的混合液中加入乙酸钠冰浴，然后离心分离；步骤四：取经所述步骤三所得的上清 至一干净离心管，加入预冷的异丙醇，混匀后离心分离，弃上清液；步骤五：取经所述步骤 四得到的沉淀用75%的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TE buffer或无菌水，再用适量 的RNase A消化，取出后于-20°C保存备用。
[0008] 进一步的，所述步骤一中所述香蕉组织样品的用量为0. 5g ;所述步骤二中所述提 取缓冲液的用量为ImU所述10% SDS的用量为150 yL、所述氯化苄的用量为200 yL~ 800 μ L ;所述步骤三中加入所述乙酸钠的含量为450 μ L ;所述步骤四中的所述异丙醇的用 量为0· lmL。
[0009] 进一步的，所述氯化苄为600 μ L。
[0010] 进一步的，所述提取缓冲液包括pH 9.0的IOOmmol · Llris-HCl、pH 8.0的 40mmo1 · L <EDTA。
[0011] 进一步的，所述步骤二中水浴温度为65°C，水浴时间为45min。
[0012] 进一步的，所述步骤三中所述乙酸钠冰浴所述混合液的时间为15min，且设定的离 心参数为13000 Xg离心8min。
[0013] 进一步的，所述步骤四中设定的离心参数为13500Xg离心10min。
[0014] 进一步的，所述步骤五中所述75%的乙醇洗涤所述沉淀的次数为两次。
[0015] 本发明的有益效果在于：本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA方法不 受取材限制，从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因组DNA，而且从单位香蕉组 织样品中提取的基因组DNA的纯度高并且收率高。
【附图说明】
[0016] 图1-1示出根据现有技术的CTAB常规法和CTAB改良法1提取香蕉各组织基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0017] 图1-2示出根据现有技术的CTAB改良法3和CTAB改良法2提取香蕉各组织基因 组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0018] 图1-3示出根据现有技术的SDS法和SDS结合蛋白酶K法提取香蕉各组织基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0019] 图1-4示出根据现有技术的改良尿素法和根据本发明的氯化苄法提取香蕉各组 织基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0020] 图2示出根据本发明的氯化苄法中不同浓度氯化苄提取香蕉各组织基因组DNA的 琼脂糖凝胶电泳结果；
[0021] 图3示出根据本发明的氯化苄法DNA的ITS扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技 术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的 技术效果。
[0023] 香蕉基因组DNA提取方法的比较实验
[0024] 在香蕉基因组DNA提取方法比较实验中，香蕉的叶、假茎、根和果实样品均采自国 内香蕉主栽品种'巴西蕉'（Musa Cavendish AAA)。此外，果实催熟后分别对果皮和果肉部 位进行采样。所有样品采集后迅速用95%的酒精清洗，分别置于-80°C超低温冰箱中保存 备用。
[0025] 取0. 5g上述各样品，加入适量液氮后研磨成粉末，迅速转至2mL离心管中，然后分 别按下述方法提取基因组DNA。
[0026] (1)氯化苄法（即本发明的方法）
[0027] 步骤如下：
[0028] 实施例1 :
[0029]①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄200 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔IOmin 摇匀一次；
[0030] ②加入450 μ L乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0031] ③取上清至一新离心管，加入0. lmL_20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混勾后在设定 的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0032] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴Ih)，取出后于-20°C保存备用。
[0033] 实施例2 :
[0034] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄600 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔15min 摇勾一次；
[0035] ②加入450 yL乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0036] ③取上清至一新离心管，加入0. lmL_20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定 的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0037] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0038] 实施例3 :
[0039] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄800 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔 10_15min 摇勾一次；
[0040] ②加入450 μ L乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0041] ③取上清至一新离心管，加入0. lmL-20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定 的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0042] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴l_2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0043] 实施例4 :
[0044] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄400 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔 10_15min 摇勾一次；
[0045] ②加入450 μ L乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0046] ③取上清至一新离心管，加入_20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定的离心 参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0047] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴l_2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0048] (2) CTAB 常规法
[0049] 步骤如下：
[0050] ①加入 ImL 65 °C 预热的 CTAB 提取缓冲液（IOOmmol · T1Tris-HCl pH 8. 0、 20mmol · T1EDTA pH 8. 0、L 4mol · L-1NaCl、3% CTAB、2% PVP、4% β -巯基乙醇），充分混 匀后65°C水浴lh，每隔10-15min摇匀一次；
[0051] ②取出离心管，室温下冷却，加入0.6mL苯酚：氯仿：异戊醇（体积比25:24:1)， 充分混匀后静置片刻，设定的离心参数为12000 Xg的条件下离心10min ;
[0052] ③取上清液至新离心管，加入0. 6mL的氯仿：异戊醇（体积比24:1)，混匀后设定 的离心参数为12000 Xg的条件下离心10min ;
[0053] ④取上清液至新离心管，加入0.1 mL的乙酸钠和0. lmL-20°C预冷的异丙醇，充分 混匀后-20°C放置Ih以上，设定的离心参数为12000Xg的条件下离心8min ;
[0054] ⑤弃上清液，取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌 水溶解DNA，再用适量的RNase A消化（37°C水浴l_2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0055] (3) CTAB 改良法 1
[0056] 操作步骤同CTAB常规法，区别在于步骤①抽提时CTAB提取缓冲液中NaCl浓度提 高至2. 50mol · I71，同时加入30 μ L蛋白酶K(浓度20mg · ml/1)。
[0057] (4) CTAB 改良法 2
[0058] 操作步骤基本同CTAB常规法，区别在于上述步骤③中加入少量无水乙醇，可以沉 淀多糖，并且利于去除蛋白质。
[0059] 上述步骤③具体改动如下：待利用CTAB提取缓冲液抽提、离心后，取上清液至新 离心管，加入0. 3mL无水乙醇和0. 4mL苯酷：氯仿：异戊醇（体积比25:24:1)，充分混勾后 静置片刻，离心取上清液；后续操作同上述CTAB常规法步骤④和⑤。
[0060] (5) CTAB 改良法 3
[0061] ①加入CTAB提取缓冲液于65°C水浴Ih后，加入0. 5mL氯仿：异戊醇（体积比 24:1)抽提去除蛋白质，设定的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，取上清液；
[0062] ②加入0. 6mL_20°C预冷的异丙醇用于沉淀核酸，充分混匀后设定的离心参数为 13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0063] ③沉淀用0· 8mL Imol · L-1NaCl溶解DNA，加入0· 8mL苯酚：氯仿（体积比1:1)， 充分混匀后在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心10min，取上清液；
[0064] ④再加入0. 8mL氯仿：异戊醇（体积比24:1)，充分混匀后在设定的离心参数为 13000 Xg的条件下离心8min，取上清液；
[0065] ⑤加入0. 8mL预冷的无水乙醇混匀再次去除杂质，在设定的离心参数为13500 Xg 的条件下离心10min，弃上清液；
[0066] ⑥沉淀用70%的乙醇洗涤1次，室温挥发乙醇，后续操作同上述CTAB常规法步骤 ⑤。
[0067] (6) SDS 法
[0068] 步骤如下：
[0069] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol .T1Tris-HCl pH 8. 0、50mmol .L-1EDTA pH 8. 0、 0· 5mol · L-1NaCld^ β巯基乙醇），混匀后加入0· 5mL 10% SDS，充分混匀后65°C水浴 60min，期间每隔10_15min摇勾一次；
[0070] ②加入ImL 5mol · Γ1乙酸钠，混匀后冰浴30min，在设定的离心参数为12000Xg 的条件下离心10min ;后续操作同上述CTAB常规法步骤③、④和⑤。
[0071 ] (7) SDS结合蛋白酶裂解法
[0072] 步骤如下：加入ImL 50 °C预热的提取缓冲液（IOmmol · T1Tris-HCl pH 8. 0、 IOOmmol · T1EDTA pH 8. 0、0· 5% SDS、75mg · Γ1 蛋白酶 K)，充分混匀后 50°C水浴 2h，每隔 10-15min摇匀一次；后续操作同上述CTAB常规法步骤②、③、④和⑤。
[0073] (8)改良尿素法
[0074] 步骤如下：
[0075] ①加入 ImL 提取缓冲液（7mol · I71 尿素、0· 3mol · L-1NaCl、0. 034mol · I71 十二烧 基肌氨酸钠、50mmol .L-1Tris-HCl pH 8.0、20mmol .L-1EDTA pH 8·0、2% β 疏基乙醇），充 分混匀后65°C水浴45min，期间每隔10-15min摇匀一次；②在设定的离心参数为13000Xg 的条件下离心l〇min，取上清加入100 μ L IOmol · I71乙酸胺，混勾后再加入2倍体积的无 水乙醇，混匀后在设定的离心参数为13000Xg的条件下离心10min ;
[0076] 后续操作同上述CTAB常规法步骤②、③、④和⑤。
[0077] 香蕉基因组DNA的质量检验
[0078] (1)①由上述各种方法提取的香蕉基因组DNA的凝胶电泳检测
[0079] 取按上述各种方法提取的香蕉基因组DNA样品3 μ L于1. 0%琼脂糖凝胶（含EB - 溴化乙锭）中分别进行电泳，在凝胶成像系统下观察、拍照。
[0080] 在图1(图1-1、图1-2、图1-3以及图1-4)中，1 :以香蕉果肉的基因组DNA为样品 的泳道；2 :以香蕉果皮的基因组DNA为样品的泳道；3 :以香蕉根的基因组DNA为样品的泳 道；4 :以香蕉假茎的基因组DNA为样品的泳道；5 :以香蕉叶的基因组DNA为样品的泳道；M : Maker (10000) ;A: CTAB 常规法；B: CTAB 改良法 I ;C: CTAB 改良法 3 ;D: CTAB 改良法 2 ;E: SDS 法；F:SDS结合蛋白酶裂解法；G:改良尿素法；Η:氯化苄法。如图1中所示，A(CTAB常规 法）与B(CTAB改良法1)下凝胶电泳图类似，香蕉果肉与果皮样品中未出现基因组DNA的 条带，根中条带不清晰，仅假茎与叶中出现较清晰的条带；C(CTAB改良法3)与D (CTAB改良 法2)下凝胶电泳图类似，香蕉果皮样品中未出现基因组DNA的条带，香蕉其它组织中出现 较清晰的基因组DNA的条带；E(SDS法）与F(SDS结合蛋白酶裂解法）下凝胶电泳图类似， 香蕉果肉与果皮样品中未出现基因组DNA的条带，而且香蕉其它组织中出现基因组DNA的 条带不清晰；G(改良尿素法）与H(氯化苄法）下凝胶电泳图类似，H(氯化苄法）提取的香 蕉的果肉、果皮、根、假茎以及叶中均有清晰的主条带，而且条带整齐明亮，几乎没有降解， 但是G(改良尿素法）下，香蕉果皮样品中未出现基因组DNA的条带。如上所述，仅H(氯化 苄法）能提取香蕉各组织中的基因组DNA，而且主条带清晰明亮可见，即，该方法提取的DNA 完整性较好、质量较高。
[0081] ②按加入不同浓度氯化苄的氯化苄法提取的香蕉基因组DNA的凝胶电泳检测
[0082] 取按不同体积氯化苄的氯化苄法提取的香蕉基因组DNA样品3 μ L于1. 0%琼脂糖 凝胶（含EB-溴化乙锭）中分别进行电泳，在凝胶成像系统下观察、拍照。
[0083] 在图2中，1 :以香蕉果肉的基因组DNA为样品的泳道；2 :以香蕉果皮的基因组DNA 为样品的泳道；3 :以香蕉根的基因组DNA为样品的泳道；4 :以香蕉假茎的基因组DNA为样 品的泳道；5 :以香蕉叶的基因组DNA为样品的泳道；M :Maker(10000) ;C1 :400 μ L氯化苄的 氯化苄法；C2 :200 μ L氯化苄的氯化苄法；C3 :60 0 μ L氯化苄的氯化苄法；C4 :800 μ L氯化 苄的氯化苄法。如图2中所示，在C4下，1泳道（果肉）中条带明显与其它泳道中的条带 跑得慢，而且条带模糊，这可能是该果肉基因组DNA中含有较多的蛋白质以及酚类；在CU C2与C3下，条带状况基本相似，但Cl与C2下，泳道2中条带非常淡，而C3中，各泳道的带 比较清晰、整齐。综上所示，C3(600 yL氯化苄的氯化苄法）最适于提取香蕉各组织中的基 因组DNA。
[0084] (2)吸光度检测
[0085] 利用核酸蛋白测定仪（Eppendorf BioPhotometer Plus)检测按上述各种方法提 取的香蕉基因组DNA样品的质量浓度（单位样品中提取出的基因组DNA的质量，单位：μ g/ mL)以及在波长260nm、280nm处的吸收值A260和A280,计算A260/A280用以判断DNA的纯 度。表1示出不同方法提取香蕉各组织DNA的质量浓度（μ g/mL)。表2示出不同DNA提取 方法提取香蕉各组织DNA的A260/A280值。表3示出氯化苄法中添加不同浓度氯化苄提取 香蕉各组织DNA的质量浓度（μ g/mL)、A260/A280值。
[0086] 纯DNA的A260/A280比值为1 · 8，若A260/A280比值在1 · 7~1 · 9之间，则表明DNA 的纯度较高；若比值在1. 5及以下则表示DNA溶液中含50%以上的蛋白质，即，DNA受到蛋 白（芳香族）或酚类物质的污染。
[0087] 表1中明显可见氯化苄法^OOyL)无论在香蕉的叶、假茎与根中，还是在果皮以 及果肉中提取出的基因组DNA的质量浓度均高于其它方法中提取的基因组DNA。
[0088] 如表2中所示，仅CTAB改良法2与氯化苄法（600 μ L)能从香蕉各组织（叶、假茎、 根、果皮以及果肉）中提取出基因组DNA ;并且仅氯化苄法（600 μ L)的Α260/Α280比值均 在1. 7~1. 9之间，如上所述，上述方法中仅氯化苄法（600 μ L)能从香蕉各组织中提取出 纯度高的基因组DNA。
[0089] 如表3中所示，600 μ L氯化苄的氯化苄法在香蕉叶、假茎、根中提取的基因组DNA 的质量浓度均高于其它浓度的氯化苄法，而且Α260/Α280比值均在1. 7~1. 9之间；虽然 600 μ L氯化苄的氯化苄法在香蕉果肉中提取的基因组DNA的质量浓度低于800 μ L氯化苄 的氯化苄法，但是600 μ L氯化苄的氯化苄法的Α260/Α280比值高于800 μ L氯化苄的氯化 苄法的Α260/Α280比值，并且小于1. 8,另外，600 μ L氯化苄的氯化苄法在香蕉果皮、果肉中 提取的基因组DNA的质量浓度均明显高于200 μ L、400 μ L的氯化苄的氯化苄法中提取的基 因组DNA的质量浓度。
[0090] 综上所述，在综合考虑基因组DNA质量浓度与纯度的情况下，600 μ L氯化苄的氯 化苄法是提取香蕉不同组织的基因组DNA的最优方法。
[0091] 表1不同方法提取香蕉各组织DNA的质量浓度对比
[0092]
[0093] 表2不同DNA提取方法提取香蕉各组织DNA的A260/A280值对比
[0094]
[0095] 表3氯化苄法中添加不同浓度氯化苄提取香蕉各组织DNA的质量浓度对比
[0096]
[0097] (3) PCR扩增检测
[0098] 分别从香蕉品种：Calcutta 4 ;巴西蕉（香牙蕉类）；Mbwazirume (东非高原香 蕉）；Mbi Egomel(Plantain);过山香；东莞大蕉（大蕉类）；广粉1号（粉蕉类）；贡蕉中 取样，然后将所有样品迅速用95%的酒精清洗，分别置于-80°C超低温冰箱中保存备用。
[0099] 取0. 5g上述各样品，加入适量液氮后研磨成粉末，迅速转至2mL离心管中，然后分 别按氯化苄法（添加600 μ L氯化苄）提取基因组DNA。
[0100] 以上述基因组DNA为模板，采用香蕉内转录间隔区通用引物ITS4/ITSL进行PCR 扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后EB染色，在紫外光下观察、拍照。
[0101] 在图3中，M :Maker(2000)的泳道；附图标记1、2、3、4、5、6、7以及8分别 表示香蕉品种Calcutta 4、巴西蕉（香牙蕉类）、Mbwazirume(东非高原香蕉）、Mbi Egomel (Plantain)、过山香、东莞大蕉（大蕉类）、广粉1号（粉蕉类）以及贡蕉的基因组 DNA的PCR产物的泳道。如图3中所示，电泳条带均清晰可见，为单一的700bp左右大小的 带，符合香蕉种质资源ITS特有片段，由此可见，由氯化苄法（添加600 μ L氯化苄）提取的 DNA符合PCR操作的需求。
[0102] 综上所述，采用氯化苄法可简便、快速地提取香蕉不同组织的基因组DNA，而且所 提取的基因组DNA完整性好、纯度高，适于PCR操作的需求；与提取基因组DNA的其它方法 相比，就提取香蕉果皮、果肉的基因组DNA而言，600 yL氯化苄的氯化苄法效果尤其凸显。
[0103] 本文虽然已经给出了本发明的具体实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在 不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不 应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
【主权项】
1. 一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一：取香蕉组织样品，加入液氮后研磨成粉末，转至离心管中； 步骤二：在所述步骤一中所得的所述香蕉组织样品中加入提取缓冲液、10%SDS与氯 化苄，充分混匀后水浴； 步骤三：在经所述步骤二得到的混合液中加入乙酸钠冰浴后离心分离； 步骤四：取经所述步骤三所得的上清液至离心管中，加入预冷的异丙醇，混匀后离心分 离，弃上清液； 步骤五：取经所述步骤四得到的沉淀用75%的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TEbuffer或无菌水，再用RNaseA消化后于-20°C保存备用。2.如权利要求1所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在 于，所述步骤一中所述香蕉组织样品的用量为〇.5g ;所述步骤二中所述提取缓冲液的用量 为ImU所述10%SDS的用量为150yL、所述氯化苄的用量为200yL~800yL;所述步骤 三中加入所述乙酸钠的含量为450yL;所述步骤四中所述异丙醇的用量为0.lmL。3. 如权利要求2所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在 于，所述氯化苄的用量为600yL。4. 如权利要求2所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在 于，所述提取缓冲液包括pH9. 0 的IOOmmol? !/1Tris-HCl与pH8. 0 的 40mmol?LlDTA。5. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤二中水浴温度为65 °C，水浴时间为45min。6. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤三中所述乙酸钠冰浴所述混合液的时间为15min，且设定的离心 参数为13000Xg离心8min。7. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤四中设定的离心参数为13500Xg离心lOmin。8. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤五中所述75%的乙醇洗涤所述沉淀的次数为两次。
【专利摘要】本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法包括：取香蕉组织样品，加入液氮研磨成粉末，迅速转至离心管中；然后，加入提取缓冲液、10％SDS与氯化苄，充分混匀后水浴；接着，加入乙酸钠冰浴，然后离心；取经上一步骤所得的上清至一干净离心管，加入预冷的异丙醇，混匀后离心，弃上清液；取经上一步骤得到的沉淀用75％的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TE buffer，再用适量的RNase A消化，取出后于-20℃保存备用。上述方法不受取材限制，从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因组DNA，而且从单位香蕉组织样品中提取的基因组DNA的纯度高并且量大。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104894104
【申请号】CN201510202596
【发明人】盛鸥, 邓贵明, 魏岳荣, 邝瑞彬, 李春雨, 易干军
【申请人】广东省农业科学院果树研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月23日
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