用于制备pap固体反应成分的冷冻干燥技术及由该技术获得的固体集成组合物与应用
用于制备pap固体反应成分的冷冻干燥技术及由该技术获得的固体集成组合物与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和核酸扩增领域，尤其是用于制备PAP固体反应成分的冷 冻干燥技术及由该技术获得的固体集成组合物与应用。
【背景技术】
[0002] 现阶段用于核酸扩增的技术包括焦磷酸化激活性聚合反应（PAP)。PAP是通过使 用3'末端阻断性引物，由DNA聚合酶把焦磷酸化反应和聚合反应串联耦合的一种核酸扩 增方法。引物在其3'末端被一个不可延伸的核苷酸（3'末端阻断剂）所阻断，如双脱氧 核苷酸，而不能被DNA聚合酶直接延伸。当3'末端阻断性引物退火与其互补的DNA模板相 配时，在焦磷酸或其类似物存在的条件下，DNA聚合酶可以将3'末端阻断性引物的3'阻断 剂除掉，这一反应称为焦磷酸化。然后DNA聚合酶可将结合到DNA模板上3'末端已解除阻 断的引物进行延伸。此外，PAP已经在美国专利号6, 534, 269, 7, 033, 763, 7, 105, 298, 7, 23 8, 480, 7, 504, 221，7, 914, 995, and 7, 919, 253 有所描述。
[0003] PAP使用了 3'末端阻断性引物串联耦合了焦磷酸化反应和延伸性聚合反应而产 生了非常高的选择性，因为一个显著的非特异性扩增（第二类错误）需要不匹配性焦磷酸 化反应并加上随后由DNA聚合酶延伸掺入错误匹配的脱氧核苷酸，这类串联耦合事件的发 生概率极低，估计为3. 3 X KT11。
[0004] 双向形式的PAP (双向PAP)使用两个相反方向的3'末端阻断性引物并在其3'末 端有一个核苷酸相互重叠，双向PAP特别适合于等位基因的特异性扩增。在IO 9个拷贝的 野生型DNA存在的条件下，双向-PAP能够检测出单一拷贝的突变型等位基因而没有假阳性 扩增。
[0005] DNA-PAP是指从DNA模板开始的PAP扩增。对于DNA-PAP的相关报道表明，PAP最 初的测试使用了 Tf 1和Taq聚合酶于人类多巴胺Dl基因 DNA模板，证明了 DNA依赖性DNA 焦磷酸化反应和DNA依赖性DNA聚合反应可以串联耦合的原理。在用于其它DNA模板的情 况下，还证明了使用一个由基因工程技术优化后含F667Y突变的聚合酶TaqFS时，PAP的效 率大大提尚。
[0006] 而RNA-PAP是指从RNA模板开始的PAP扩增。对于RNA-PAP的相关报道则表明， RNA-PAP的发明可以直接扩增RNA模板而无需额外的处理。RNA-PAP带来了一个RNA模板扩 增的新机理，当阻断性引物退火杂交至RNA模板上时，RNA依赖性DNA聚合酶焦磷酸化反应 除掉：V阻断剂，例如Y双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合酶将活化的引物延伸。 同样由于这种串联耦合，RNA-PAP具有很高的选择性来对抗RNA模板的不匹配，提供了高度 特异的RNA模板的扩增（美国专利申请公开号20140186840)。
[0007] 冷冻干燥是一个将材料冷冻然后降低周围压力使材料中的冰直接从固相到气相 升华的脱水过程。这一工艺被用于稳定逆转录酶和RNA聚合酶（美国专利号5614387)，冻 干式PCR试剂（美国专利号5861251,6153412, WO专利申请公开号2005103277, EP专利号 2202302)，和干燥式荧光Sanger测序分析试剂（美国专利号7407747)。然而，在多种组成 成分存在的情况下，因为成分之间脆弱的平衡和相互作用，冻干的结果基本上是不可预知 的。例如，据报道含有引物的干燥后的混合物可使Taq聚合酶失活（EP专利号2202302)，及 镁离子引发的非特异性反应导致假阳性扩增。
[0008] 另外在实际工作中，PAP组合物以多种水溶液形式分别存储，包括反应缓冲液、焦 磷酸、dNTPs、3'阻断性引物、聚合酶、及核酸模板等均被存储在多个不同的试管内。操作时 需要把PAP的各个组分从不同的试管移液加入到一个试管内，该操作过程既容易出错且相 当费时。
[0009] 可见，寻求一种PAP组合物冷冻干燥技术具有非常重要的应用价值。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题在于提供用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技 术。
[0011] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述液体集成组合物通过冷冻干燥 技术所获得的固体集成组合物。
[0012] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述固体集成组合物的应用。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0014] 用于制备固体PAP反应成分的冷冻干燥技术，包括：
[0015] a)提供了一个由液体集成组合物的水溶液，包括有I)反应缓冲液、3'阻断性引 物、脱氧核苷三磷酸、焦磷酸、荧光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非还原性双糖；
[0016] b)将液体集成组合物的水溶液通过冷冻干燥技术获得固体集成组合物，使其易 于存储和操作；其中，
[0017] 所述液体集成组合物的水溶液包括：反应缓冲液包含有Tris-HCl、（NH4) 2SO4、和 Mg++;脱氧核苷三磷酸和焦磷酸为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na 407P2或其类似物；荧光染料是 SybrGreen I或连接于引物上的FAM ;聚合酶是含有F667Y氨基酸突变的Taq聚合酶；所述 非还原性双糖包括有海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖或乳果糖。
[0018] 优选的，上述用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，所述液体集成组合物中还 含有牛血清白蛋白。
[0019] 优选的，上述用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，所述液体集成组合物中还 含有多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇（PEG)或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
[0020] 优选的，上述用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，所述液体集成组合物中还 含有洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40。
[0021] 优选的，上述用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术，所述通过冷冻干燥技 术获得PAP固体集成组合物的方法还进一步包括步骤：c)冷冻干燥后，加入液体性核酸模 板水溶液使得冷冻干燥获得的固体集成组合物溶解。
[0022] 优选的，上述用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术，具体步骤如下：
[0023] (1)准备水溶液，使每5-10微升的水溶液中含有176-352mM Tris-HCl (pH值8. 0， 25°C )、20-40mM(NH4)2S04、2. 4-10mM MgCl2、50 或 90 或 100 或 180 μΜ 的每一种 dNTP(包括 (^丁卩、(1111\(?^13和(1〇13)、0.2-0.4以]\1每种引物、180-36(^]\1恥4??丨，0.2-0.4\571^6代611 I 染料，〇· 02-0. 04% Tween-20,2 单位聚合酶，200-400mM 海藻糖，0-0· 4% 聚蔗糖-400， 50-100g/ml BSA，和 0· 5-lmM DTT ;
[0024] (2)冷冻干燥过程，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，具体条件为：在_50°C至_55°C 快速冷冻2-4小时后，将样品抽至0-15帕压力真空并保持在-40°C至_45°C、15-30小时，然 后逐渐升高温度至室温，例如在-20摄氏度运行1小时，在5°C运行1小时，在30°C运行1 小时。
[0025] 由上述冷冻干燥技术所获得的固体集成组合物，由上述冷冻干燥技术制备而得。
[0026] 优选的，上述固体集成组合物，具有组分如下：
[0027] 反应缓冲液成分，包括 Tris-HCl、（NH4)2SO4、和 Mg++;
[0028] 脱氧核苷三磷酸和焦磷酸，为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na4O 7P2或其类似物；
[0029] 荧光染料，是SybrGreen I或连接于引物上的FAM ;
[0030] 聚合酶，是含有F66 7Y氨基酸突变的Taq聚合酶；
[0031] 双糖，包括海藻糖，蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，乳糖，或乳果糖。
[0032] 优选的，上述固体集成组合物，还含有牛血清白蛋白。
[0033] 优选的，上述固体集成组合物，还含有多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙 二醇（PEG)或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
[0034] 优选的，上述固体集成组合物，还含有洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40。
[0035] 优选的，上述固体集成组合物是通过冷冻干燥从液体集成组合物获得的，所述液 体集成组合物为每5-10微升的水溶液中含有176-352mM Tris-HCl (pH值8.0, 25 °C )、 20-40mM(NH4) 2S04、2. 4-10mM MgCl2、50 或 90 或 100 或 180 μ M每一种 dNTP (包括 dATP、dTTP、 dGTP 和 dCTP)、0. 2-0.4 μΜ 每种引物、180-360 μΜ Na4PPi，0. 2-0. 4XSybrGreen I 染料， 0.02-0.04%了胃6611-20,2单位聚合酶，200-4001111海藻糖，0-0.4%聚蔗糖-400,50-10(^/1111 BSA，和 0· 5-lmM DTT。
[0036] 上述通过冷冻干燥获得的固体集成组合物的应用，冷冻干燥后，所述固体集成组 合物通过加入含有核酸模板的水溶液进行溶解，进行PAP扩增。
[0037] 优选的，上述通过冷冻干燥获得的固体集成组合物的应用，用于实施PAP扩增，具 体方法包括：
[0038] a)加入含有核酸模板的水溶液以溶解冷冻干燥获得的固体集成组合（其中冷冻 干燥后固体集成组合物已含有反应缓冲液、3'阻断性引物、脱氧核苷三磷酸和焦磷酸、荧 光染料、核酸聚合酶和一个非还原性双糖，但不含有核酸模板）；
[0039] b)进行热循环扩增。
[0040] 本发明的有益效果是：
[0041] 本发明所述用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术解决了在液体状PAP集成 组合物中，特别是在室温下储存时，聚合酶不稳定且dNTPs易降解的技术问题，采用特定工 艺条件的冷冻干燥技术使获得的固体集成组合物易于操作并可以在非行业标准要求的温 度下长期储存；由该技术获得的固体集成组合物，除核酸模板外，汇总或集成所有的PAP反 应成分至仅一个试管内将大大方便使用，具有广泛的应用前景。
【具体实施方式】
[0042] 术语：
[0043] 除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语是与在本领域的普通技术人员所 通常理解的术语含义是相同的。
[0044] PCR是指聚合酶链式反应。
[0045] 焦磷酸化反应是脱氧核糖核酸聚合反应的逆反应。在焦磷酸的存在下，聚合酶可 从双链DNA上将3'末端核苷酸去除而生成一个三磷酸核苷酸和一个3'末端去除阻断的双 链 DNA :[dNMP]n+PPi - [dNMPL-i+dNTP 5。
[0046] 聚合酶或核酸聚合酶是指一多聚酶，其具有催化聚合反应或延长脱氧核糖核酸的 特性。它可以是DNA模板依赖性或RNA模板依赖性。
[0047] 3'末端阻断性引物是指其带有3'末端非延伸性核苷酸（3'末端阻断剂）如双脱 氧核苷酸的寡核苷酸。其3'末端核苷酸不能被直接延伸，但它可以被焦磷酸化反应所去 除，随即此去除阻断的引物可以被聚合酶所延伸。
[0048] PAP是指焦磷酸化激活性聚合反应。
[0049] 热稳定酶是指一种酶，其具有热稳定性或热抵抗性。
[0050] 蛋白突变是指在某一蛋白质位点的氨基酸残基的改变，如Taq聚合酶。氨基酸残 基的改变则被定义为与其相对的自然生成性蛋白质而言。一个蛋白具有突变则被称作为 "突变体"蛋白质。
[0051] TaqFS是一个经由基因工程技术优化型式的Taq聚合酶，与野生型序列相比含有 G46E和F667Y氨基酸的变化。
[0052] 冻干也称为冷冻干燥，是一个将材料冷冻然后降低周围压力使材料中的冰直接从 固相到气相升华的脱水过程。
[0053] 固体组合物指的是指一种基本上无溶剂的组合物。
[0054] 冷冻干燥PAP是指使用冻干组合物进行PAP反应。
[0055] 技术方案阐述--PAP液体集成组合物的冷冻干燥
[0056] 对于冷冻干燥，一个在水溶液中的集成的PAP组合物可分为PAP的基本组成成分， 冷冻干燥的基本组成成分，和其他组成成分。
[0057] 在水溶液中的PAP基本组成成分包括反应缓冲液、3'阻断性引物、脱氧核苷三磷 酸、焦磷酸、核酸聚合酶，和如需实时检测的话则有荧光染料。并且，PAP基本组成成分的 浓度和相应的容量体积是关键性的，这些不仅影响冷冻干燥的升华而且影响组合物的稳定 性。当溶解后反应组合物开始扩增时（IX组成成分浓度20 μ 1体积），最佳值有2到4倍浓 度和相对应到体积的变化。
[0058] 水溶液中冷冻干燥的主要成分应与PAP的基本组成成分相符，并能保持PAP的基 本组成成分稳定。非还原性双糖如海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖或乳果糖基本上充 分有效地发挥了稳定作用，无论水溶液体积大小如何，其关键的浓度范围可有从200 μ M到 400 μ M的变化。
[0059] 水溶液中的其它成分包括多元醇，如从0.05%到4%不同浓度的聚蔗糖-400,葡 聚糖，聚乙烯乙二醇-8000 (PEG)，从25到100毫微克/ μ L的聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，和洗 涤剂如0. 0125-0. 05%的Tween-20会促进PAP的基本组成成分稳定。（见实施例2-5)
[0060] PAP检测了 GNAS、HIV、rDNA和EGFR基因作为示范（表1)。由实验结果可以看出， 即使存储在50°C高温长达六天后，冷冻干燥样品表现出高效而特异的扩增，表示成功。最佳 集成PAP组合物为冷冻干燥中所描述的材料和方法参见实施例1。
[0061] 实施例1
[0062] 材料和方法
[0063] 制备引物
[0064] 靠近3'末端用6-FAM标记的dT引物是由IDT公司（USA)沿3' -5'方向化学合成 的，并用高效液相色谱法进行了纯化。
[0065] 3'末端用ddCMP所阻断的引物是由IDT公司（USA)沿沿3' -5'方向化学合成的， 并用高效液相色谱法进行了纯化。
[0066] 3'末端ddAMP、ddTMP和ddGMP所阻断的引物是用末端转移酶在寡核苷酸的3'末 端加上ddAMP、ddTMP和ddGMP酶法合成的 1 ;4。引物随后用含7M尿素的16%聚丙烯酰胺凝 胶电泳进行纯化，各回收引物的量用260nm紫外吸光度测定决定（表1)。
[0067] 表1.引物表
[0068]
[0069]
[0070] 表1注释：
[0071] a CACCAA是附接于引物5'端一个尾巴。/FAM_dT/是指FAM荧光标记的dT。
[0072] 模板的准备
[0073] 基因组DNA是用Qiagen公司QIAamp血液迷你试剂盒并按其说明书中的方法自全 血白细胞提取的。重组质粒DNA是通过插入一个化学合成或PCR扩增的100-400碱基对的 靶DNA片段至pUC57载体中所构建的，将其转化到大肠杆菌中，重组质粒DNA再用QIAamp 质粒迷你试剂盒按说明书中方法提取出。洗脱的DNA溶解于TE缓冲液（IOmM Tris-HCl， 0.1 mM EDTA，pH8. 0)，通过紫外260nm吸光度在来测定DNA的量。
[0074] 冷冻干燥前PAP液体集成组合物的制备
[0075] 在冷冻干燥前先准备5微升的水溶液，当中含有352mM Tris-HCKpH值8.0， 25°C )、40mM(NH4)2S04、4.8-10mM MgCl2、100 或 180μΜ 每一种 dNTP(dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)、0 .4yM 每种引物、360 μΜ Na4PPi，0.4x SybrGreen I染料，0.04%Tween-20,2 单位 聚合酶，200-4001111海藻糖，0-0.4%聚蔗糖-400,50-100微克/毫升854，和1111101'1'。该水 溶液加入单个试管、8联孔试管条、或96孔板中。
[0076] 另制备一 10微升的水溶液，含有 176mM Tris-HCKpH 8.0, 25°C)，20mM(NH4)2SO4, 2 .4-5禮1%(：12,50或9(^]\1每一种(1阶13((^了？、(1111\(?^1 3和(1〇13)，0.2 4]\1每种引物，18(^]\1 Na4PPpO. 2XSybrGreen I 染料，0· 02% Tween-20,2 单位聚合酶，200-400mM 海藻糖，0· 2% 聚蔗糖-400，100g/m I BSA和0. 5mM DTT。该水溶液加入单个试管、8联孔试管条、或96孔 板中。
[0077] 冷冻干燥过程
[0078] 使用VFD2000冷冻干燥机（北京博康实验医学仪器，中国）进行冷冻干燥，在-50 摄氏度快速冷冻2小时后，将样品抽至10-15帕压力真空并保持在-45°C 20小时，然后-20 摄氏度运行1小时，在5°C运行1小时，在30°C运行1小时。
[0079] 冷冻干燥后PAP固体集成组合物的储存稳定性
[0080] 冷冻干燥之后，将干样品储存在-20°c，37°c，或50°C下各种不同长度的时间来测 试其稳定性。
[0081] 冷冻干燥后固体集成组合物的溶解
[0082] 加入含有DNA模板的水溶液到该冷冻干燥后固体集成组合物至20微升的最终体 积。溶解后的反应混合物含有 88mM Tris-HCl(pH 8. 0,25°C) UOmM(NH4)2SO4U. 2-2. 5mM MgCl2、25 或 45 μΜ 每一种 dNTPs(dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)、0· 1-0. 2 μΜ 每种引物、90 μΜ Na4PPi、0.1 XSybrGreen I 染料、0.01 % Tween-20、2 单位聚合酶、100-200mM 海藻糖、0· 1% 聚蔗糖-400、25-50g/m I BSA、0.1mM DTT、以及 DNA 模板。
[0083] 热循环
[0084] 对扩增产物的定量使用了 Bio-Rad公司的CFX96实时PCR检测系统。分析模式： SybrGreen荧光；基线设置：基线扣除曲线拟合；阈值循环（CT)测定：单阈值；基线方法： SYBR自动计算；阈值设置：自动计算。
[0085] 循环包括96°C 12秒，60°C 30秒，64°C 30秒，和68°C 30秒共40个循环。在热循 环前，使用一个96°C 2分钟的步骤来对基因组DNA进行完全变性。或另一个循环包括96°C 持12秒，64°C 45秒，和68°C 45秒，共40个循环。在第一个循环之前加入一个96°C 2分钟 的变性步骤。
[0086] 为了证明为扩增产物，加上一个自68°C至95°C以每5秒递增0. 5°C的熔点曲线分 析以确认特异性扩增产物。
[0087] 实施例2
[0088] 本PAP试验的目的是要放大野生型序列的GNAS基因（表1)。一个在接近其3'末 端标记有FAM的LUX (Light Upon extension)引物被用来发出实时焚光信号（Nazarenko, I .,Lowe,B.,Darfler, Μ. , Ikonomi, Ρ. , Schuster, D. , and Rashtchian, Α· (2002) · Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeled with a single fluorophore. Nucleic acids research 30, e37) 〇 一旦引物退火并延伸到产物去，LUX会发射更多的焚 光信号。
[0089] 冷冻干燥集成的PAP组合物的制备如实施例1。对200 μΜ至400 μM的海藻糖， 5 μ 1和10 μ 1的水溶液，和0%至0. 4%的Ficoll等列于表2的因素进行了测试，在冷冻干 燥后将样品储存在_20°C，稳定性没有显著改变。为了加速将样品储存在50°C。在热循环 之前，加入溶于TE缓冲液的20ng基因组DNA至20 μ 1的体积。
[0090] 为了评估PAP的扩增性能，对Ct值和RFU进行了测定。Ct是阈值圈数而RFU是最 高荧光信号中减去基线后的随机单位。使用250Μ，300Μ，400Μ的海藻糖，Ct和RFU有高效 能的扩增，显示了冷冻干燥后组合集成物在50°C下6天是稳定的。另外还在82-83?范围 内测定到Tm，显示了其特异性扩增。
[0091] 然而用200 μ M的海藻糖（组合7)在50°C下储存六天后，Ct和RFU表现出低效扩 增，显示出低浓度海藻糖的效果不明显，但聚蔗糖并非如此。
[0092] 表2. GNAS基因的稳定性试验
[0093]
[0094] 表2注释：组合1和组合2是由101水溶液组成，含有176mM Tris-HCl (pH 8. 0， 25°C )、20mM(NH4)2S04、5mM MgCl2,、90 μΜ 每一种 dNTP、0. 2 μΜ 的每一种 GNAS 引物、180 μΜ Na4PPi、2 单位的聚合酶、0. 02% Tween-20、50μg/ml 的牛血清白蛋白、0. 5mM DTT 和 0. 20% 聚蔗糖-400。此外，组合1含300mM而组合2含有400mM的海藻糖。组合3和组合4则为 5μ1 的水溶液，内有 352mM Tris-HCl(pH 8.0,25°C)、40mM(NH4)2S04、10mM MgCl2、180yM 每一种(1ΝΤΡ、0·4μΜ 每一种引物、360 μΜ Na4PPi、2 单位聚合酶、0.04% Tween-20、50yg/ ml牛血清白蛋白、ImM DTT和0.40%聚蔗糖-400。此外，组合3含有300mM而组合4含有 400mM的海藻糖。组合5、组合6和组合7由5 μ 1水溶液组成，含有352mM Tris-HCl (pH 8· 0，25 °C )、40mM (NH4) 2S04、IOmM MgCl2、180 μ M 每一种 dNTP、0·4μΜ 每一种引物、360 μΜ 似4卩？1、2单位聚合酶，0.04%了￥6611-20,5(^8/1111牛血清白蛋白，1111101'1'。此外，组合5 含有200mM海藻糖和0%聚蔗糖，组合6则含有250mM海藻糖和0. 2%聚蔗糖，组合7含有 200mM海藻糖和0. 4 %聚蔗糖。
[0095] 实施例3
[0096] 本PAP试验是设计用来扩增HIV DNA (表1)。一个在接近其3'末端标记有FAM的 LUX (Light Upon extension)引物被用来发出实时荧光信号。
[0097] 该冷冻干燥集成的PAP组合物的制备与材料和方法中一致。对300 μ M和400 μ M 的海藻糖，以及对5 μ 1和10 μ 1水溶液等因素进行了测试（表3)。冷冻干燥后，将样品在 50°C下储存0、2、4和6天。在热循环之前，10,000拷贝的TE缓冲液的重组质粒DNA加入到 20微升的体积。
[0098] 为了评估PAP的扩增性能，对Ct和RFU进行测定。对于每一个组合，不同天数的 Ct和RFU得到的值相类似，显示在50 °C下6天是稳定的。另外，所测定的Tm为83 ± I °C，显 示出其为特异性扩增。
[0099] 表3.对HIV基因的稳定性试验
[0100]
[0101] 表3注释：
[0102] a除了为HIV引物外，组合1，组合2,组合3和组合4其它组分均与表2相同。
[0103] 实施例4
[0104] 本PAP试验设计用来扩增rDNA基因（表1)。SybrGreen被用来发出实时荧光信 号。
[01 05] 冷冻干燥集成的PAP组合物的制备如实施例1。对酶量等因素进行了测试（表4)。 冷冻干燥后，将样品在50°C储存0、1、2、3、4和5天。在热循环前，加入0. 2ng基因组DNA至 20 μ 1体积。
[0106] 为了评估PAP的扩增性能，Ct和RFU进行了测定。对于2单位和1单位聚合酶， 在50 °C下五天后Ct和RFU显示稳定。另外，所测定的Tm为80-81 °C，显示出其为特异性扩 增。更进一步，当酶量减少到〇. 5单位时，没有观察到有效的扩增。
[0107] 表4. rDNA基因的稳定性测试a
[0108]
[0109] 表4注释：
[0110] a rDNA 基因的组合是 51 的水溶液，含有 352mM Tris-HCl (pH 8. 0, 25 °C )、 40mM(NH4)2S04、10mM MgCl2、180 μΜ 每一种 dNTP、0. 4 μΜ 每一个 rDNA 引物、360 μΜ Na4PPi、 I或2个单位聚合酶、0. 04% Tween-20、50 μ g/ml的牛血清白蛋白、ImM的DTT、300mM的海 藻糖和0.4%聚蔗糖。
[0111] 实施例5
[0112] 设计了双向-PAP试验以扩增肺癌特异性的EGFR基因突变（表1)。
[0113] SybrGreen I被用来发出实时荧光信号。
[0114] 冷冻干燥集成的PAP组合物的制备如实施例1。PAP试验对L858R，L861Q，和L790M 三个突变体进行了测试（表5)。冷冻干燥后，将样品在50°C储存1、2、3、4和6天。在热循 环前，加入1000个拷贝溶于TE缓冲液的重组质粒DNA至20 μ 1体积。
[0115] 为了评估PAP的扩增性能，对Ct和RFU进行了测定。从第1天至第6天，每个突变 体均有相似的Ct和RFU值，显示在50 °C下6天是稳定的。另外，Tm测定为82-83 °C、80-81 °C 和85-86 °C，显示其为特异性扩增。
[0116] 表5. EGFR基因的稳定性试验
[0117]
[0118] 表5注释
[0119] a EGFR 基因的组合是 51 的水溶液，含有 352mM Tris-HCl (pH 8. 0, 25 °C )、 40mM(NH4)2S04、10mM MgCl2、180 μΜ 每一种 dNTP、0. 4 μΜ 每一个 EGFR 引物、360 μΜ Na4PPi、 2个单位聚合酶、0. 04% Tween_20、50μg/ml的牛血清白蛋白、ImM DTT、300mM海藻糖和 0.4%聚蔗糖。
[0120] 上述参照【具体实施方式】对该用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术及由该 技术获得的固体集成组合物与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照 所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 用于制备固体PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：包括： a) 提供了一个由液体集成组合物的水溶液，包括有I)反应缓冲液、3'阻断性引物、脱 氧核苷三磷酸、焦磷酸、荧光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非还原性双糖； b) 将液体集成组合物的水溶液通过冷冻干燥技术获得固体集成组合物，使其易于存 储和操作。2. 根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：所述 液体集成组合物的水溶液包括：反应缓冲液包含有Tris-HCl、（NH4)2SO4、和Mg++;脱氧核苷 三磷酸和焦磷酸为(^了卩、(1111\(?^1\(1〇1\似40 7?2或其类似物；荧光染料包括371^6代6111 或连接于引物上的FAM;聚合酶包括含有F667Y氨基酸突变的Taq聚合酶；所述非还原性双 糖包括有海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖或乳果糖。3. 根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：所述 液体集成组合物中还含有： 牛血清白蛋白；和/或 多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮；和/或 洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40 〇4. 根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：所述 通过冷冻干燥技术获得PAP固体集成组合物的方法还进一步包括步骤：c)冷冻干燥后，加 入液体性核酸模板水溶液使得冷冻干燥获得的固体集成组合物溶解。5. 根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：具体 步骤如下： (1) 准备水溶液，使每5-10微升的水溶液中含有176-352mM(pH值8. 0、25°C) Tris-HCl、20-40mM(NH4)2S04、2.4-10mMMgCl2、50 或 90 或 100 或 180yM每一种dNTP、 0? 2-0. 4yM每种引物、180-360yMNa4PPi，0.2-0. 4XSybrGreenI染料，0.02-0. 04 % Tween-20,2 单位聚合酶，200-400mM海藻糖，0-0? 4 % 聚蔗糖-400,50-100g/mlBSA，和 0.5-lmMDTT； (2) 冷冻干燥过程，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，具体条件为：在-50°C至_55°C快速 冷冻2-4小时后，将样品抽至0-15帕压力真空并保持在-40°C至_45°C、15-30小时，然后逐 渐升高温度至室温。6. -种固体集成组合物，其特征在于：是由权利要求1-5之一所述冷冻干燥技术制备 而得的。7. 根据权利要求6所述的固体集成组合物，其特征在于：具有组分如下： 反应缓冲液成分，包括Tris-HCl、（NH4)2SO4、和Mg++; 脱氧核苷三磷酸和焦磷酸，为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na4O7P2或其类似物； 荧光染料，包括SybrGreenI或连接于引物上的FAM; 聚合酶，包括含有F667Y氨基酸突变的Taq聚合酶； 双糖，包括海藻糖，蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，乳糖，或乳果糖。8. 根据权利要求6所述的固体集成组合物，其特征在于：还含有： 牛血清白蛋白；和/或 多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮；和/或 洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40 〇9. 根据权利要求6所述的固体集成组合物，其特征在于：是通过冷冻干燥从液体集成 组合物获得的，所述液体集成组合物为每5-10微升的水溶液中含有176-352mM(pH值8. 0、 25°C)Tris-HCl、20-40mM(NH4)2S04、2. 4-10mMMgCl2、50 或 90 或 100 或 180yM每一种dNTP、 0? 2-0. 4yM每种引物、180-360yMNa4PPi，0.2-0.4XSybrGreenI染料，0.02-0. 04 % Tween-20,2 单位聚合酶，200-400mM海藻糖，0-0? 4 % 聚蔗糖-400,50-100g/mlBSA，和 0.5-lmMDTTo10. 权利要求6所述的固体集成组合物的应用，其特征在于：冷冻干燥后，所述固体集 成组合物通过加入含有核酸模板的水溶液进行溶解，进行PAP扩增。
【专利摘要】本发明提供了用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术及由该技术获得的固体集成组合物与应用，该冷冻干燥技术包括：a)提供了一个由液体集成组合物的水溶液，包括有I)反应缓冲液、3′阻断性引物、脱氧核苷三磷酸、焦磷酸、荧光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非还原性双糖；b)将液体集成组合物的水溶液通过冷冻干燥技术获得的固体集成组合物,使其易于存储和操作；该冷冻干燥后所得固体集成组合物通过加入含有核酸模板的水溶液进行溶解,进行PAP扩增。
【IPC分类】F26B5/06, C12N15/10
【公开号】CN104894105
【申请号】CN201510259340
【发明人】丁少峰, 刘强
【申请人】丁少峰, 刘强
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月20日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和核酸扩增领域，尤其是用于制备PAP固体反应成分的冷 冻干燥技术及由该技术获得的固体集成组合物与应用。
【背景技术】
[0002] 现阶段用于核酸扩增的技术包括焦磷酸化激活性聚合反应（PAP)。PAP是通过使 用3'末端阻断性引物，由DNA聚合酶把焦磷酸化反应和聚合反应串联耦合的一种核酸扩 增方法。引物在其3'末端被一个不可延伸的核苷酸（3'末端阻断剂）所阻断，如双脱氧 核苷酸，而不能被DNA聚合酶直接延伸。当3'末端阻断性引物退火与其互补的DNA模板相 配时，在焦磷酸或其类似物存在的条件下，DNA聚合酶可以将3'末端阻断性引物的3'阻断 剂除掉，这一反应称为焦磷酸化。然后DNA聚合酶可将结合到DNA模板上3'末端已解除阻 断的引物进行延伸。此外，PAP已经在美国专利号6, 534, 269, 7, 033, 763, 7, 105, 298, 7, 23 8, 480, 7, 504, 221，7, 914, 995, and 7, 919, 253 有所描述。
[0003] PAP使用了 3'末端阻断性引物串联耦合了焦磷酸化反应和延伸性聚合反应而产 生了非常高的选择性，因为一个显著的非特异性扩增（第二类错误）需要不匹配性焦磷酸 化反应并加上随后由DNA聚合酶延伸掺入错误匹配的脱氧核苷酸，这类串联耦合事件的发 生概率极低，估计为3. 3 X KT11。
[0004] 双向形式的PAP (双向PAP)使用两个相反方向的3'末端阻断性引物并在其3'末 端有一个核苷酸相互重叠，双向PAP特别适合于等位基因的特异性扩增。在IO 9个拷贝的 野生型DNA存在的条件下，双向-PAP能够检测出单一拷贝的突变型等位基因而没有假阳性 扩增。
[0005] DNA-PAP是指从DNA模板开始的PAP扩增。对于DNA-PAP的相关报道表明，PAP最 初的测试使用了 Tf 1和Taq聚合酶于人类多巴胺Dl基因 DNA模板，证明了 DNA依赖性DNA 焦磷酸化反应和DNA依赖性DNA聚合反应可以串联耦合的原理。在用于其它DNA模板的情 况下，还证明了使用一个由基因工程技术优化后含F667Y突变的聚合酶TaqFS时，PAP的效 率大大提尚。
[0006] 而RNA-PAP是指从RNA模板开始的PAP扩增。对于RNA-PAP的相关报道则表明， RNA-PAP的发明可以直接扩增RNA模板而无需额外的处理。RNA-PAP带来了一个RNA模板扩 增的新机理，当阻断性引物退火杂交至RNA模板上时，RNA依赖性DNA聚合酶焦磷酸化反应 除掉：V阻断剂，例如Y双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合酶将活化的引物延伸。 同样由于这种串联耦合，RNA-PAP具有很高的选择性来对抗RNA模板的不匹配，提供了高度 特异的RNA模板的扩增（美国专利申请公开号20140186840)。
[0007] 冷冻干燥是一个将材料冷冻然后降低周围压力使材料中的冰直接从固相到气相 升华的脱水过程。这一工艺被用于稳定逆转录酶和RNA聚合酶（美国专利号5614387)，冻 干式PCR试剂（美国专利号5861251,6153412, WO专利申请公开号2005103277, EP专利号 2202302)，和干燥式荧光Sanger测序分析试剂（美国专利号7407747)。然而，在多种组成 成分存在的情况下，因为成分之间脆弱的平衡和相互作用，冻干的结果基本上是不可预知 的。例如，据报道含有引物的干燥后的混合物可使Taq聚合酶失活（EP专利号2202302)，及 镁离子引发的非特异性反应导致假阳性扩增。
[0008] 另外在实际工作中，PAP组合物以多种水溶液形式分别存储，包括反应缓冲液、焦 磷酸、dNTPs、3'阻断性引物、聚合酶、及核酸模板等均被存储在多个不同的试管内。操作时 需要把PAP的各个组分从不同的试管移液加入到一个试管内，该操作过程既容易出错且相 当费时。
[0009] 可见，寻求一种PAP组合物冷冻干燥技术具有非常重要的应用价值。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题在于提供用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技 术。
[0011] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述液体集成组合物通过冷冻干燥 技术所获得的固体集成组合物。
[0012] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述固体集成组合物的应用。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0014] 用于制备固体PAP反应成分的冷冻干燥技术，包括：
[0015] a)提供了一个由液体集成组合物的水溶液，包括有I)反应缓冲液、3'阻断性引 物、脱氧核苷三磷酸、焦磷酸、荧光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非还原性双糖；
[0016] b)将液体集成组合物的水溶液通过冷冻干燥技术获得固体集成组合物，使其易 于存储和操作；其中，
[0017] 所述液体集成组合物的水溶液包括：反应缓冲液包含有Tris-HCl、（NH4) 2SO4、和 Mg++;脱氧核苷三磷酸和焦磷酸为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na 407P2或其类似物；荧光染料是 SybrGreen I或连接于引物上的FAM ;聚合酶是含有F667Y氨基酸突变的Taq聚合酶；所述 非还原性双糖包括有海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖或乳果糖。
[0018] 优选的，上述用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，所述液体集成组合物中还 含有牛血清白蛋白。
[0019] 优选的，上述用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，所述液体集成组合物中还 含有多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇（PEG)或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
[0020] 优选的，上述用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，所述液体集成组合物中还 含有洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40。
[0021] 优选的，上述用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术，所述通过冷冻干燥技 术获得PAP固体集成组合物的方法还进一步包括步骤：c)冷冻干燥后，加入液体性核酸模 板水溶液使得冷冻干燥获得的固体集成组合物溶解。
[0022] 优选的，上述用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术，具体步骤如下：
[0023] (1)准备水溶液，使每5-10微升的水溶液中含有176-352mM Tris-HCl (pH值8. 0， 25°C )、20-40mM(NH4)2S04、2. 4-10mM MgCl2、50 或 90 或 100 或 180 μΜ 的每一种 dNTP(包括 (^丁卩、(1111\(?^13和(1〇13)、0.2-0.4以]\1每种引物、180-36(^]\1恥4??丨，0.2-0.4\571^6代611 I 染料，〇· 02-0. 04% Tween-20,2 单位聚合酶，200-400mM 海藻糖，0-0· 4% 聚蔗糖-400， 50-100g/ml BSA，和 0· 5-lmM DTT ;
[0024] (2)冷冻干燥过程，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，具体条件为：在_50°C至_55°C 快速冷冻2-4小时后，将样品抽至0-15帕压力真空并保持在-40°C至_45°C、15-30小时，然 后逐渐升高温度至室温，例如在-20摄氏度运行1小时，在5°C运行1小时，在30°C运行1 小时。
[0025] 由上述冷冻干燥技术所获得的固体集成组合物，由上述冷冻干燥技术制备而得。
[0026] 优选的，上述固体集成组合物，具有组分如下：
[0027] 反应缓冲液成分，包括 Tris-HCl、（NH4)2SO4、和 Mg++;
[0028] 脱氧核苷三磷酸和焦磷酸，为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na4O 7P2或其类似物；
[0029] 荧光染料，是SybrGreen I或连接于引物上的FAM ;
[0030] 聚合酶，是含有F66 7Y氨基酸突变的Taq聚合酶；
[0031] 双糖，包括海藻糖，蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，乳糖，或乳果糖。
[0032] 优选的，上述固体集成组合物，还含有牛血清白蛋白。
[0033] 优选的，上述固体集成组合物，还含有多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙 二醇（PEG)或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
[0034] 优选的，上述固体集成组合物，还含有洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40。
[0035] 优选的，上述固体集成组合物是通过冷冻干燥从液体集成组合物获得的，所述液 体集成组合物为每5-10微升的水溶液中含有176-352mM Tris-HCl (pH值8.0, 25 °C )、 20-40mM(NH4) 2S04、2. 4-10mM MgCl2、50 或 90 或 100 或 180 μ M每一种 dNTP (包括 dATP、dTTP、 dGTP 和 dCTP)、0. 2-0.4 μΜ 每种引物、180-360 μΜ Na4PPi，0. 2-0. 4XSybrGreen I 染料， 0.02-0.04%了胃6611-20,2单位聚合酶，200-4001111海藻糖，0-0.4%聚蔗糖-400,50-10(^/1111 BSA，和 0· 5-lmM DTT。
[0036] 上述通过冷冻干燥获得的固体集成组合物的应用，冷冻干燥后，所述固体集成组 合物通过加入含有核酸模板的水溶液进行溶解，进行PAP扩增。
[0037] 优选的，上述通过冷冻干燥获得的固体集成组合物的应用，用于实施PAP扩增，具 体方法包括：
[0038] a)加入含有核酸模板的水溶液以溶解冷冻干燥获得的固体集成组合（其中冷冻 干燥后固体集成组合物已含有反应缓冲液、3'阻断性引物、脱氧核苷三磷酸和焦磷酸、荧 光染料、核酸聚合酶和一个非还原性双糖，但不含有核酸模板）；
[0039] b)进行热循环扩增。
[0040] 本发明的有益效果是：
[0041] 本发明所述用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术解决了在液体状PAP集成 组合物中，特别是在室温下储存时，聚合酶不稳定且dNTPs易降解的技术问题，采用特定工 艺条件的冷冻干燥技术使获得的固体集成组合物易于操作并可以在非行业标准要求的温 度下长期储存；由该技术获得的固体集成组合物，除核酸模板外，汇总或集成所有的PAP反 应成分至仅一个试管内将大大方便使用，具有广泛的应用前景。
【具体实施方式】
[0042] 术语：
[0043] 除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语是与在本领域的普通技术人员所 通常理解的术语含义是相同的。
[0044] PCR是指聚合酶链式反应。
[0045] 焦磷酸化反应是脱氧核糖核酸聚合反应的逆反应。在焦磷酸的存在下，聚合酶可 从双链DNA上将3'末端核苷酸去除而生成一个三磷酸核苷酸和一个3'末端去除阻断的双 链 DNA :[dNMP]n+PPi - [dNMPL-i+dNTP 5。
[0046] 聚合酶或核酸聚合酶是指一多聚酶，其具有催化聚合反应或延长脱氧核糖核酸的 特性。它可以是DNA模板依赖性或RNA模板依赖性。
[0047] 3'末端阻断性引物是指其带有3'末端非延伸性核苷酸（3'末端阻断剂）如双脱 氧核苷酸的寡核苷酸。其3'末端核苷酸不能被直接延伸，但它可以被焦磷酸化反应所去 除，随即此去除阻断的引物可以被聚合酶所延伸。
[0048] PAP是指焦磷酸化激活性聚合反应。
[0049] 热稳定酶是指一种酶，其具有热稳定性或热抵抗性。
[0050] 蛋白突变是指在某一蛋白质位点的氨基酸残基的改变，如Taq聚合酶。氨基酸残 基的改变则被定义为与其相对的自然生成性蛋白质而言。一个蛋白具有突变则被称作为 "突变体"蛋白质。
[0051] TaqFS是一个经由基因工程技术优化型式的Taq聚合酶，与野生型序列相比含有 G46E和F667Y氨基酸的变化。
[0052] 冻干也称为冷冻干燥，是一个将材料冷冻然后降低周围压力使材料中的冰直接从 固相到气相升华的脱水过程。
[0053] 固体组合物指的是指一种基本上无溶剂的组合物。
[0054] 冷冻干燥PAP是指使用冻干组合物进行PAP反应。
[0055] 技术方案阐述--PAP液体集成组合物的冷冻干燥
[0056] 对于冷冻干燥，一个在水溶液中的集成的PAP组合物可分为PAP的基本组成成分， 冷冻干燥的基本组成成分，和其他组成成分。
[0057] 在水溶液中的PAP基本组成成分包括反应缓冲液、3'阻断性引物、脱氧核苷三磷 酸、焦磷酸、核酸聚合酶，和如需实时检测的话则有荧光染料。并且，PAP基本组成成分的 浓度和相应的容量体积是关键性的，这些不仅影响冷冻干燥的升华而且影响组合物的稳定 性。当溶解后反应组合物开始扩增时（IX组成成分浓度20 μ 1体积），最佳值有2到4倍浓 度和相对应到体积的变化。
[0058] 水溶液中冷冻干燥的主要成分应与PAP的基本组成成分相符，并能保持PAP的基 本组成成分稳定。非还原性双糖如海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖或乳果糖基本上充 分有效地发挥了稳定作用，无论水溶液体积大小如何，其关键的浓度范围可有从200 μ M到 400 μ M的变化。
[0059] 水溶液中的其它成分包括多元醇，如从0.05%到4%不同浓度的聚蔗糖-400,葡 聚糖，聚乙烯乙二醇-8000 (PEG)，从25到100毫微克/ μ L的聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，和洗 涤剂如0. 0125-0. 05%的Tween-20会促进PAP的基本组成成分稳定。（见实施例2-5)
[0060] PAP检测了 GNAS、HIV、rDNA和EGFR基因作为示范（表1)。由实验结果可以看出， 即使存储在50°C高温长达六天后，冷冻干燥样品表现出高效而特异的扩增，表示成功。最佳 集成PAP组合物为冷冻干燥中所描述的材料和方法参见实施例1。
[0061] 实施例1
[0062] 材料和方法
[0063] 制备引物
[0064] 靠近3'末端用6-FAM标记的dT引物是由IDT公司（USA)沿3' -5'方向化学合成 的，并用高效液相色谱法进行了纯化。
[0065] 3'末端用ddCMP所阻断的引物是由IDT公司（USA)沿沿3' -5'方向化学合成的， 并用高效液相色谱法进行了纯化。
[0066] 3'末端ddAMP、ddTMP和ddGMP所阻断的引物是用末端转移酶在寡核苷酸的3'末 端加上ddAMP、ddTMP和ddGMP酶法合成的 1 ;4。引物随后用含7M尿素的16%聚丙烯酰胺凝 胶电泳进行纯化，各回收引物的量用260nm紫外吸光度测定决定（表1)。
[0067] 表1.引物表
[0068]
[0069]
[0070] 表1注释：
[0071] a CACCAA是附接于引物5'端一个尾巴。/FAM_dT/是指FAM荧光标记的dT。
[0072] 模板的准备
[0073] 基因组DNA是用Qiagen公司QIAamp血液迷你试剂盒并按其说明书中的方法自全 血白细胞提取的。重组质粒DNA是通过插入一个化学合成或PCR扩增的100-400碱基对的 靶DNA片段至pUC57载体中所构建的，将其转化到大肠杆菌中，重组质粒DNA再用QIAamp 质粒迷你试剂盒按说明书中方法提取出。洗脱的DNA溶解于TE缓冲液（IOmM Tris-HCl， 0.1 mM EDTA，pH8. 0)，通过紫外260nm吸光度在来测定DNA的量。
[0074] 冷冻干燥前PAP液体集成组合物的制备
[0075] 在冷冻干燥前先准备5微升的水溶液，当中含有352mM Tris-HCKpH值8.0， 25°C )、40mM(NH4)2S04、4.8-10mM MgCl2、100 或 180μΜ 每一种 dNTP(dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)、0 .4yM 每种引物、360 μΜ Na4PPi，0.4x SybrGreen I染料，0.04%Tween-20,2 单位 聚合酶，200-4001111海藻糖，0-0.4%聚蔗糖-400,50-100微克/毫升854，和1111101'1'。该水 溶液加入单个试管、8联孔试管条、或96孔板中。
[0076] 另制备一 10微升的水溶液，含有 176mM Tris-HCKpH 8.0, 25°C)，20mM(NH4)2SO4, 2 .4-5禮1%(：12,50或9(^]\1每一种(1阶13((^了？、(1111\(?^1 3和(1〇13)，0.2 4]\1每种引物，18(^]\1 Na4PPpO. 2XSybrGreen I 染料，0· 02% Tween-20,2 单位聚合酶，200-400mM 海藻糖，0· 2% 聚蔗糖-400，100g/m I BSA和0. 5mM DTT。该水溶液加入单个试管、8联孔试管条、或96孔 板中。
[0077] 冷冻干燥过程
[0078] 使用VFD2000冷冻干燥机（北京博康实验医学仪器，中国）进行冷冻干燥，在-50 摄氏度快速冷冻2小时后，将样品抽至10-15帕压力真空并保持在-45°C 20小时，然后-20 摄氏度运行1小时，在5°C运行1小时，在30°C运行1小时。
[0079] 冷冻干燥后PAP固体集成组合物的储存稳定性
[0080] 冷冻干燥之后，将干样品储存在-20°c，37°c，或50°C下各种不同长度的时间来测 试其稳定性。
[0081] 冷冻干燥后固体集成组合物的溶解
[0082] 加入含有DNA模板的水溶液到该冷冻干燥后固体集成组合物至20微升的最终体 积。溶解后的反应混合物含有 88mM Tris-HCl(pH 8. 0,25°C) UOmM(NH4)2SO4U. 2-2. 5mM MgCl2、25 或 45 μΜ 每一种 dNTPs(dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)、0· 1-0. 2 μΜ 每种引物、90 μΜ Na4PPi、0.1 XSybrGreen I 染料、0.01 % Tween-20、2 单位聚合酶、100-200mM 海藻糖、0· 1% 聚蔗糖-400、25-50g/m I BSA、0.1mM DTT、以及 DNA 模板。
[0083] 热循环
[0084] 对扩增产物的定量使用了 Bio-Rad公司的CFX96实时PCR检测系统。分析模式： SybrGreen荧光；基线设置：基线扣除曲线拟合；阈值循环（CT)测定：单阈值；基线方法： SYBR自动计算；阈值设置：自动计算。
[0085] 循环包括96°C 12秒，60°C 30秒，64°C 30秒，和68°C 30秒共40个循环。在热循 环前，使用一个96°C 2分钟的步骤来对基因组DNA进行完全变性。或另一个循环包括96°C 持12秒，64°C 45秒，和68°C 45秒，共40个循环。在第一个循环之前加入一个96°C 2分钟 的变性步骤。
[0086] 为了证明为扩增产物，加上一个自68°C至95°C以每5秒递增0. 5°C的熔点曲线分 析以确认特异性扩增产物。
[0087] 实施例2
[0088] 本PAP试验的目的是要放大野生型序列的GNAS基因（表1)。一个在接近其3'末 端标记有FAM的LUX (Light Upon extension)引物被用来发出实时焚光信号（Nazarenko, I .,Lowe,B.,Darfler, Μ. , Ikonomi, Ρ. , Schuster, D. , and Rashtchian, Α· (2002) · Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeled with a single fluorophore. Nucleic acids research 30, e37) 〇 一旦引物退火并延伸到产物去，LUX会发射更多的焚 光信号。
[0089] 冷冻干燥集成的PAP组合物的制备如实施例1。对200 μΜ至400 μM的海藻糖， 5 μ 1和10 μ 1的水溶液，和0%至0. 4%的Ficoll等列于表2的因素进行了测试，在冷冻干 燥后将样品储存在_20°C，稳定性没有显著改变。为了加速将样品储存在50°C。在热循环 之前，加入溶于TE缓冲液的20ng基因组DNA至20 μ 1的体积。
[0090] 为了评估PAP的扩增性能，对Ct值和RFU进行了测定。Ct是阈值圈数而RFU是最 高荧光信号中减去基线后的随机单位。使用250Μ，300Μ，400Μ的海藻糖，Ct和RFU有高效 能的扩增，显示了冷冻干燥后组合集成物在50°C下6天是稳定的。另外还在82-83?范围 内测定到Tm，显示了其特异性扩增。
[0091] 然而用200 μ M的海藻糖（组合7)在50°C下储存六天后，Ct和RFU表现出低效扩 增，显示出低浓度海藻糖的效果不明显，但聚蔗糖并非如此。
[0092] 表2. GNAS基因的稳定性试验
[0093]
[0094] 表2注释：组合1和组合2是由101水溶液组成，含有176mM Tris-HCl (pH 8. 0， 25°C )、20mM(NH4)2S04、5mM MgCl2,、90 μΜ 每一种 dNTP、0. 2 μΜ 的每一种 GNAS 引物、180 μΜ Na4PPi、2 单位的聚合酶、0. 02% Tween-20、50μg/ml 的牛血清白蛋白、0. 5mM DTT 和 0. 20% 聚蔗糖-400。此外，组合1含300mM而组合2含有400mM的海藻糖。组合3和组合4则为 5μ1 的水溶液，内有 352mM Tris-HCl(pH 8.0,25°C)、40mM(NH4)2S04、10mM MgCl2、180yM 每一种(1ΝΤΡ、0·4μΜ 每一种引物、360 μΜ Na4PPi、2 单位聚合酶、0.04% Tween-20、50yg/ ml牛血清白蛋白、ImM DTT和0.40%聚蔗糖-400。此外，组合3含有300mM而组合4含有 400mM的海藻糖。组合5、组合6和组合7由5 μ 1水溶液组成，含有352mM Tris-HCl (pH 8· 0，25 °C )、40mM (NH4) 2S04、IOmM MgCl2、180 μ M 每一种 dNTP、0·4μΜ 每一种引物、360 μΜ 似4卩？1、2单位聚合酶，0.04%了￥6611-20,5(^8/1111牛血清白蛋白，1111101'1'。此外，组合5 含有200mM海藻糖和0%聚蔗糖，组合6则含有250mM海藻糖和0. 2%聚蔗糖，组合7含有 200mM海藻糖和0. 4 %聚蔗糖。
[0095] 实施例3
[0096] 本PAP试验是设计用来扩增HIV DNA (表1)。一个在接近其3'末端标记有FAM的 LUX (Light Upon extension)引物被用来发出实时荧光信号。
[0097] 该冷冻干燥集成的PAP组合物的制备与材料和方法中一致。对300 μ M和400 μ M 的海藻糖，以及对5 μ 1和10 μ 1水溶液等因素进行了测试（表3)。冷冻干燥后，将样品在 50°C下储存0、2、4和6天。在热循环之前，10,000拷贝的TE缓冲液的重组质粒DNA加入到 20微升的体积。
[0098] 为了评估PAP的扩增性能，对Ct和RFU进行测定。对于每一个组合，不同天数的 Ct和RFU得到的值相类似，显示在50 °C下6天是稳定的。另外，所测定的Tm为83 ± I °C，显 示出其为特异性扩增。
[0099] 表3.对HIV基因的稳定性试验
[0100]
[0101] 表3注释：
[0102] a除了为HIV引物外，组合1，组合2,组合3和组合4其它组分均与表2相同。
[0103] 实施例4
[0104] 本PAP试验设计用来扩增rDNA基因（表1)。SybrGreen被用来发出实时荧光信 号。
[01 05] 冷冻干燥集成的PAP组合物的制备如实施例1。对酶量等因素进行了测试（表4)。 冷冻干燥后，将样品在50°C储存0、1、2、3、4和5天。在热循环前，加入0. 2ng基因组DNA至 20 μ 1体积。
[0106] 为了评估PAP的扩增性能，Ct和RFU进行了测定。对于2单位和1单位聚合酶， 在50 °C下五天后Ct和RFU显示稳定。另外，所测定的Tm为80-81 °C，显示出其为特异性扩 增。更进一步，当酶量减少到〇. 5单位时，没有观察到有效的扩增。
[0107] 表4. rDNA基因的稳定性测试a
[0108]
[0109] 表4注释：
[0110] a rDNA 基因的组合是 51 的水溶液，含有 352mM Tris-HCl (pH 8. 0, 25 °C )、 40mM(NH4)2S04、10mM MgCl2、180 μΜ 每一种 dNTP、0. 4 μΜ 每一个 rDNA 引物、360 μΜ Na4PPi、 I或2个单位聚合酶、0. 04% Tween-20、50 μ g/ml的牛血清白蛋白、ImM的DTT、300mM的海 藻糖和0.4%聚蔗糖。
[0111] 实施例5
[0112] 设计了双向-PAP试验以扩增肺癌特异性的EGFR基因突变（表1)。
[0113] SybrGreen I被用来发出实时荧光信号。
[0114] 冷冻干燥集成的PAP组合物的制备如实施例1。PAP试验对L858R，L861Q，和L790M 三个突变体进行了测试（表5)。冷冻干燥后，将样品在50°C储存1、2、3、4和6天。在热循 环前，加入1000个拷贝溶于TE缓冲液的重组质粒DNA至20 μ 1体积。
[0115] 为了评估PAP的扩增性能，对Ct和RFU进行了测定。从第1天至第6天，每个突变 体均有相似的Ct和RFU值，显示在50 °C下6天是稳定的。另外，Tm测定为82-83 °C、80-81 °C 和85-86 °C，显示其为特异性扩增。
[0116] 表5. EGFR基因的稳定性试验
[0117]
[0118] 表5注释
[0119] a EGFR 基因的组合是 51 的水溶液，含有 352mM Tris-HCl (pH 8. 0, 25 °C )、 40mM(NH4)2S04、10mM MgCl2、180 μΜ 每一种 dNTP、0. 4 μΜ 每一个 EGFR 引物、360 μΜ Na4PPi、 2个单位聚合酶、0. 04% Tween_20、50μg/ml的牛血清白蛋白、ImM DTT、300mM海藻糖和 0.4%聚蔗糖。
[0120] 上述参照【具体实施方式】对该用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术及由该 技术获得的固体集成组合物与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照 所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 用于制备固体PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：包括： a) 提供了一个由液体集成组合物的水溶液，包括有I)反应缓冲液、3'阻断性引物、脱 氧核苷三磷酸、焦磷酸、荧光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非还原性双糖； b) 将液体集成组合物的水溶液通过冷冻干燥技术获得固体集成组合物，使其易于存 储和操作。2. 根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：所述 液体集成组合物的水溶液包括：反应缓冲液包含有Tris-HCl、（NH4)2SO4、和Mg++;脱氧核苷 三磷酸和焦磷酸为(^了卩、(1111\(?^1\(1〇1\似40 7?2或其类似物；荧光染料包括371^6代6111 或连接于引物上的FAM;聚合酶包括含有F667Y氨基酸突变的Taq聚合酶；所述非还原性双 糖包括有海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖或乳果糖。3. 根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：所述 液体集成组合物中还含有： 牛血清白蛋白；和/或 多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮；和/或 洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40 〇4. 根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：所述 通过冷冻干燥技术获得PAP固体集成组合物的方法还进一步包括步骤：c)冷冻干燥后，加 入液体性核酸模板水溶液使得冷冻干燥获得的固体集成组合物溶解。5. 根据权利要求1所述的用于制备PAP反应成分的冷冻干燥技术，其特征在于：具体 步骤如下： (1) 准备水溶液，使每5-10微升的水溶液中含有176-352mM(pH值8. 0、25°C) Tris-HCl、20-40mM(NH4)2S04、2.4-10mMMgCl2、50 或 90 或 100 或 180yM每一种dNTP、 0? 2-0. 4yM每种引物、180-360yMNa4PPi，0.2-0. 4XSybrGreenI染料，0.02-0. 04 % Tween-20,2 单位聚合酶，200-400mM海藻糖，0-0? 4 % 聚蔗糖-400,50-100g/mlBSA，和 0.5-lmMDTT； (2) 冷冻干燥过程，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，具体条件为：在-50°C至_55°C快速 冷冻2-4小时后，将样品抽至0-15帕压力真空并保持在-40°C至_45°C、15-30小时，然后逐 渐升高温度至室温。6. -种固体集成组合物，其特征在于：是由权利要求1-5之一所述冷冻干燥技术制备 而得的。7. 根据权利要求6所述的固体集成组合物，其特征在于：具有组分如下： 反应缓冲液成分，包括Tris-HCl、（NH4)2SO4、和Mg++; 脱氧核苷三磷酸和焦磷酸，为dATP、dTTP、dGTP、dCTP、Na4O7P2或其类似物； 荧光染料，包括SybrGreenI或连接于引物上的FAM; 聚合酶，包括含有F667Y氨基酸突变的Taq聚合酶； 双糖，包括海藻糖，蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，乳糖，或乳果糖。8. 根据权利要求6所述的固体集成组合物，其特征在于：还含有： 牛血清白蛋白；和/或 多元醇，所述多元醇为聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮；和/或 洗涤剂，所述洗涤剂为Tween-20或NP-40 〇9. 根据权利要求6所述的固体集成组合物，其特征在于：是通过冷冻干燥从液体集成 组合物获得的，所述液体集成组合物为每5-10微升的水溶液中含有176-352mM(pH值8. 0、 25°C)Tris-HCl、20-40mM(NH4)2S04、2. 4-10mMMgCl2、50 或 90 或 100 或 180yM每一种dNTP、 0? 2-0. 4yM每种引物、180-360yMNa4PPi，0.2-0.4XSybrGreenI染料，0.02-0. 04 % Tween-20,2 单位聚合酶，200-400mM海藻糖，0-0? 4 % 聚蔗糖-400,50-100g/mlBSA，和 0.5-lmMDTTo10. 权利要求6所述的固体集成组合物的应用，其特征在于：冷冻干燥后，所述固体集 成组合物通过加入含有核酸模板的水溶液进行溶解，进行PAP扩增。
【专利摘要】本发明提供了用于制备PAP固体反应成分的冷冻干燥技术及由该技术获得的固体集成组合物与应用，该冷冻干燥技术包括：a)提供了一个由液体集成组合物的水溶液，包括有I)反应缓冲液、3′阻断性引物、脱氧核苷三磷酸、焦磷酸、荧光染料、聚合酶，但不含核酸模板，以及II)非还原性双糖；b)将液体集成组合物的水溶液通过冷冻干燥技术获得的固体集成组合物,使其易于存储和操作；该冷冻干燥后所得固体集成组合物通过加入含有核酸模板的水溶液进行溶解,进行PAP扩增。
【IPC分类】F26B5/06, C12N15/10
【公开号】CN104894105
【申请号】CN201510259340
【发明人】丁少峰, 刘强
【申请人】丁少峰, 刘强
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月20日
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