一种扩增高顶鳞皮蚌f型线粒体基因组序列的方法
一种扩增高顶鳞皮蚌f型线粒体基因组序列的方法
【专利说明】一种扩增高顶鱗皮蚌F型线粒体基因组序列的方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及生物技术领域，具体为一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的 方法。
【背景技术】
[0003] 高顶鳞皮鮮（ZepiiZoofe1Sma 为鮮科鳞皮鮮属的动物，俗名青壳鮮、美 带蚌、狗脑壳，是中国的特有物种。分布于安徽、浙江、江苏、江西、湖北、湖南等地，一般生活 于水流较缓、水位较深、无水草的湖泊以及河流的污泥底或泥沙底里。近几十年来，全球范 围内淡水贝类种群呈明显衰退趋势，原因是多方面的，由于极端气候的影响，河流湖泊水位 急剧下降导致淡水蚌类的栖息地丧失；但人为干扰是造成其多样性减少和群落结构变化的 主要因素。无序的水利工程建设、采砂作业导致淡水蚌类栖息地的丧失、寄主鱼类洄游的阻 挡和寄主鱼产卵场的破坏；破坏性的捕捞鱼类使寄主鱼种类数量锐减，影响了蚌类生活史 的寄生环节；因纽扣珠核制造的需要大量捕捞淡水蚌类，破坏了淡水蚌类的种群结构。以 上种种原因导致了淡水蚌类的种群数量、种群密度急剧下降，物种多样性受到严重威胁。本 发明首次报道了高顶鳞皮蚌的线粒体基因组，也是首次报道了一种扩增高顶鳞皮蚌线粒体 基因组序列的方法，可以为蚌科的线粒体基因组学研宄和种质资源保护提供重要的基础材 料。
[0004] 线粒体基因组DNA是裸露的双链超螺旋共价闭合环状分子，少数为线状分子（如 原生动物草履虫与四膜虫的mtDNA)，是真核细胞的第二遗传信息系统，或称核外基因及其 表达体系。相对于核DNA，mtDNA具有分子量小、多态性高、结构简单、碱基突变率高、母系遗 传、进化速度快等特点，已被广泛应用于生理病理、临床诊断、遗传变异、分子标记、系统进 化等多方面的研宄，与线粒体和线粒体基因组相关的研宄已成为临床医学、进化生物学、基 因组学、生物信息学等生命科学领域的研宄热点和前沿。
[0005] 蚌科动物线粒体的遗传不单单是母系遗传，还存在线粒体基因组遗传的一种 特例--双单亲遗传现象（Doubly-Uniparental Inheritance, DUI)。这种遗传方 式使后代中雌性mtDN只来自母系（female-transmitted, F type)，与严格的母系遗传 相似；而雄性的mtDNA来自双亲，在体细胞中存在F型mtDNA，在精巢中存在父系mtDNA (male-transmitted, M type)。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种快速扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法。为 了实现上述目的，本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现。
[0007] 本发明所述方法包括下列步骤： (1)提取蚌的总DNA ;使用购自天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取 试剂盒，提取高顶鳞皮蚌的总DNA ; (2) 利用保守引物分别对coxl、16SrRNA和nadl基因进行普通PCR扩增并测序； (3) 根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序； (4) 序列拼接； (5) 基因注释。
[0008] 所述的长片段引物包括以下三对： FG16S-ND1P1 ：TTGGGGCAATCTTGGAAC FG16S-ND1P2 ：CTGCGAAATCAAATGGAGC FGND1-C01P1 ： TTGCCCCGTTACCGTTAT FGND1-C01P2 ：TTTGTTGGTTGCTGCCCT FGC01-16SP1 ： GCTACATTCCCAGACAACG FGC01-16SP2:TGCCCCAATCAAACCTTAT〇
[0009] 本发明的有益效果：通过设计的特异性长片段引物，通过LA-PCR技术对高顶鳞皮 蚌F型线粒体基因组进行扩增，再进行测序、拼接和校正，获得了高顶鳞皮蚌F型线粒体基 因组全序列。本发明获得的高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列总长15754bp，可从组成和结 构的角度对高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组进行分析，可以丰富蚌科线粒体基因组信息，为 蚌类的系统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。
【附图说明】
[0010] 图1为高顶鳞皮蚌总DNA的琼脂糖电泳结果示意图，图中M为DL5000 marker, 1、 2为高顶鳞皮蚌总DNA ; 图2为高顶鳞皮蚌普通PCR扩增的琼脂糖电泳结果示意图，图中M为DL5000 marker，1 为保守引物16SrRNA的扩增结果，2为保守引物NDl的扩增结果，3为保守引物COXl的扩增 结果； 图3为高顶鳞皮蚌LA-PCR扩增的琼脂糖电泳结果示意图，图中M为DL5000 marker，1 为设计引物16S-ND1的扩增结果，2为设计引物NDl-COl的扩增结果，3为设计引物C01-16S 的扩增结果。
【具体实施方式】
[0011] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。
[0012] 一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法如下： (1)总DNA提取： 使用购自天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，提取高顶鳞 皮蚌的总DNA。
[0013] (2)普通PCR扩增及测序： 对于高顶鳞皮蚌F型线粒体的姻和基因的扩增分别采用LC01490/ HC02198、16SarL/16SbrH和Leu-uurF/LoGlyR引物扩增。扩增产物送生工生物工程（上海） 股份有限公司测序。
[0014] (3)长片段引物设计 把cod、和基因的部分片段的测序结果在NCBI中进行nucleotide blast，确定都为鮮科动物线粒体DNA基因片段且均为正义链。利用Primer premier5.0将 前期得到的《^7、7必WP姻和Mi//基因三段序列为模板设计三对长PCR引物结果为： FG16S-ND1P1 ：TTGGGGCAATCTTGGAAC FG16S-ND1P2 ：CTGCGAAATCAAATGGAGC FGND1-C01P1 ： TTGCCCCGTTACCGTTAT FGND1-C01P2 ：TTTGTTGGTTGCTGCCCT FGC01-16SP1 ： GCTACATTCCCAGACAACG FGC01-16SP2:TGCCCCAATCAAACCTTAT (4) LA-PCR扩增及测序 使用设计的三对长PCR引物进行扩增，产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测 序。
[0015] (5)序列拼接 把实验所得的全部序列片段利用DNASTAR7. 1软件中的SeqMan组件进行拼接，组装成 一条首尾相接的序列，并仔细检查，对照测序峰图人工校正序列中相冲突的位点，校正完后 再利用SeqMan把首尾的重复序列去除其中一个，最终得到完整的线粒体DNA全序列。
[0016] (6)基因注释 高顶鳞皮蚌F型线粒体DNA全序列的注释参考珠蚌亚科已测物种的线粒体DNA，用在 线工具 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)和 Blast 查找线 粒体基因组的13个蛋白质基因，利用在线工具ARWEN (http://130. 235. 46. 10/ARWEN)和 MITOS (http: //mtos. biinf. unileizig. de/help. py)查找 22 个 tRNA 基因和 2 个 rRNA 基 因以及控制区（Control Region，CR)。该序列总长15754bp，包括13个蛋白质编码基因，2 个rRNA基因，22个tRNA基因，其中的tRNASer基因和tRNALeu基因均为双拷贝，以及一个 长度429bp的控制区和26个l~307bp不等的非编码区；37个基因中有11个在H链上编码， 其余的26个都在L链上编码；全序列中的碱基含量依次为A (39. 1%)、T (25. 7%)、C (23. 4%)、 G (II. 8%)，具有明显的A+T偏向性；13个蛋白质基因共有五个起始密码子：ATA、ATG、ATT、 GTG、TTG，其中有7个蛋白质基因以ATG为起始密码子，以及2个典型的终止密码子：TAA、 TAG，不含非完整终止密码子。
【主权项】
1. 一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法，包括以下步骤： 提取蚌的总DNA; 利用保守引物分别对和基因进行普通PCR扩增并测序； 根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序； 序列拼接； 基因注释。2. 根据权利要求1所述的一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法，其特征 是，所述的长片段引物包括以下三对： FG16S-ND1P1：TTGGGGCAATCTTGGAAC FG16S-ND1P2：CTGCGAAATCAAATGGAGC FGND1-C01P1：TTGCCCCGTTACCGTTAT FGND1-C01P2：TTTGTTGGTTGCTGCCCT FGC01-16SP1：GCTACATTCCCAGACAACG FGC01-16SP2:TGCCCCAATCAAACCTTATo
【专利摘要】本发明公开了一种快速扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法，该方法通过提取总DNA、普通PCR扩增及测序、设计长片段引物、LA-PCR扩增及测序和序列拼接，获得了高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列，该序列总长15754bp，包括13个蛋白质编码基因，2个rRNA基因，22个tRNA基因。本发明首次公布了获得高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法，为蚌科的系统发生学、比较和进化基因组学、谱系基因组学、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定提供重要的基础材料。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104894107
【申请号】CN201510271508
【发明人】周春花, 丁美煌, 欧阳珊, 吴小平
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
【专利说明】一种扩增高顶鱗皮蚌F型线粒体基因组序列的方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及生物技术领域，具体为一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的 方法。
【背景技术】
[0003] 高顶鳞皮鮮（ZepiiZoofe1Sma 为鮮科鳞皮鮮属的动物，俗名青壳鮮、美 带蚌、狗脑壳，是中国的特有物种。分布于安徽、浙江、江苏、江西、湖北、湖南等地，一般生活 于水流较缓、水位较深、无水草的湖泊以及河流的污泥底或泥沙底里。近几十年来，全球范 围内淡水贝类种群呈明显衰退趋势，原因是多方面的，由于极端气候的影响，河流湖泊水位 急剧下降导致淡水蚌类的栖息地丧失；但人为干扰是造成其多样性减少和群落结构变化的 主要因素。无序的水利工程建设、采砂作业导致淡水蚌类栖息地的丧失、寄主鱼类洄游的阻 挡和寄主鱼产卵场的破坏；破坏性的捕捞鱼类使寄主鱼种类数量锐减，影响了蚌类生活史 的寄生环节；因纽扣珠核制造的需要大量捕捞淡水蚌类，破坏了淡水蚌类的种群结构。以 上种种原因导致了淡水蚌类的种群数量、种群密度急剧下降，物种多样性受到严重威胁。本 发明首次报道了高顶鳞皮蚌的线粒体基因组，也是首次报道了一种扩增高顶鳞皮蚌线粒体 基因组序列的方法，可以为蚌科的线粒体基因组学研宄和种质资源保护提供重要的基础材 料。
[0004] 线粒体基因组DNA是裸露的双链超螺旋共价闭合环状分子，少数为线状分子（如 原生动物草履虫与四膜虫的mtDNA)，是真核细胞的第二遗传信息系统，或称核外基因及其 表达体系。相对于核DNA，mtDNA具有分子量小、多态性高、结构简单、碱基突变率高、母系遗 传、进化速度快等特点，已被广泛应用于生理病理、临床诊断、遗传变异、分子标记、系统进 化等多方面的研宄，与线粒体和线粒体基因组相关的研宄已成为临床医学、进化生物学、基 因组学、生物信息学等生命科学领域的研宄热点和前沿。
[0005] 蚌科动物线粒体的遗传不单单是母系遗传，还存在线粒体基因组遗传的一种 特例--双单亲遗传现象（Doubly-Uniparental Inheritance, DUI)。这种遗传方 式使后代中雌性mtDN只来自母系（female-transmitted, F type)，与严格的母系遗传 相似；而雄性的mtDNA来自双亲，在体细胞中存在F型mtDNA，在精巢中存在父系mtDNA (male-transmitted, M type)。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种快速扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法。为 了实现上述目的，本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现。
[0007] 本发明所述方法包括下列步骤： (1)提取蚌的总DNA ;使用购自天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取 试剂盒，提取高顶鳞皮蚌的总DNA ; (2) 利用保守引物分别对coxl、16SrRNA和nadl基因进行普通PCR扩增并测序； (3) 根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序； (4) 序列拼接； (5) 基因注释。
[0008] 所述的长片段引物包括以下三对： FG16S-ND1P1 ：TTGGGGCAATCTTGGAAC FG16S-ND1P2 ：CTGCGAAATCAAATGGAGC FGND1-C01P1 ： TTGCCCCGTTACCGTTAT FGND1-C01P2 ：TTTGTTGGTTGCTGCCCT FGC01-16SP1 ： GCTACATTCCCAGACAACG FGC01-16SP2:TGCCCCAATCAAACCTTAT〇
[0009] 本发明的有益效果：通过设计的特异性长片段引物，通过LA-PCR技术对高顶鳞皮 蚌F型线粒体基因组进行扩增，再进行测序、拼接和校正，获得了高顶鳞皮蚌F型线粒体基 因组全序列。本发明获得的高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列总长15754bp，可从组成和结 构的角度对高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组进行分析，可以丰富蚌科线粒体基因组信息，为 蚌类的系统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。
【附图说明】
[0010] 图1为高顶鳞皮蚌总DNA的琼脂糖电泳结果示意图，图中M为DL5000 marker, 1、 2为高顶鳞皮蚌总DNA ; 图2为高顶鳞皮蚌普通PCR扩增的琼脂糖电泳结果示意图，图中M为DL5000 marker，1 为保守引物16SrRNA的扩增结果，2为保守引物NDl的扩增结果，3为保守引物COXl的扩增 结果； 图3为高顶鳞皮蚌LA-PCR扩增的琼脂糖电泳结果示意图，图中M为DL5000 marker，1 为设计引物16S-ND1的扩增结果，2为设计引物NDl-COl的扩增结果，3为设计引物C01-16S 的扩增结果。
【具体实施方式】
[0011] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。
[0012] 一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法如下： (1)总DNA提取： 使用购自天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，提取高顶鳞 皮蚌的总DNA。
[0013] (2)普通PCR扩增及测序： 对于高顶鳞皮蚌F型线粒体的姻和基因的扩增分别采用LC01490/ HC02198、16SarL/16SbrH和Leu-uurF/LoGlyR引物扩增。扩增产物送生工生物工程（上海） 股份有限公司测序。
[0014] (3)长片段引物设计 把cod、和基因的部分片段的测序结果在NCBI中进行nucleotide blast，确定都为鮮科动物线粒体DNA基因片段且均为正义链。利用Primer premier5.0将 前期得到的《^7、7必WP姻和Mi//基因三段序列为模板设计三对长PCR引物结果为： FG16S-ND1P1 ：TTGGGGCAATCTTGGAAC FG16S-ND1P2 ：CTGCGAAATCAAATGGAGC FGND1-C01P1 ： TTGCCCCGTTACCGTTAT FGND1-C01P2 ：TTTGTTGGTTGCTGCCCT FGC01-16SP1 ： GCTACATTCCCAGACAACG FGC01-16SP2:TGCCCCAATCAAACCTTAT (4) LA-PCR扩增及测序 使用设计的三对长PCR引物进行扩增，产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测 序。
[0015] (5)序列拼接 把实验所得的全部序列片段利用DNASTAR7. 1软件中的SeqMan组件进行拼接，组装成 一条首尾相接的序列，并仔细检查，对照测序峰图人工校正序列中相冲突的位点，校正完后 再利用SeqMan把首尾的重复序列去除其中一个，最终得到完整的线粒体DNA全序列。
[0016] (6)基因注释 高顶鳞皮蚌F型线粒体DNA全序列的注释参考珠蚌亚科已测物种的线粒体DNA，用在 线工具 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)和 Blast 查找线 粒体基因组的13个蛋白质基因，利用在线工具ARWEN (http://130. 235. 46. 10/ARWEN)和 MITOS (http: //mtos. biinf. unileizig. de/help. py)查找 22 个 tRNA 基因和 2 个 rRNA 基 因以及控制区（Control Region，CR)。该序列总长15754bp，包括13个蛋白质编码基因，2 个rRNA基因，22个tRNA基因，其中的tRNASer基因和tRNALeu基因均为双拷贝，以及一个 长度429bp的控制区和26个l~307bp不等的非编码区；37个基因中有11个在H链上编码， 其余的26个都在L链上编码；全序列中的碱基含量依次为A (39. 1%)、T (25. 7%)、C (23. 4%)、 G (II. 8%)，具有明显的A+T偏向性；13个蛋白质基因共有五个起始密码子：ATA、ATG、ATT、 GTG、TTG，其中有7个蛋白质基因以ATG为起始密码子，以及2个典型的终止密码子：TAA、 TAG，不含非完整终止密码子。
【主权项】
1. 一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法，包括以下步骤： 提取蚌的总DNA; 利用保守引物分别对和基因进行普通PCR扩增并测序； 根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序； 序列拼接； 基因注释。2. 根据权利要求1所述的一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法，其特征 是，所述的长片段引物包括以下三对： FG16S-ND1P1：TTGGGGCAATCTTGGAAC FG16S-ND1P2：CTGCGAAATCAAATGGAGC FGND1-C01P1：TTGCCCCGTTACCGTTAT FGND1-C01P2：TTTGTTGGTTGCTGCCCT FGC01-16SP1：GCTACATTCCCAGACAACG FGC01-16SP2:TGCCCCAATCAAACCTTATo
【专利摘要】本发明公开了一种快速扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法，该方法通过提取总DNA、普通PCR扩增及测序、设计长片段引物、LA-PCR扩增及测序和序列拼接，获得了高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列，该序列总长15754bp，包括13个蛋白质编码基因，2个rRNA基因，22个tRNA基因。本发明首次公布了获得高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法，为蚌科的系统发生学、比较和进化基因组学、谱系基因组学、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定提供重要的基础材料。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104894107
【申请号】CN201510271508
【发明人】周春花, 丁美煌, 欧阳珊, 吴小平
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
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