Est-ssr标记引物组合及筛选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析和鉴定的制作方法
Est-ssr标记引物组合及筛选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析和鉴定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种EST-SSR标记引物组合及其筛 选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析和鉴定。
【背景技术】
[0002] 大豆起源于中国，已有5000-6000年的种植历史。自野生大豆发现以来，随着人们 对该物种的改良、驯化，大豆逐渐分化成两种类型：粮用大豆和菜用大豆。其中，菜用大豆 不仅口感好，而且富含营养优越的蛋白质、多种游离氨基酸和维生素，是当今公认的保健食 品，市场前景十分广阔。发展至今，中国已成为世界上最大的菜用大豆生产国和出口国。但 是，我国关于菜用大豆种质资源鉴定及育种工作起步较晚，目前可利用的资源和品种不多， 许多地区粮用、菜用大豆品种混用，特别是种质资源鉴定过程中经常遇到'一种多名'现象， 单以表型性状较难区分各类种质，严重制约了育种进程。因此，利用分子标记进行种质资源 鉴定和遗传多样性分析，将有助于精确鉴定大豆种质，实现粮用/菜用类型分类，为育种打 下坚实基础。
[0003] 基于表达序列标签（expressed sequence tag，EST)的微卫星标记（即简单重复序 列simple sequence repeat，SSR)是目前逐渐发展并成熟的分子标记技术，具有易检测、 稳定性高、共显性、通用性强等特点，已成为在生物上应用最广、最为重要的分子标记。近年 来，NCBI数据库中可用EST数据的快速增加，为EST-SSR标记的开发提供一个巨大的、有价 值的来源，能够克服SSR引物在创造时费用高的问题。近年来在水稻、玉米、番茄、大麦等许 多农作物都已经建立了 EST-SSR标记，并分别在遗传学图谱构建、品种鉴别和亲缘关系鉴 定、遗传多样性研宄以及功能基因的发掘和利用研宄方面发挥了巨大作用。但在大豆中，虽 然已开发了部分EST-SSR标记，但绝大部分都基于粮用大豆，鲜有在菜用大豆中的应用；而 同时用于粮用大豆、菜用大豆及其祖先野生大豆的分子标记开发及遗传多样性鉴定尚未见 报道。鉴于此，本发明利用目前数据库中的EST片段，自主开发EST-SSR标记，实现快速准 确鉴定粮用、菜用及野生大豆材料。
【发明内容】
[0004] 本发明第一目的在于提供一种用于菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析的 EST-SSR标记组合。
[0005] 本发明第二目的在于提供上述EST-SSR标记组合的构建、筛选方法。
[0006] 本发明第三目的在于提供上述EST-SSR标记组合在进行大豆遗传多样性的鉴定。
[0007] -种用于菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析的EST-SSR标记组合，包括35对 EST-SSR可用引物，引物名称及序列分别为： NGMP-031 s:5 ' - TACCAGCAACAACAGCA-3 ' ；a:5 ' - CATCGTAATGAGGAGGC-3 ' NGMP-069 s:5 ' _ GGAAGAGGAGGAGCAGG-3 ' ； a:5 ' _ CAAGCCAGGATGAGGTA-3， NGMP-080 s:5 ' - AAAGAAGACCCATCCCA-3 ' ； a:5 ' - GACGGTGAAGACGAAGA-3 ' NGMP-I36 s:5' - TGCGGATTTCTCCACAAG-3' ；a:5' - GGTCACCTCCAACCAAGT-3' NGMP-I48 s:5' - TCCTCCTGGACCTCGGTG-3' ；a:5' - CTTGGGCGTGAAGTGAC -3' NGMP-I66 s:5' - ACTGCCACCCCAATAAC -3' ；a:5' - CCTTAGAGGAAGAGGAAACT -3' NGMP-167 s:5' - GTAGTGTTTGGTGGCAGTG-3' ；a:5' - ACCTCTTGATTGGCTTCA -3' NGMP-172 s:5, - CTCAACCAACTCACCCCAGAC -3, ；a:5, - CCACTTGCCCCAATGCC -3， NGMP-I74 s:5' - TAACCCTTTACGGCTAT -3' ；a:5' - ATTCCAGGTGAAGAACC -3' NGMP-177 s:5' - AGTGGAAGATGGCGTAA-3' ；a:5' - CATTCATTCTGGGACAA -3' NGMP-I79 s:5, - GGACGCCATAGAGCACA-3, ；a:5, - ATCACCGCCTTCTTTCA -3， NGMP-185 s:5' -TGAAGAGCGGGTAACAA -3' ；a:5' - TGAAGGGTAAAAGGAGG -3' NGMP-187 s:5' -GGCTTTGTTATTGGGTC -3' ；a:5' - CATCACAATGGGTAGACAC -3' NGMP-I90 s:5' - GGGAATGGTTTACTGCT-3' ；a:5' - TCTTCACTCCTTTCTGCT -3' NGMP-200 s:5' -GTAAATACCTTTCCACCCA -3' ；a:5' - TTTGACCAGCCTAGCAC -3' NGMP-235 s:5 ' - GACATACATCCGAGGTTC-3 ' ；a:5 ' - AGGGGTAGAGTTGGAAA -3 ' NGMP-245 s:5' -ATTCAACAACGCAATCTCC -3' ；a:5' - TCCACCCCTTTTCCCTCT -3' NGMP-260 s:5 ' -AAGAACGCAACACCAAAG -3 ' ； a:5 ' - TCCCCATCAAAGACATCA -3 ' NGMP-262 s:5 ' - TGACAGCGAGTGAAAGAA-3 ' ；a:5 ' - CAGGAGGAAGTCCAAATC -3 ' NGMP-294 s:5' - ACATTAGCGTACTCTGTTTG -3' ；a:5' - CGGTTTCTGAGATTTGG -3' NGMP-314 s:5' - TTGGCTGGAATCTATCA -3' ；a:5' - GTTGGGGCTAATGTGGG -3' NGMP-324 s:5' - AGTGAACAAAAGGCAAGC -3' ；a:5' - CAGATAAAGAACAACAACCC -3' NGMP-332 s:5 ' - ATCCAGCGTCGGTAGTTA-3 ' ；a:5 ' - AGAATGAGTCCAAGAGCC -3 ' NGMP-356 s:5' - GAACATTATGGCGGAAGT -3' ；a:5' - TGTAGGCATCGGAGTAGG -3' NGMP-359 s:5' - GCAAGAGCAACAGCAAT -3' ；a:5' - GAAGGTCGTGGATGGAG -3' NGMP-373 s:5' - GTGACCCTTATAGGTTTGG -3' ；a:5' - ACTTCGCTGTTGGATGTA -3' NGMP-397 s:5' - GAAACAAGACAAGCCATC -3' ；a:5' - AGTTCAGACCCACAGGAG -3' NGMP-399 s:5' - CTATGTAGACGACCTCACC -3' ；a:5' - CTCATCCAAAACAACTCC -3' NGMP-422 s:5' - AACGCAGTGGCAGACATA -3' ；a:5' - GTTTCTTCCCAAGTAGCAAT -3' NGMP-462 s:5' - GCGGTGGTGTTGAGTTGT -3' ；a:5' - TTTGCGAGGAGAAGGAAT -3' NGMP-492 s:5' - GGTCGTCCTCCTCAAAA -3' ；a:5' - CAGTCCTACGGGGTTCA -3' NGMP-562 s:5' - GCTTCCCTCCCTCCTTTG -3' ；a:5' - TGTGCCCCTTATTGCCTC -3' NGMP-567 s:5' - CACCATTCCCCTCCCATC -3' ；a:5' - CTACAAGCCTCGCTCACG -3' NGMP-606 s:5' - CAGACTCCCTCTTCATACC -3' ；a:5' - GCATCCAAGGCACTAACA -3' NGMP-607 s:5' - GCACTCGGTACAGGGAC -3' ；a:5' - GGTTTTGGTTGGTTGAA-3'。
[0008] -种上述用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的EST-SSR标记组 合的构建、筛选方法，包括如下步骤： (1) 大豆EST序列中SSR位点筛选：从PlantGDB数据库中下载得到大豆EST数据，利 用DNAStar软件对所下载的EST进行拼接、去除冗余序列，之后采用SSRIT软件对非冗余序 列进行SSR筛选分析； (2) 引物设计：利用Primer Premier 5. 0软件，对步骤（1)筛选分析的含有SSR的 unigene进行特异引物设计，引物正义链的5'端分别以FAM或HEX荧光染料标记；引物设 计的主要参数为：引物长度为18-24 bp，退火温度为50-60°C ; (3) PCR扩增：步骤（2)设计的引物以大豆DNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系 总体积20以1^，具体包括1\?0?缓冲液，2以111〇14-1]\%(：12,0.2以111〇14-1(1阶1 38,0.2 μmol·L-l正引物，0·2μmol·L-l反引物，lUTaqDNA聚合酶及15-25ngDNA模板；PCR 扩增反应程序为：94 °C预变性2 min;94 °C变性30 s，54 °C复性30 s，72 °C延伸70 s，45 个循环；最后72 °C延伸8 min ; (4) 产物毛细管电泳检测：步骤（3)扩增产物混匀稀释后，加入ET550-R分子量内标， 95°C变性I min，迅速冰浴至冷却，3000 r/min离心I min，于MegaBACE 1000 DNA分析系统 上进行毛细管电泳；其中进样电压3 kV，进样时间45 s，电泳电压8 kV，电泳时间90 min ; (5) 标记筛选：用Genetic profiler软件对毛细管电泳检测原始数据进行分析，筛选 出35对ETS-SSR标记。
[0009] 进一步地，所述步骤（1)对非冗余序列进行SSR筛选分析中筛选标准为：二基元重 复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基元以上重复不少于3次。
[0010] 一种利用上述的用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的EST-SSR 标记组合进行大豆种质资源鉴定的方法，包括如下步骤： (1) 实验材料的准备：选取不同地域的菜用大豆，粮用大豆及野生大豆进行育苗处理， 待幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片，用液氮速冻后于-70°c保存.采用试剂盒法提取总DNA ; (2) 以步骤（1)获得额DNA为模板，利用权利要求1所述的EST-SSR标记组合进行PCR 扩增； (3) 对步骤（3)中扩增产物进行毛细管电泳检测，用Genetic profiler软件对原始数 据进行分析，计算各目标DNA片段的大小；利用GenAlEx 6. 5软件进行种质材料遗传多样性 分析，区分不同种类大豆。
[0011] 本发明开发的一批EST-SSR标记组合，对菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多 样性和聚类分析，有助于快速、准确地辨析区分菜用大豆、粮用大豆和野生大豆种质材料， 分析其亲缘关系，为该物种的定向育种奠定基础。
[0012] 说明书附图 图I EST-SSR生物荧光毛细管电泳结果示例。
[0013] 图2 EST-SSR应用于菜用、粮用和野生大豆分类。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过实施例，对本发明【具体实施方式】进行说明。
[0015] 实施例1 EST-SSR标记引物组合及筛选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析和鉴定，其 具体步骤如下： (1)种质材料准备。
[0016] 如表1所示，本发明所利用的大豆材料包括35份菜用大豆，18份粮用大豆和15份 野生大豆。
[0017] 表1大豆种质信息表。
[0018] ⑵种质样本DNA提取 供试种质材料在浙江省农业科学院蔬菜研宄所豆类育种基地育苗，幼苗长至四叶时采 集幼嫩叶片，用液氮速冻后于_7〇°C保存·采用试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN) 法提取总DNA。
[0019] ⑶引物设计 从 Plant⑶B 数据库（http://www. plantgdb. org/)中下载大豆 EST 数据，利用 DNAStar 软件对所下载的豌豆 EST进行拼接，去除冗余序列，然后采用SSRIT软件（http://WWW. gramene. org/gramene/searches/ssrtool)对非冗余序列进行SSR筛选分析，筛选标准 为：二基元重复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基元以上重复不少 于3次。利用Primer Premier 5. 0软件，对含有SSR的unigene进行特异引物设计，引物 设计的主要参数为：引物长度为18-24 bp，退火温度为50-60°C。共自主设计引物615对， 引物由上海赛百胜公司合成，分别以FAM或HEX荧光染料标记SSR引物正义链的5'端。
[0020] (4) PCR扩增及产物检测 PCR反应体系的总体积为20 yL，含有IXPCR缓冲液，2 μπιο? ?Γ1 MgCl2,0.2 μ mol.Γ1 dNTPs，0.2 μ mol.Γ1 正、反引物，I U Taq DNA 聚合酶及约 20 ng 的 DNA 模 板。各样品反应混合液分别加入至96孔PCR板中，根据修饰引物不同，分为FAM反应板和 HEX反应板。PCR扩增反应程序为：94 °C预变性2 min ;94 °C变性30 s，54 °C复性30 s， 72 °C延伸70 s，45个循环；最后72 °C延伸8 min。
[0021] 扩增后产物混点：各取一板FAM修饰产物和HEX修饰产物，每样品吸取10 μ L，于 1块新的96孔PCR板中混合均匀，获得1块含196个样品的PCR产物板。
[0022] 毛细管电泳检测：将PCR混合产物稀释50倍，在96孔板的各孔中分别加入 ET550-R分子量内标（GE Healthcare)和1 μ L稀释后的PCR混合产物，95°C变性I min， 迅速冰浴至冷却，3000 r/min离心I min，于MegaBACE 1000 DNA分析系统上进行毛细管电 泳。进样电压3 kV，进样时间45 s，电泳电压8 kV，电泳时间90 min。
[0023] 用Genetic profiler软件对原始数据进行分析，系统将各峰值的位置与其泳道中 的ET 550-R分子量内标做比较.计算各目标DNA片段的大小。利用GenAlEx 6. 5软件进 行种质材料遗传多样性分析。
[0024] 实施例2 下面结合实施例1，EST-SSR标记引物组合及筛选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多 样性分析和鉴定实验结果分析如下。
[0025] 图1为EST-SSR标记荧光毛细管电泳检测结果，通过对615对引物的分析，共有 386对获得了有效扩增，并能在同一泳道中得到明显条带。
[0026] 如表2所示，从中筛选获得35对ETS-SSR标记用于大豆种质资源鉴定。
[0027] 如图2所示，成功将35份菜用大豆，18份粮用大豆和15份野生大豆分成三类。
[0028] 表2大豆EST-SSR引物信息表
【主权项】
1. 一种用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的EST-SSR标记组合，其 特征在于，包括35对EST-SSR可用引物，引物名称及序列分别为： NGMP-031 s:5 ' - TACCAGCAACAACAGCA-3 ' ；a:5 ' - CATCGTAATGAGGAGGC-3 ' NGMP-069 s:5 ' _ GGAAGAGGAGGAGCAGG-3 ' ； a:5 ' _ CAAGCCAGGATGAGGTA-3， NGMP-080 s:5 ' - AAAGAAGACCCATCCCA-3 ' ； a:5 ' - GACGGTGAAGACGAAGA-3 ' NGMP-136 s:5' - TGCGGATTTCTCCACAAG-3' ；a:5' - GGTCACCTCCAACCAAGT-3' NGMP-I48 s:5' - TCCTCCTGGACCTCGGTG-3' ；a:5' - CTTGGGCGTGAAGTGAC -3' NGMP-I66 s:5' - ACTGCCACCCCAATAAC -3' ；a:5' - CCTTAGAGGAAGAGGAAACT -3' NGMP-167 s:5' - GTAGTGTTTGGTGGCAGTG-3' ；a:5' - ACCTCTTGATTGGCTTCA -3' NGMP-172 s:5, - CTCAACCAACTCACCCCAGAC -3, ；a:5, - CCACTTGCCCCAATGCC -3， NGMP-I74 s:5' - TAACCCTTTACGGCTAT -3' ；a:5' - ATTCCAGGTGAAGAACC -3' NGMP-177 s:5' - AGTGGAAGATGGCGTAA-3' ；a:5' - CATTCATTCTGGGACAA -3' NGMP-I79 s:5, - GGACGCCATAGAGCACA-3, ；a:5, - ATCACCGCCTTCTTTCA -3， NGMP-185 s:5' -TGAAGAGCGGGTAACAA -3' ；a:5' - TGAAGGGTAAAAGGAGG -3' NGMP-187 s:5' -GGCTTTGTTATTGGGTC -3' ；a:5' - CATCACAATGGGTAGACAC -3' NGMP-I90 s:5' - GGGAATGGTTTACTGCT-3' ；a:5' - TCTTCACTCCTTTCTGCT -3' NGMP-200 s:5' -GTAAATACCTTTCCACCCA -3' ；a:5' - TTTGACCAGCCTAGCAC -3' NGMP-235 s:5 ' - GACATACATCCGAGGTTC-3 ' ；a:5 ' - AGGGGTAGAGTTGGAAA -3 ' NGMP-245 s:5' -ATTCAACAACGCAATCTCC -3' ；a:5' - TCCACCCCTTTTCCCTCT -3' NGMP-260 s:5 ' -AAGAACGCAACACCAAAG -3 ' ； a:5 ' - TCCCCATCAAAGACATCA -3 ' NGMP-262 s:5 ' - TGACAGCGAGTGAAAGAA-3 ' ；a:5 ' - CAGGAGGAAGTCCAAATC -3 ' NGMP-294 s:5' - ACATTAGCGTACTCTGTTTG -3' ；a:5' - CGGTTTCTGAGATTTGG -3' NGMP-314 s:5' - TTGGCTGGAATCTATCA -3' ；a:5' - GTTGGGGCTAATGTGGG -3' NGMP-324 s:5' - AGTGAACAAAAGGCAAGC -3' ；a:5' - CAGATAAAGAACAACAACCC -3' NGMP-332 s:5 ' - ATCCAGCGTCGGTAGTTA-3 ' ；a:5 ' - AGAATGAGTCCAAGAGCC -3 ' NGMP-356 s:5' - GAACATTATGGCGGAAGT -3' ；a:5' - TGTAGGCATCGGAGTAGG -3' NGMP-359 s:5' - GCAAGAGCAACAGCAAT -3' ；a:5' - GAAGGTCGTGGATGGAG -3' NGMP-373 s:5' - GTGACCCTTATAGGTTTGG -3' ；a:5' - ACTTCGCTGTTGGATGTA -3' NGMP-397 s:5' - GAAACAAGACAAGCCATC -3' ；a:5' - AGTTCAGACCCACAGGAG -3' NGMP-399 s:5' - CTATGTAGACGACCTCACC -3' ；a:5' - CTCATCCAAAACAACTCC -3' NGMP-422 s:5' - AACGCAGTGGCAGACATA -3' ；a:5' - GTTTCTTCCCAAGTAGCAAT -3' NGMP-462 s:5' - GCGGTGGTGTTGAGTTGT -3' ；a:5' - TTTGCGAGGAGAAGGAAT -3' NGMP-492 s:5' - GGTCGTCCTCCTCAAAA -3' ；a:5' - CAGTCCTACGGGGTTCA -3' NGMP-562 s:5' - GCTTCCCTCCCTCCTTTG -3' ；a:5' - TGTGCCCCTTATTGCCTC -3' NGMP-567 s:5' - CACCATTCCCCTCCCATC -3' ；a:5' - CTACAAGCCTCGCTCACG -3' NGMP-606 s:5' - CAGACTCCCTCTTCATACC -3' ；a:5' - GCATCCAAGGCACTAACA -3' NGMP-607 s:5' - GCACTCGGTACAGGGAC -3' ；a:5' - GGTTTTGGTTGGTTGAA-3'。2. -种权利要求I所述的用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的 EST-SSR标记组合的构建、筛选方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)大豆EST序列中SSR位点筛选：从PlantGDB数据库中下载得到大豆EST数据，利 用DNAStar软件对所下载的EST进行拼接、去除冗余序列，之后采用SSRIT软件对非冗余序 列进行SSR筛选分析； (2) 引物设计：利用PrimerPremier5.O软件，对步骤（1)筛选分析的含有SSR的 unigene进行特异引物设计，引物正义链的5'端分别以FAM或HEX荧光染料标记；引物设 计的主要参数为：引物长度为18-24bp，退火温度为50-60°C; (3) PCR扩增：步骤（2)设计的引物以大豆DNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系 总体积20 y L，具体包括IXPCR缓冲液，2 y mol ? I71 MgCl2,0? 2 y mol ? I71 dNTPs，0? 2 y mol?I71正引物，0.2 y mol?厂1 反引物，I U Taq DNA聚合酶及15-25 ngDNA模板；PCR 扩增反应程序为：94 °C预变性2 min;94 °C变性30 s，54 °C复性30 s，72 °C延伸70 s，45 个循环；最后72 °C延伸8 min ; (4) 产物毛细管电泳检测：步骤（3)扩增产物混匀稀释后，加入ET550-R分子量内标， 95°C变性Imin，迅速冰浴至冷却，3000r/min离心Imin，于MegaBACE1000DNA分析系统 上进行毛细管电泳；其中进样电压3kV，进样时间45s，电泳电压8kV，电泳时间90min; (5)标记筛选：用Genetic profiler软件对毛细管电泳检测原始数据进行分析，筛选 出35对ETS-SSR标记。3. 根据权利要求2所述的用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的 EST-SSR标记组合的构建、筛选方法，其特征在于，所述步骤（1)对非冗余序列进行SSR筛选 分析中筛选标准为：二基元重复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基 元以上重复不少于3次。4. 一种利用权利要求1所述的用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析 的EST-SSR标记组合进行大豆种质资源鉴定的方法，包括如下步骤： (1) 实验材料的准备：选取不同地域的菜用大豆，粮用大豆及野生大豆进行育苗处理， 待幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片，用液氮速冻后于_70°C保存.采用试剂盒法提取总DNA; (2) 以步骤（1)获得额DNA为模板，利用权利要求1所述的EST-SSR标记组合进行PCR 扩增； (3) 对步骤（3)中扩增产物进行毛细管电泳检测，用Geneticprofiler软件对原始数 据进行分析，计算各目标DNA片段大小；利用GenAlEx6. 5软件进行种质材料遗传多样性分 析，区分不同种类大豆。
【专利摘要】本发明公开了一种EST-SSR标记引物组合，包括35对EST-SSR可用引物，EST-SSR标记引物组合筛选方法的步骤包括大豆EST序列中SSR位点筛选、引物设计、PCR扩增、产物毛细管电泳检测、标记筛选，并将该EST-SSR标记引物组合应用菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性，对菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性和聚类分析，有助于快速、准确地辨析区分菜用大豆、粮用大豆和野生大豆种质材料，分析其亲缘关系，为该物种的定向育种奠定基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11, C12N15/10
【公开号】CN104894109
【申请号】CN201510189691
【发明人】徐盛春, 龚亚明, 胡齐赞, 刘娜
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月21日
【技术领域】
[0001] 本发明本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种EST-SSR标记引物组合及其筛 选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析和鉴定。
【背景技术】
[0002] 大豆起源于中国，已有5000-6000年的种植历史。自野生大豆发现以来，随着人们 对该物种的改良、驯化，大豆逐渐分化成两种类型：粮用大豆和菜用大豆。其中，菜用大豆 不仅口感好，而且富含营养优越的蛋白质、多种游离氨基酸和维生素，是当今公认的保健食 品，市场前景十分广阔。发展至今，中国已成为世界上最大的菜用大豆生产国和出口国。但 是，我国关于菜用大豆种质资源鉴定及育种工作起步较晚，目前可利用的资源和品种不多， 许多地区粮用、菜用大豆品种混用，特别是种质资源鉴定过程中经常遇到'一种多名'现象， 单以表型性状较难区分各类种质，严重制约了育种进程。因此，利用分子标记进行种质资源 鉴定和遗传多样性分析，将有助于精确鉴定大豆种质，实现粮用/菜用类型分类，为育种打 下坚实基础。
[0003] 基于表达序列标签（expressed sequence tag，EST)的微卫星标记（即简单重复序 列simple sequence repeat，SSR)是目前逐渐发展并成熟的分子标记技术，具有易检测、 稳定性高、共显性、通用性强等特点，已成为在生物上应用最广、最为重要的分子标记。近年 来，NCBI数据库中可用EST数据的快速增加，为EST-SSR标记的开发提供一个巨大的、有价 值的来源，能够克服SSR引物在创造时费用高的问题。近年来在水稻、玉米、番茄、大麦等许 多农作物都已经建立了 EST-SSR标记，并分别在遗传学图谱构建、品种鉴别和亲缘关系鉴 定、遗传多样性研宄以及功能基因的发掘和利用研宄方面发挥了巨大作用。但在大豆中，虽 然已开发了部分EST-SSR标记，但绝大部分都基于粮用大豆，鲜有在菜用大豆中的应用；而 同时用于粮用大豆、菜用大豆及其祖先野生大豆的分子标记开发及遗传多样性鉴定尚未见 报道。鉴于此，本发明利用目前数据库中的EST片段，自主开发EST-SSR标记，实现快速准 确鉴定粮用、菜用及野生大豆材料。
【发明内容】
[0004] 本发明第一目的在于提供一种用于菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析的 EST-SSR标记组合。
[0005] 本发明第二目的在于提供上述EST-SSR标记组合的构建、筛选方法。
[0006] 本发明第三目的在于提供上述EST-SSR标记组合在进行大豆遗传多样性的鉴定。
[0007] -种用于菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析的EST-SSR标记组合，包括35对 EST-SSR可用引物，引物名称及序列分别为： NGMP-031 s:5 ' - TACCAGCAACAACAGCA-3 ' ；a:5 ' - CATCGTAATGAGGAGGC-3 ' NGMP-069 s:5 ' _ GGAAGAGGAGGAGCAGG-3 ' ； a:5 ' _ CAAGCCAGGATGAGGTA-3， NGMP-080 s:5 ' - AAAGAAGACCCATCCCA-3 ' ； a:5 ' - GACGGTGAAGACGAAGA-3 ' NGMP-I36 s:5' - TGCGGATTTCTCCACAAG-3' ；a:5' - GGTCACCTCCAACCAAGT-3' NGMP-I48 s:5' - TCCTCCTGGACCTCGGTG-3' ；a:5' - CTTGGGCGTGAAGTGAC -3' NGMP-I66 s:5' - ACTGCCACCCCAATAAC -3' ；a:5' - CCTTAGAGGAAGAGGAAACT -3' NGMP-167 s:5' - GTAGTGTTTGGTGGCAGTG-3' ；a:5' - ACCTCTTGATTGGCTTCA -3' NGMP-172 s:5, - CTCAACCAACTCACCCCAGAC -3, ；a:5, - CCACTTGCCCCAATGCC -3， NGMP-I74 s:5' - TAACCCTTTACGGCTAT -3' ；a:5' - ATTCCAGGTGAAGAACC -3' NGMP-177 s:5' - AGTGGAAGATGGCGTAA-3' ；a:5' - CATTCATTCTGGGACAA -3' NGMP-I79 s:5, - GGACGCCATAGAGCACA-3, ；a:5, - ATCACCGCCTTCTTTCA -3， NGMP-185 s:5' -TGAAGAGCGGGTAACAA -3' ；a:5' - TGAAGGGTAAAAGGAGG -3' NGMP-187 s:5' -GGCTTTGTTATTGGGTC -3' ；a:5' - CATCACAATGGGTAGACAC -3' NGMP-I90 s:5' - GGGAATGGTTTACTGCT-3' ；a:5' - TCTTCACTCCTTTCTGCT -3' NGMP-200 s:5' -GTAAATACCTTTCCACCCA -3' ；a:5' - TTTGACCAGCCTAGCAC -3' NGMP-235 s:5 ' - GACATACATCCGAGGTTC-3 ' ；a:5 ' - AGGGGTAGAGTTGGAAA -3 ' NGMP-245 s:5' -ATTCAACAACGCAATCTCC -3' ；a:5' - TCCACCCCTTTTCCCTCT -3' NGMP-260 s:5 ' -AAGAACGCAACACCAAAG -3 ' ； a:5 ' - TCCCCATCAAAGACATCA -3 ' NGMP-262 s:5 ' - TGACAGCGAGTGAAAGAA-3 ' ；a:5 ' - CAGGAGGAAGTCCAAATC -3 ' NGMP-294 s:5' - ACATTAGCGTACTCTGTTTG -3' ；a:5' - CGGTTTCTGAGATTTGG -3' NGMP-314 s:5' - TTGGCTGGAATCTATCA -3' ；a:5' - GTTGGGGCTAATGTGGG -3' NGMP-324 s:5' - AGTGAACAAAAGGCAAGC -3' ；a:5' - CAGATAAAGAACAACAACCC -3' NGMP-332 s:5 ' - ATCCAGCGTCGGTAGTTA-3 ' ；a:5 ' - AGAATGAGTCCAAGAGCC -3 ' NGMP-356 s:5' - GAACATTATGGCGGAAGT -3' ；a:5' - TGTAGGCATCGGAGTAGG -3' NGMP-359 s:5' - GCAAGAGCAACAGCAAT -3' ；a:5' - GAAGGTCGTGGATGGAG -3' NGMP-373 s:5' - GTGACCCTTATAGGTTTGG -3' ；a:5' - ACTTCGCTGTTGGATGTA -3' NGMP-397 s:5' - GAAACAAGACAAGCCATC -3' ；a:5' - AGTTCAGACCCACAGGAG -3' NGMP-399 s:5' - CTATGTAGACGACCTCACC -3' ；a:5' - CTCATCCAAAACAACTCC -3' NGMP-422 s:5' - AACGCAGTGGCAGACATA -3' ；a:5' - GTTTCTTCCCAAGTAGCAAT -3' NGMP-462 s:5' - GCGGTGGTGTTGAGTTGT -3' ；a:5' - TTTGCGAGGAGAAGGAAT -3' NGMP-492 s:5' - GGTCGTCCTCCTCAAAA -3' ；a:5' - CAGTCCTACGGGGTTCA -3' NGMP-562 s:5' - GCTTCCCTCCCTCCTTTG -3' ；a:5' - TGTGCCCCTTATTGCCTC -3' NGMP-567 s:5' - CACCATTCCCCTCCCATC -3' ；a:5' - CTACAAGCCTCGCTCACG -3' NGMP-606 s:5' - CAGACTCCCTCTTCATACC -3' ；a:5' - GCATCCAAGGCACTAACA -3' NGMP-607 s:5' - GCACTCGGTACAGGGAC -3' ；a:5' - GGTTTTGGTTGGTTGAA-3'。
[0008] -种上述用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的EST-SSR标记组 合的构建、筛选方法，包括如下步骤： (1) 大豆EST序列中SSR位点筛选：从PlantGDB数据库中下载得到大豆EST数据，利 用DNAStar软件对所下载的EST进行拼接、去除冗余序列，之后采用SSRIT软件对非冗余序 列进行SSR筛选分析； (2) 引物设计：利用Primer Premier 5. 0软件，对步骤（1)筛选分析的含有SSR的 unigene进行特异引物设计，引物正义链的5'端分别以FAM或HEX荧光染料标记；引物设 计的主要参数为：引物长度为18-24 bp，退火温度为50-60°C ; (3) PCR扩增：步骤（2)设计的引物以大豆DNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系 总体积20以1^，具体包括1\?0?缓冲液，2以111〇14-1]\%(：12,0.2以111〇14-1(1阶1 38,0.2 μmol·L-l正引物，0·2μmol·L-l反引物，lUTaqDNA聚合酶及15-25ngDNA模板；PCR 扩增反应程序为：94 °C预变性2 min;94 °C变性30 s，54 °C复性30 s，72 °C延伸70 s，45 个循环；最后72 °C延伸8 min ; (4) 产物毛细管电泳检测：步骤（3)扩增产物混匀稀释后，加入ET550-R分子量内标， 95°C变性I min，迅速冰浴至冷却，3000 r/min离心I min，于MegaBACE 1000 DNA分析系统 上进行毛细管电泳；其中进样电压3 kV，进样时间45 s，电泳电压8 kV，电泳时间90 min ; (5) 标记筛选：用Genetic profiler软件对毛细管电泳检测原始数据进行分析，筛选 出35对ETS-SSR标记。
[0009] 进一步地，所述步骤（1)对非冗余序列进行SSR筛选分析中筛选标准为：二基元重 复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基元以上重复不少于3次。
[0010] 一种利用上述的用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的EST-SSR 标记组合进行大豆种质资源鉴定的方法，包括如下步骤： (1) 实验材料的准备：选取不同地域的菜用大豆，粮用大豆及野生大豆进行育苗处理， 待幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片，用液氮速冻后于-70°c保存.采用试剂盒法提取总DNA ; (2) 以步骤（1)获得额DNA为模板，利用权利要求1所述的EST-SSR标记组合进行PCR 扩增； (3) 对步骤（3)中扩增产物进行毛细管电泳检测，用Genetic profiler软件对原始数 据进行分析，计算各目标DNA片段的大小；利用GenAlEx 6. 5软件进行种质材料遗传多样性 分析，区分不同种类大豆。
[0011] 本发明开发的一批EST-SSR标记组合，对菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多 样性和聚类分析，有助于快速、准确地辨析区分菜用大豆、粮用大豆和野生大豆种质材料， 分析其亲缘关系，为该物种的定向育种奠定基础。
[0012] 说明书附图 图I EST-SSR生物荧光毛细管电泳结果示例。
[0013] 图2 EST-SSR应用于菜用、粮用和野生大豆分类。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过实施例，对本发明【具体实施方式】进行说明。
[0015] 实施例1 EST-SSR标记引物组合及筛选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多样性分析和鉴定，其 具体步骤如下： (1)种质材料准备。
[0016] 如表1所示，本发明所利用的大豆材料包括35份菜用大豆，18份粮用大豆和15份 野生大豆。
[0017] 表1大豆种质信息表。
[0018] ⑵种质样本DNA提取 供试种质材料在浙江省农业科学院蔬菜研宄所豆类育种基地育苗，幼苗长至四叶时采 集幼嫩叶片，用液氮速冻后于_7〇°C保存·采用试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN) 法提取总DNA。
[0019] ⑶引物设计 从 Plant⑶B 数据库（http://www. plantgdb. org/)中下载大豆 EST 数据，利用 DNAStar 软件对所下载的豌豆 EST进行拼接，去除冗余序列，然后采用SSRIT软件（http://WWW. gramene. org/gramene/searches/ssrtool)对非冗余序列进行SSR筛选分析，筛选标准 为：二基元重复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基元以上重复不少 于3次。利用Primer Premier 5. 0软件，对含有SSR的unigene进行特异引物设计，引物 设计的主要参数为：引物长度为18-24 bp，退火温度为50-60°C。共自主设计引物615对， 引物由上海赛百胜公司合成，分别以FAM或HEX荧光染料标记SSR引物正义链的5'端。
[0020] (4) PCR扩增及产物检测 PCR反应体系的总体积为20 yL，含有IXPCR缓冲液，2 μπιο? ?Γ1 MgCl2,0.2 μ mol.Γ1 dNTPs，0.2 μ mol.Γ1 正、反引物，I U Taq DNA 聚合酶及约 20 ng 的 DNA 模 板。各样品反应混合液分别加入至96孔PCR板中，根据修饰引物不同，分为FAM反应板和 HEX反应板。PCR扩增反应程序为：94 °C预变性2 min ;94 °C变性30 s，54 °C复性30 s， 72 °C延伸70 s，45个循环；最后72 °C延伸8 min。
[0021] 扩增后产物混点：各取一板FAM修饰产物和HEX修饰产物，每样品吸取10 μ L，于 1块新的96孔PCR板中混合均匀，获得1块含196个样品的PCR产物板。
[0022] 毛细管电泳检测：将PCR混合产物稀释50倍，在96孔板的各孔中分别加入 ET550-R分子量内标（GE Healthcare)和1 μ L稀释后的PCR混合产物，95°C变性I min， 迅速冰浴至冷却，3000 r/min离心I min，于MegaBACE 1000 DNA分析系统上进行毛细管电 泳。进样电压3 kV，进样时间45 s，电泳电压8 kV，电泳时间90 min。
[0023] 用Genetic profiler软件对原始数据进行分析，系统将各峰值的位置与其泳道中 的ET 550-R分子量内标做比较.计算各目标DNA片段的大小。利用GenAlEx 6. 5软件进 行种质材料遗传多样性分析。
[0024] 实施例2 下面结合实施例1，EST-SSR标记引物组合及筛选方法对菜用、粮用和野生大豆遗传多 样性分析和鉴定实验结果分析如下。
[0025] 图1为EST-SSR标记荧光毛细管电泳检测结果，通过对615对引物的分析，共有 386对获得了有效扩增，并能在同一泳道中得到明显条带。
[0026] 如表2所示，从中筛选获得35对ETS-SSR标记用于大豆种质资源鉴定。
[0027] 如图2所示，成功将35份菜用大豆，18份粮用大豆和15份野生大豆分成三类。
[0028] 表2大豆EST-SSR引物信息表
【主权项】
1. 一种用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的EST-SSR标记组合，其 特征在于，包括35对EST-SSR可用引物，引物名称及序列分别为： NGMP-031 s:5 ' - TACCAGCAACAACAGCA-3 ' ；a:5 ' - CATCGTAATGAGGAGGC-3 ' NGMP-069 s:5 ' _ GGAAGAGGAGGAGCAGG-3 ' ； a:5 ' _ CAAGCCAGGATGAGGTA-3， NGMP-080 s:5 ' - AAAGAAGACCCATCCCA-3 ' ； a:5 ' - GACGGTGAAGACGAAGA-3 ' NGMP-136 s:5' - TGCGGATTTCTCCACAAG-3' ；a:5' - GGTCACCTCCAACCAAGT-3' NGMP-I48 s:5' - TCCTCCTGGACCTCGGTG-3' ；a:5' - CTTGGGCGTGAAGTGAC -3' NGMP-I66 s:5' - ACTGCCACCCCAATAAC -3' ；a:5' - CCTTAGAGGAAGAGGAAACT -3' NGMP-167 s:5' - GTAGTGTTTGGTGGCAGTG-3' ；a:5' - ACCTCTTGATTGGCTTCA -3' NGMP-172 s:5, - CTCAACCAACTCACCCCAGAC -3, ；a:5, - CCACTTGCCCCAATGCC -3， NGMP-I74 s:5' - TAACCCTTTACGGCTAT -3' ；a:5' - ATTCCAGGTGAAGAACC -3' NGMP-177 s:5' - AGTGGAAGATGGCGTAA-3' ；a:5' - CATTCATTCTGGGACAA -3' NGMP-I79 s:5, - GGACGCCATAGAGCACA-3, ；a:5, - ATCACCGCCTTCTTTCA -3， NGMP-185 s:5' -TGAAGAGCGGGTAACAA -3' ；a:5' - TGAAGGGTAAAAGGAGG -3' NGMP-187 s:5' -GGCTTTGTTATTGGGTC -3' ；a:5' - CATCACAATGGGTAGACAC -3' NGMP-I90 s:5' - GGGAATGGTTTACTGCT-3' ；a:5' - TCTTCACTCCTTTCTGCT -3' NGMP-200 s:5' -GTAAATACCTTTCCACCCA -3' ；a:5' - TTTGACCAGCCTAGCAC -3' NGMP-235 s:5 ' - GACATACATCCGAGGTTC-3 ' ；a:5 ' - AGGGGTAGAGTTGGAAA -3 ' NGMP-245 s:5' -ATTCAACAACGCAATCTCC -3' ；a:5' - TCCACCCCTTTTCCCTCT -3' NGMP-260 s:5 ' -AAGAACGCAACACCAAAG -3 ' ； a:5 ' - TCCCCATCAAAGACATCA -3 ' NGMP-262 s:5 ' - TGACAGCGAGTGAAAGAA-3 ' ；a:5 ' - CAGGAGGAAGTCCAAATC -3 ' NGMP-294 s:5' - ACATTAGCGTACTCTGTTTG -3' ；a:5' - CGGTTTCTGAGATTTGG -3' NGMP-314 s:5' - TTGGCTGGAATCTATCA -3' ；a:5' - GTTGGGGCTAATGTGGG -3' NGMP-324 s:5' - AGTGAACAAAAGGCAAGC -3' ；a:5' - CAGATAAAGAACAACAACCC -3' NGMP-332 s:5 ' - ATCCAGCGTCGGTAGTTA-3 ' ；a:5 ' - AGAATGAGTCCAAGAGCC -3 ' NGMP-356 s:5' - GAACATTATGGCGGAAGT -3' ；a:5' - TGTAGGCATCGGAGTAGG -3' NGMP-359 s:5' - GCAAGAGCAACAGCAAT -3' ；a:5' - GAAGGTCGTGGATGGAG -3' NGMP-373 s:5' - GTGACCCTTATAGGTTTGG -3' ；a:5' - ACTTCGCTGTTGGATGTA -3' NGMP-397 s:5' - GAAACAAGACAAGCCATC -3' ；a:5' - AGTTCAGACCCACAGGAG -3' NGMP-399 s:5' - CTATGTAGACGACCTCACC -3' ；a:5' - CTCATCCAAAACAACTCC -3' NGMP-422 s:5' - AACGCAGTGGCAGACATA -3' ；a:5' - GTTTCTTCCCAAGTAGCAAT -3' NGMP-462 s:5' - GCGGTGGTGTTGAGTTGT -3' ；a:5' - TTTGCGAGGAGAAGGAAT -3' NGMP-492 s:5' - GGTCGTCCTCCTCAAAA -3' ；a:5' - CAGTCCTACGGGGTTCA -3' NGMP-562 s:5' - GCTTCCCTCCCTCCTTTG -3' ；a:5' - TGTGCCCCTTATTGCCTC -3' NGMP-567 s:5' - CACCATTCCCCTCCCATC -3' ；a:5' - CTACAAGCCTCGCTCACG -3' NGMP-606 s:5' - CAGACTCCCTCTTCATACC -3' ；a:5' - GCATCCAAGGCACTAACA -3' NGMP-607 s:5' - GCACTCGGTACAGGGAC -3' ；a:5' - GGTTTTGGTTGGTTGAA-3'。2. -种权利要求I所述的用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的 EST-SSR标记组合的构建、筛选方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)大豆EST序列中SSR位点筛选：从PlantGDB数据库中下载得到大豆EST数据，利 用DNAStar软件对所下载的EST进行拼接、去除冗余序列，之后采用SSRIT软件对非冗余序 列进行SSR筛选分析； (2) 引物设计：利用PrimerPremier5.O软件，对步骤（1)筛选分析的含有SSR的 unigene进行特异引物设计，引物正义链的5'端分别以FAM或HEX荧光染料标记；引物设 计的主要参数为：引物长度为18-24bp，退火温度为50-60°C; (3) PCR扩增：步骤（2)设计的引物以大豆DNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系 总体积20 y L，具体包括IXPCR缓冲液，2 y mol ? I71 MgCl2,0? 2 y mol ? I71 dNTPs，0? 2 y mol?I71正引物，0.2 y mol?厂1 反引物，I U Taq DNA聚合酶及15-25 ngDNA模板；PCR 扩增反应程序为：94 °C预变性2 min;94 °C变性30 s，54 °C复性30 s，72 °C延伸70 s，45 个循环；最后72 °C延伸8 min ; (4) 产物毛细管电泳检测：步骤（3)扩增产物混匀稀释后，加入ET550-R分子量内标， 95°C变性Imin，迅速冰浴至冷却，3000r/min离心Imin，于MegaBACE1000DNA分析系统 上进行毛细管电泳；其中进样电压3kV，进样时间45s，电泳电压8kV，电泳时间90min; (5)标记筛选：用Genetic profiler软件对毛细管电泳检测原始数据进行分析，筛选 出35对ETS-SSR标记。3. 根据权利要求2所述的用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析的 EST-SSR标记组合的构建、筛选方法，其特征在于，所述步骤（1)对非冗余序列进行SSR筛选 分析中筛选标准为：二基元重复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基 元以上重复不少于3次。4. 一种利用权利要求1所述的用于菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性分析 的EST-SSR标记组合进行大豆种质资源鉴定的方法，包括如下步骤： (1) 实验材料的准备：选取不同地域的菜用大豆，粮用大豆及野生大豆进行育苗处理， 待幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片，用液氮速冻后于_70°C保存.采用试剂盒法提取总DNA; (2) 以步骤（1)获得额DNA为模板，利用权利要求1所述的EST-SSR标记组合进行PCR 扩增； (3) 对步骤（3)中扩增产物进行毛细管电泳检测，用Geneticprofiler软件对原始数 据进行分析，计算各目标DNA片段大小；利用GenAlEx6. 5软件进行种质材料遗传多样性分 析，区分不同种类大豆。
【专利摘要】本发明公开了一种EST-SSR标记引物组合，包括35对EST-SSR可用引物，EST-SSR标记引物组合筛选方法的步骤包括大豆EST序列中SSR位点筛选、引物设计、PCR扩增、产物毛细管电泳检测、标记筛选，并将该EST-SSR标记引物组合应用菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性，对菜用大豆、粮用大豆和野生大豆遗传多样性和聚类分析，有助于快速、准确地辨析区分菜用大豆、粮用大豆和野生大豆种质材料，分析其亲缘关系，为该物种的定向育种奠定基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11, C12N15/10
【公开号】CN104894109
【申请号】CN201510189691
【发明人】徐盛春, 龚亚明, 胡齐赞, 刘娜
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月21日
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