构建芥菜ssr遗传图谱的引物组及遗传图谱的构建方法
构建芥菜ssr遗传图谱的引物组及遗传图谱的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子标记技术，具体涉及构建芥菜SSR遗传图谱的引物组及遗传 图谱的构建方法。
【背景技术】
[0002] 芥菜（B. juncea)是十字花科芸薹属的一种重要栽培作物，作为蔬菜、油料和调味 品，该物种在世界范围内广泛栽培。目前常见的芥菜类作物包括芥菜型油菜、调味品籽芥 菜、菜用芥菜及其变种等，并且不同芥菜类作物之间的生物学差异很大。农艺性状都受多基 因控制，其遗传改良较为复杂。通过分子标记对芥菜进行早期选择、预测，利用遗传图谱，把 优良的基因分离出来，对多基因控制的复杂的性状进行遗传改良，可以提高目标基因的选 择效率，加速育种进程。
[0003] 目前，随着分子标记的发展与应用，越来越多的芥菜遗传图谱完成构建，其中应 用较多的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP等，但这些标记大多是采用无全基因组序列信息 的技术开发得到，表现出随机性强、稳定性差等缺点。而简单重复序列（simple sequence repeat，SSR)标记具有重复性好、稳定性强、多态性高、共显性遗传和基因组中普遍存在等 优点，广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析及分子标记辅助育种等研宄。而目前SSR 分子标记在芥菜中的应用报道很少，并且其中大多以籽用芥菜即芥菜型油菜为材料，少数 以调味用芥菜为材料。还未见以我国特有蔬菜类芥菜为材料的SSR遗传图谱构建的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供构建芥菜SSR遗传图谱的引物组及遗 传图谱的构建方法，所述引物组能特异地扩增出芥菜中含有的SSR分子标记，利用这些SSR 分子标记能构建芥菜的SSR遗传图谱。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：构建芥菜SSR遗传图谱的引物组，包 括以下112对引物：
[0006] BjSSROOOl 正向引物 SEQ ID NO. I :AAATCCCCAAAAACCTAGAG
[0007] 反向引物 SEQ ID NO. 113 :CTCATCCATCTCCTCGTCT
[0008] BjSSR0002 正向引物 SEQ ID NO. 2 :CTTCGTTTGCGCGTTTT
[0009] 反向引物 SEQ ID NO. 114 :ATGATGGTCTCCTTTTGTTG
[0010] BjSSR0004 正向引物 SEQ ID NO. 3 :AAGAAGTCGAGTAGTCGCAG
[0011] 反向引物 SEQ ID NO. 115 :AAACGAACAATACTTCCCG
[0012] BjSSR0008 正向引物 SEQ ID NO. 4 :ATGGAGCACATCTCAAAGAC
[0013] 反向引物 SEQ ID NO. 116 :CTTTTGTTGTGATGACCCTT
[0014] BjSSR0019 正向引物 SEQ ID NO. 5 :GAAACACAAACGCAGCA
[0015] 反向引物 SEQ ID NO. 117 :ACAGGCATTGTAGGAGACAC
[0016] BjSSR0023 正向引物 SEQ ID NO. 6 :TAAGCAGAGAAAGAAATGGG
[0017] 反向引物 SEQ ID NO. 118 :AGATCTCTGGAGTTGGGAGT
[0018] BjSSR0166 正向引物 SEQ ID NO. 7 :GAACAACAACTCATCCACCT
[0019] 反向引物 SEQ ID NO. 119 :AGACTCGTTATTGATGCTGG
[0020] BjSSR0234 正向引物 SEQ ID NO. 8 :ATTCTAATCACAACAACCGC
[0021] 反向引物 SEQ ID NO. 120 :ATGTAGTAGCCAAGGTGGTG
[0022] BjSSR0312 正向引物 SEQ ID NO. 9 :AGAAGCTTGGTAAGACGACA
[0023] 反向引物 SEQ ID NO. 121 :ATGCTCGAAGCTTTCTTATG
[0024] BjSSR0364 正向引物 SEQ ID NO. 10 :ATCCCCTCGTTAAAACTCTC
[0025] 反向引物 SEQ ID NO. 122 :GATGTTGAGGAGGTACTGGA
[0026] BjSSR0486 正向引物 SEQ ID NO. 11 :TTCCAAATCATCTTCTCACC
[0027] 反向引物 SEQ ID NO. 123 :CGTCCAACACAACAAACATA
[0028] BjSSR0513 正向引物 SEQ ID NO. 12 :ATCAAGAAAATGGAGCAAGA
[0029] 反向引物 SEQ ID NO. 124 :CTTCACTCTTGAACCTCTGG
[0030] BjSSR0612 正向引物 SEQ ID NO. 13 :TCGATTCTGGTCTTGAGTTT
[0031] 反向引物 SEQ ID NO. 125 :GAGTTGTAGACCGGATCAAA
[0032] BjSSR0613 正向引物 SEQ ID NO. 14 :TGAATTTGATCTCCGGTAAC
[0033] 反向引物 SEQ ID NO. 126 :ATTGCTGATCATACGGAAAC
[0034] BjSSR0678 正向引物 SEQ ID NO. 15 :TCAGCTACGGATAGAAGAGC
[0035] 反向引物 SEQ ID NO. 127 :GGACTCACATTGATCGTCTT
[0036] BjSSR0723 正向引物 SEQ ID NO. 16 :TAATGGCTTTGAAACTCTGC
[0037] 反向引物 SEQ ID NO. 128 :GGAAAGGAAGAGGTTCTTGT
[0038] BjSSR0731 正向引物 SEQ ID NO. 17 :CTCAAGAGGCTCAACACTTC
[0039] 反向引物 SEQ ID NO. 129 :TCCATTGCAACAATTAGACA
[0040] BjSSR0806 正向引物 SEQ ID NO. 18 :GATGAAGAGAGAAGCGAAGA
[0041] 反向引物 SEQ ID NO. 130 :TCCGTGAAGAAGCTAATGAT
[0042] BjSSR0891 正向引物 SEQ ID NO. 19 :GTTCTGAACGTTCTGGCTAC
[0043] 反向引物 SEQ ID NO. 131 :CATACACACGGTCTGATGAA
[0044] BjSSR0913 正向引物 SEQ ID NO. 20 :AATCCTCAGACCTCAAAACA
[0045] 反向引物 SEQ ID NO. 132 :GTATTCCTCGTAATCGTTGG
[0046] BjSSR0942 正向引物 SEQ ID NO. 21 :AATCTGGCAGAACTCAGAGA
[0047] 反向引物 SEQ ID NO. 133 :TCGGTGTAAGCCATATCTTT
[0048] BjSSR0967 正向引物 SEQ ID NO. 22 :GACCTCCTCCTGAAGTTTCT
[0049] 反向引物 SEQ ID NO. 134 :GCTGCAACTCACTTCTCTTT
[0050] BjSSRlOl8 正向引物 SEQ ID NO. 23 :CAGTTGTGTCCATGTACGAG
[0051] 反向引物 SEQ ID NO. 135 :TTCCGATGTCTGATAACTCC
[0052] BjSSRKMO 正向引物 SEQ ID NO. 24 :ACAAACAAATGGAAGACGAG
[0053] 反向引物 SEQ ID NO. 136 :AGATCGGATTTGATCTTGG
[0054] BjSSR1215 正向引物 SEQ ID NO. 25 :AGGGTGAGATACGACGAGTA
[0055] 反向引物 SEQ ID NO. 137 :CTTTCGTTTGGTCATTCATC
[0056] BjSSR1289 正向引物 SEQ ID NO. 26 :CGAGAGCCTAGATCTGAGAA
[0057] 反向引物 SEQ ID NO. 138 :TAAACAAACGCCTTACCTTC
[0058] BjSSR1365 正向引物 SEQ ID NO. 27 :TGAAAGTAGGCAACCGTATT
[0059] 反向引物 SEQ ID NO. 139 :CTCGCTTTACTCTCTGCAAT
[0060] BjSSR1448 正向引物 SEQ ID NO. 28 :GAGGTTGTTTCTTTTCCCTT
[0061] 反向引物 SEQ ID NO. 140 :GAATCAGCTATTCATCGGAG
[0062] BjSSR1474 正向引物 SEQ ID NO. 29 :ACTTTCCCTTACAATCCTCC
[0063] 反向引物 SEQ ID NO. 141 :GACTAGCAGCCTTCATCATC
[0064] BjSSR1528 正向引物 SEQ ID NO. 30 :CGTTCTCTTCACTATGCTCC
[0065] 反向引物 SEQ ID NO. 142 :TCACATAGCCCATAAACACA
[0066] BjSSR1594 正向引物 SEQ ID NO. 31 :AACAAACCTCACAAACCAAC
[0067] 反向引物 SEQ ID NO. 143 :ATTCTTCCACTCCCTTCTTC
[0068] BjSSR1612 正向引物 SEQ ID NO. 32 :AGGAGGAGGAAGAAGACAAC
[0069] 反向引物 SEQ ID NO. 144 :TCGTTTGATCGAACTTACCT
[0070] BjSSR1764 正向引物 SEQ ID NO. 33 :AAAGTCATGAAGAATGTGGG
[0071] 反向引物 SEQ ID NO. 145 :AGAAGCTTGTCTCAACATGG
[0072] BjSSR1799 正向引物 SEQ ID NO. 34 :GAAGTTTCCAACAAAACAGG
[0073] 反向引物 SEQ ID NO. 146 :GATTATGAACCACCGAGAGA
[0074] BjSSR1811 正向引物 SEQ ID NO. 35 :TCACAACGCAAAATAAACAA
[0075] 反向引物 SEQ ID NO. 147 :CTTTCCATCCCATGTGTAGT
[0076] BjSSR1812 正向引物 SEQ ID NO. 36 :TCAATATACAATCTTCGTGACTCT
[0077] 反向引物 SEQ ID NO. 148 :CAATAGGGATCATAACCGTC
[0078] BjSSR1813 正向引物 SEQ ID NO. 37 :GCTGCTATAGCTGGTCACTC
[0079] 反向引物 SEQ ID NO. 149 :TCATCGTTTGGTTCTTCTTT
[0080] BjSSR1831 正向引物 SEQ ID NO. 38 :ACTTGTTTCACTTCCAGCAT
[0081] 反向引物 SEQ ID NO. 150 :TTGTTTTGATTGTTATCCCC
[0082] BjSSR1885 正向引物 SEQ ID NO. 39 :ACCACAAAAACACACCAAAC
[0083] 反向引物 SEQ ID NO. 151 :TCTCACTCCTCTATAACGGG
[0084] BjSSR1926 正向引物 SEQ ID NO. 40 :TCCAGCAGCTTATTACCAGT
[0085] 反向引物 SEQ ID NO. 152 :GCACTTTAGCTGTTCTTGGT
[0086] BjSSR1934 正向引物 SEQ ID NO. 41 :TTTTCTCTTACCGAACCAAA
[0087] 反向引物 SEQ ID NO. 153 :GTTTGAAGGAAGAAGTGTCG
[0088] BjSSR1950 正向引物 SEQ ID NO. 42 :CCCTCGTCTTCTTAGGTCTT
[0089] 反向引物 SEQ ID NO. 154 :ATCAACCATTCCAGACATTC
[0090] BjSSR1970 正向引物 SEQ ID NO. 43 :ATATCACCACCACCATTGTT
[0091] 反向引物 SEQ ID NO. 155 :TCCTCCACAATCTCCATTAC
[0092] BjSSR1984 正向引物 SEQ ID NO. 44 :GCAATTGCTTTAATCTGTCC
[0093] 反向引物 SEQ ID NO. 156 :GAGGCAGGTATACAGATGCT
[0094] BjSSR1985 正向引物 SEQ ID NO. 45 :GTTCTCCGACGTCTGTTCT
[0095] 反向引物 SEQ ID NO. 157 :TTTCTGGTTTTCGATTTCAT
[0096] BjSSR2017 正向引物 SEQ ID NO. 46 :CGTTGATTCCAACAAACC
[0097] 反向引物 SEQ ID NO. 158 :GAGTTGATGAGAGATTTGGC
[0098] BjSSR2113 正向引物 SEQ ID NO. 47 :CCTCAGTTTCAGAATCAAGC
[0099] 反向引物 SEQ ID NO. 159 :TCCGGAAGAGAGAATAACAA
[0100] BjSSR2164 正向引物 SEQ ID NO. 48 :TCTCTTATCCTTTGGTCACG
[0101] 反向引物 SEQ ID NO. 160 :GGAAACGAAGACATAAGCTG
[0102] BjSSR2184 正向引物 SEQ ID NO. 49 :GGATTCGTGTTTGAGTTGTT
[0103] 反向引物 SEQ ID NO. 161 :TTCCCAGAAGAAGAAGATCA
[0104] BjSSR2234 正向引物 SEQ ID NO. 50 :TACACCGTCTGATTCCATCT
[0105] 反向引物 SEQ ID NO. 162 :GGGTTCGAGATACCACAATA
[0106] BjSSR2235 正向引物 SEQ ID NO. 51 :CGCTTACACCTTTCTTGAAT
[0107] 反向引物 SEQ ID NO. 163 :CGAAGTTCAAATTTCCAATC
[0108] BjSSR2247 正向引物 SEQ ID NO. 52 :ACAAGTACAGTGGAGGGATG
[0109] 反向引物 SEQ ID NO. 164 :CAGACCACCTGTTGGTATCT
[0110] BjSSR2272 正向引物 SEQ ID NO. 53 :AAGATCTAGGGTTTCTTCGC
[0111] 反向引物 SEQ ID NO. 165 :CGAAGAGCTTCTGAGTGAAT
[0112] BjSSR2285 正向引物 SEQ ID NO. 54 :CAACCTTTCTTTCTTACGCA
[0113] 反向引物 SEQ ID NO. 166 :TTAAGAGAAACCCACCAAAA
[0114] BjSSR2449 正向引物 SEQ ID NO. 55 :TGCATAACCACCATAGAACA
[0115] 反向引物 SEQ ID NO. 167 :ATCAAGTGCTGCGTATAGGT
[0116] BjSSR2450 正向引物 SEQ ID NO. 56 :CTCCTCTTCTCCAGAGGATT
[0117] 反向引物 SEQ ID NO. 168 :GAGGAGGAAGGGAAGAGTC
[0118] BjSSR2464 正向引物 SEQ ID NO. 57 :CTCTCGTGGACAGAGAAAAC
[0119] 反向引物 SEQ ID NO. 169 :GATCACTTCACCATTCTGCT
[0120] BjSSR2519 正向引物 SEQ ID NO. 58 :AAGTGGAAGAAGAAGTGGGT
[0121] 反向引物 SEQ ID NO. 170 :CGCTAGGAGAAAGACTCTCA
[0122] BjSSR2669 正向引物 SEQ ID NO. 59 :GAAGATGGTGGCAGCTATAC
[0123] 反向引物 SEQ ID NO. 171 :TAAGAAGACAGAGCCAAAGC
[0124] BjSSR2743 正向引物 SEQ ID NO. 60 :GTCGGGTCAGGTTAGTTACA
[0125] 反向引物 SEQ ID NO. 172 :CAGAACCTCCAAAAGTTGAG
[0126] BjSSR2763 正向引物 SEQ ID NO. 61 :CAAACCCATAGAGAAAGACG
[0127] 反向引物 SEQ ID NO. 173 :TCGGAGACGAACTTAGAGAG
[0128] BjSSR2886 正向引物 SEQ ID NO. 62 :TCCCCGCCTCCCTTCAC
[0129] 反向引物 SEQ ID NO. 174 :GTCTCCGAGTAAGACGTCAG
[0130] BjSSR2910 正向引物 SEQ ID NO. 63 :AATCCTATGGCACAGATGAC
[0131] 反向引物 SEQ ID NO. 175 :TGATCTTGGATCGATAGCTT
[0132] BjSSR2957 正向引物 SEQ ID NO. 64 :TCTGAACTCGTCGTCTCTCT
[0133] 反向引物 SEQ ID NO. 176 :TTAAGCACAGTGTTGAGTGC
[0134] BjSSR3033 正向引物 SEQ ID NO. 65 :ATACAGTTTCTGCGATTTGG
[0135] 反向引物 SEQ ID NO. 177 :ACTGCGAGTGAAAGAAGAAG
[0136] BjSSR3109 正向引物 SEQ ID NO. 66 :AAATCAGGAGAGAAAGGGTC
[0137] 反向引物 SEQ ID NO. 178 :AAAGCTGCTTAATTTCGGAT
[0138] BjSSR3137 正向引物 SEQ ID NO. 67 :AAGAGATGGATCTTGGTGTG
[0139] 反向引物 SEQ ID NO. 179 :GAATCTTCCTCATCTGCTTG
[0140] BjSSR3227 正向引物 SEQ ID NO. 68 :CTGTTCATCTTCGTCTCCTC
[0141] 反向引物 SEQ ID NO. 180 :ACTTCTCTGTCTTCGGTTGA
[0142] BjSSR3364 正向引物 SEQ ID NO. 69 :TTCCCTATTCAGTGATCTGC
[0143] 反向引物 SEQ ID NO. 181 :CAAACCAGCCTCTCTGG
[0144] BjSSR3426 正向引物 SEQ ID NO. 70 :AGATTTTCTCGCGAGTATTG
[0145] 反向引物 SEQ ID NO. 182 :TGAGAGAGAGAGCCTGAGAG
[0146] BjSSR3445 正向引物 SEQ ID NO. 71 :TCAAGCTAAGAGGCTTTCAC
[0147] 反向引物 SEQ ID NO. 183 :GAGACATTGGAACCAACCTA
[0148] BjSSR3488 正向引物 SEQ ID NO. 72 :CTGTGATTTCCCAATTTTCT
[0149] 反向引物 SEQ ID NO. 184 :CATTTCTTCTTCAAGATCCG
[0150] BjSSR3505 正向引物 SEQ ID NO. 73 :AGGAGGAGGAGACAGAAGAC
[0151] 反向引物 SEQ ID NO. 185 :ACCAACAGCACAAGAGAAGT
[0152] BjSSR3613 正向引物 SEQ ID NO. 74 :ACAGAGGTTTCCATCATCAG
[0153] 反向引物 SEQ ID NO. 186 :CCTTTTGGTCTGAGTTTCTG
[0154] BjSSR3652 正向引物 SEQ ID NO. 75 :GTGATATTAAATTCGCCGTC
[0155] 反向引物 SEQ ID NO. 187 :CATTGCCATCTCTCTCTCTC
[0156] BjSSR3690 正向引物 SEQ ID NO. 76 :GCGAGTTTTCCTCTTCTTC
[0157] 反向引物 SEQ ID NO. 188 :GATTTCCGATTAGGGTTGTT
[0158] BjSSR3876 正向引物 SEQ ID NO. 77 :AACAGAGCTTAAACCAAACG
[0159] 反向引物 SEQ ID NO. 189 :AACCTCCGAGAAACCGT
[0160] BjSSR3885 正向引物 SEQ ID NO. 78 :ATCGTTAGTAGCACCTCCAA
[0161] 反向引物 SEQ ID NO. 190 :TGTCTTCTCATGTCTCCCTC
[0162] BjSSR3914 正向引物 SEQ ID NO. 79 :CAACCCATCTCTGTTCAAGT
[0163] 反向引物 SEQ ID NO. 191 :CAAGGGACTATCGACGTAAG
[0164] BjSSR3915 正向引物 SEQ ID NO. 80 :AGGGAAGGAAAGTTTGAGAC
[0165] 反向引物 SEQ ID NO. 192 :AGCACAACCCATTTATGTTC
[0166] BjSSR3969 正向引物 SEQ ID NO. 81 :AGTCCCTTTGCTCTTCTTCT
[0167] 反向引物 SEQ ID NO. 193 :TTGGTCTTTGGTCTACCATC
[0168] BjSSR3988 正向引物 SEQ ID NO. 82 :TCTCTATCCCTCACATCTCG
[0169] 反向引物 SEQ ID NO. 194 :AGGAGGATGAAAAGAAGAGG
[0170] BjSSR4254 正向引物 SEQ ID NO. 83 :TACCCACAAGTGAAATCTCC
[0171] 反向引物 SEQ ID NO. 195 :ATCACCTCCACGTACTCAAC
[0172] BjSSR4315 正向引物 SEQ ID NO. 84 :AAAACGTTTACAACGGAGAA
[0173] 反向引物 SEQ ID NO. 196 :TTGGATACGCAAAAGAGAAT
[0174] BjSSR4351 正向引物 SEQ ID NO. 85 :ACGCAAATTCGATATACACC
[0175] 反向引物 SEQ ID NO. 197 :CGATGATGAAGAAGAGGAAG
[0176] BjSSR4366 正向引物 SEQ ID NO. 86 :ACATTACCACTGTTGAAGCC
[0177] 反向引物 SEQ ID NO. 198 :GGAGCGTTAGATGTGGTTAC
[0178] BjSSR4391 正向引物 SEQ ID NO. 87 :AGAGGACGAGAGTGTGAGAA
[0179] 反向引物 SEQ ID NO. 199 :GACTTAGGGCTCTTTGGTTT
[0180] BjSSR4514 正向引物 SEQ ID NO. 88 :TACTATGAAGAGCAGCAGCA
[0181] 反向引物 SEQ ID NO. 200 :ATCTATCGAACGATGACCAC
[0182] BjSSR4587 正向引物 SEQ ID NO. 89 :CTCAGCTCTCCTTACTTCCA
[0183] 反向引物 SEQ ID NO. 201 :AGAGGAGGAACCATCGTTAG
[0184] BjSSR4628 正向引物 SEQ ID NO. 90 :ACTTCACGTTGCTCATCTCT
[0185] 反向引物 SEQ ID NO. 202 :AAGAAGCTAACCGTCTTCCT
[0186] BjSSR4662 正向引物 SEQ ID NO. 91 :CATTATCTTCGAAAGACCAAA
[0187] 反向引物 SEQ ID NO. 203 :CGTACTGGTGAGGGTACATC
[0188] BjSSR4707 正向引物 SEQ ID NO. 92 :TCTCTGATCAGGATGGTAGG
[0189] 反向引物 SEQ ID NO. 204 :ATGGTTAGATGATGCTGGTC
[0190] BjSSR4811 正向引物 SEQ ID NO. 93 :GAACTTTCTCAATGCCTGTC
[0191] 反向引物 SEQ ID NO. 205 :GAGAAGTCACCAAAGACGTG
[0192] BjSSR4854 正向引物 SEQ ID NO. 94 :CTTCAGTTCAAACCTTCGAC
[0193] 反向引物 SEQ ID NO. 206 :GTTGATTGATGTTGCTGATG
[0194] BjSSR4873 正向引物 SEQ ID NO. 95 :AGTCCTCTTTCTCAGGGAAC
[0195] 反向引物 SEQ ID NO. 207 :TCTGCAACATTGAGTTCTTG
[0196] BjSSR4957 正向引物 SEQ ID NO. 96 :TGGTGGAAGAAATAATGGTC
[0197] 反向引物 SEQ ID NO. 208 :GAGAGGGTGACAGGAGTACA
[0198] BjSSR5151 正向引物 SEQ ID NO. 97 :ATGATAAGAGTTGGAAACGC
[0199] 反向引物 SEQ ID NO. 209 :GTCTCTTCCTTCTCCGTTCT
[0200] BjSSR5176 正向引物 SEQ ID NO. 98 :GATTGCGATGATTTGGTAAT
[0201] 反向引物 SEQ ID NO. 210 :GAGTTCTATGCTTCGGACAG
[0202] BjSSR5177 正向引物 SEQ ID NO. 99 :TGGGTCTCTTCACAAGAATC
[0203] 反向引物 SEQ ID NO. 211 :ATAGATGACCATCAACGGAG
[0204] BjSSR5206 正向引物 SEQ ID NO. 100 :CTACAATTCACCACCTCCAC
[0205] 反向引物 SEQ ID NO. 212 :GGTGAGTACTCTATGCAGGG
[0206] BjSSR5224 正向引物 SEQ ID NO. 101 :CTATAGGCTCCTTCTACGCA
[0207] 反向引物 SEQ ID NO. 213 :TGTTTAGTTGTGTTTCGCTG
[0208] BjSSR5269 正向引物 SEQ ID NO. 102 :ACACAAACCCAAGAACACTC
[0209] 反向引物 SEQ ID NO. 214 :GAGTAGACATAGCTGGGACG
[0210] BjSSR5270 正向引物 SEQ ID NO. 103 :AATCAAGCAAACCTTCTACT
[0211] 反向引物 SEQ ID NO. 215 :TCCAACAAACAAACACAGAA
[0212] BjSSR5340 正向引物 SEQ ID NO. 104 :AGGAAGAGAGGCGTAAAAGT
[0213] 反向引物 SEQ ID NO. 216 :TCCTATCTCTCTCCTCCCTC
[0214] BjSSR5342 正向引物 SEQ ID NO. 1 05 :ACGGATCAACACAAGAAATC
[0215] 反向引物 SEQ ID NO. 217 :ATCACATCATCACCACCTTT
[0216] BjSSR5411 正向引物 SEQ ID NO. 106 :CAGTCTGGTACTCCAAGAGC
[0217] 反向引物 SEQ ID NO. 218 :TATTTGCAGACGAAACCTCT
[0218] BjSSR5542 正向引物 SEQ ID NO. 107 :TAGGTAATGGAAGGAGCAAA
[0219] 反向引物 SEQ ID NO. 219 :TCCTACAACAATGTCACGAA
[0220] BjSSR5854 正向引物 SEQ ID NO. 108 :AGCATACTCTTCTTCGACCA
[0221] 反向引物 SEQ ID NO. 220 :GTTGCCATAAACCTGATGAT
[0222] BjSSR5877 正向引物 SEQ ID NO. 109 :GAAGAGAGTCAACAACAGCC
[0223] 反向引物 SEQ ID NO. 221 :TTCACTTCGACATCCTTCTT
[0224] BjSSR5921 正向引物 SEQ ID NO. 110 :GTCGCAAGGAATCATCTAAC
[0225] 反向引物 SEQ ID NO. 222 :GTACACAAAGGACCAACCAC
[0226] BjSSR5941 正向引物 SEQ ID NO. Ill :AAAAGCTTCTCTTGCTGATG
[0227] 反向引物 SEQ ID NO. 223 :TGCTGAGTCTGTTGCTGTAG
[0228] BjSSR5990 正向引物 SEQ ID NO. 112 :TTCGTTTTAGCGTCTCTCTC
[0229] 反向引物 SEQ ID NO. 224 :GAATTTTTGCAACAGCTTTC。
[0230] 一种引物构建芥菜SSR遗传图谱的方法，包括以下步骤：
[0231] (1)取不同芥菜种为亲本进行杂交，获得匕代，然后将F 进行自交获得F 2代，随 机选取200株F2代作为作图群体；
[0232] (2)提取亲本及F2代的基因组DNA ;
[0233] (3)分别用112对引物PCR扩增亲本基因组DNA和F2代的基因组DNA ;
[0234] (4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建芥菜SSR遗传图谱。
[0235] 进一步地，在所述步骤（1)中，所述芥菜亲本中，母本为榨菜，其为"浙桐一号"多 年自交系，父本为叶芥，其为"邱隘大叶黄种雪里蕻"多年自交系分蘖芥。
[0236] 进一步地，在所述步骤（2)中，选取一个半月苗龄的幼嫩叶片进行基因组DNA的提 取。
[0237] 进一步地，在所述步骤（2)中，采用CTAB法提取基因组DNA。
[0238] 进一步地，在所述步骤（3)中，所述PCR反应采用20 μ L反应体系，包括浓度为 IOOng/ μ L的基因组DNA模板1. 0 μ L，浓度为10 μ M的正向引物1. 0 μ L、浓度为10 μ M的反 向引物 I. 0 μ L，浓度为 5U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，10 X PCR Buffer (Mg2+) 2. 5 μ L，浓 度为2. 5mM的dNTP 2 μ L，CldH2O 12. 3 μ L ;扩增反应程序为：94°C预变性3min，进入35个循 环，每个循环为94°C变性30S，55°C退火30s，72°C延伸30s ;35个循环后再72°C延伸7min， 4°C保存。
[0239] 进一步地，在所述步骤（4)中，对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳：PCR产 物加入2 yL loading buffer，以20bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用质量体积比为 0.12g/ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为lXTBE，240V稳压电泳1.5h。 电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶拍照；根据电泳结果剔除偏分离的SSR分子标 记，再利用生物学软件JoinMap 4. O构建芥菜SSR遗传图谱。
[0240] 进一步地，剔除偏分离SSR分子标记的方法是：利用X 2测验（p〈0. 05水平上）对 匕作图群体的电泳结果进行适合性检测，随后剔除偏分离严重（p〈0. 001水平上）的标记。
[0241] 本发明的优点是：本发明针对芥菜，筛选出112对基于转录组序列开发得到的SSR 引物，能对芥菜的SSR分子标记进行特异性扩增，建立了芥菜高效、准确的SSR分子标记的 技术体系。本发明针对芥菜提供了一种SSR遗传图谱构建方法，构建了第一个我国特有的 芥菜类蔬菜种质的SSR遗传图谱，为进一步进行QTL定位及分子标记辅助育种提供依据。
【附图说明】
[0242] 图1采用本发明方法构建的芥菜SSR遗传图谱LGl~LG17连锁群。
【具体实施方式】
[0243] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不用来限制本发明的范围，若未特别 说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0244] 实施例1 :
[0245] L材料获取
[0246] 以茎膨大的"浙桐一号"多年自交系榨菜为母本，茎不膨大的"邱隘大叶黄种雪里 蕻"多年自交系分蘖芥叶芥为父本。通过常规杂交获得F 1, F1通过自交获得F2群体。随机 选取&群体中的200株作为作图群体。
[0247] 2. DNA提取及检测
[0248] (1)将质量体积比为0. 02g/ml的CTAB抽提缓冲液在水浴锅中预热至65°C，加热 前加入β -巯基乙醇（缓冲液与β -巯基乙醇的体积比为100:2)。
[0249] (2)用液氮将研钵预冷，然后在冷冻条件下分别将两亲本、Fl及200株F2后代幼 嫩叶片充分磨碎，取粉末（约Ig)快速转入含ImL预热的CTAB提取液的灭菌离心管中，充 分混匀后65°C水浴45min，期间每隔IOmin轻轻振荡一次。注意：样品的量不能太多，否则 CTAB加入的量太少，细胞裂解不充分。
[0250] (3)保持温度在4°C以上，12000rpm离心20min，将上清转移到新的2mL离心管。注 意，温度太低则DNA容易和CTAB结合而沉淀。
[0251] (4)在上清中加入等体积预冷的氯仿-异戊醇（体积比为24:1)，将离心管缓慢颠 倒多次（约100次），使管内充分混勾。在4°c下，12000rpm离心10min ;将上清小心转到新 的1.5mL离心管中。注意：吸取2/3的上清即可。不能吸取太多，防止将氯仿-异戊醇或沉 淀吸入，降低DNA的纯度。
[0252] (5)加入上清体积2/3预冷的异丙醇，缓慢混匀（缓慢颠倒20次）。置于-20°C下 培养30min。
[0253] (6)在4°C下，13000rpm离心10min，弃上清，加入ImL预冷的体积比为70%乙醇洗 涤两次DNA沉淀，微干。
[0254] (7)加入 200 μ L TE 或 CldH2O (稍多加），溶解 DNA。
[0255] (8)加入 20 μ L IOmg · mL 1RNAse, 37°C 水浴 60min。
[0256] (9)加入200 μ L预冷的氯仿-异戊醇（体积比为24:1)混勾，静置lOmin，在4°C 下，12000rpm 离心 lOmin。
[0257] (10)取上清，加入上清1/10体积的3mol · PNaAc，上清2倍体积的无水乙 醇，-20°C放置30min或更长时间（0. 5-2h均可）（过夜沉淀DNA量更多，但可能会有杂质）， 在4°C下13000rpm，离心15min，取沉淀。
[0258] (11)用体积比为70%的冷乙醇沉淀2次，再用无水乙醇漂洗1次。置于超净工作 台吹干1-2h，或用冷冻真空干燥机抽干。
[0259] (12)加入50 μ L CldH2O或TE使沉淀溶解，置于-20 °C冰箱保存。
[0260] (13)取1 μ L DNA+99 μ L ddH20,以质量体积比0· 012g/ml的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的质量，同时用超微量核酸定量仪（NanoDrop 2000, German)检测DNA的含量及质量。 凝胶电泳结果显示条带清晰、完整、无拖尾、无降解，无蛋白和RNA污染，该DNA质量达到要 求。并且核酸定量仪显示A260nm/A280nm的值在1. 8左右，表明提取的DNA纯度较好。
[0261] 3.引物的获得及筛选
[0262] (1)榨菜转录组数据的获得
[0263] 采集一个半月苗龄的榨菜幼嫩叶片，用锡箔纸包裹并置于液氮罐里，速冻后置 于-70°C冰箱内保存。使用Trizol试剂提取榨菜的总RNA ;提取样品总RNA后，用带有 Oligo (dT)的磁珠富集mRNA ;利用mRNA反转录并合成双链cDNA，纯化cDNA，在cDNA末端添 加腺嘌呤核苷并连接测序接头，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收200-700bp片段，将回收得 到的片段进行PCR扩增，建立测序文库，用Illumina HiSeqTM2000对测序文库进行测序；根 据测序结果，从中选取已知方向的EST序列，共56, 822条EST序列，进行后续EST-SSR位点 的开发。
[0264] (2)榨菜EST序列中SSR位点识别：
[0265] 米用 SSRLocator(http://www. ufpel. tche. br/faem/fitotecnia/fitomel horamento/faleconosco.html)软件进行SSR位点的检测。先对上述步骤（1)中得到的序 列进行聚类去冗余，然后进行SSR位点的筛选。筛选标准包括：单核苷酸的重复次数大于或 等于16次，二核苷酸重复次数大于或等于6次，三核苷酸重复次数大于或等于5次，四、五 核苷酸重复次数大于或等于4次，六、七、八、九、十核苷酸重复次数大于或等于3次。同时 也筛选中间被少数碱基（间隔小于或等于5bp)打断的不完全重复的SSR位点。检索得到 8, 777 个 EST-SSR 位点。
[0266] (3)榨菜EST-SSR引物的设计与合成：
[0267] 依据上述步骤⑵得到的EST-SSR位点，采用SSRLocator软件进行SSR引物 设计。引物设计主要参数：引物长度控制在17_24bp，最佳长度为20bp ;GC含量控制在 30%-70%，最佳为50% ;退火温度控制在50-70°C，最佳为55°C ;预期产物长度控制在 100-280bp，最佳为200bp。共设计获得6, 127对引物。引物设计完成后随机选取520对引 物进行合成。
[0268] (4) SSR引物筛选
[0269] 以父母本及F1基因组DNA为模板，分别利用步骤（3)合成的520对引物，按照下 列反应体系和反应程序进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶检测PCR产物，选取多态性好、条带 清晰的引物。然后再次用双亲及F 1对筛选得到的引物进行验证，去除不稳定的标记。共获 得112对核心引物，如表1所示。
[0270]
[0274] I) PCR反应采用20 μ L反应体系，包括浓度为IOOng/ μ L的基因组DNA模板 1. 0 μ L，浓度为10 μ M的正向引物1. 0 μ L、浓度为10 μ M的反向引物1. 0 μ L，浓度为5U/μ L 的 Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，10 X PCR Buffer (Mg2+) 2. 5 μ L，浓度为 2. 5mM 的 dNTP 2 μ L，CldH2O 12. 3 μ L。扩增反应程序为：94°C预变性3min，进入35个循环，每个循环为94°C变性30S， 55°C退火30s，72°C延伸30s ;35个循环后再72°C延伸7min，最后4°C保存。
[0275] 2) PCR产物PAGE胶检测
[0276] PCR产物用质量体积比为0. 12g/ml的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
[0277] PAGE电泳及银染所用试剂和仪器如下：
[0278] ①质量体积比为0· 3g/ml的丙稀酰胺混合液（IOOmL) :29g丙稀酰（Acrylamide)， Ig N, Ν' -甲双丙稀酰胺（Bisacrylamide)，加入ddH20定容至100mL，37°C搅拌溶解，过滤 除杂，4°C下避光保存。
[0279] ②质量体积比为0· lg/ml的过硫酸胺（IOmL) :0· Ig过硫酸胺（Ammonium persulfate, APS)溶于ImL ddH20中，常温保存，使用不超过一周。
[0280] ③ 5XTBE 缓冲液（pH 8.3,500mL) :27g Tris，13.75g硼酸，1.86gNa2EDTA.H20,加 入ddH 20定容到500mL，4°C保存。
[0281] ④ TEMED (Ν'，Ν'，Ν'，Ν' -四甲基乙二胺）。
[0282] ⑤上样缓冲液：质量体积比为0. 0025g/ml的溴酚蓝，质量体积比为0. 4g/ml的蔗 糖水溶液，4°C贮存。
[0283] ⑥封底胶：质量体积比为0. 0lg/ml的琼脂糖溶液，用I XTBE配置。
[0284] ⑦染色液：无水乙醇50mL，硝酸银0. 5g，溶于dH20并定容至500mL。IC存于棕色瓶 中，室温保存，一般当天内使用。
[0285] ⑧显色液：氢氧化钠10g，溶于dH20并定容至500mL，室温保存。甲醛使用时再加， 浓度比例为2mL/500mL。
[0286] PAGE胶电泳的主要步骤：
[0287] ①将玻璃板、梳子、胶套、电泳槽等，用去污剂洗涤干净，自来水冲洗，酒精擦拭，晾 干。
[0288] ②将两块玻璃板插入橡胶套后，放入电泳槽中，使较低的玻璃板朝向负极（黑色 电极），内侧。保持电泳槽水平，双手以对角线的方式，拧紧电泳槽上的螺杆使玻璃板和橡胶 套稳固且密封。
[0289] ③将配置好的封底胶置于微波炉中加热煮沸，用胶头滴管吸取封底胶，将玻璃板 和橡胶套的外侧接缝封好，并将其中一块玻璃板底部的空隙封上。室温凝胶15-20min。
[0290] ④制胶（质量体积比为0· 12g/ml的聚丙烯酰胺凝胶）50mL : 19. 65mL ddH20+20mL 0.3g/ml的丙烯酰胺混合液+10mL5XTBE+350 μLAPS。在制备好的胶液中，加入35μL TEMED，迅速混匀。
[0291] ⑤灌胶：配好胶后，迅速用IOOmL注射器吸取凝胶溶液，调转注射器，排净进入针 管的空气。将注射器的针头插入两块玻璃板之间的空隙，注入丙烯酰胺溶 液，几乎注满空 隙。控制速度，减少气泡的产生，如有气泡，可用细铁丝赶走。
[0292] ⑥立即将合适的梳子轻轻插到凝胶中，用力均勾，小心勿使梳齿下留有气泡。梳子 的顶端应略高于玻璃板的上沿。
[0293] ⑦丙烯酰胺于室温聚合30-60min，冬天则放入30°C烘箱中。若凝胶回缩明显，应 补加溶液。凝胶完全聚合时可见梳齿下两条折光线。
[0294] ⑧拔梳子：用IXTBE浸润凝胶的顶端2_4min，小心拔出梳子，立即用IXTBE冲 洗一下加样孔，防止残留的少量丙烯酰胺溶液在加样孔聚合，梳孔不整齐。加入电泳液 (1XTBE)，外侧（正极）没过玻璃板7-8cm即可，内侧（负极）没过短玻璃板。
[0295] ⑨每20 μ L PCR产物中加2 μ L上样缓冲液，混勾，点样2 μ L。
[0296] ⑩电泳：240V，120mA，距到 2/3 处停下（约 I. 5h)。
[0297] PAGE胶的染色采用快速银染法，具体步骤如下：
[0298] ①染色：聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，卸下玻璃板，将凝胶转移至染色液中，室温 下于摇床上以40rpm振荡8-10min。
[0299] ②清洗：将凝胶转移置另一容器中，用dH20清洗凝胶2次，20-30s，第二次清洗 20-30s后，加入微量显色液，稍振荡后倒掉变黑的显色液。
[0300] ③显色：将凝胶转移置含500mL已配好的显色液中，室温下，以40rpm在摇床上振 荡至清晰带纹出现（约5min)。
[0301] ④清洗：倒尽显色液，并用dH20冲洗2-3次。
[0302] ⑤拍照：将PAGE胶小心的转移到白色底板上，并用吸水纸吸走多余的水分，拍照。
[0303] 4.芥菜SSR遗传图谱的构建
[0304] 构建芥菜SSR遗传图谱，具体包括：
[0305] (1)利用第2部分提取的亲本及200株F2作图群体的基因组DNA，利用第3部分筛 选获得的SSR引物，进行PCR反应。反应体系、反应程序及PCR产物检测与第3部分相同。
[0306] (2)根据电泳结果构建芥菜SSR遗传图谱
[0307] F2群体中，对共显性标记，与亲本榨菜相同带型记为A，与亲本叶芥相同带型记为 B，杂合子带型记为H;对显性标记，相同于榨菜的杂合带型（有带）记为c，纯合带（无带） 型记为a，相同于叶芥的杂合带型（有带）记为d，纯合带型（无带）记为b，缺失或模糊带 型记为对于能扩增出多位点或者双位点的标记来说，利用DNA片段的大小顺序在标记 的名称后面加上小写字母（a、b、c等）来区别。
[0308] 数据统计结束后，将植株编号与对应的标记基因型输入Excel表中。分析112对 弓丨物所产生的199个SSR标记在F2群体中的分离，利用X 2测验（p〈0. 05水平上）进行适 合性检测，其中59个标记发生了偏分离，去除部分偏分离较为严重（p〈0. 001)的标记共57 个。
[0309] 剔除偏分离分子标记后，利用Join Map 4. 0软件对142个标记进行连锁分 析，最终得到一张由116个SSR分子标记组成，平均图距为17. 92cM，覆盖基因组长度为 2061. OcM，包含17个连锁群的芥菜遗传图谱（图1和表2)。
[0310] 表2 SSR分子标记在分子遗传图谱上的分布
[0311]
[0312]
【主权项】
1.构建芥菜SSR遗传图谱的引物组，其特征在于，包括以下112对引物： BjSSROOOl正向引物SEQ ID NO. I :AAATCCCCAAAAACCTAGAG 反向引物SEQ ID NO. 113 :CTCATCCATCTCCTCGTCT BjSSR0002正向引物SEQ ID NO. 2 :CTTCGTTTGCGCGTTTT 反向引物SEQ ID NO. 114 :ATGATGGTCTCCITTTGITG BjSSR0004正向引物SEQ ID NO. 3 :AAGAAGTCGAGTAGTCGCAG 反向引物SEQ ID NO. 115 :AAACGAACAATACTTCCCG BjSSR0008正向引物SEQ ID NO. 4 :ATGGAGCACATCTCAAAGAC 反向引物SEQ ID NO. 116 :CITTTGITGTGATGACCCTT BjSSR0019正向引物SEQ ID NO. 5 :GAAACACAAACGCAGCA 反向引物SEQ ID NO. 117 :ACAGGCAITGTAGGAGACAC BjSSR0023正向引物SEQ ID NO. 6 :TAAGCAGAGAAAGAAATGGG 反向引物SEQ ID NO. 118 :AGATCTCTGGAGITGGGAGT BjSSR0166正向引物SEQ ID NO. 7 :GAACAACAACTCATCCACCT 反向引物SEQ ID NO. 119 :AGACTCGTTAITGATGCTGG BjSSR0234正向引物SEQ ID NO. 8 :ATTCTAATCACAACAACCGC 反向引物SEQ ID NO. 120 :ATGTAGTAGCCAAGGTGGTG BjSSR0312正向引物SEQ ID NO. 9 :AGAAGCTTGGTAAGACGACA 反向引物SEQ ID NO. 121 :ATGCTCGAAGCTITCTTATG BjSSR0364正向引物SEQ ID NO. 10 :ATCCCCTCGTTAAAACTCTC 反向引物SEQ ID NO. 122 :GATGITGAGGAGGTACTGGA BjSSR0486正向引物SEQ ID NO. 11 :TTCCAAATCATCTTCTCACC 反向引物SEQ ID NO. 123 :CGTCCAACACAACAAACATA BjSSR0513正向引物SEQ ID NO. 12 :ATCAAGAAAATGGAGCAAGA 反向引物SEQ ID NO. 124 :CTTCACTCTTGAACCTCTGG BjSSR0612正向引物SEQ ID NO. 13 :TCGATTCTGGTCTTGAGTTT 反向引物SEQ ID NO. 125 :GAGTTGTAGACCGGATCAAA BjSSR0613正向引物SEQ ID NO. 14 :TGAATTTGATCTCCGGTAAC 反向引物SEQ ID NO. 126 :ATTGCTGATCATACGGAAAC BjSSR0678正向引物SEQ ID NO. 15 :TCAGCTACGGATAGAAGAGC 反向引物SEQ ID NO. 127 :GGACTCACAITGATCGTCTT BjSSR0723正向引物SEQ ID NO. 16 :TAATGGCTTTGAAACTCTGC 反向引物SEQ ID NO. 128 :GGAAAGGAAGAGGITCTTGT BjSSR0731正向引物SEQ ID NO. 17 :CTCAAGAGGCTCAACACTTC 反向引物SEQ ID NO. 129 :TCCAITGCAACAATTAGACA BjSSR0806正向引物SEQ ID NO. 18 :GATGAAGAGAGAAGCGAAGA 反向引物SEQ ID NO. 130 :TCCGTGAAGAAGCTAATGAT BjSSR0891正向引物SEQ ID NO. 19 :GTTCTGAACGTTCTGGCTAC 反向引物SEQ ID NO. 131 :CATACACACGGTCTGATGAA BjSSR0913正向引物SEQ ID NO. 20 :AATCCTCAGACCTCAAAACA反向引物SEQ ID NO. 132 :GTAITCCTCGTAATCGITGG BjSSR0942正向引物SEQ ID N0.21 :AATCTGGCAGAACTCAGAGA 反向引物SEQ ID NO. 133 :TCGGTGTAAGCCATATCTTT BjSSR0967正向引物SEQ ID NO. 22 :GACCTCCTCCTGAAGTTTCT 反向引物SEQ ID NO. 134 :GCTGCAACTCACTTCTCTTT BjSSR1018正向引物SEQ ID NO. 23 :CAGTTGTGTCCATGTACGAG 反向引物SEQ ID NO. 135 :TTCCGATGTCTGATAACTCC BjSSRKMO正向引物SEQ ID N0.24:ACAAACAAATGGAAGACGAG 反向引物SEQ ID NO. 136 :AGATCGGAITTGATCTTGG BjSSR1215正向引物SEQ ID NO. 25 :AGGGTGAGATACGACGAGTA 反向引物SEQ ID NO. 137 :CITTCGmGGTCAITCATC BjSSR1289正向引物SEQ ID NO. 26 :CGAGAGCCTAGATCTGAGAA 反向引物SEQ ID NO. 138 :TAAACAAACGCCTTACCTTC BjSSR1365正向引物SEQ ID NO. 27 :TGAAAGTAGGCAACCGTATT 反向引物SEQ ID NO. 139 :CTCGCTTTACTCTCTGCAAT BjSSR1448正向引物SEQ ID NO. 28 :GAGGTTGTTTCTTTTCCCTT 反向引物SEQ ID NO. 140 :GAATCAGCTAITCATCGGAG BjSSR1474正向引物SEQ ID NO. 29 :ACTTTCCCTTACAATCCTCC 反向引物SEQ ID NO. 141 :GACTAGCAGCCTTCATCATC BjSSR1528正向引物SEQ ID NO. 30 :CGTTCTCTTCACTATGCTCC 反向引物SEQ ID NO. 142 :TCACATAGCCCATAAACACA BjSSR1594正向引物SEQ ID N0.31 :AACAAACCTCACAAACCAAC 反向引物SEQ ID NO. 143 :AITCTTCCACTCCCTTCTTC BjSSR1612正向引物SEQ ID NO. 32 :AGGAGGAGGAAGAAGACAAC 反向引物SEQ ID NO. 144 :TCGITTGATCGAACTTACCT BjSSR1764正向引物SEQ ID NO. 33 :AAAGTCATGAAGAATGTGGG 反向引物SEQ ID NO. 145 :AGAAGCTTGTCTCAACATGG BjSSR1799正向引物SEQ ID N0.34:GAAGTTTCCAACAAAACAGG 反向引物SEQ ID NO. 146 :GATTATGAACCACCGAGAGA BjSSR1811正向引物SEQ ID NO. 35 :TCACAACGCAAAATAAACAA 反向引物SEQ ID NO. 147 :CTTTCCATCCCATGTGTAGT BjSSR1812正向引物SEQ ID NO. 36 :TCAATATACAATCTTCGTGACTCT 反向引物SEQ ID NO. 148 :CAATAGGGATCATAACCGTC BjSSR1813正向引物SEQ ID NO. 37 :GCTGCTATAGCTGGTCACTC 反向引物SEQ ID NO. 149 :TCATCGITTGGITCTTCTTT BjSSR1831正向引物SEQ ID NO. 38 :ACTTGTTTCACTTCCAGCAT 反向引物SEQ ID NO. 150 :TTGmTGAITGTTATCCCC BjSSR1885正向引物SEQ ID NO. 39 :ACCACAAAAACACACCAAAC 反向引物SEQ ID NO. 151 :TCTCACTCCTCTATAACGGG BjSSR1926正向引物SEQ ID NO. 40 :TCCAGCAGCTTATTACCAGT 反向引物SEQ ID NO. 152 :GCACTTTAGCTGTTCTTGGT BjSSR1934正向引物SEQ ID N0.41 :TTTTCTCTTACCGAACCAAA 反向引物SEQ ID NO. 153 :GITTGAAGGAAGAAGTGTCG BjSSR1950正向引物SEQ ID NO. 42 :CCCTCGTCTTCTTAGGTCTT 反向引物SEQ ID NO. 154 :ATCAACCAITCCAGACAITC BjSSR1970正向引物SEQ ID NO. 43 :ATATCACCACCACCATTGTT 反向引物SEQ ID NO. 155 :TCCTCCACAATCTCCATTAC BjSSR1984正向引物SEQ ID NO. 44 :GCAATTGCTTTAATCTGTCC 反向引物SEQ ID NO. 156 :GAGGCAGGTATACAGATGCT BjSSR1985正向引物SEQ ID NO. 45 :GTTCTCCGACGTCTGTTCT 反向引物SEQ ID NO. 157 :nTCTGGmTCGAITTCAT BjSSR2017正向引物SEQ ID NO. 46 :CGTTGATTCCAACAAACC 反向引物SEQ ID NO. 158 :GAGITGATGAGAGAITTGGC BjSSR2113正向引物SEQ ID NO. 47 :CCTCAGTTTCAGAATCAAGC 反向引物SEQ ID NO. 159 :TCCGGAAGAGAGAATAACAA BjSSR2164正向引物SEQ ID NO. 48 :TCTCTTATCCTTTGGTCACG 反向引物SEQ ID NO. 160 :GGAAACGAAGACATAAGCTG BjSSR2184正向引物SEQ ID NO. 49 :GGATTCGTGTTTGAGTTGTT 反向引物SEQ ID NO. 161 :TTCCCAGAAGAAGAAGATCA BjSSR2234正向引物SEQ ID NO. 50 :TACACCGTCTGATTCCATCT 反向引物SEQ ID NO. 162 :GGGITCGAGATACCACAATA BjSSR2235正向引物SEQ ID N0.51 :CGCTTACACCTTTCTTGAAT 反向引物SEQ ID NO. 163 :CGAAGITCAAAITTCCAATC BjSSR2247正向引物SEQ ID NO. 52 :ACAAGTACAGTGGAGGGATG 反向引物SEQ ID NO. 164 :CAGACCACCTGITGGTATCT BjSSR2272正向引物SEQ ID NO. 53 :AAGATCTAGGGTTTCTTCGC 反向引物SEQ ID NO. 165 :CGAAGAGCTTCTGAGTGAAT BjSSR2285正向引物SEQ ID N0.54:CAACCTTTCTTTCTTACGCA 反向引物SEQ ID NO. 166 :TTAAGAGAAACCCACCAAAA BjSSR2449正向引物SEQ ID NO. 55 :TGCATAACCACCATAGAACA 反向引物SEQ ID NO. 167 :ATCAAGTGCTGCGTATAGGT BjSSR2450 正向引物SEQ ID NO. 56 :CTCCTCTTCTCCAGAGGATT 反向引物SEQ ID NO. 168 :GAGGAGGAAGGGAAGAGTC BjSSR2464正向引物SEQ ID NO. 57 :CTCTCGTGGACAGAGAAAAC 反向引物SEQ ID NO. 169 :GATCACTTCACCAITCTGCT BjSSR2519正向引物SEQ ID NO. 58 :AAGTGGAAGAAGAAGTGGGT 反向引物SEQ ID NO. 170 :CGCTAGGAGAAAGACTCTCA BjSSR2669正向引物SEQ ID NO. 59 :GAAGATGGTGGCAGCTATAC反向引物SEQ ID NO. 171 :TAAGAAGACAGAGCCAAAGC BjSSR2743正向引物SEQ ID NO. 60 :GTCGGGTCAGGTTAGTTACA 反向引物SEQ ID NO. 172 :CAGAACCTCCAAAAGITGAG BjSSR2763正向引物SEQ ID NO. 61 :CAAACCCATAGAGAAAGACG 反向引物SEQ ID NO. 173 :TCGGAGACGAACTTAGAGAG BjSSR2886正向引物SEQ ID NO. 62 :TCCCCGCCTCCCTTCAC 反向引物SEQ ID NO. 174 :GTCTCCGAGTAAGACGTCAG BjSSR2910正向引物SEQ ID NO. 63 :AATCCTATGGCACAGATGAC 反向引物SEQ ID NO. 175 :TGATCTTGGATCGATAGCTT BjSSR2957正向引物SEQ ID NO. 64 :TCTGAACTCGTCGTCTCTCT 反向引物SEQ ID NO. 176 :TTAAGCACAGTGITGAGTGC BjSSR3033正向引物SEQ ID NO. 65 :ATACAGTTTCTGCGATTTGG 反向引物SEQ ID NO. 177 :ACTGCGAGTGAAAGAAGAAG BjSSR3109正向引物SEQ ID NO. 66 :AAATCAGGAGAGAAAGGGTC 反向引物SEQ ID NO. 178 :AAAGCTGCTTAAITTCGGAT BjSSR3137正向引物SEQ ID NO. 67 :AAGAGATGGATCTTGGTGTG 反向引物SEQ ID NO. 179 :GAATCTTCCTCATCTGCTTG BjSSR3227正向引物SEQ ID NO. 68 :CTGTTCATCTTCGTCTCCTC 反向引物SEQ ID NO. 180 :ACTTCTCTGTCTTCGGITGA BjSSR3364正向引物SEQ ID NO. 69 :TTCCCTATTCAGTGATCTGC 反向引物SEQ ID NO. 181 :CAAACCAGCCTCTCTGG BjSSR3426正向引物SEQ ID NO. 70 :AGATTTTCTCGCGAGTATTG 反向引物SEQ ID NO. 182 :TGAGAGAGAGAGCCTGAGAG BjSSR3445正向引物SEQ ID N0.71 :TCAAGCTAAGAGGCTTTCAC 反向引物SEQ ID NO. 183 :GAGACAITGGAACCAACCTA BjSSR3488正向引物SEQ ID NO. 72 :CTGTGATTTCCCAATTTTCT 反向引物SEQ ID NO. 184 :CAITTCTTCTTCAAGATCCG BjSSR3505正向引物SEQ ID NO. 73 :AGGAGGAGGAGACAGAAGAC 反向引物SEQ ID NO. 185 :ACCAACAGCACAAGAGAAGT BjSSR3613正向引物SEQ ID N0.74:ACAGAGGTTTCCATCATCAG 反向引物SEQ ID NO. 186 :CCTmGGTCTGAGITTCTG BjSSR3652正向引物SEQ ID NO. 75 :GTGATATTAAATTCGCCGTC 反向引物SEQ ID NO. 187 :CAITGCCATCTCTCTCTCTC BjSSR3690正向引物SEQ ID NO. 76 :GCGAGTTTTCCTCTTCTTC 反向引物SEQ ID NO. 188 :GAITTCCGATTAGGGITGTT BjSSR3876正向引物SEQ ID NO. 77 :AACAGAGCTTAAACCAAACG 反向引物SEQ ID NO. 189 :AACCTCCGAGAAACCGT BjSSR3885正向引物SEQ ID NO. 78 :ATCGTTAGTAGCACCTCCAA 反向引物SEQIDNO. 190:TGTCTTCTCATGTCTCCCTC BjSSR3914 正向引物SEQIDNO. 79:CAACCCATCTCTGTTCAAGT 反向引物SEQIDNO. 191:CAAGGGACTATCGACGTAAG BjSSR3915 正向引物SEQIDNO. 80:AGGGAAGGAAAGTTTGAGAC 反向引物SEQIDNO. 192:AGCACAACCCAITTATGITC BjSSR3969 正向引物SEQIDNO. 81:AGTCCCTTTGCTCTTCTTCT 反向引物SEQIDNO. 193:ITGGTCTTTGGTCTACCATC BjSSR3988 正向引物SEQIDNO. 82:TCTCTATCCCTCACATCTCG 反向引物SEQIDNO. 194:AGGAGGATGAAAAGAAGAGG BjSSR4254 正向引物SEQIDNO. 83:TACCCACAAGTGAAATCTCC 反向引物SEQIDNO. 195:ATCACCTCCACGTACTCAAC BjSSR4315 正向引物SEQIDNO. 84:AAAACGTTTACAACGGAGAA 反向引物SEQIDNO. 196:TTGGATACGCAAAAGAGAAT BjSSR4351 正向引物SEQIDNO. 85:ACGCAAATTCGATATACACC 反向引物SEQIDNO. 197:CGATGATGAAGAAGAGGAAG BjSSR4366 正向引物SEQIDNO. 86:ACATTACCACTGTTGAAGCC 反向引物SEQIDNO. 198:GGAGCGTTAGATGTGGTTAC BjSSR4391 正向引物SEQIDNO. 87:AGAGGACGAGAGTGTGAGAA 反向引物SEQIDNO. 199:GACTTAGGGCTCITTGGITT BjSSR4514 正向引物SEQIDNO. 88:TACTATGAAGAGCAGCAGCA 反向引物SEQIDNO. 200:ATCTATCGAACGATGACCAC BjSSR4587 正向引物SEQIDNO. 89:CTCAGCTCTCCTTACTTCCA 反向引物SEQIDNO. 201:AGAGGAGGAACCATCGTTAG BjSSR4628 正向引物SEQIDNO. 90:ACTTCACGTTGCTCATCTCT 反向引物SEQIDNO. 202:AAGAAGCTAACCGTCTTCCT BjSSR4662 正向引物SEQIDNO. 91:CATTATCTTCGAAAGACCAAA 反向引物SEQIDNO. 203:CGTACTGGTGAGGGTACATC BjSSR4707 正向引物SEQIDNO. 92:TCTCTGATCAGGATGGTAGG 反向引物SEQIDN0.204:ATGGTTAGATGATGCTGGTC BjSSR4811 正向引物SEQIDNO. 93:GAACTTTCTCAATGCCTGTC 反向引物SEQIDNO. 205:GAGAAGTCACCAAAGACGTG BjSSR4854 正向引物SEQIDNO. 94:CTTCAGTTCAAACCTTCGAC 反向引物SEQIDNO. 206:GITGAITGATGITGCTGATG BjSSR4873 正向引物SEQIDNO. 95:AGTCCTCTTTCTCAGGGAAC 反向引物SEQIDNO. 207:TCTGCAACAITGAGITCTTG BjSSR4957 正向引物SEQIDNO. 96:TGGTGGAAGAAATAATGGTC 反向引物SEQIDNO. 208:GAGAGGGTGACAGGAGTACA BjSSR5151 正向引物SEQIDNO. 97:ATGATAAGAGTTGGAAACGC 反向引物SEQIDNO. 209:GTCTCTTCCTTCTCCGITCT BjSSR5176 正向引物SEQIDNO. 98:GATTGCGATGATTTGGTAAT反向引物SEQIDNO. 210:GAGTTCTATGCTTCGGACAG BjSSR5177 正向引物SEQIDNO. 99:TGGGTCTCTTCACAAGAATC 反向引物SEQIDNO. 211:ATAGATGACCATCAACGGAG BjSSR5206 正向引物SEQIDNO. 100:CTACAATTCACCACCTCCAC 反向引物SEQIDNO. 212:GGTGAGTACTCTATGCAGGG BjSSR5224 正向引物SEQIDNO. 101:CTATAGGCTCCTTCTACGCA 反向引物SEQIDNO. 213:TGTTTAGirGTGITTCGCTG BjSSR5269 正向引物SEQIDNO. 102:ACACAAACCCAAGAACACTC 反向引物SEQIDN0.214:GAGTAGACATAGCTGGGACG BjSSR5270 正向引物SEQIDNO. 103:AATCAAGCAAACCTTCTACT 反向引物SEQIDNO. 215:TCCAACAAACAAACACAGAA BjSSR5340 正向引物SEQIDNO. 104:AGGAAGAGAGGCGTAAAAGT 反向引物SEQIDNO. 216:TCCTATCTCTCTCCTCCCTC BjSSR5342 正向引物SEQIDNO. 105:ACGGATCAACACAAGAAATC 反向引物SEQIDNO. 217:ATCACATCATCACCACCTTT BjSSR5411 正向引物SEQIDNO. 106:CAGTCTGGTACTCCAAGAGC 反向引物SEQIDNO. 218:TAITTGCAGACGAAACCTCT BjSSR5542 正向引物SEQIDNO. 107:TAGGTAATGGAAGGAGCAAA 反向引物SEQIDNO. 219:TCCTACAACAATGTCACGAA BjSSR5854 正向引物SEQIDNO. 108:AGCATACTCTTCTTCGACCA 反向引物SEQIDNO. 220:GITGCCATAAACCTGATGAT BjSSR5877 正向引物SEQIDNO. 109:GAAGAGAGTCAACAACAGCC 反向引物SEQIDNO. 221:ITCACTTCGACATCCTTCTT BjSSR5921 正向引物SEQIDNO. 110:GTCGCAAGGAATCATCTAAC 反向引物SEQIDNO. 222:GTACACAAAGGACCAACCAC BjSSR5941 正向引物SEQIDNO.Ill:AAAAGCTTCTCTTGCTGATG 反向引物SEQIDNO. 223:TGCTGAGTCTGITGCTGTAG BjSSR5990 正向引物SEQIDNO. 112:TTCGTTTTAGCGTCTCTCTC 反向引物SEQIDNa224:GAAmTTGCAACAGCITTC。2. -种用权利要求I所述的引物组构建芥菜SSR遗传图谱的方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 取不同芥菜种为亲本进行杂交，获得Fl代，然后将Fl代进行自交获得&代，随机 选取200株F2代作为作图群体； (2) 提取亲本及F2代的基因组DNA; (3) 分别用112对引物PCR扩增亲本基因组DNA和F2代的基因组DNA; (4) 利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建芥菜SSR遗传图谱。3. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，在所述步骤 (1)中，所述芥菜亲本中，母本为榨菜，其为"浙桐一号"多年自交系，父本为叶芥，其为"邱 隘大叶黄种雪里蕻"多年自交系分蘖芥。4. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，在所述步骤 (2)中，选取一个半月苗龄的幼嫩叶片进行基因组DNA的提取。5. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于：在所述步 骤⑵中，采用CTAB法提取基因组DNA。6. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，在所述步 骤⑶中，所述PCR反应采用20yL反应体系，包括浓度为IOOng/yL的基因组DNA模板 I.OyL，浓度为IOyM的正向引物LOyL、浓度为IOyM的反向引物LOyL，浓度为5U/ yL的TaqDNA聚合酶 0? 2yL，10XPCRBuffer(Mg2+) 2. 5yL，浓度为 2. 5mM的dNTP2yL， CldH2O12. 3yL;扩增反应程序为：94°C预变性3min，进入35个循环，每个循环为94°C变性 30S，55°C退火30s，72°C延伸30s;35个循环后再72°C延伸7min，4°C保存。7. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，在所述步骤 (4)中，对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳：PCR产物加入2yLloadingbuffer，以 20bpDNAladder为DNA分子量标准，采用质量体积比为0. 12g/ml的非变性聚丙稀酰胺凝 胶进行电泳，电泳缓冲液为IXTBE，240V稳压电泳I. 5h。电泳结束后，采用银染法染色，最 后将凝胶拍照；根据电泳结果剔除偏分离的SSR分子标记，再利用生物学软件JoinMap4.0 构建芥菜SSR遗传图谱。8. 根据权利要求7所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，剔除偏分 离SSR分子标记的方法是：利用X2测验（p〈〇. 05水平上）对？2作图群体的电泳结果进行 适合性检测，随后剔除偏分离严重（P〈〇. 001水平上）的标记。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及构建芥菜SSR遗传图谱的引物组及遗传图谱的构建方法。其是基于榨菜转录组序列信息开发得到的EST-SSR引物组，所述引物组包含112对多态性引物。以茎膨大的“浙桐一号”多年自交系为母本，以茎不膨大的“邱隘大叶黄种雪里蕻”多年自交系分蘖芥为父本，通过杂交获得F1后代，然后F1自交获得F2作图群体。利用112对多态性引物通过两亲本及200株F2群体，构建芥菜遗传图谱。本发明构建了第一个我国特有的芥菜类蔬菜种质的SSR遗传图谱，为进一步进行QTL定位以及分子标记辅助育种提供了依据。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11, C12N15/10
【公开号】CN104894110
【申请号】CN201510246083
【发明人】陈利萍, 李俊星, 邹晓霞, 曹丽雯, 于宁宁
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月14日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子标记技术，具体涉及构建芥菜SSR遗传图谱的引物组及遗传 图谱的构建方法。
【背景技术】
[0002] 芥菜（B. juncea)是十字花科芸薹属的一种重要栽培作物，作为蔬菜、油料和调味 品，该物种在世界范围内广泛栽培。目前常见的芥菜类作物包括芥菜型油菜、调味品籽芥 菜、菜用芥菜及其变种等，并且不同芥菜类作物之间的生物学差异很大。农艺性状都受多基 因控制，其遗传改良较为复杂。通过分子标记对芥菜进行早期选择、预测，利用遗传图谱，把 优良的基因分离出来，对多基因控制的复杂的性状进行遗传改良，可以提高目标基因的选 择效率，加速育种进程。
[0003] 目前，随着分子标记的发展与应用，越来越多的芥菜遗传图谱完成构建，其中应 用较多的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP等，但这些标记大多是采用无全基因组序列信息 的技术开发得到，表现出随机性强、稳定性差等缺点。而简单重复序列（simple sequence repeat，SSR)标记具有重复性好、稳定性强、多态性高、共显性遗传和基因组中普遍存在等 优点，广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析及分子标记辅助育种等研宄。而目前SSR 分子标记在芥菜中的应用报道很少，并且其中大多以籽用芥菜即芥菜型油菜为材料，少数 以调味用芥菜为材料。还未见以我国特有蔬菜类芥菜为材料的SSR遗传图谱构建的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供构建芥菜SSR遗传图谱的引物组及遗 传图谱的构建方法，所述引物组能特异地扩增出芥菜中含有的SSR分子标记，利用这些SSR 分子标记能构建芥菜的SSR遗传图谱。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：构建芥菜SSR遗传图谱的引物组，包 括以下112对引物：
[0006] BjSSROOOl 正向引物 SEQ ID NO. I :AAATCCCCAAAAACCTAGAG
[0007] 反向引物 SEQ ID NO. 113 :CTCATCCATCTCCTCGTCT
[0008] BjSSR0002 正向引物 SEQ ID NO. 2 :CTTCGTTTGCGCGTTTT
[0009] 反向引物 SEQ ID NO. 114 :ATGATGGTCTCCTTTTGTTG
[0010] BjSSR0004 正向引物 SEQ ID NO. 3 :AAGAAGTCGAGTAGTCGCAG
[0011] 反向引物 SEQ ID NO. 115 :AAACGAACAATACTTCCCG
[0012] BjSSR0008 正向引物 SEQ ID NO. 4 :ATGGAGCACATCTCAAAGAC
[0013] 反向引物 SEQ ID NO. 116 :CTTTTGTTGTGATGACCCTT
[0014] BjSSR0019 正向引物 SEQ ID NO. 5 :GAAACACAAACGCAGCA
[0015] 反向引物 SEQ ID NO. 117 :ACAGGCATTGTAGGAGACAC
[0016] BjSSR0023 正向引物 SEQ ID NO. 6 :TAAGCAGAGAAAGAAATGGG
[0017] 反向引物 SEQ ID NO. 118 :AGATCTCTGGAGTTGGGAGT
[0018] BjSSR0166 正向引物 SEQ ID NO. 7 :GAACAACAACTCATCCACCT
[0019] 反向引物 SEQ ID NO. 119 :AGACTCGTTATTGATGCTGG
[0020] BjSSR0234 正向引物 SEQ ID NO. 8 :ATTCTAATCACAACAACCGC
[0021] 反向引物 SEQ ID NO. 120 :ATGTAGTAGCCAAGGTGGTG
[0022] BjSSR0312 正向引物 SEQ ID NO. 9 :AGAAGCTTGGTAAGACGACA
[0023] 反向引物 SEQ ID NO. 121 :ATGCTCGAAGCTTTCTTATG
[0024] BjSSR0364 正向引物 SEQ ID NO. 10 :ATCCCCTCGTTAAAACTCTC
[0025] 反向引物 SEQ ID NO. 122 :GATGTTGAGGAGGTACTGGA
[0026] BjSSR0486 正向引物 SEQ ID NO. 11 :TTCCAAATCATCTTCTCACC
[0027] 反向引物 SEQ ID NO. 123 :CGTCCAACACAACAAACATA
[0028] BjSSR0513 正向引物 SEQ ID NO. 12 :ATCAAGAAAATGGAGCAAGA
[0029] 反向引物 SEQ ID NO. 124 :CTTCACTCTTGAACCTCTGG
[0030] BjSSR0612 正向引物 SEQ ID NO. 13 :TCGATTCTGGTCTTGAGTTT
[0031] 反向引物 SEQ ID NO. 125 :GAGTTGTAGACCGGATCAAA
[0032] BjSSR0613 正向引物 SEQ ID NO. 14 :TGAATTTGATCTCCGGTAAC
[0033] 反向引物 SEQ ID NO. 126 :ATTGCTGATCATACGGAAAC
[0034] BjSSR0678 正向引物 SEQ ID NO. 15 :TCAGCTACGGATAGAAGAGC
[0035] 反向引物 SEQ ID NO. 127 :GGACTCACATTGATCGTCTT
[0036] BjSSR0723 正向引物 SEQ ID NO. 16 :TAATGGCTTTGAAACTCTGC
[0037] 反向引物 SEQ ID NO. 128 :GGAAAGGAAGAGGTTCTTGT
[0038] BjSSR0731 正向引物 SEQ ID NO. 17 :CTCAAGAGGCTCAACACTTC
[0039] 反向引物 SEQ ID NO. 129 :TCCATTGCAACAATTAGACA
[0040] BjSSR0806 正向引物 SEQ ID NO. 18 :GATGAAGAGAGAAGCGAAGA
[0041] 反向引物 SEQ ID NO. 130 :TCCGTGAAGAAGCTAATGAT
[0042] BjSSR0891 正向引物 SEQ ID NO. 19 :GTTCTGAACGTTCTGGCTAC
[0043] 反向引物 SEQ ID NO. 131 :CATACACACGGTCTGATGAA
[0044] BjSSR0913 正向引物 SEQ ID NO. 20 :AATCCTCAGACCTCAAAACA
[0045] 反向引物 SEQ ID NO. 132 :GTATTCCTCGTAATCGTTGG
[0046] BjSSR0942 正向引物 SEQ ID NO. 21 :AATCTGGCAGAACTCAGAGA
[0047] 反向引物 SEQ ID NO. 133 :TCGGTGTAAGCCATATCTTT
[0048] BjSSR0967 正向引物 SEQ ID NO. 22 :GACCTCCTCCTGAAGTTTCT
[0049] 反向引物 SEQ ID NO. 134 :GCTGCAACTCACTTCTCTTT
[0050] BjSSRlOl8 正向引物 SEQ ID NO. 23 :CAGTTGTGTCCATGTACGAG
[0051] 反向引物 SEQ ID NO. 135 :TTCCGATGTCTGATAACTCC
[0052] BjSSRKMO 正向引物 SEQ ID NO. 24 :ACAAACAAATGGAAGACGAG
[0053] 反向引物 SEQ ID NO. 136 :AGATCGGATTTGATCTTGG
[0054] BjSSR1215 正向引物 SEQ ID NO. 25 :AGGGTGAGATACGACGAGTA
[0055] 反向引物 SEQ ID NO. 137 :CTTTCGTTTGGTCATTCATC
[0056] BjSSR1289 正向引物 SEQ ID NO. 26 :CGAGAGCCTAGATCTGAGAA
[0057] 反向引物 SEQ ID NO. 138 :TAAACAAACGCCTTACCTTC
[0058] BjSSR1365 正向引物 SEQ ID NO. 27 :TGAAAGTAGGCAACCGTATT
[0059] 反向引物 SEQ ID NO. 139 :CTCGCTTTACTCTCTGCAAT
[0060] BjSSR1448 正向引物 SEQ ID NO. 28 :GAGGTTGTTTCTTTTCCCTT
[0061] 反向引物 SEQ ID NO. 140 :GAATCAGCTATTCATCGGAG
[0062] BjSSR1474 正向引物 SEQ ID NO. 29 :ACTTTCCCTTACAATCCTCC
[0063] 反向引物 SEQ ID NO. 141 :GACTAGCAGCCTTCATCATC
[0064] BjSSR1528 正向引物 SEQ ID NO. 30 :CGTTCTCTTCACTATGCTCC
[0065] 反向引物 SEQ ID NO. 142 :TCACATAGCCCATAAACACA
[0066] BjSSR1594 正向引物 SEQ ID NO. 31 :AACAAACCTCACAAACCAAC
[0067] 反向引物 SEQ ID NO. 143 :ATTCTTCCACTCCCTTCTTC
[0068] BjSSR1612 正向引物 SEQ ID NO. 32 :AGGAGGAGGAAGAAGACAAC
[0069] 反向引物 SEQ ID NO. 144 :TCGTTTGATCGAACTTACCT
[0070] BjSSR1764 正向引物 SEQ ID NO. 33 :AAAGTCATGAAGAATGTGGG
[0071] 反向引物 SEQ ID NO. 145 :AGAAGCTTGTCTCAACATGG
[0072] BjSSR1799 正向引物 SEQ ID NO. 34 :GAAGTTTCCAACAAAACAGG
[0073] 反向引物 SEQ ID NO. 146 :GATTATGAACCACCGAGAGA
[0074] BjSSR1811 正向引物 SEQ ID NO. 35 :TCACAACGCAAAATAAACAA
[0075] 反向引物 SEQ ID NO. 147 :CTTTCCATCCCATGTGTAGT
[0076] BjSSR1812 正向引物 SEQ ID NO. 36 :TCAATATACAATCTTCGTGACTCT
[0077] 反向引物 SEQ ID NO. 148 :CAATAGGGATCATAACCGTC
[0078] BjSSR1813 正向引物 SEQ ID NO. 37 :GCTGCTATAGCTGGTCACTC
[0079] 反向引物 SEQ ID NO. 149 :TCATCGTTTGGTTCTTCTTT
[0080] BjSSR1831 正向引物 SEQ ID NO. 38 :ACTTGTTTCACTTCCAGCAT
[0081] 反向引物 SEQ ID NO. 150 :TTGTTTTGATTGTTATCCCC
[0082] BjSSR1885 正向引物 SEQ ID NO. 39 :ACCACAAAAACACACCAAAC
[0083] 反向引物 SEQ ID NO. 151 :TCTCACTCCTCTATAACGGG
[0084] BjSSR1926 正向引物 SEQ ID NO. 40 :TCCAGCAGCTTATTACCAGT
[0085] 反向引物 SEQ ID NO. 152 :GCACTTTAGCTGTTCTTGGT
[0086] BjSSR1934 正向引物 SEQ ID NO. 41 :TTTTCTCTTACCGAACCAAA
[0087] 反向引物 SEQ ID NO. 153 :GTTTGAAGGAAGAAGTGTCG
[0088] BjSSR1950 正向引物 SEQ ID NO. 42 :CCCTCGTCTTCTTAGGTCTT
[0089] 反向引物 SEQ ID NO. 154 :ATCAACCATTCCAGACATTC
[0090] BjSSR1970 正向引物 SEQ ID NO. 43 :ATATCACCACCACCATTGTT
[0091] 反向引物 SEQ ID NO. 155 :TCCTCCACAATCTCCATTAC
[0092] BjSSR1984 正向引物 SEQ ID NO. 44 :GCAATTGCTTTAATCTGTCC
[0093] 反向引物 SEQ ID NO. 156 :GAGGCAGGTATACAGATGCT
[0094] BjSSR1985 正向引物 SEQ ID NO. 45 :GTTCTCCGACGTCTGTTCT
[0095] 反向引物 SEQ ID NO. 157 :TTTCTGGTTTTCGATTTCAT
[0096] BjSSR2017 正向引物 SEQ ID NO. 46 :CGTTGATTCCAACAAACC
[0097] 反向引物 SEQ ID NO. 158 :GAGTTGATGAGAGATTTGGC
[0098] BjSSR2113 正向引物 SEQ ID NO. 47 :CCTCAGTTTCAGAATCAAGC
[0099] 反向引物 SEQ ID NO. 159 :TCCGGAAGAGAGAATAACAA
[0100] BjSSR2164 正向引物 SEQ ID NO. 48 :TCTCTTATCCTTTGGTCACG
[0101] 反向引物 SEQ ID NO. 160 :GGAAACGAAGACATAAGCTG
[0102] BjSSR2184 正向引物 SEQ ID NO. 49 :GGATTCGTGTTTGAGTTGTT
[0103] 反向引物 SEQ ID NO. 161 :TTCCCAGAAGAAGAAGATCA
[0104] BjSSR2234 正向引物 SEQ ID NO. 50 :TACACCGTCTGATTCCATCT
[0105] 反向引物 SEQ ID NO. 162 :GGGTTCGAGATACCACAATA
[0106] BjSSR2235 正向引物 SEQ ID NO. 51 :CGCTTACACCTTTCTTGAAT
[0107] 反向引物 SEQ ID NO. 163 :CGAAGTTCAAATTTCCAATC
[0108] BjSSR2247 正向引物 SEQ ID NO. 52 :ACAAGTACAGTGGAGGGATG
[0109] 反向引物 SEQ ID NO. 164 :CAGACCACCTGTTGGTATCT
[0110] BjSSR2272 正向引物 SEQ ID NO. 53 :AAGATCTAGGGTTTCTTCGC
[0111] 反向引物 SEQ ID NO. 165 :CGAAGAGCTTCTGAGTGAAT
[0112] BjSSR2285 正向引物 SEQ ID NO. 54 :CAACCTTTCTTTCTTACGCA
[0113] 反向引物 SEQ ID NO. 166 :TTAAGAGAAACCCACCAAAA
[0114] BjSSR2449 正向引物 SEQ ID NO. 55 :TGCATAACCACCATAGAACA
[0115] 反向引物 SEQ ID NO. 167 :ATCAAGTGCTGCGTATAGGT
[0116] BjSSR2450 正向引物 SEQ ID NO. 56 :CTCCTCTTCTCCAGAGGATT
[0117] 反向引物 SEQ ID NO. 168 :GAGGAGGAAGGGAAGAGTC
[0118] BjSSR2464 正向引物 SEQ ID NO. 57 :CTCTCGTGGACAGAGAAAAC
[0119] 反向引物 SEQ ID NO. 169 :GATCACTTCACCATTCTGCT
[0120] BjSSR2519 正向引物 SEQ ID NO. 58 :AAGTGGAAGAAGAAGTGGGT
[0121] 反向引物 SEQ ID NO. 170 :CGCTAGGAGAAAGACTCTCA
[0122] BjSSR2669 正向引物 SEQ ID NO. 59 :GAAGATGGTGGCAGCTATAC
[0123] 反向引物 SEQ ID NO. 171 :TAAGAAGACAGAGCCAAAGC
[0124] BjSSR2743 正向引物 SEQ ID NO. 60 :GTCGGGTCAGGTTAGTTACA
[0125] 反向引物 SEQ ID NO. 172 :CAGAACCTCCAAAAGTTGAG
[0126] BjSSR2763 正向引物 SEQ ID NO. 61 :CAAACCCATAGAGAAAGACG
[0127] 反向引物 SEQ ID NO. 173 :TCGGAGACGAACTTAGAGAG
[0128] BjSSR2886 正向引物 SEQ ID NO. 62 :TCCCCGCCTCCCTTCAC
[0129] 反向引物 SEQ ID NO. 174 :GTCTCCGAGTAAGACGTCAG
[0130] BjSSR2910 正向引物 SEQ ID NO. 63 :AATCCTATGGCACAGATGAC
[0131] 反向引物 SEQ ID NO. 175 :TGATCTTGGATCGATAGCTT
[0132] BjSSR2957 正向引物 SEQ ID NO. 64 :TCTGAACTCGTCGTCTCTCT
[0133] 反向引物 SEQ ID NO. 176 :TTAAGCACAGTGTTGAGTGC
[0134] BjSSR3033 正向引物 SEQ ID NO. 65 :ATACAGTTTCTGCGATTTGG
[0135] 反向引物 SEQ ID NO. 177 :ACTGCGAGTGAAAGAAGAAG
[0136] BjSSR3109 正向引物 SEQ ID NO. 66 :AAATCAGGAGAGAAAGGGTC
[0137] 反向引物 SEQ ID NO. 178 :AAAGCTGCTTAATTTCGGAT
[0138] BjSSR3137 正向引物 SEQ ID NO. 67 :AAGAGATGGATCTTGGTGTG
[0139] 反向引物 SEQ ID NO. 179 :GAATCTTCCTCATCTGCTTG
[0140] BjSSR3227 正向引物 SEQ ID NO. 68 :CTGTTCATCTTCGTCTCCTC
[0141] 反向引物 SEQ ID NO. 180 :ACTTCTCTGTCTTCGGTTGA
[0142] BjSSR3364 正向引物 SEQ ID NO. 69 :TTCCCTATTCAGTGATCTGC
[0143] 反向引物 SEQ ID NO. 181 :CAAACCAGCCTCTCTGG
[0144] BjSSR3426 正向引物 SEQ ID NO. 70 :AGATTTTCTCGCGAGTATTG
[0145] 反向引物 SEQ ID NO. 182 :TGAGAGAGAGAGCCTGAGAG
[0146] BjSSR3445 正向引物 SEQ ID NO. 71 :TCAAGCTAAGAGGCTTTCAC
[0147] 反向引物 SEQ ID NO. 183 :GAGACATTGGAACCAACCTA
[0148] BjSSR3488 正向引物 SEQ ID NO. 72 :CTGTGATTTCCCAATTTTCT
[0149] 反向引物 SEQ ID NO. 184 :CATTTCTTCTTCAAGATCCG
[0150] BjSSR3505 正向引物 SEQ ID NO. 73 :AGGAGGAGGAGACAGAAGAC
[0151] 反向引物 SEQ ID NO. 185 :ACCAACAGCACAAGAGAAGT
[0152] BjSSR3613 正向引物 SEQ ID NO. 74 :ACAGAGGTTTCCATCATCAG
[0153] 反向引物 SEQ ID NO. 186 :CCTTTTGGTCTGAGTTTCTG
[0154] BjSSR3652 正向引物 SEQ ID NO. 75 :GTGATATTAAATTCGCCGTC
[0155] 反向引物 SEQ ID NO. 187 :CATTGCCATCTCTCTCTCTC
[0156] BjSSR3690 正向引物 SEQ ID NO. 76 :GCGAGTTTTCCTCTTCTTC
[0157] 反向引物 SEQ ID NO. 188 :GATTTCCGATTAGGGTTGTT
[0158] BjSSR3876 正向引物 SEQ ID NO. 77 :AACAGAGCTTAAACCAAACG
[0159] 反向引物 SEQ ID NO. 189 :AACCTCCGAGAAACCGT
[0160] BjSSR3885 正向引物 SEQ ID NO. 78 :ATCGTTAGTAGCACCTCCAA
[0161] 反向引物 SEQ ID NO. 190 :TGTCTTCTCATGTCTCCCTC
[0162] BjSSR3914 正向引物 SEQ ID NO. 79 :CAACCCATCTCTGTTCAAGT
[0163] 反向引物 SEQ ID NO. 191 :CAAGGGACTATCGACGTAAG
[0164] BjSSR3915 正向引物 SEQ ID NO. 80 :AGGGAAGGAAAGTTTGAGAC
[0165] 反向引物 SEQ ID NO. 192 :AGCACAACCCATTTATGTTC
[0166] BjSSR3969 正向引物 SEQ ID NO. 81 :AGTCCCTTTGCTCTTCTTCT
[0167] 反向引物 SEQ ID NO. 193 :TTGGTCTTTGGTCTACCATC
[0168] BjSSR3988 正向引物 SEQ ID NO. 82 :TCTCTATCCCTCACATCTCG
[0169] 反向引物 SEQ ID NO. 194 :AGGAGGATGAAAAGAAGAGG
[0170] BjSSR4254 正向引物 SEQ ID NO. 83 :TACCCACAAGTGAAATCTCC
[0171] 反向引物 SEQ ID NO. 195 :ATCACCTCCACGTACTCAAC
[0172] BjSSR4315 正向引物 SEQ ID NO. 84 :AAAACGTTTACAACGGAGAA
[0173] 反向引物 SEQ ID NO. 196 :TTGGATACGCAAAAGAGAAT
[0174] BjSSR4351 正向引物 SEQ ID NO. 85 :ACGCAAATTCGATATACACC
[0175] 反向引物 SEQ ID NO. 197 :CGATGATGAAGAAGAGGAAG
[0176] BjSSR4366 正向引物 SEQ ID NO. 86 :ACATTACCACTGTTGAAGCC
[0177] 反向引物 SEQ ID NO. 198 :GGAGCGTTAGATGTGGTTAC
[0178] BjSSR4391 正向引物 SEQ ID NO. 87 :AGAGGACGAGAGTGTGAGAA
[0179] 反向引物 SEQ ID NO. 199 :GACTTAGGGCTCTTTGGTTT
[0180] BjSSR4514 正向引物 SEQ ID NO. 88 :TACTATGAAGAGCAGCAGCA
[0181] 反向引物 SEQ ID NO. 200 :ATCTATCGAACGATGACCAC
[0182] BjSSR4587 正向引物 SEQ ID NO. 89 :CTCAGCTCTCCTTACTTCCA
[0183] 反向引物 SEQ ID NO. 201 :AGAGGAGGAACCATCGTTAG
[0184] BjSSR4628 正向引物 SEQ ID NO. 90 :ACTTCACGTTGCTCATCTCT
[0185] 反向引物 SEQ ID NO. 202 :AAGAAGCTAACCGTCTTCCT
[0186] BjSSR4662 正向引物 SEQ ID NO. 91 :CATTATCTTCGAAAGACCAAA
[0187] 反向引物 SEQ ID NO. 203 :CGTACTGGTGAGGGTACATC
[0188] BjSSR4707 正向引物 SEQ ID NO. 92 :TCTCTGATCAGGATGGTAGG
[0189] 反向引物 SEQ ID NO. 204 :ATGGTTAGATGATGCTGGTC
[0190] BjSSR4811 正向引物 SEQ ID NO. 93 :GAACTTTCTCAATGCCTGTC
[0191] 反向引物 SEQ ID NO. 205 :GAGAAGTCACCAAAGACGTG
[0192] BjSSR4854 正向引物 SEQ ID NO. 94 :CTTCAGTTCAAACCTTCGAC
[0193] 反向引物 SEQ ID NO. 206 :GTTGATTGATGTTGCTGATG
[0194] BjSSR4873 正向引物 SEQ ID NO. 95 :AGTCCTCTTTCTCAGGGAAC
[0195] 反向引物 SEQ ID NO. 207 :TCTGCAACATTGAGTTCTTG
[0196] BjSSR4957 正向引物 SEQ ID NO. 96 :TGGTGGAAGAAATAATGGTC
[0197] 反向引物 SEQ ID NO. 208 :GAGAGGGTGACAGGAGTACA
[0198] BjSSR5151 正向引物 SEQ ID NO. 97 :ATGATAAGAGTTGGAAACGC
[0199] 反向引物 SEQ ID NO. 209 :GTCTCTTCCTTCTCCGTTCT
[0200] BjSSR5176 正向引物 SEQ ID NO. 98 :GATTGCGATGATTTGGTAAT
[0201] 反向引物 SEQ ID NO. 210 :GAGTTCTATGCTTCGGACAG
[0202] BjSSR5177 正向引物 SEQ ID NO. 99 :TGGGTCTCTTCACAAGAATC
[0203] 反向引物 SEQ ID NO. 211 :ATAGATGACCATCAACGGAG
[0204] BjSSR5206 正向引物 SEQ ID NO. 100 :CTACAATTCACCACCTCCAC
[0205] 反向引物 SEQ ID NO. 212 :GGTGAGTACTCTATGCAGGG
[0206] BjSSR5224 正向引物 SEQ ID NO. 101 :CTATAGGCTCCTTCTACGCA
[0207] 反向引物 SEQ ID NO. 213 :TGTTTAGTTGTGTTTCGCTG
[0208] BjSSR5269 正向引物 SEQ ID NO. 102 :ACACAAACCCAAGAACACTC
[0209] 反向引物 SEQ ID NO. 214 :GAGTAGACATAGCTGGGACG
[0210] BjSSR5270 正向引物 SEQ ID NO. 103 :AATCAAGCAAACCTTCTACT
[0211] 反向引物 SEQ ID NO. 215 :TCCAACAAACAAACACAGAA
[0212] BjSSR5340 正向引物 SEQ ID NO. 104 :AGGAAGAGAGGCGTAAAAGT
[0213] 反向引物 SEQ ID NO. 216 :TCCTATCTCTCTCCTCCCTC
[0214] BjSSR5342 正向引物 SEQ ID NO. 1 05 :ACGGATCAACACAAGAAATC
[0215] 反向引物 SEQ ID NO. 217 :ATCACATCATCACCACCTTT
[0216] BjSSR5411 正向引物 SEQ ID NO. 106 :CAGTCTGGTACTCCAAGAGC
[0217] 反向引物 SEQ ID NO. 218 :TATTTGCAGACGAAACCTCT
[0218] BjSSR5542 正向引物 SEQ ID NO. 107 :TAGGTAATGGAAGGAGCAAA
[0219] 反向引物 SEQ ID NO. 219 :TCCTACAACAATGTCACGAA
[0220] BjSSR5854 正向引物 SEQ ID NO. 108 :AGCATACTCTTCTTCGACCA
[0221] 反向引物 SEQ ID NO. 220 :GTTGCCATAAACCTGATGAT
[0222] BjSSR5877 正向引物 SEQ ID NO. 109 :GAAGAGAGTCAACAACAGCC
[0223] 反向引物 SEQ ID NO. 221 :TTCACTTCGACATCCTTCTT
[0224] BjSSR5921 正向引物 SEQ ID NO. 110 :GTCGCAAGGAATCATCTAAC
[0225] 反向引物 SEQ ID NO. 222 :GTACACAAAGGACCAACCAC
[0226] BjSSR5941 正向引物 SEQ ID NO. Ill :AAAAGCTTCTCTTGCTGATG
[0227] 反向引物 SEQ ID NO. 223 :TGCTGAGTCTGTTGCTGTAG
[0228] BjSSR5990 正向引物 SEQ ID NO. 112 :TTCGTTTTAGCGTCTCTCTC
[0229] 反向引物 SEQ ID NO. 224 :GAATTTTTGCAACAGCTTTC。
[0230] 一种引物构建芥菜SSR遗传图谱的方法，包括以下步骤：
[0231] (1)取不同芥菜种为亲本进行杂交，获得匕代，然后将F 进行自交获得F 2代，随 机选取200株F2代作为作图群体；
[0232] (2)提取亲本及F2代的基因组DNA ;
[0233] (3)分别用112对引物PCR扩增亲本基因组DNA和F2代的基因组DNA ;
[0234] (4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建芥菜SSR遗传图谱。
[0235] 进一步地，在所述步骤（1)中，所述芥菜亲本中，母本为榨菜，其为"浙桐一号"多 年自交系，父本为叶芥，其为"邱隘大叶黄种雪里蕻"多年自交系分蘖芥。
[0236] 进一步地，在所述步骤（2)中，选取一个半月苗龄的幼嫩叶片进行基因组DNA的提 取。
[0237] 进一步地，在所述步骤（2)中，采用CTAB法提取基因组DNA。
[0238] 进一步地，在所述步骤（3)中，所述PCR反应采用20 μ L反应体系，包括浓度为 IOOng/ μ L的基因组DNA模板1. 0 μ L，浓度为10 μ M的正向引物1. 0 μ L、浓度为10 μ M的反 向引物 I. 0 μ L，浓度为 5U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，10 X PCR Buffer (Mg2+) 2. 5 μ L，浓 度为2. 5mM的dNTP 2 μ L，CldH2O 12. 3 μ L ;扩增反应程序为：94°C预变性3min，进入35个循 环，每个循环为94°C变性30S，55°C退火30s，72°C延伸30s ;35个循环后再72°C延伸7min， 4°C保存。
[0239] 进一步地，在所述步骤（4)中，对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳：PCR产 物加入2 yL loading buffer，以20bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用质量体积比为 0.12g/ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为lXTBE，240V稳压电泳1.5h。 电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶拍照；根据电泳结果剔除偏分离的SSR分子标 记，再利用生物学软件JoinMap 4. O构建芥菜SSR遗传图谱。
[0240] 进一步地，剔除偏分离SSR分子标记的方法是：利用X 2测验（p〈0. 05水平上）对 匕作图群体的电泳结果进行适合性检测，随后剔除偏分离严重（p〈0. 001水平上）的标记。
[0241] 本发明的优点是：本发明针对芥菜，筛选出112对基于转录组序列开发得到的SSR 引物，能对芥菜的SSR分子标记进行特异性扩增，建立了芥菜高效、准确的SSR分子标记的 技术体系。本发明针对芥菜提供了一种SSR遗传图谱构建方法，构建了第一个我国特有的 芥菜类蔬菜种质的SSR遗传图谱，为进一步进行QTL定位及分子标记辅助育种提供依据。
【附图说明】
[0242] 图1采用本发明方法构建的芥菜SSR遗传图谱LGl~LG17连锁群。
【具体实施方式】
[0243] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不用来限制本发明的范围，若未特别 说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0244] 实施例1 :
[0245] L材料获取
[0246] 以茎膨大的"浙桐一号"多年自交系榨菜为母本，茎不膨大的"邱隘大叶黄种雪里 蕻"多年自交系分蘖芥叶芥为父本。通过常规杂交获得F 1, F1通过自交获得F2群体。随机 选取&群体中的200株作为作图群体。
[0247] 2. DNA提取及检测
[0248] (1)将质量体积比为0. 02g/ml的CTAB抽提缓冲液在水浴锅中预热至65°C，加热 前加入β -巯基乙醇（缓冲液与β -巯基乙醇的体积比为100:2)。
[0249] (2)用液氮将研钵预冷，然后在冷冻条件下分别将两亲本、Fl及200株F2后代幼 嫩叶片充分磨碎，取粉末（约Ig)快速转入含ImL预热的CTAB提取液的灭菌离心管中，充 分混匀后65°C水浴45min，期间每隔IOmin轻轻振荡一次。注意：样品的量不能太多，否则 CTAB加入的量太少，细胞裂解不充分。
[0250] (3)保持温度在4°C以上，12000rpm离心20min，将上清转移到新的2mL离心管。注 意，温度太低则DNA容易和CTAB结合而沉淀。
[0251] (4)在上清中加入等体积预冷的氯仿-异戊醇（体积比为24:1)，将离心管缓慢颠 倒多次（约100次），使管内充分混勾。在4°c下，12000rpm离心10min ;将上清小心转到新 的1.5mL离心管中。注意：吸取2/3的上清即可。不能吸取太多，防止将氯仿-异戊醇或沉 淀吸入，降低DNA的纯度。
[0252] (5)加入上清体积2/3预冷的异丙醇，缓慢混匀（缓慢颠倒20次）。置于-20°C下 培养30min。
[0253] (6)在4°C下，13000rpm离心10min，弃上清，加入ImL预冷的体积比为70%乙醇洗 涤两次DNA沉淀，微干。
[0254] (7)加入 200 μ L TE 或 CldH2O (稍多加），溶解 DNA。
[0255] (8)加入 20 μ L IOmg · mL 1RNAse, 37°C 水浴 60min。
[0256] (9)加入200 μ L预冷的氯仿-异戊醇（体积比为24:1)混勾，静置lOmin，在4°C 下，12000rpm 离心 lOmin。
[0257] (10)取上清，加入上清1/10体积的3mol · PNaAc，上清2倍体积的无水乙 醇，-20°C放置30min或更长时间（0. 5-2h均可）（过夜沉淀DNA量更多，但可能会有杂质）， 在4°C下13000rpm，离心15min，取沉淀。
[0258] (11)用体积比为70%的冷乙醇沉淀2次，再用无水乙醇漂洗1次。置于超净工作 台吹干1-2h，或用冷冻真空干燥机抽干。
[0259] (12)加入50 μ L CldH2O或TE使沉淀溶解，置于-20 °C冰箱保存。
[0260] (13)取1 μ L DNA+99 μ L ddH20,以质量体积比0· 012g/ml的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的质量，同时用超微量核酸定量仪（NanoDrop 2000, German)检测DNA的含量及质量。 凝胶电泳结果显示条带清晰、完整、无拖尾、无降解，无蛋白和RNA污染，该DNA质量达到要 求。并且核酸定量仪显示A260nm/A280nm的值在1. 8左右，表明提取的DNA纯度较好。
[0261] 3.引物的获得及筛选
[0262] (1)榨菜转录组数据的获得
[0263] 采集一个半月苗龄的榨菜幼嫩叶片，用锡箔纸包裹并置于液氮罐里，速冻后置 于-70°C冰箱内保存。使用Trizol试剂提取榨菜的总RNA ;提取样品总RNA后，用带有 Oligo (dT)的磁珠富集mRNA ;利用mRNA反转录并合成双链cDNA，纯化cDNA，在cDNA末端添 加腺嘌呤核苷并连接测序接头，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收200-700bp片段，将回收得 到的片段进行PCR扩增，建立测序文库，用Illumina HiSeqTM2000对测序文库进行测序；根 据测序结果，从中选取已知方向的EST序列，共56, 822条EST序列，进行后续EST-SSR位点 的开发。
[0264] (2)榨菜EST序列中SSR位点识别：
[0265] 米用 SSRLocator(http://www. ufpel. tche. br/faem/fitotecnia/fitomel horamento/faleconosco.html)软件进行SSR位点的检测。先对上述步骤（1)中得到的序 列进行聚类去冗余，然后进行SSR位点的筛选。筛选标准包括：单核苷酸的重复次数大于或 等于16次，二核苷酸重复次数大于或等于6次，三核苷酸重复次数大于或等于5次，四、五 核苷酸重复次数大于或等于4次，六、七、八、九、十核苷酸重复次数大于或等于3次。同时 也筛选中间被少数碱基（间隔小于或等于5bp)打断的不完全重复的SSR位点。检索得到 8, 777 个 EST-SSR 位点。
[0266] (3)榨菜EST-SSR引物的设计与合成：
[0267] 依据上述步骤⑵得到的EST-SSR位点，采用SSRLocator软件进行SSR引物 设计。引物设计主要参数：引物长度控制在17_24bp，最佳长度为20bp ;GC含量控制在 30%-70%，最佳为50% ;退火温度控制在50-70°C，最佳为55°C ;预期产物长度控制在 100-280bp，最佳为200bp。共设计获得6, 127对引物。引物设计完成后随机选取520对引 物进行合成。
[0268] (4) SSR引物筛选
[0269] 以父母本及F1基因组DNA为模板，分别利用步骤（3)合成的520对引物，按照下 列反应体系和反应程序进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶检测PCR产物，选取多态性好、条带 清晰的引物。然后再次用双亲及F 1对筛选得到的引物进行验证，去除不稳定的标记。共获 得112对核心引物，如表1所示。
[0270]
[0274] I) PCR反应采用20 μ L反应体系，包括浓度为IOOng/ μ L的基因组DNA模板 1. 0 μ L，浓度为10 μ M的正向引物1. 0 μ L、浓度为10 μ M的反向引物1. 0 μ L，浓度为5U/μ L 的 Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，10 X PCR Buffer (Mg2+) 2. 5 μ L，浓度为 2. 5mM 的 dNTP 2 μ L，CldH2O 12. 3 μ L。扩增反应程序为：94°C预变性3min，进入35个循环，每个循环为94°C变性30S， 55°C退火30s，72°C延伸30s ;35个循环后再72°C延伸7min，最后4°C保存。
[0275] 2) PCR产物PAGE胶检测
[0276] PCR产物用质量体积比为0. 12g/ml的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
[0277] PAGE电泳及银染所用试剂和仪器如下：
[0278] ①质量体积比为0· 3g/ml的丙稀酰胺混合液（IOOmL) :29g丙稀酰（Acrylamide)， Ig N, Ν' -甲双丙稀酰胺（Bisacrylamide)，加入ddH20定容至100mL，37°C搅拌溶解，过滤 除杂，4°C下避光保存。
[0279] ②质量体积比为0· lg/ml的过硫酸胺（IOmL) :0· Ig过硫酸胺（Ammonium persulfate, APS)溶于ImL ddH20中，常温保存，使用不超过一周。
[0280] ③ 5XTBE 缓冲液（pH 8.3,500mL) :27g Tris，13.75g硼酸，1.86gNa2EDTA.H20,加 入ddH 20定容到500mL，4°C保存。
[0281] ④ TEMED (Ν'，Ν'，Ν'，Ν' -四甲基乙二胺）。
[0282] ⑤上样缓冲液：质量体积比为0. 0025g/ml的溴酚蓝，质量体积比为0. 4g/ml的蔗 糖水溶液，4°C贮存。
[0283] ⑥封底胶：质量体积比为0. 0lg/ml的琼脂糖溶液，用I XTBE配置。
[0284] ⑦染色液：无水乙醇50mL，硝酸银0. 5g，溶于dH20并定容至500mL。IC存于棕色瓶 中，室温保存，一般当天内使用。
[0285] ⑧显色液：氢氧化钠10g，溶于dH20并定容至500mL，室温保存。甲醛使用时再加， 浓度比例为2mL/500mL。
[0286] PAGE胶电泳的主要步骤：
[0287] ①将玻璃板、梳子、胶套、电泳槽等，用去污剂洗涤干净，自来水冲洗，酒精擦拭，晾 干。
[0288] ②将两块玻璃板插入橡胶套后，放入电泳槽中，使较低的玻璃板朝向负极（黑色 电极），内侧。保持电泳槽水平，双手以对角线的方式，拧紧电泳槽上的螺杆使玻璃板和橡胶 套稳固且密封。
[0289] ③将配置好的封底胶置于微波炉中加热煮沸，用胶头滴管吸取封底胶，将玻璃板 和橡胶套的外侧接缝封好，并将其中一块玻璃板底部的空隙封上。室温凝胶15-20min。
[0290] ④制胶（质量体积比为0· 12g/ml的聚丙烯酰胺凝胶）50mL : 19. 65mL ddH20+20mL 0.3g/ml的丙烯酰胺混合液+10mL5XTBE+350 μLAPS。在制备好的胶液中，加入35μL TEMED，迅速混匀。
[0291] ⑤灌胶：配好胶后，迅速用IOOmL注射器吸取凝胶溶液，调转注射器，排净进入针 管的空气。将注射器的针头插入两块玻璃板之间的空隙，注入丙烯酰胺溶 液，几乎注满空 隙。控制速度，减少气泡的产生，如有气泡，可用细铁丝赶走。
[0292] ⑥立即将合适的梳子轻轻插到凝胶中，用力均勾，小心勿使梳齿下留有气泡。梳子 的顶端应略高于玻璃板的上沿。
[0293] ⑦丙烯酰胺于室温聚合30-60min，冬天则放入30°C烘箱中。若凝胶回缩明显，应 补加溶液。凝胶完全聚合时可见梳齿下两条折光线。
[0294] ⑧拔梳子：用IXTBE浸润凝胶的顶端2_4min，小心拔出梳子，立即用IXTBE冲 洗一下加样孔，防止残留的少量丙烯酰胺溶液在加样孔聚合，梳孔不整齐。加入电泳液 (1XTBE)，外侧（正极）没过玻璃板7-8cm即可，内侧（负极）没过短玻璃板。
[0295] ⑨每20 μ L PCR产物中加2 μ L上样缓冲液，混勾，点样2 μ L。
[0296] ⑩电泳：240V，120mA，距到 2/3 处停下（约 I. 5h)。
[0297] PAGE胶的染色采用快速银染法，具体步骤如下：
[0298] ①染色：聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，卸下玻璃板，将凝胶转移至染色液中，室温 下于摇床上以40rpm振荡8-10min。
[0299] ②清洗：将凝胶转移置另一容器中，用dH20清洗凝胶2次，20-30s，第二次清洗 20-30s后，加入微量显色液，稍振荡后倒掉变黑的显色液。
[0300] ③显色：将凝胶转移置含500mL已配好的显色液中，室温下，以40rpm在摇床上振 荡至清晰带纹出现（约5min)。
[0301] ④清洗：倒尽显色液，并用dH20冲洗2-3次。
[0302] ⑤拍照：将PAGE胶小心的转移到白色底板上，并用吸水纸吸走多余的水分，拍照。
[0303] 4.芥菜SSR遗传图谱的构建
[0304] 构建芥菜SSR遗传图谱，具体包括：
[0305] (1)利用第2部分提取的亲本及200株F2作图群体的基因组DNA，利用第3部分筛 选获得的SSR引物，进行PCR反应。反应体系、反应程序及PCR产物检测与第3部分相同。
[0306] (2)根据电泳结果构建芥菜SSR遗传图谱
[0307] F2群体中，对共显性标记，与亲本榨菜相同带型记为A，与亲本叶芥相同带型记为 B，杂合子带型记为H;对显性标记，相同于榨菜的杂合带型（有带）记为c，纯合带（无带） 型记为a，相同于叶芥的杂合带型（有带）记为d，纯合带型（无带）记为b，缺失或模糊带 型记为对于能扩增出多位点或者双位点的标记来说，利用DNA片段的大小顺序在标记 的名称后面加上小写字母（a、b、c等）来区别。
[0308] 数据统计结束后，将植株编号与对应的标记基因型输入Excel表中。分析112对 弓丨物所产生的199个SSR标记在F2群体中的分离，利用X 2测验（p〈0. 05水平上）进行适 合性检测，其中59个标记发生了偏分离，去除部分偏分离较为严重（p〈0. 001)的标记共57 个。
[0309] 剔除偏分离分子标记后，利用Join Map 4. 0软件对142个标记进行连锁分 析，最终得到一张由116个SSR分子标记组成，平均图距为17. 92cM，覆盖基因组长度为 2061. OcM，包含17个连锁群的芥菜遗传图谱（图1和表2)。
[0310] 表2 SSR分子标记在分子遗传图谱上的分布
[0311]
[0312]
【主权项】
1.构建芥菜SSR遗传图谱的引物组，其特征在于，包括以下112对引物： BjSSROOOl正向引物SEQ ID NO. I :AAATCCCCAAAAACCTAGAG 反向引物SEQ ID NO. 113 :CTCATCCATCTCCTCGTCT BjSSR0002正向引物SEQ ID NO. 2 :CTTCGTTTGCGCGTTTT 反向引物SEQ ID NO. 114 :ATGATGGTCTCCITTTGITG BjSSR0004正向引物SEQ ID NO. 3 :AAGAAGTCGAGTAGTCGCAG 反向引物SEQ ID NO. 115 :AAACGAACAATACTTCCCG BjSSR0008正向引物SEQ ID NO. 4 :ATGGAGCACATCTCAAAGAC 反向引物SEQ ID NO. 116 :CITTTGITGTGATGACCCTT BjSSR0019正向引物SEQ ID NO. 5 :GAAACACAAACGCAGCA 反向引物SEQ ID NO. 117 :ACAGGCAITGTAGGAGACAC BjSSR0023正向引物SEQ ID NO. 6 :TAAGCAGAGAAAGAAATGGG 反向引物SEQ ID NO. 118 :AGATCTCTGGAGITGGGAGT BjSSR0166正向引物SEQ ID NO. 7 :GAACAACAACTCATCCACCT 反向引物SEQ ID NO. 119 :AGACTCGTTAITGATGCTGG BjSSR0234正向引物SEQ ID NO. 8 :ATTCTAATCACAACAACCGC 反向引物SEQ ID NO. 120 :ATGTAGTAGCCAAGGTGGTG BjSSR0312正向引物SEQ ID NO. 9 :AGAAGCTTGGTAAGACGACA 反向引物SEQ ID NO. 121 :ATGCTCGAAGCTITCTTATG BjSSR0364正向引物SEQ ID NO. 10 :ATCCCCTCGTTAAAACTCTC 反向引物SEQ ID NO. 122 :GATGITGAGGAGGTACTGGA BjSSR0486正向引物SEQ ID NO. 11 :TTCCAAATCATCTTCTCACC 反向引物SEQ ID NO. 123 :CGTCCAACACAACAAACATA BjSSR0513正向引物SEQ ID NO. 12 :ATCAAGAAAATGGAGCAAGA 反向引物SEQ ID NO. 124 :CTTCACTCTTGAACCTCTGG BjSSR0612正向引物SEQ ID NO. 13 :TCGATTCTGGTCTTGAGTTT 反向引物SEQ ID NO. 125 :GAGTTGTAGACCGGATCAAA BjSSR0613正向引物SEQ ID NO. 14 :TGAATTTGATCTCCGGTAAC 反向引物SEQ ID NO. 126 :ATTGCTGATCATACGGAAAC BjSSR0678正向引物SEQ ID NO. 15 :TCAGCTACGGATAGAAGAGC 反向引物SEQ ID NO. 127 :GGACTCACAITGATCGTCTT BjSSR0723正向引物SEQ ID NO. 16 :TAATGGCTTTGAAACTCTGC 反向引物SEQ ID NO. 128 :GGAAAGGAAGAGGITCTTGT BjSSR0731正向引物SEQ ID NO. 17 :CTCAAGAGGCTCAACACTTC 反向引物SEQ ID NO. 129 :TCCAITGCAACAATTAGACA BjSSR0806正向引物SEQ ID NO. 18 :GATGAAGAGAGAAGCGAAGA 反向引物SEQ ID NO. 130 :TCCGTGAAGAAGCTAATGAT BjSSR0891正向引物SEQ ID NO. 19 :GTTCTGAACGTTCTGGCTAC 反向引物SEQ ID NO. 131 :CATACACACGGTCTGATGAA BjSSR0913正向引物SEQ ID NO. 20 :AATCCTCAGACCTCAAAACA反向引物SEQ ID NO. 132 :GTAITCCTCGTAATCGITGG BjSSR0942正向引物SEQ ID N0.21 :AATCTGGCAGAACTCAGAGA 反向引物SEQ ID NO. 133 :TCGGTGTAAGCCATATCTTT BjSSR0967正向引物SEQ ID NO. 22 :GACCTCCTCCTGAAGTTTCT 反向引物SEQ ID NO. 134 :GCTGCAACTCACTTCTCTTT BjSSR1018正向引物SEQ ID NO. 23 :CAGTTGTGTCCATGTACGAG 反向引物SEQ ID NO. 135 :TTCCGATGTCTGATAACTCC BjSSRKMO正向引物SEQ ID N0.24:ACAAACAAATGGAAGACGAG 反向引物SEQ ID NO. 136 :AGATCGGAITTGATCTTGG BjSSR1215正向引物SEQ ID NO. 25 :AGGGTGAGATACGACGAGTA 反向引物SEQ ID NO. 137 :CITTCGmGGTCAITCATC BjSSR1289正向引物SEQ ID NO. 26 :CGAGAGCCTAGATCTGAGAA 反向引物SEQ ID NO. 138 :TAAACAAACGCCTTACCTTC BjSSR1365正向引物SEQ ID NO. 27 :TGAAAGTAGGCAACCGTATT 反向引物SEQ ID NO. 139 :CTCGCTTTACTCTCTGCAAT BjSSR1448正向引物SEQ ID NO. 28 :GAGGTTGTTTCTTTTCCCTT 反向引物SEQ ID NO. 140 :GAATCAGCTAITCATCGGAG BjSSR1474正向引物SEQ ID NO. 29 :ACTTTCCCTTACAATCCTCC 反向引物SEQ ID NO. 141 :GACTAGCAGCCTTCATCATC BjSSR1528正向引物SEQ ID NO. 30 :CGTTCTCTTCACTATGCTCC 反向引物SEQ ID NO. 142 :TCACATAGCCCATAAACACA BjSSR1594正向引物SEQ ID N0.31 :AACAAACCTCACAAACCAAC 反向引物SEQ ID NO. 143 :AITCTTCCACTCCCTTCTTC BjSSR1612正向引物SEQ ID NO. 32 :AGGAGGAGGAAGAAGACAAC 反向引物SEQ ID NO. 144 :TCGITTGATCGAACTTACCT BjSSR1764正向引物SEQ ID NO. 33 :AAAGTCATGAAGAATGTGGG 反向引物SEQ ID NO. 145 :AGAAGCTTGTCTCAACATGG BjSSR1799正向引物SEQ ID N0.34:GAAGTTTCCAACAAAACAGG 反向引物SEQ ID NO. 146 :GATTATGAACCACCGAGAGA BjSSR1811正向引物SEQ ID NO. 35 :TCACAACGCAAAATAAACAA 反向引物SEQ ID NO. 147 :CTTTCCATCCCATGTGTAGT BjSSR1812正向引物SEQ ID NO. 36 :TCAATATACAATCTTCGTGACTCT 反向引物SEQ ID NO. 148 :CAATAGGGATCATAACCGTC BjSSR1813正向引物SEQ ID NO. 37 :GCTGCTATAGCTGGTCACTC 反向引物SEQ ID NO. 149 :TCATCGITTGGITCTTCTTT BjSSR1831正向引物SEQ ID NO. 38 :ACTTGTTTCACTTCCAGCAT 反向引物SEQ ID NO. 150 :TTGmTGAITGTTATCCCC BjSSR1885正向引物SEQ ID NO. 39 :ACCACAAAAACACACCAAAC 反向引物SEQ ID NO. 151 :TCTCACTCCTCTATAACGGG BjSSR1926正向引物SEQ ID NO. 40 :TCCAGCAGCTTATTACCAGT 反向引物SEQ ID NO. 152 :GCACTTTAGCTGTTCTTGGT BjSSR1934正向引物SEQ ID N0.41 :TTTTCTCTTACCGAACCAAA 反向引物SEQ ID NO. 153 :GITTGAAGGAAGAAGTGTCG BjSSR1950正向引物SEQ ID NO. 42 :CCCTCGTCTTCTTAGGTCTT 反向引物SEQ ID NO. 154 :ATCAACCAITCCAGACAITC BjSSR1970正向引物SEQ ID NO. 43 :ATATCACCACCACCATTGTT 反向引物SEQ ID NO. 155 :TCCTCCACAATCTCCATTAC BjSSR1984正向引物SEQ ID NO. 44 :GCAATTGCTTTAATCTGTCC 反向引物SEQ ID NO. 156 :GAGGCAGGTATACAGATGCT BjSSR1985正向引物SEQ ID NO. 45 :GTTCTCCGACGTCTGTTCT 反向引物SEQ ID NO. 157 :nTCTGGmTCGAITTCAT BjSSR2017正向引物SEQ ID NO. 46 :CGTTGATTCCAACAAACC 反向引物SEQ ID NO. 158 :GAGITGATGAGAGAITTGGC BjSSR2113正向引物SEQ ID NO. 47 :CCTCAGTTTCAGAATCAAGC 反向引物SEQ ID NO. 159 :TCCGGAAGAGAGAATAACAA BjSSR2164正向引物SEQ ID NO. 48 :TCTCTTATCCTTTGGTCACG 反向引物SEQ ID NO. 160 :GGAAACGAAGACATAAGCTG BjSSR2184正向引物SEQ ID NO. 49 :GGATTCGTGTTTGAGTTGTT 反向引物SEQ ID NO. 161 :TTCCCAGAAGAAGAAGATCA BjSSR2234正向引物SEQ ID NO. 50 :TACACCGTCTGATTCCATCT 反向引物SEQ ID NO. 162 :GGGITCGAGATACCACAATA BjSSR2235正向引物SEQ ID N0.51 :CGCTTACACCTTTCTTGAAT 反向引物SEQ ID NO. 163 :CGAAGITCAAAITTCCAATC BjSSR2247正向引物SEQ ID NO. 52 :ACAAGTACAGTGGAGGGATG 反向引物SEQ ID NO. 164 :CAGACCACCTGITGGTATCT BjSSR2272正向引物SEQ ID NO. 53 :AAGATCTAGGGTTTCTTCGC 反向引物SEQ ID NO. 165 :CGAAGAGCTTCTGAGTGAAT BjSSR2285正向引物SEQ ID N0.54:CAACCTTTCTTTCTTACGCA 反向引物SEQ ID NO. 166 :TTAAGAGAAACCCACCAAAA BjSSR2449正向引物SEQ ID NO. 55 :TGCATAACCACCATAGAACA 反向引物SEQ ID NO. 167 :ATCAAGTGCTGCGTATAGGT BjSSR2450 正向引物SEQ ID NO. 56 :CTCCTCTTCTCCAGAGGATT 反向引物SEQ ID NO. 168 :GAGGAGGAAGGGAAGAGTC BjSSR2464正向引物SEQ ID NO. 57 :CTCTCGTGGACAGAGAAAAC 反向引物SEQ ID NO. 169 :GATCACTTCACCAITCTGCT BjSSR2519正向引物SEQ ID NO. 58 :AAGTGGAAGAAGAAGTGGGT 反向引物SEQ ID NO. 170 :CGCTAGGAGAAAGACTCTCA BjSSR2669正向引物SEQ ID NO. 59 :GAAGATGGTGGCAGCTATAC反向引物SEQ ID NO. 171 :TAAGAAGACAGAGCCAAAGC BjSSR2743正向引物SEQ ID NO. 60 :GTCGGGTCAGGTTAGTTACA 反向引物SEQ ID NO. 172 :CAGAACCTCCAAAAGITGAG BjSSR2763正向引物SEQ ID NO. 61 :CAAACCCATAGAGAAAGACG 反向引物SEQ ID NO. 173 :TCGGAGACGAACTTAGAGAG BjSSR2886正向引物SEQ ID NO. 62 :TCCCCGCCTCCCTTCAC 反向引物SEQ ID NO. 174 :GTCTCCGAGTAAGACGTCAG BjSSR2910正向引物SEQ ID NO. 63 :AATCCTATGGCACAGATGAC 反向引物SEQ ID NO. 175 :TGATCTTGGATCGATAGCTT BjSSR2957正向引物SEQ ID NO. 64 :TCTGAACTCGTCGTCTCTCT 反向引物SEQ ID NO. 176 :TTAAGCACAGTGITGAGTGC BjSSR3033正向引物SEQ ID NO. 65 :ATACAGTTTCTGCGATTTGG 反向引物SEQ ID NO. 177 :ACTGCGAGTGAAAGAAGAAG BjSSR3109正向引物SEQ ID NO. 66 :AAATCAGGAGAGAAAGGGTC 反向引物SEQ ID NO. 178 :AAAGCTGCTTAAITTCGGAT BjSSR3137正向引物SEQ ID NO. 67 :AAGAGATGGATCTTGGTGTG 反向引物SEQ ID NO. 179 :GAATCTTCCTCATCTGCTTG BjSSR3227正向引物SEQ ID NO. 68 :CTGTTCATCTTCGTCTCCTC 反向引物SEQ ID NO. 180 :ACTTCTCTGTCTTCGGITGA BjSSR3364正向引物SEQ ID NO. 69 :TTCCCTATTCAGTGATCTGC 反向引物SEQ ID NO. 181 :CAAACCAGCCTCTCTGG BjSSR3426正向引物SEQ ID NO. 70 :AGATTTTCTCGCGAGTATTG 反向引物SEQ ID NO. 182 :TGAGAGAGAGAGCCTGAGAG BjSSR3445正向引物SEQ ID N0.71 :TCAAGCTAAGAGGCTTTCAC 反向引物SEQ ID NO. 183 :GAGACAITGGAACCAACCTA BjSSR3488正向引物SEQ ID NO. 72 :CTGTGATTTCCCAATTTTCT 反向引物SEQ ID NO. 184 :CAITTCTTCTTCAAGATCCG BjSSR3505正向引物SEQ ID NO. 73 :AGGAGGAGGAGACAGAAGAC 反向引物SEQ ID NO. 185 :ACCAACAGCACAAGAGAAGT BjSSR3613正向引物SEQ ID N0.74:ACAGAGGTTTCCATCATCAG 反向引物SEQ ID NO. 186 :CCTmGGTCTGAGITTCTG BjSSR3652正向引物SEQ ID NO. 75 :GTGATATTAAATTCGCCGTC 反向引物SEQ ID NO. 187 :CAITGCCATCTCTCTCTCTC BjSSR3690正向引物SEQ ID NO. 76 :GCGAGTTTTCCTCTTCTTC 反向引物SEQ ID NO. 188 :GAITTCCGATTAGGGITGTT BjSSR3876正向引物SEQ ID NO. 77 :AACAGAGCTTAAACCAAACG 反向引物SEQ ID NO. 189 :AACCTCCGAGAAACCGT BjSSR3885正向引物SEQ ID NO. 78 :ATCGTTAGTAGCACCTCCAA 反向引物SEQIDNO. 190:TGTCTTCTCATGTCTCCCTC BjSSR3914 正向引物SEQIDNO. 79:CAACCCATCTCTGTTCAAGT 反向引物SEQIDNO. 191:CAAGGGACTATCGACGTAAG BjSSR3915 正向引物SEQIDNO. 80:AGGGAAGGAAAGTTTGAGAC 反向引物SEQIDNO. 192:AGCACAACCCAITTATGITC BjSSR3969 正向引物SEQIDNO. 81:AGTCCCTTTGCTCTTCTTCT 反向引物SEQIDNO. 193:ITGGTCTTTGGTCTACCATC BjSSR3988 正向引物SEQIDNO. 82:TCTCTATCCCTCACATCTCG 反向引物SEQIDNO. 194:AGGAGGATGAAAAGAAGAGG BjSSR4254 正向引物SEQIDNO. 83:TACCCACAAGTGAAATCTCC 反向引物SEQIDNO. 195:ATCACCTCCACGTACTCAAC BjSSR4315 正向引物SEQIDNO. 84:AAAACGTTTACAACGGAGAA 反向引物SEQIDNO. 196:TTGGATACGCAAAAGAGAAT BjSSR4351 正向引物SEQIDNO. 85:ACGCAAATTCGATATACACC 反向引物SEQIDNO. 197:CGATGATGAAGAAGAGGAAG BjSSR4366 正向引物SEQIDNO. 86:ACATTACCACTGTTGAAGCC 反向引物SEQIDNO. 198:GGAGCGTTAGATGTGGTTAC BjSSR4391 正向引物SEQIDNO. 87:AGAGGACGAGAGTGTGAGAA 反向引物SEQIDNO. 199:GACTTAGGGCTCITTGGITT BjSSR4514 正向引物SEQIDNO. 88:TACTATGAAGAGCAGCAGCA 反向引物SEQIDNO. 200:ATCTATCGAACGATGACCAC BjSSR4587 正向引物SEQIDNO. 89:CTCAGCTCTCCTTACTTCCA 反向引物SEQIDNO. 201:AGAGGAGGAACCATCGTTAG BjSSR4628 正向引物SEQIDNO. 90:ACTTCACGTTGCTCATCTCT 反向引物SEQIDNO. 202:AAGAAGCTAACCGTCTTCCT BjSSR4662 正向引物SEQIDNO. 91:CATTATCTTCGAAAGACCAAA 反向引物SEQIDNO. 203:CGTACTGGTGAGGGTACATC BjSSR4707 正向引物SEQIDNO. 92:TCTCTGATCAGGATGGTAGG 反向引物SEQIDN0.204:ATGGTTAGATGATGCTGGTC BjSSR4811 正向引物SEQIDNO. 93:GAACTTTCTCAATGCCTGTC 反向引物SEQIDNO. 205:GAGAAGTCACCAAAGACGTG BjSSR4854 正向引物SEQIDNO. 94:CTTCAGTTCAAACCTTCGAC 反向引物SEQIDNO. 206:GITGAITGATGITGCTGATG BjSSR4873 正向引物SEQIDNO. 95:AGTCCTCTTTCTCAGGGAAC 反向引物SEQIDNO. 207:TCTGCAACAITGAGITCTTG BjSSR4957 正向引物SEQIDNO. 96:TGGTGGAAGAAATAATGGTC 反向引物SEQIDNO. 208:GAGAGGGTGACAGGAGTACA BjSSR5151 正向引物SEQIDNO. 97:ATGATAAGAGTTGGAAACGC 反向引物SEQIDNO. 209:GTCTCTTCCTTCTCCGITCT BjSSR5176 正向引物SEQIDNO. 98:GATTGCGATGATTTGGTAAT反向引物SEQIDNO. 210:GAGTTCTATGCTTCGGACAG BjSSR5177 正向引物SEQIDNO. 99:TGGGTCTCTTCACAAGAATC 反向引物SEQIDNO. 211:ATAGATGACCATCAACGGAG BjSSR5206 正向引物SEQIDNO. 100:CTACAATTCACCACCTCCAC 反向引物SEQIDNO. 212:GGTGAGTACTCTATGCAGGG BjSSR5224 正向引物SEQIDNO. 101:CTATAGGCTCCTTCTACGCA 反向引物SEQIDNO. 213:TGTTTAGirGTGITTCGCTG BjSSR5269 正向引物SEQIDNO. 102:ACACAAACCCAAGAACACTC 反向引物SEQIDN0.214:GAGTAGACATAGCTGGGACG BjSSR5270 正向引物SEQIDNO. 103:AATCAAGCAAACCTTCTACT 反向引物SEQIDNO. 215:TCCAACAAACAAACACAGAA BjSSR5340 正向引物SEQIDNO. 104:AGGAAGAGAGGCGTAAAAGT 反向引物SEQIDNO. 216:TCCTATCTCTCTCCTCCCTC BjSSR5342 正向引物SEQIDNO. 105:ACGGATCAACACAAGAAATC 反向引物SEQIDNO. 217:ATCACATCATCACCACCTTT BjSSR5411 正向引物SEQIDNO. 106:CAGTCTGGTACTCCAAGAGC 反向引物SEQIDNO. 218:TAITTGCAGACGAAACCTCT BjSSR5542 正向引物SEQIDNO. 107:TAGGTAATGGAAGGAGCAAA 反向引物SEQIDNO. 219:TCCTACAACAATGTCACGAA BjSSR5854 正向引物SEQIDNO. 108:AGCATACTCTTCTTCGACCA 反向引物SEQIDNO. 220:GITGCCATAAACCTGATGAT BjSSR5877 正向引物SEQIDNO. 109:GAAGAGAGTCAACAACAGCC 反向引物SEQIDNO. 221:ITCACTTCGACATCCTTCTT BjSSR5921 正向引物SEQIDNO. 110:GTCGCAAGGAATCATCTAAC 反向引物SEQIDNO. 222:GTACACAAAGGACCAACCAC BjSSR5941 正向引物SEQIDNO.Ill:AAAAGCTTCTCTTGCTGATG 反向引物SEQIDNO. 223:TGCTGAGTCTGITGCTGTAG BjSSR5990 正向引物SEQIDNO. 112:TTCGTTTTAGCGTCTCTCTC 反向引物SEQIDNa224:GAAmTTGCAACAGCITTC。2. -种用权利要求I所述的引物组构建芥菜SSR遗传图谱的方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 取不同芥菜种为亲本进行杂交，获得Fl代，然后将Fl代进行自交获得&代，随机 选取200株F2代作为作图群体； (2) 提取亲本及F2代的基因组DNA; (3) 分别用112对引物PCR扩增亲本基因组DNA和F2代的基因组DNA; (4) 利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建芥菜SSR遗传图谱。3. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，在所述步骤 (1)中，所述芥菜亲本中，母本为榨菜，其为"浙桐一号"多年自交系，父本为叶芥，其为"邱 隘大叶黄种雪里蕻"多年自交系分蘖芥。4. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，在所述步骤 (2)中，选取一个半月苗龄的幼嫩叶片进行基因组DNA的提取。5. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于：在所述步 骤⑵中，采用CTAB法提取基因组DNA。6. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，在所述步 骤⑶中，所述PCR反应采用20yL反应体系，包括浓度为IOOng/yL的基因组DNA模板 I.OyL，浓度为IOyM的正向引物LOyL、浓度为IOyM的反向引物LOyL，浓度为5U/ yL的TaqDNA聚合酶 0? 2yL，10XPCRBuffer(Mg2+) 2. 5yL，浓度为 2. 5mM的dNTP2yL， CldH2O12. 3yL;扩增反应程序为：94°C预变性3min，进入35个循环，每个循环为94°C变性 30S，55°C退火30s，72°C延伸30s;35个循环后再72°C延伸7min，4°C保存。7. 根据权利要求2所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，在所述步骤 (4)中，对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳：PCR产物加入2yLloadingbuffer，以 20bpDNAladder为DNA分子量标准，采用质量体积比为0. 12g/ml的非变性聚丙稀酰胺凝 胶进行电泳，电泳缓冲液为IXTBE，240V稳压电泳I. 5h。电泳结束后，采用银染法染色，最 后将凝胶拍照；根据电泳结果剔除偏分离的SSR分子标记，再利用生物学软件JoinMap4.0 构建芥菜SSR遗传图谱。8. 根据权利要求7所述的一种芥菜SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，剔除偏分 离SSR分子标记的方法是：利用X2测验（p〈〇. 05水平上）对？2作图群体的电泳结果进行 适合性检测，随后剔除偏分离严重（P〈〇. 001水平上）的标记。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及构建芥菜SSR遗传图谱的引物组及遗传图谱的构建方法。其是基于榨菜转录组序列信息开发得到的EST-SSR引物组，所述引物组包含112对多态性引物。以茎膨大的“浙桐一号”多年自交系为母本，以茎不膨大的“邱隘大叶黄种雪里蕻”多年自交系分蘖芥为父本，通过杂交获得F1后代，然后F1自交获得F2作图群体。利用112对多态性引物通过两亲本及200株F2群体，构建芥菜遗传图谱。本发明构建了第一个我国特有的芥菜类蔬菜种质的SSR遗传图谱，为进一步进行QTL定位以及分子标记辅助育种提供了依据。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11, C12N15/10
【公开号】CN104894110
【申请号】CN201510246083
【发明人】陈利萍, 李俊星, 邹晓霞, 曹丽雯, 于宁宁
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月14日
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