一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒及其引物和探针的制作方法
一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒及其引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒核酸检测技术领域，涉及一种基于核酸序列依赖性扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技术的日本乙型脑炎病毒快速检测技术。具 体涉及日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增快速检测试剂盒，以及所述试剂盒中使用的对 于乙型脑炎NSl基因具有特异性的引物对和分子信标探针。
【背景技术】
[0002] 日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒 属，是一种危害严重的人畜共患病病原。该病毒为单股正链RNA病毒，其核酸序列编码了 3 个结构蛋白和7个非结构蛋白（Nonstructural protein)，其中各基因型间NSl蛋白的同源 性较高，是建立该病核酸检测的良好候选基因。日本乙型脑炎经蚊传播，多见于夏秋季，对 患者神经系统的造成不可逆的损伤，病死率高，部分幸存者会遗留中枢神经系统后遗症。我 国为日本乙型脑炎高发区，平均年发病数约占全世界乙脑发病数的80%，且主要危害人群 为儿童，对人民的健康造成极大的危害。因此建立一套简便快速、特异性强的日本乙型脑炎 病毒检测技术，对该病的防控和临床诊有着十分重要的意义。
[0003] 由于乙脑的流行具有明显的季节性、地区性和临床病变，可以据其进行初步诊断， 但确诊还是需要通过实验室诊断，主要包括病毒的分离鉴定、酶联免疫法和RT-PCR等。病 毒分离培养法操作繁琐，耗时很长，不适于快速检测和临床紧急病情处理；酶联免疫检测 技术受其本身的限制，灵敏度比较低，不利于病程初期的诊断；RT-PCR、荧光RT-PCR以及 RT-LAMP等也是基于核酸扩增的检测方法，灵敏度较前两种方法提高了很多，但PCR的扩增 需要有反转录步骤以及变性、退火及延伸等多个温度点进行几十次升降温循环，耗时较长， 而LAMP方法对引物设计区域要求过高，在变异较大且频繁的RNA病毒上难以实现良好应 用。
[0004] 核酸序列依赖性扩增（NASBA)与以往核酸扩增技术不同，更为高效简便，尤其 适用于RNA病毒的检测。NASBA在AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、RNA酶H的介导下，在 41°C -42°C恒温条件下，经一对引物在体外连续扩增出均一的特异性的核酸序列。在该技 术的基础上结合分子信标探针（moleular beacon)可以建立实时焚光NASBA (Real-time NASBA)扩增技术。Real-time NASBA具有以下特点：①在同一温度条件下进行的等温扩增； ②与RT-PCR相比，无需15-30分钟的反转录过程，不受引物量限制，在60-90分钟内使模板 RNA扩增IO9倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA ;③只对RNA模板 进行扩增，不受双链DNA污染的影响，且产物通过分子信标探针来检测，实现了实时检测并 减少了对环境的污染。④与RT-LAMP相比，更容易筛选出检测靶位点，满足变异度高的核酸 病毒检测要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基于实时荧光核酸序列依赖性扩增技术（Real-time NASBA)对日本乙型脑炎NSl基因具有特异性检测作用的引物对和分子信标探针；此外，本 发明还提供了一种包含上述引物对和分子信标的日本乙型脑炎Real-time NASBA检测试剂 盒。
[0006] 为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研宄并不懈努力，最终获得了如下 技术方案：
[0007] -种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的特异性引物对，该引物对 包括正向引物Primer-I和反向引物Primer-2,所述正向引物和反向引物的碱基序列如下 所示：
[0008] Primer-I :5, -GACGTTAGCAGGTAGACGAGGCATGATGAAACAACACTC-3,（SEQ ID NO :1);
[0009] Primer-2 :5' -CTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCTCTTGCGAAGGAC-3'（SEQ ID NO : 2) 〇
[0010] 一种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的分子信标探针Tagl，该 分子信标探针在其寡核苷酸DNA分子的5'端标记焚光报告基团FAM，3'端标记促灭基团 DABCYL，探针上的寡核苷酸DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO :3所示。整个探针形式如下 所示：
[0011] 5 ' FAM-CATCGCAGCTGGGCCTTCTGGTGATGTTTCTCGATG-DABCYL-3 '。
[0012] 由于上述特异性引物对和分子信标探针可用来检测离体标本中是否存在乙型脑 炎病毒的NSl基因，进而确定样品中是否含有乙型脑炎病毒，因此本发明还提供一种产品 新用途，即：上述的特异性引物对在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的用途； 或者，上述的分子信标探针在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的用途。
[0013] 本发明提供的一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒至少包括： 2 X实时荧光NASBA反应液和4 X酶混合液。所述2 X实时荧光NASBA反应液包含有如上 所述的正向引物Primer-Ι、反向引物Primer-2和分子信标探针；4X酶混合液包AMV反转 录酶、T7RNA聚合酶和RNase H酶等。
[0014] 进一步优选，所述2X实时荧光NASBA反应液各组分见表1，4X酶混合液各组分 见表2。
[0015] 表1 :2 X实时荧光NASBA反应液
[0016]
[0019] 所述的日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒还包括阳性对照、阴性对 照和空白对照，所述阳性对照为乙型脑炎体外转录NSl基因的RNA片段，所述阴性对照为在 核酸提取时与标本同时平行提取无菌生理盐水，所述空白对照为无核酸酶的超纯水。
[0020] 与现有技术相比，本发明首次通过提供一种对乙型脑炎病毒NSl基因具有特异性 的一对引物和一条分子信标探针，包含上述引物对和分子信标探针的试剂盒，来检测离体 标本中是否存在乙型脑炎病毒的NSl基因，进而确定样品中是否含有乙型脑炎病毒；本发 明在设计筛选扩增引物时，以乙脑病毒检测的特异性和通用性为本，综合考虑引物和探针 的Tm值、3 '末端自由能，GC含量、RNA二级结构、Λ G等因素，并分析比较了日本乙型脑炎病 毒5个不同基因型毒株的基因序列，所设计筛选的引物可对不同基因型NSl进行检测。另 外，本发明所涉及的检测试剂盒具有以下优点：
[0021] 1、等温扩增：避免了普通RT-PCR对温度循环的特殊要求所带来的种种不便；
[0022] 2、特异：通过精心设计并结合临床样本筛查优化选择出的特异性正向引物、反向 引物和分子信标探针，同步识别乙型脑炎病毒的3个不同区域，保证了扩增的特异性；
[0023] 3、灵敏：由于NASBA自身的扩增特点，使得检测灵敏度进一步提高，拷贝数为个位 的模板可被检出；
[0024] 4、高效：可以在60-90分钟内完成检测，并使模板RNA扩增约IO9倍；
[0025] 5、实时监测：NASBA扩增结束后马上可以分析数据获得检测结果，无需再次操作 减少对环境的污染。
【附图说明】
[0026] 图 I :NASBA 的 AMV buffer 体积的优化，其中，1 :2· 4 μ L ;2 :2· 8 μ L ;3 :3· 2 μ L ;4 : 3. 6 μ L ;5 :4. 0 μ L ;6 :4· 4 μ L ;7 :4· 8 μ L。
[0027] 图 2 :NASBA 的 dNTP/NTP 浓度的优化，其中，1 :0· 5mM/2mM ;2 :lmM/2mM，3 : I. 5mM/2mM ;4 :2mM/2mM。
[0028] 图 3 :NASBA 引物浓度的优化，其中，1 :0· 125mM ;2 :0· 25mM ;3 :0· 375mM ;4 :0· 5mM ; 5 :0. 625mM ;6 :阴性对照；7 :空白对照。
[0029] 图 4 :NASBA 反应探针浓度的优化，其中，I :0. 5mM ;2 :0. 375mM ;3 :0. 25mM ;4 : 0. 125mM。
[0030] 图 5 :NASBA 反应的 DMSO 浓度的优化，其中，1:4% ;2:6% ;3 :8% ;4:10% ;5:12% ; 6 :阴性对照。
[0031] 图 6 :乙型脑炎 Real-Time NASBA灵敏度实验结果，其中，I :1. 5X109copy/yL ;2 : 1. 5X IO8Copy/ μ L ；3 ：I. 5 X IO7Copy/ μ L ；4 ：I. 5 X IO6Copy/ μ L ；5 ：I. 5 X IO5Copy/ μ L ；6 ： I. 5Χ IO4Copy/ μ L ；7 ：1. 5Χ IO3Copy/ μ L ；8 ：1. 5Χ IO2Copy/ μ L ；9 ：1. 5Χ IO1Copy/ μ L ；10 ： I. 5copy/ μ L ;11 :1· 5Χ 10 1Copy/ μ L ;12 :阴性对照。
[0032] 图 7 :RT-PCR 灵敏度实验电泳图，其中，M :marker2000 ;1 :1. 5X109copy/yL ;2 : I. 5X IO8Copy/ μ L ；3 ：I. 5 X IO7Copy/ μ L ；4 ：I. 5 X IO6Copy/ μ L ；5 ：I. 5 X IO5Copy/ μ L ；6 ： I. 5Χ IO4Copy/ μ L ；7 ：1. 5Χ IO3Copy/ μ L ；8 ：1. 5Χ IO2Copy/ μ L ；9 ：1. 5Χ IO1Copy/ μ L ；10 ： I. 5copy/yL ;11 :1. SXK^copy/yL ;NTC 为阴性对照。
[0033] 图8 :Real time-NASBA特异性实验，其中，1 :猪瘟病毒；2 :乙脑病毒；3 :繁殖与呼 吸系统综合征病毒；4 :流行性腹泻病毒；5 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0034] 下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果，但本发明的保护 范围不限于如下实施例。
[0035] 实施例1、阳性对照品的制备
[0036] 从日本乙型脑炎病毒细胞培养液中用超离的方式提纯收获病毒颗粒，提取病毒 RNA。设计NSl基因扩增引物N-Primer-I和N-Primer-2,利用RT-PCR技术扩增获得约520bp 的日本乙型脑炎NSl基因片段。将获得的RT-PCR产物插入pGEM-4z克隆质粒，构建重组质 粒pGEM-4z-NSl，并进行序列测定。测序结果与GenBank中随机选择的10条5种不同基因 型的日本乙型脑炎病毒NSl基因序列进行同源比对分析，保证其同源性达到95%以上。阳 性克隆菌株增菌后提取质粒DNA，线性化后，利用质粒上的T7启动子，对插入的NSl基因进 行体外转录，获得NSl的单链RNA。转录后用DNase I消化去除其中的DNA分子，然后利用 全式金公司的试剂盒Easypure RNA Purification kit进行过柱纯化。利用微量紫外分光 光度计测定纯化后RNA的浓度，通过其分子量计算出拷贝数。分装后于-80°C保存，作为试 剂盒的阳性对照。
[0037] 上述引物序列为：
[0038] N-Primer-I:GCTCTAGAGCACTCATCATTCCGCATACCAT
[0039] N-Primer-2:CGGAATTCCGCATACCTCGCCAAATCAGTGT
[0040] 实施例2、日本乙型脑炎病毒实时荧光NASBA检测体系的建立与优化 [0041] 针对影响实时荧 光NASBA检测体系的重要条件因素进行反应条件的优化。
[0042] 1、各项因素及优化方法
[0043] ①AMV buffer体积：按照表1的反应体系配置2XNASBA反应液，固定其他参数， 分别调节 AMV buffer 的体积至 2. 4yL、2. 8 yL、3. 2 yL、3. 6 yL、4. 0 yL、4. 4 yL，以乙脑 病毒NSl基因体外转录RNA为模板进行实时荧光NASBA扩增。实时结束后比较不同AMV buffer对扩增效率和荧光曲线的影响，结果如图1。AMV buffer体积与各个成分浓度成分 对照见表3。
[0044] 表 3 AMV buffer 体积和 Tris-HCl，KCl，MgCl2, DTT 成分浓度对照表
[0045]
[0046] ②dNTP/NTP的浓度组合：按照表1的反应体系配置2XNASBA反应液，固定其他参 数，分别调节dNTP/NTP的终浓度至0. 5mM/2mM，lmM/2mM，I. 5mM/2mM，2mM/2mM，以乙脑病毒 NSl基因体外转录RNA为模板进行实时荧光NASBA扩增。实时结束后比较不同dNTP/NTP浓 度组合对扩增效率和荧光曲线的影响，结果如图2。
[0047] ③上下游引物的浓度比：按照表1的反应体系配置2XNASBA反应液，固定 其他参数，分别调节上下游引物的浓度比为〇. 125 μ M/0. 125 μ M，0. 25 μ M/0. 25 μ M， 0· 375 μΜ/0· 375 μΜ，0· 5 μΜ/0· 5 μΜ，0· 625 μΜ/0· 625 μΜ。以乙脑病毒 NSl 基因体外转录 RNA为模板进行实时荧光NASBA扩增。实时结束后比较不同上下游引物的浓度比对扩增效 率和荧光曲线的影响，结果如图3。
[0048] ④引物与探针的浓度比：按照表1的反应体系配置2XNASBA反应液，固 定其他参数，分别调节引物和探针的浓度比为〇. 25 μ Μ/0. 5 μ Μ，0. 25 μ Μ/0. 25 μ Μ， 0. 25μΜ/0. 15μΜ，0. 25μΜ/0. 1 μΜ以乙脑病毒NSl基因体外转录RNA为模板进行实时荧 光NASBA扩增。实时结束后比较不同引物与探针的浓度比对扩增效率和荧光曲线的影响， 结果如图4。
[0049] ⑤DMSO的浓度：按照表1的反应体系配置2 X NASBA反应液，固定其他参数，分别 调节引物DMSO的浓度比为4%，6%，8%，10%，12%，以乙脑病毒呢1基因体外转录1?隱为 模板进行实时荧光NASBA扩增。实时结束后比较不同DMSO的浓度对扩增效率和荧光曲线 的影响，结果见图5。
[0050] 2、结果：针对每个动力学优化实验，系统比较实时NASBA反应所获得的荧光增长 曲线情况，结果发现当AMV buffer体积选用4. 0 μ L、dNTP/NTP的浓度组合选用0. 5mM/2mM、 上下游引物浓度比选择〇. 125 μM/0. 125 μM，引物和探针的浓度比为0. 125 μM/0. 25 μM， DMSO浓度为10%时，通过90分钟的NASBA等温扩增所得的扩增效果最佳。因此选用上述 最优条件确定为试剂盒各组分的组成。
[0051] 实施例3、日本乙型脑炎病毒实时荧光NASBA试剂盒的组分和检测方法
[0052] 1、试剂盒的组成（保存于_20°C )
[0053] ① 2X 实时 NASBA 反应液：含有 Tris-HCl IOOmM, KCl IOOmM, MgCl220mM, DTT 20mM，DMSO 20 %，NTP 4mM，dNTP ImM，上游引物、下游引物（Primer-1、Primer-2)各 0· 125 μ M，以及分子信标探针（Tagl) 0· 25 μ Μ。
[0054] ②4Χ酶混合液：含有AMV反转录酶I. 6U/ μ L，T7RNA聚合酶8U/ μ L，Rnase H 0· 04U/μ L，Ribonuclease Inhibitor 2U/μ L，BSA 2· 0 μ g〇
[0055] ③阳性对照：为日本乙型脑炎病毒体外转录的NSl基因的RNA片段。
[0056] ④阴性对照：为无菌生理盐水，在核酸提取时与标本同时平行提取以作为阴性对 照使用。
[0057] ⑤DEPC水：为DEPC处理的无核酸酶的超纯水，作为空白对照使用。
[0058] 2、试剂盒检测方法
[0059] ①待检样品RNA模板的制备：本发明试剂盒未提供RNA样本提取试剂，使用时可根 据样品类型选用合适的商品化试剂盒提取病毒核酸。
[0060] ②配置实时荧光NASBA反应液：取10 μ L 2 X NASBA反应液加入到5 μ L病毒RNA 模板中，瞬时离心30s，放置到荧光PCR仪器上。
[0061] ③反应预处理：将上述反应管置于恒温干浴器或普通PCR仪上，经65°C加热5min 后再41°C孵育5min。
[0062] ④上机检测：将5 X酶混合液取5 μ L加入上述反应管中，充分混匀后，简短离心。 然后将反应管置于荧光定量PCR仪中进行等温扩增和实时监测。反应条件为：4rC，90min， 设置每30-40s为循环，每个循环检测一次荧光信号，累计循环时间达90min即可。
[0063] ⑤结果判定：根据检测样本的荧光信号值判定结果，以阴性对照荧光信号值1. 2 倍为判定阈值。质控系统的判定为，阳性对照荧光信号值需大于判定阈值，空白对照荧光信 号值小于阈值，否则系统检测无效。当系统检测有效时，待检样品的荧光信号值大于等于判 定阈值时判为阳性，小于判定阈值时判为阴性。
[0064] ⑥注意事项：试剂盒阳性对照及扩增产物均是RNA，容易降解，所有步骤均应注意 进行带无粉手套操作，所用器皿、离心管和枪头均应DEPC水处理。
[0065] 实施例4、日本乙型脑炎病毒实时荧光NASBA试剂盒灵敏度分析
[0066] 1、方法：
[0067] ①样本处理：将体外转录的乙型脑炎病毒的RNA作为模板，利用微量紫外分光光 度计测定纯化后的RNA的浓度，通过分子量计算初始RNA模板的拷贝数为I. 5 X IO9Copy/ mL，然后对其做10倍梯度稀释至ΚΓ2,共计12个浓度梯度，每个浓度梯度取5 μ L作为模板， 拷贝数即为I. 5Χ IO9至I. 5Χ 10 _2。
[0068] ②2组平行对照试验：分别用本发明所述实时NASBA检测试剂盒和普通RT-PCR 技术对上述12个梯度稀释样本和1个阴性对照进行扩增检测。RT-PCR试剂购自宝生物 公司，RT-PCR 体系为20yL:2Xlstep buffer 10yL，PrimerScript I step Enzyme Mix 0· 5 μ L，上游引物 0· 5 μ L，下游引物 0· 5 μ L，模板 5 μ L，RNase H2O 3. 5 μ L，PCR 程序： 45〇C 30min ；94〇C 5min ；94〇C 30s,60〇C 30s,72〇C 30s ；72〇C 10min〇
[0069] 2、结果：两组平行对照实验的检测结果表明，本发明所述NASBA试剂盒可检测到 拷贝数为个位（1.5X10°)的转录RNA，而且在30个循环（恒温扩增约30分钟）时就已 经达到阈值荧光信号并上升进入指数扩增期，结果见图6。RT-PCR反应的最低检出限是 I. 5X 103,结果见图7。本实施例不仅证实本发明所述实时NASBA乙脑检测试剂盒敏感度比 普通RT-PCR高IO 3倍，同时也证实本发明所述实时NASBA检测试剂盒比RT-PCR扩增效率 高，而且所需时间短。
[0070] 实施例5、日本乙型脑炎病毒实时荧光NASBA试剂盒特异性分析
[0071] 1、样本：用商品化的病毒RNA/DNA提取试剂盒提取猪常见病毒：猪瘟病毒、繁殖与 呼吸系统综合征（蓝耳病毒）病毒、伪狂犬病毒、乙脑的RNA。
[0072] 2、方法：分别对提取的猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒的RNA， 取PCR管分别加入10 μ L的2X实时荧光NASBA反应液，然后加入各个病毒的RNA5 μ L， 65°〇51^11，41°0 51^11;打开盖子加入5\酶混合液5以1^，瞬时离心混匀，将？〇?管放入荧光 定量PCR仪中，设定条件：41°C 30s，90个循环。每个循环检测一次FAM荧光信号，反应结束 后读取结果。
[0073] 3、结果：实时NASBA检测试剂盒检测乙型脑炎病毒的特异性分析结果显示（图 8)，只有乙脑病毒的RNA扩增出目的条带，其它病毒和阴性对照检测均为阴性，表明本发明 有较好的特异性。
【主权项】
1. 一种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的特异性引物对，其特征在 于，该引物对包括正向引物Primer-I和反向引物Primer-2,Primer-I的碱基序列如SEQID NO:1所示，Primer-2的碱基序列如SEQIDNO:2所示。2. 权利要求1所述的特异性引物对在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的 用途。3. -种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的分子信标探针，其特征 在于，该探针在其寡核苷酸DNA分子的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记促灭基团 DABCYL，所述的探针寡核苷酸DNA分子的碱基序列如SEQIDNO:3所示。4. 权利要求3所述的分子信标探针在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的 用途。5. -种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有 权利要求1所述的特异性引物对和权利要求3所述的分子信标探针。6. 根据权利要求5所述的日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒，其特征在 于，该试剂盒包括以下成分： 2X实时NASBA反应液：含有IOOmMTris-HCl，100mMKCl，20mMMgCl2,20mMDTT，20%DMS0,4mMNTP，lmMdNTP，各 0? 125yM的Primer-l、Primer-2,以及 0.25yM分子信标探针； 4X酶混合液：含有I. 6U/yLAMV反转录酶，8U/yLI7RNA聚合酶，0. 04U/yLRnase H，2U/yLRibonucleaseInhibitor，0.1%的BSA07. 根据权利要求6所述的日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒，其特征在 于，该试剂盒含有以下成分： 阳性对照：为日本乙型脑炎病毒体外转录的NSl基因的RNA片段； 阴性对照：为无菌生理盐水，在核酸提取时与标本同时平行提取以作为阴性对照使 用； 空白对照：为无核酸酶的超纯水。
【专利摘要】本发明公开了一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒及其引物和探针，该试剂盒包括以下成分：100mM Tris-HCl，100mM KCl，20mM MgCl2，20mM DTT，20％DMSO，4mM NTP，1mM dNTP，各0.125μM的Primer-1、Primer-2，以及0.25μM分子信标探针；1.6U/μL AMV反转录酶，8U/μL T7RNA聚合酶，0.04U/μL Rnase H，2U/μL Ribonuclease Inhibitor，0.1％的BSA。本发明通过设计并结合临床样本筛查优化选择出的特异性正向引物、反向引物和分子信标探针，同步识别乙型脑炎病毒的3个不同区域，保证了扩增的特异性；可检测出样品中所含的个位拷贝数的乙脑病毒RNA，提高了乙脑检测的敏感性。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894112
【申请号】CN201510256259
【发明人】周丹娜, 田永祥, 刘学, 郭锐, 段正赢, 杨克礼, 袁芳艳, 刘威, 刘泽文, 孟丽
【申请人】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒核酸检测技术领域，涉及一种基于核酸序列依赖性扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技术的日本乙型脑炎病毒快速检测技术。具 体涉及日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增快速检测试剂盒，以及所述试剂盒中使用的对 于乙型脑炎NSl基因具有特异性的引物对和分子信标探针。
【背景技术】
[0002] 日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒 属，是一种危害严重的人畜共患病病原。该病毒为单股正链RNA病毒，其核酸序列编码了 3 个结构蛋白和7个非结构蛋白（Nonstructural protein)，其中各基因型间NSl蛋白的同源 性较高，是建立该病核酸检测的良好候选基因。日本乙型脑炎经蚊传播，多见于夏秋季，对 患者神经系统的造成不可逆的损伤，病死率高，部分幸存者会遗留中枢神经系统后遗症。我 国为日本乙型脑炎高发区，平均年发病数约占全世界乙脑发病数的80%，且主要危害人群 为儿童，对人民的健康造成极大的危害。因此建立一套简便快速、特异性强的日本乙型脑炎 病毒检测技术，对该病的防控和临床诊有着十分重要的意义。
[0003] 由于乙脑的流行具有明显的季节性、地区性和临床病变，可以据其进行初步诊断， 但确诊还是需要通过实验室诊断，主要包括病毒的分离鉴定、酶联免疫法和RT-PCR等。病 毒分离培养法操作繁琐，耗时很长，不适于快速检测和临床紧急病情处理；酶联免疫检测 技术受其本身的限制，灵敏度比较低，不利于病程初期的诊断；RT-PCR、荧光RT-PCR以及 RT-LAMP等也是基于核酸扩增的检测方法，灵敏度较前两种方法提高了很多，但PCR的扩增 需要有反转录步骤以及变性、退火及延伸等多个温度点进行几十次升降温循环，耗时较长， 而LAMP方法对引物设计区域要求过高，在变异较大且频繁的RNA病毒上难以实现良好应 用。
[0004] 核酸序列依赖性扩增（NASBA)与以往核酸扩增技术不同，更为高效简便，尤其 适用于RNA病毒的检测。NASBA在AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、RNA酶H的介导下，在 41°C -42°C恒温条件下，经一对引物在体外连续扩增出均一的特异性的核酸序列。在该技 术的基础上结合分子信标探针（moleular beacon)可以建立实时焚光NASBA (Real-time NASBA)扩增技术。Real-time NASBA具有以下特点：①在同一温度条件下进行的等温扩增； ②与RT-PCR相比，无需15-30分钟的反转录过程，不受引物量限制，在60-90分钟内使模板 RNA扩增IO9倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA ;③只对RNA模板 进行扩增，不受双链DNA污染的影响，且产物通过分子信标探针来检测，实现了实时检测并 减少了对环境的污染。④与RT-LAMP相比，更容易筛选出检测靶位点，满足变异度高的核酸 病毒检测要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基于实时荧光核酸序列依赖性扩增技术（Real-time NASBA)对日本乙型脑炎NSl基因具有特异性检测作用的引物对和分子信标探针；此外，本 发明还提供了一种包含上述引物对和分子信标的日本乙型脑炎Real-time NASBA检测试剂 盒。
[0006] 为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研宄并不懈努力，最终获得了如下 技术方案：
[0007] -种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的特异性引物对，该引物对 包括正向引物Primer-I和反向引物Primer-2,所述正向引物和反向引物的碱基序列如下 所示：
[0008] Primer-I :5, -GACGTTAGCAGGTAGACGAGGCATGATGAAACAACACTC-3,（SEQ ID NO :1);
[0009] Primer-2 :5' -CTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCTCTTGCGAAGGAC-3'（SEQ ID NO : 2) 〇
[0010] 一种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的分子信标探针Tagl，该 分子信标探针在其寡核苷酸DNA分子的5'端标记焚光报告基团FAM，3'端标记促灭基团 DABCYL，探针上的寡核苷酸DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO :3所示。整个探针形式如下 所示：
[0011] 5 ' FAM-CATCGCAGCTGGGCCTTCTGGTGATGTTTCTCGATG-DABCYL-3 '。
[0012] 由于上述特异性引物对和分子信标探针可用来检测离体标本中是否存在乙型脑 炎病毒的NSl基因，进而确定样品中是否含有乙型脑炎病毒，因此本发明还提供一种产品 新用途，即：上述的特异性引物对在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的用途； 或者，上述的分子信标探针在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的用途。
[0013] 本发明提供的一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒至少包括： 2 X实时荧光NASBA反应液和4 X酶混合液。所述2 X实时荧光NASBA反应液包含有如上 所述的正向引物Primer-Ι、反向引物Primer-2和分子信标探针；4X酶混合液包AMV反转 录酶、T7RNA聚合酶和RNase H酶等。
[0014] 进一步优选，所述2X实时荧光NASBA反应液各组分见表1，4X酶混合液各组分 见表2。
[0015] 表1 :2 X实时荧光NASBA反应液
[0016]
[0019] 所述的日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒还包括阳性对照、阴性对 照和空白对照，所述阳性对照为乙型脑炎体外转录NSl基因的RNA片段，所述阴性对照为在 核酸提取时与标本同时平行提取无菌生理盐水，所述空白对照为无核酸酶的超纯水。
[0020] 与现有技术相比，本发明首次通过提供一种对乙型脑炎病毒NSl基因具有特异性 的一对引物和一条分子信标探针，包含上述引物对和分子信标探针的试剂盒，来检测离体 标本中是否存在乙型脑炎病毒的NSl基因，进而确定样品中是否含有乙型脑炎病毒；本发 明在设计筛选扩增引物时，以乙脑病毒检测的特异性和通用性为本，综合考虑引物和探针 的Tm值、3 '末端自由能，GC含量、RNA二级结构、Λ G等因素，并分析比较了日本乙型脑炎病 毒5个不同基因型毒株的基因序列，所设计筛选的引物可对不同基因型NSl进行检测。另 外，本发明所涉及的检测试剂盒具有以下优点：
[0021] 1、等温扩增：避免了普通RT-PCR对温度循环的特殊要求所带来的种种不便；
[0022] 2、特异：通过精心设计并结合临床样本筛查优化选择出的特异性正向引物、反向 引物和分子信标探针，同步识别乙型脑炎病毒的3个不同区域，保证了扩增的特异性；
[0023] 3、灵敏：由于NASBA自身的扩增特点，使得检测灵敏度进一步提高，拷贝数为个位 的模板可被检出；
[0024] 4、高效：可以在60-90分钟内完成检测，并使模板RNA扩增约IO9倍；
[0025] 5、实时监测：NASBA扩增结束后马上可以分析数据获得检测结果，无需再次操作 减少对环境的污染。
【附图说明】
[0026] 图 I :NASBA 的 AMV buffer 体积的优化，其中，1 :2· 4 μ L ;2 :2· 8 μ L ;3 :3· 2 μ L ;4 : 3. 6 μ L ;5 :4. 0 μ L ;6 :4· 4 μ L ;7 :4· 8 μ L。
[0027] 图 2 :NASBA 的 dNTP/NTP 浓度的优化，其中，1 :0· 5mM/2mM ;2 :lmM/2mM，3 : I. 5mM/2mM ;4 :2mM/2mM。
[0028] 图 3 :NASBA 引物浓度的优化，其中，1 :0· 125mM ;2 :0· 25mM ;3 :0· 375mM ;4 :0· 5mM ; 5 :0. 625mM ;6 :阴性对照；7 :空白对照。
[0029] 图 4 :NASBA 反应探针浓度的优化，其中，I :0. 5mM ;2 :0. 375mM ;3 :0. 25mM ;4 : 0. 125mM。
[0030] 图 5 :NASBA 反应的 DMSO 浓度的优化，其中，1:4% ;2:6% ;3 :8% ;4:10% ;5:12% ; 6 :阴性对照。
[0031] 图 6 :乙型脑炎 Real-Time NASBA灵敏度实验结果，其中，I :1. 5X109copy/yL ;2 : 1. 5X IO8Copy/ μ L ；3 ：I. 5 X IO7Copy/ μ L ；4 ：I. 5 X IO6Copy/ μ L ；5 ：I. 5 X IO5Copy/ μ L ；6 ： I. 5Χ IO4Copy/ μ L ；7 ：1. 5Χ IO3Copy/ μ L ；8 ：1. 5Χ IO2Copy/ μ L ；9 ：1. 5Χ IO1Copy/ μ L ；10 ： I. 5copy/ μ L ;11 :1· 5Χ 10 1Copy/ μ L ;12 :阴性对照。
[0032] 图 7 :RT-PCR 灵敏度实验电泳图，其中，M :marker2000 ;1 :1. 5X109copy/yL ;2 : I. 5X IO8Copy/ μ L ；3 ：I. 5 X IO7Copy/ μ L ；4 ：I. 5 X IO6Copy/ μ L ；5 ：I. 5 X IO5Copy/ μ L ；6 ： I. 5Χ IO4Copy/ μ L ；7 ：1. 5Χ IO3Copy/ μ L ；8 ：1. 5Χ IO2Copy/ μ L ；9 ：1. 5Χ IO1Copy/ μ L ；10 ： I. 5copy/yL ;11 :1. SXK^copy/yL ;NTC 为阴性对照。
[0033] 图8 :Real time-NASBA特异性实验，其中，1 :猪瘟病毒；2 :乙脑病毒；3 :繁殖与呼 吸系统综合征病毒；4 :流行性腹泻病毒；5 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0034] 下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果，但本发明的保护 范围不限于如下实施例。
[0035] 实施例1、阳性对照品的制备
[0036] 从日本乙型脑炎病毒细胞培养液中用超离的方式提纯收获病毒颗粒，提取病毒 RNA。设计NSl基因扩增引物N-Primer-I和N-Primer-2,利用RT-PCR技术扩增获得约520bp 的日本乙型脑炎NSl基因片段。将获得的RT-PCR产物插入pGEM-4z克隆质粒，构建重组质 粒pGEM-4z-NSl，并进行序列测定。测序结果与GenBank中随机选择的10条5种不同基因 型的日本乙型脑炎病毒NSl基因序列进行同源比对分析，保证其同源性达到95%以上。阳 性克隆菌株增菌后提取质粒DNA，线性化后，利用质粒上的T7启动子，对插入的NSl基因进 行体外转录，获得NSl的单链RNA。转录后用DNase I消化去除其中的DNA分子，然后利用 全式金公司的试剂盒Easypure RNA Purification kit进行过柱纯化。利用微量紫外分光 光度计测定纯化后RNA的浓度，通过其分子量计算出拷贝数。分装后于-80°C保存，作为试 剂盒的阳性对照。
[0037] 上述引物序列为：
[0038] N-Primer-I:GCTCTAGAGCACTCATCATTCCGCATACCAT
[0039] N-Primer-2:CGGAATTCCGCATACCTCGCCAAATCAGTGT
[0040] 实施例2、日本乙型脑炎病毒实时荧光NASBA检测体系的建立与优化 [0041] 针对影响实时荧 光NASBA检测体系的重要条件因素进行反应条件的优化。
[0042] 1、各项因素及优化方法
[0043] ①AMV buffer体积：按照表1的反应体系配置2XNASBA反应液，固定其他参数， 分别调节 AMV buffer 的体积至 2. 4yL、2. 8 yL、3. 2 yL、3. 6 yL、4. 0 yL、4. 4 yL，以乙脑 病毒NSl基因体外转录RNA为模板进行实时荧光NASBA扩增。实时结束后比较不同AMV buffer对扩增效率和荧光曲线的影响，结果如图1。AMV buffer体积与各个成分浓度成分 对照见表3。
[0044] 表 3 AMV buffer 体积和 Tris-HCl，KCl，MgCl2, DTT 成分浓度对照表
[0045]
[0046] ②dNTP/NTP的浓度组合：按照表1的反应体系配置2XNASBA反应液，固定其他参 数，分别调节dNTP/NTP的终浓度至0. 5mM/2mM，lmM/2mM，I. 5mM/2mM，2mM/2mM，以乙脑病毒 NSl基因体外转录RNA为模板进行实时荧光NASBA扩增。实时结束后比较不同dNTP/NTP浓 度组合对扩增效率和荧光曲线的影响，结果如图2。
[0047] ③上下游引物的浓度比：按照表1的反应体系配置2XNASBA反应液，固定 其他参数，分别调节上下游引物的浓度比为〇. 125 μ M/0. 125 μ M，0. 25 μ M/0. 25 μ M， 0· 375 μΜ/0· 375 μΜ，0· 5 μΜ/0· 5 μΜ，0· 625 μΜ/0· 625 μΜ。以乙脑病毒 NSl 基因体外转录 RNA为模板进行实时荧光NASBA扩增。实时结束后比较不同上下游引物的浓度比对扩增效 率和荧光曲线的影响，结果如图3。
[0048] ④引物与探针的浓度比：按照表1的反应体系配置2XNASBA反应液，固 定其他参数，分别调节引物和探针的浓度比为〇. 25 μ Μ/0. 5 μ Μ，0. 25 μ Μ/0. 25 μ Μ， 0. 25μΜ/0. 15μΜ，0. 25μΜ/0. 1 μΜ以乙脑病毒NSl基因体外转录RNA为模板进行实时荧 光NASBA扩增。实时结束后比较不同引物与探针的浓度比对扩增效率和荧光曲线的影响， 结果如图4。
[0049] ⑤DMSO的浓度：按照表1的反应体系配置2 X NASBA反应液，固定其他参数，分别 调节引物DMSO的浓度比为4%，6%，8%，10%，12%，以乙脑病毒呢1基因体外转录1?隱为 模板进行实时荧光NASBA扩增。实时结束后比较不同DMSO的浓度对扩增效率和荧光曲线 的影响，结果见图5。
[0050] 2、结果：针对每个动力学优化实验，系统比较实时NASBA反应所获得的荧光增长 曲线情况，结果发现当AMV buffer体积选用4. 0 μ L、dNTP/NTP的浓度组合选用0. 5mM/2mM、 上下游引物浓度比选择〇. 125 μM/0. 125 μM，引物和探针的浓度比为0. 125 μM/0. 25 μM， DMSO浓度为10%时，通过90分钟的NASBA等温扩增所得的扩增效果最佳。因此选用上述 最优条件确定为试剂盒各组分的组成。
[0051] 实施例3、日本乙型脑炎病毒实时荧光NASBA试剂盒的组分和检测方法
[0052] 1、试剂盒的组成（保存于_20°C )
[0053] ① 2X 实时 NASBA 反应液：含有 Tris-HCl IOOmM, KCl IOOmM, MgCl220mM, DTT 20mM，DMSO 20 %，NTP 4mM，dNTP ImM，上游引物、下游引物（Primer-1、Primer-2)各 0· 125 μ M，以及分子信标探针（Tagl) 0· 25 μ Μ。
[0054] ②4Χ酶混合液：含有AMV反转录酶I. 6U/ μ L，T7RNA聚合酶8U/ μ L，Rnase H 0· 04U/μ L，Ribonuclease Inhibitor 2U/μ L，BSA 2· 0 μ g〇
[0055] ③阳性对照：为日本乙型脑炎病毒体外转录的NSl基因的RNA片段。
[0056] ④阴性对照：为无菌生理盐水，在核酸提取时与标本同时平行提取以作为阴性对 照使用。
[0057] ⑤DEPC水：为DEPC处理的无核酸酶的超纯水，作为空白对照使用。
[0058] 2、试剂盒检测方法
[0059] ①待检样品RNA模板的制备：本发明试剂盒未提供RNA样本提取试剂，使用时可根 据样品类型选用合适的商品化试剂盒提取病毒核酸。
[0060] ②配置实时荧光NASBA反应液：取10 μ L 2 X NASBA反应液加入到5 μ L病毒RNA 模板中，瞬时离心30s，放置到荧光PCR仪器上。
[0061] ③反应预处理：将上述反应管置于恒温干浴器或普通PCR仪上，经65°C加热5min 后再41°C孵育5min。
[0062] ④上机检测：将5 X酶混合液取5 μ L加入上述反应管中，充分混匀后，简短离心。 然后将反应管置于荧光定量PCR仪中进行等温扩增和实时监测。反应条件为：4rC，90min， 设置每30-40s为循环，每个循环检测一次荧光信号，累计循环时间达90min即可。
[0063] ⑤结果判定：根据检测样本的荧光信号值判定结果，以阴性对照荧光信号值1. 2 倍为判定阈值。质控系统的判定为，阳性对照荧光信号值需大于判定阈值，空白对照荧光信 号值小于阈值，否则系统检测无效。当系统检测有效时，待检样品的荧光信号值大于等于判 定阈值时判为阳性，小于判定阈值时判为阴性。
[0064] ⑥注意事项：试剂盒阳性对照及扩增产物均是RNA，容易降解，所有步骤均应注意 进行带无粉手套操作，所用器皿、离心管和枪头均应DEPC水处理。
[0065] 实施例4、日本乙型脑炎病毒实时荧光NASBA试剂盒灵敏度分析
[0066] 1、方法：
[0067] ①样本处理：将体外转录的乙型脑炎病毒的RNA作为模板，利用微量紫外分光光 度计测定纯化后的RNA的浓度，通过分子量计算初始RNA模板的拷贝数为I. 5 X IO9Copy/ mL，然后对其做10倍梯度稀释至ΚΓ2,共计12个浓度梯度，每个浓度梯度取5 μ L作为模板， 拷贝数即为I. 5Χ IO9至I. 5Χ 10 _2。
[0068] ②2组平行对照试验：分别用本发明所述实时NASBA检测试剂盒和普通RT-PCR 技术对上述12个梯度稀释样本和1个阴性对照进行扩增检测。RT-PCR试剂购自宝生物 公司，RT-PCR 体系为20yL:2Xlstep buffer 10yL，PrimerScript I step Enzyme Mix 0· 5 μ L，上游引物 0· 5 μ L，下游引物 0· 5 μ L，模板 5 μ L，RNase H2O 3. 5 μ L，PCR 程序： 45〇C 30min ；94〇C 5min ；94〇C 30s,60〇C 30s,72〇C 30s ；72〇C 10min〇
[0069] 2、结果：两组平行对照实验的检测结果表明，本发明所述NASBA试剂盒可检测到 拷贝数为个位（1.5X10°)的转录RNA，而且在30个循环（恒温扩增约30分钟）时就已 经达到阈值荧光信号并上升进入指数扩增期，结果见图6。RT-PCR反应的最低检出限是 I. 5X 103,结果见图7。本实施例不仅证实本发明所述实时NASBA乙脑检测试剂盒敏感度比 普通RT-PCR高IO 3倍，同时也证实本发明所述实时NASBA检测试剂盒比RT-PCR扩增效率 高，而且所需时间短。
[0070] 实施例5、日本乙型脑炎病毒实时荧光NASBA试剂盒特异性分析
[0071] 1、样本：用商品化的病毒RNA/DNA提取试剂盒提取猪常见病毒：猪瘟病毒、繁殖与 呼吸系统综合征（蓝耳病毒）病毒、伪狂犬病毒、乙脑的RNA。
[0072] 2、方法：分别对提取的猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒的RNA， 取PCR管分别加入10 μ L的2X实时荧光NASBA反应液，然后加入各个病毒的RNA5 μ L， 65°〇51^11，41°0 51^11;打开盖子加入5\酶混合液5以1^，瞬时离心混匀，将？〇?管放入荧光 定量PCR仪中，设定条件：41°C 30s，90个循环。每个循环检测一次FAM荧光信号，反应结束 后读取结果。
[0073] 3、结果：实时NASBA检测试剂盒检测乙型脑炎病毒的特异性分析结果显示（图 8)，只有乙脑病毒的RNA扩增出目的条带，其它病毒和阴性对照检测均为阴性，表明本发明 有较好的特异性。
【主权项】
1. 一种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的特异性引物对，其特征在 于，该引物对包括正向引物Primer-I和反向引物Primer-2,Primer-I的碱基序列如SEQID NO:1所示，Primer-2的碱基序列如SEQIDNO:2所示。2. 权利要求1所述的特异性引物对在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的 用途。3. -种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的分子信标探针，其特征 在于，该探针在其寡核苷酸DNA分子的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记促灭基团 DABCYL，所述的探针寡核苷酸DNA分子的碱基序列如SEQIDNO:3所示。4. 权利要求3所述的分子信标探针在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的 用途。5. -种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有 权利要求1所述的特异性引物对和权利要求3所述的分子信标探针。6. 根据权利要求5所述的日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒，其特征在 于，该试剂盒包括以下成分： 2X实时NASBA反应液：含有IOOmMTris-HCl，100mMKCl，20mMMgCl2,20mMDTT，20%DMS0,4mMNTP，lmMdNTP，各 0? 125yM的Primer-l、Primer-2,以及 0.25yM分子信标探针； 4X酶混合液：含有I. 6U/yLAMV反转录酶，8U/yLI7RNA聚合酶，0. 04U/yLRnase H，2U/yLRibonucleaseInhibitor，0.1%的BSA07. 根据权利要求6所述的日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒，其特征在 于，该试剂盒含有以下成分： 阳性对照：为日本乙型脑炎病毒体外转录的NSl基因的RNA片段； 阴性对照：为无菌生理盐水，在核酸提取时与标本同时平行提取以作为阴性对照使 用； 空白对照：为无核酸酶的超纯水。
【专利摘要】本发明公开了一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒及其引物和探针，该试剂盒包括以下成分：100mM Tris-HCl，100mM KCl，20mM MgCl2，20mM DTT，20％DMSO，4mM NTP，1mM dNTP，各0.125μM的Primer-1、Primer-2，以及0.25μM分子信标探针；1.6U/μL AMV反转录酶，8U/μL T7RNA聚合酶，0.04U/μL Rnase H，2U/μL Ribonuclease Inhibitor，0.1％的BSA。本发明通过设计并结合临床样本筛查优化选择出的特异性正向引物、反向引物和分子信标探针，同步识别乙型脑炎病毒的3个不同区域，保证了扩增的特异性；可检测出样品中所含的个位拷贝数的乙脑病毒RNA，提高了乙脑检测的敏感性。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894112
【申请号】CN201510256259
【发明人】周丹娜, 田永祥, 刘学, 郭锐, 段正赢, 杨克礼, 袁芳艳, 刘威, 刘泽文, 孟丽
【申请人】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
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