一种花生种子中优势表达启动子的克隆和应用
一种花生种子中优势表达启动子的克隆和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的 可在花生种子中优势表达启动子的克隆和应用。
【背景技术】
[0002] 种子在农业生产和国民经济中占有举足轻重的地位。统计数据表明，人类粮食的 80%直接取自植物的种子，稻、麦等种子中富含淀粉，是人类赖以生存的主粮；大豆、花生、 油菜、芝麻等种子的含油量高，是食用油的主要来源。种子中储存物质的多少和组成成份， 直接影响作物的产量和品质。因此，提高粮食作物和油料作物产量、改善作物品质的根本在 于提高和改善其种子中储藏物质的积累量和组成。尽管常规育种技术所培育的优良作物品 种，为解决世界粮食安全问题、改善人民生活做出了重大贡献。然而，常规育种技术在继续 提高作物产量和品质方面的潜力有限。因此，挖掘新的功能基因，利用转基因技术提高花生 等作物产量及种子的含油量具有巨大的应用价值。
[0003] 花生作为重要的油料作物，不仅在国内农业经济中具有重要地位，而且在世界贸 易中也具有举足轻重的作用。研宄表明，不同植物种子储藏油脂的含量存在很大差异如主 要油料作物油菜为28% -48%、大豆15% -22%、花生44% -54%、芝麻45% -57%，并且 其主要脂肪酸组成也不同，油菜油中含有大量的芥酸（31-55% )，其他含量较高的不饱和 脂肪酸为油酸14-19%、亚油酸12-24%和亚麻酸1-10% ;大豆油中含量最高的为亚油酸 52-65%和油酸25-36%，并且棕榈酸（6-8% )、硬脂酸（3-5% )和亚麻酸（2-3% )也占 有较大比例；花生种子脂肪酸组成主要是：棕榈酸、油酸和亚油酸，分别占总脂肪酸含量的 10%、36-67%和15-43%，是除橄榄油外单不饱和脂肪酸油酸含量最高的。研宄花生种子发 育和储藏物质积累相关基因的表达调控，阐明相关基因的功能，对于通过基因工程改良其 他作物具有一定指导意义。
[0004] 启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板 DNA准确的结合并起始基因特异性地转录。启动子决定着基因转录的方向、效率和时空特 性，是理解基因表达和转录调控机制的关键。按作用方式和功能，可将启动子分为组成型 启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前在植物基因工程研宄中，组成型启动子的 应用最为广泛，如花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、玉米的Ubiquitin启动子和水稻的 Actinl启动子等。这些启动子能够驱动外源基因在植物的所有组织和器官中高效表达。然 而，许多具有时空表达特异性基因的过量表达往往造成能量浪费，有些外源基因的组成性 高表达还影响了植物的正常发育。为在确保植物正常生长的情况下，对目标性状进行更为 有效的定点、定时遗传改良，在植物基因功能鉴定研宄和基因工程遗传改良实践中更加倾 向于使用组织特异性或诱导型启动子。
[0005] 近年来，国内外多个实验室开展了花生种子发育和籽粒储藏物质积累相关基因启 动子的克隆与研宄，旨在充分了解基因的表达调控特征，为作物遗传改良提供依据。花生 籽粒中多个主要储藏蛋白一过敏原Arahl、2、3和6基因的启动子已被克隆和鉴定（Viquez 等，2003 ;2004 ;Zhong 等，2006 ;Bhattacharya 等，2012)，花生 Arah2 启动子驱动 GUS 在种 胚中特异表达，且强度高于35S启动子，而在种皮中基本无表达；花生Arah 6启动子驱动 ⑶S在子叶中表达，而在真叶中表达较弱。花生油体蛋白基因 Ah01eol7.8、Ah01eol8. 5启动 子（Li et al.，2009)和脂肪酸合成与油脂积累相关的基因如AhDGAT3(唐桂英等，2013)、 AhACP (单雷等，2014)启动子，也相继获得克隆与分析。调控种子发育的关键转录因子基 因 AhLEClA的启动子分析发现，其驱动的GUS基因在早期发育的种胚中特异表达，并且其特 异性表达受多个种子特异性调控元件和抑制其在营养组织中表达的负调控元件共同调节 (唐桂英等，2013)。
【发明内容】
[0006] 基于上述现有技术，本发明的发明人经过深入研宄，从花生中克隆获得了一个新 的1289bp花生AhLEClB基因的启动子，该启动子包括Y端非翻译区^ UTR)54bp和其 上游1235bp启动子区，其核苷酸序列如Seq ID N〇:l所示；同时本发明为了进一步验证其 功能，还构建了 1281bp启动子（包括52bp 5' UTR和1229bp启动子区，其基因序列如Seq IDNo:2所示）以及：y端缺失351bp(缺失部分包括52bp5 ,UTR和 299bp启动子区）的 930bp(其基因序列如Seq ID No:3所示）的启动子驱动的⑶S报告基因植物表达载体，并 转化拟南芥。实验表明，该1281bp启动子驱动的GUS基因主要在转基因植株的种子中高效 表达，在根、茎、叶、花中有极低水平的表达；而：V端缺失351bp的930bp启动子仅驱动⑶S 基因在幼嫩的茎中表达，因此利用1281bp和1289bp的启动子在种胚中高效表达的特性，可 以应用在提高种子储藏物质含量中；构建该启动子和相关基因的表达载体，调控淀粉、油脂 或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量。因此，该启动子的克隆对 植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
[0007] 该启动子是在已得到的花生AhLEClB基因的基因组序列（该基因其核苷酸序列如 Seq ID No:4所示）的基础上，通过染色体步移技术得到的1289bp AhLEClB基因 Y端上 游序列，其核苷酸序列如Seq ID No: 1所示。经转录起始位点分析发现，AhLEClB基因转录 起始位点位于翻译起始密码ATG上游-83nt处，通过PlantCARE和PLACE软件对该启动子 进行顺式调控元件分析，该序列除包含启动子中心元件TATA BOX，还包含光响应调控元件 GATA BOX(GATA)、GT1C0NSENSUS(GRWAAW)、S0RLIP1AT(GCCAC)以及莲座叶和根中高表达调 控元件RAVlA AT(CAACA)等；包含许多种子储藏蛋白和胚胎发育相关基因启动子中均含有 的 E BOX (CANNTG)、CARGCW8GAT (CffffffffffffffffG)以及胚表达调控元件 DPBF CORE (ACACNNG)、 SEF4M0TIF(RTTTTTR)等；包含细胞分裂素、赤霉素、乙烯等植物激素响应调控元件CPB Sequence (TATTAG)、CARE element (CAACTC)、ERE Motif(AWTTCAAA)等；另外，还含有一些 负调控基因表达的元件 WRKY710S (TGAC)、SREATMSD (TTATCC)、HDZIP2ATATHB2 (TAATMATTA) 等。
[0008] 与已知的AhLEClA相比，本发明所针对的AhLEClB有着显著的不同之处，它们核 苷酸序列存在28个碱基的差异，编码蛋白有11个不同的氨基酸，氨基酸相似性达95%。 AhLEClA 和 AhLEClB 基因组 DNA 长度分别为 2279bp 和 2166bp。AhLEClA 和 AhLEClB 在根、 茎、叶、花和未成熟种子及种子发育过程中的表达特征均不同。而根据其获得的相应启动子 也有着明显的不同之处。
[0009] 为了完成该启动子的初步功能分析，本发明以pCAMBIA3301为出发载体，分别以 Fl为正向引物、Rl和R2为反向引物，扩增相应的启动子片段，构建了含有AhLEClB基因 1281bp启动子片段和Y端缺失351bp (包括Y UTR和300bp启动子区）的930bp启动子 片段的⑶S基因植物表达载体，即用不同启动子片段取代pCAMBIA3301中驱动⑶S基因表 达的35S启动子，获得的植物表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，即待拟南 芥繁殖开花时，配制浸染液，用农杆菌浸染将要开放的花序。
[0010] 本发明分别取转基因拟南芥的根、茎、叶、花和种胚，通过现有的方法检测GUS基 因的表达情况。本发明所提供的1281bp启动子区域中，包括5'端非翻译区52bp和其上 游启动子1229bp区段，其基因序列如Seq ID N〇:2所示，即可驱动⑶S基因在种胚中高 效表达，而在植物根、茎、叶、花器官中表达量极低；而缺失了:V端351bp的930bp启动子 区段由于缺失了核心区域的TATA BOX及其他重要的诱导型调控元件，故驱动功能基本丧 失。由此可见本发明克隆的花生AhLEClB基因的包括Y端非翻译区52bp和其上游启动子 1229bp区段具有在种子中高效表达的特性。
[0011] 通过上述实验，发明人证实了，在本发明提供的1281bp 5'端上游调控区包括非 翻译区52bp和其上游启动子1229bp区段，其基因序列Seq ID No: 2所示；以及包括Y端 非翻译区C UTR)54bp和其上游1235bp启动子区，其核苷酸序列如Seq ID No:l所示的 1289bp花生AhLEClB基因的启动子，两者具有在种胚中高效表达的特性。同时这种在种胚 中尚效表达的特性，可以应用在提尚种子储减物质含量中；构建该启动子和相关基因的表 达载体，调控淀粉、油脂或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量。 因此，该启动子的克隆对植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
【附图说明】
[0012] 图1为扩增获得的花生AhLEClB基因1289bp 5'端上游序列扩增的电泳图，
[0013] 图中M为Trans2K DNA Marker，LD、LE、LP和LS为不同基因组文库扩增结果， LP泳道箭头所指为扩增的目的启动子片段；由图中结合实施例可知，扩增得到的序列为 1289bp，包括1235bp的启动子序列、54bp 5'非编码区序列；
[0014] 图2为花生AhLEClB基因启动子区域可能的顺式作用元件；
[0015] 图3为花生AhLEClB基因启动子驱动⑶S表达的载体构建流程图；
[0016] 图4为不同长度启动子片段PCR扩增；
[0017] 图中Ql启动子大小1281bp，Q2为930bp ;
[0018] 图5为本发明所提供的1281bp和930bp启动子片段驱动的⑶S基因表达结构转 基因拟南芥根、茎、叶、花和种胚GUS活性组织化学检测图；
[0019] 图中自上而下为拟南芥根和叶、茎、花和种胚；CK-P为转基因阳性对照，CK-N为未 转基因阴性对照；
[0020] 该图中Ql启动子驱动⑶S基因的转基因拟南芥种胚染色较深，其他组织未染色； Q2启动子驱动GUS基因的转基因拟南芥除了在幼茎中有较浅染色外，其余组织均无染色； CK-P为35S驱动⑶S基因的转基因阳性对照，植株的各组织均有染色；CK-N为未转基因阴 性对照，植株各组织均为无色；
[0021] 由图可见包括52bp 5' UTR和其上游1229bp区段启动子可驱动⑶S基因在种胚 中高效表达；而缺失了：V端351bp的930bp启动子区段则仅能驱动⑶S基因在幼嫩的茎 中表达。
【具体实施方式】
[0022] 本发明的实施步骤是根据花生AhLEClB基因的基因组DNA序列用染色体步移的方 法克隆得到该基因的启动子序列一启动子顺式作用元件分析及功能预测一设计带有酶切 位点Hind III和Nco I的引物从启动子DNA上扩增得到不同长度的目的启动子序列一用同 样的酶Hind III和Nco I酶切载体pCAMBIA3301 -目的片段连接到酶切的pCAMBIA3301载 体上一含植物表达载体的农杆菌转化拟南芥一转基因拟南芥鉴定和筛选纯合体转基因株 系一⑶S组织化学染色检测⑶S表达部位及强度，分析启动子功能。本实施例中的其他技 术均采用已有技术。
[0023] 实施例1花生AhLEClB基因启动子的克隆
[0024] I. 1花生基因组DNA的提取
[0025] 用植物DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司产品）提供的方法提取花生 幼叶的DNA，溶解于适量TE (pH8. 0)缓冲液中；
[0026] 1. 2花生AhLEClB基因启动子的克隆
[0027] 分别取2. 5yg花生基因组DNA经Dral、EcoRV、PvuII、StuI内切酶酶切、苯酚 抽提纯化后，溶解于20 μ I TE (pH 7. 5)缓冲液中。分别取4 μ 1酶切完全的DNA，按照BD GenomeWalker Universal Kit 的要求连接上 Adaptor (序列：5'GTAATACGACTCACTATAGGG CACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 3'，如 Seq ID No: 5 所示），构建 4 个花生基因组 DNA 文 库（LD、LE、LP、LS)。根据已获得的花生AhLEClB基因的基因组序列，设计该基因的2个嵌 套的 3'端特异性引物 LEC1BGSP2-1(5'CCTTGTTCCCATGTAAAACCATGAAAGCA 3'，如 Seq ID No:6 所示）和 LEC1BGSP2-2(5'AGGTAAAGCAGCCGCTAATCTAGTTAGT 3'，如 Seq ID No:7 所 示）。以 API C 端接头引物：5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'，如 Seq ID No:8 所示）和 LEC1BGSP2-1为引物进行第一轮扩增，扩增体系为25 μ 1，模板量为1 μ 1，扩增条件为：94°C 25sec，72°C 3min，7 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，32 个循环；最后 67°C继续延伸 7min。 第二轮巢式PCR模板为1 μ 1第一轮PCR产物10倍稀释液，引物为5 '端巢式接头引物 轮 PCR 相同，扩增条件 94°C 25sec，72°C 3min，5 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，20 个循 环；最后67°C继续延伸7min。1%琼脂糖电泳检测PCR结果（见图I);
[0028] 挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆 经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。
[0029] I. 3RNA提取和转录起始位点确定
[0030] 用CTAB法提取不同发育时期种子的总RNA，经琼脂糖电泳检测RNA质量和分光光 度计定量后，等量混合储存于_80°C冰箱备用。为防止RNA酶污染，研钵、研锤、药匙均以 180°C烘烤6h，所用塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡，于室温下过夜后，高温灭菌处理。
[0031] 用Invitrogen公司GeneRacer? Kit提供的方法和试剂，取5 μ g混合好的LH14种 子总RNA，按照说明书要求用碱性磷酸酶（CIP)将截断的mRNA或其他非mRNA5'端去磷酸 化，然后将抽提纯化并沉淀的全长mRNA脱去帽子结构，并连接上RNA接头（GeneRacer RNA 01igo:5'CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA3'JnSeqIDNo:l(^；f*); 以此RNA为模板，用试剂盒提供的随机引物和SurperScript?III RT酶反转录合成cDNA ;最 终将合成的cDNA克隆至载体pCR4-T0P0中，获得LH14不同发育时期种子全长cDNA文库， 用于随后转录起始位点扩增。根据已获得的花生AhLEClB基因的cDNA序列，设计2个该 基因的 3'端特异性引物，引物序列为：TSS GSP1-15'TCTTTTGCGTCGTCGGAGATTTTAGC 3'， 如Seq ID No: 11所示，TSS GSP2与LEC1BGSP2-2相同。以构建的cDNA文库为模板，分别 以 TSS GSPl-I 引物与 GeneRacer? 5'Primer(5'CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3'，如 Seq ID No: 12所示）进行第一轮PCR扩增，PCR体系参照BD Advantage?2PCR Kit要求，扩增条件 为：94°C预变性 2min ;94°C 30sec，72°C 30sec，5 个循环；94°C 30sec，70°C 30sec，5 个循 环；94°C 30sec，63°C 30sec，68°C 30sec，20-25 个循环；最后 68°C继续延伸 lOmin。第一 轮PCR产物经电泳检测后，用缓冲液稀释50倍，用于第二轮巢式PCR。取1 μ 1第一轮PCR 产物，以 TSS GSP2 和 GeneRacer? 5，Nested Primer(5，GGACACTGACATGG ACTGAAGGAGTA 3'， 如569 10此：13所示）进行第二轮？0?，扩增条件为：94°0预变性2!1^11;94°0 3〇86(3,65°〇 30sec，68°C IOsec，35个循环；最后68°C继续延伸IOmin。I. 5 %琼脂糖电泳检测PCR结果。
[0032] 挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆 经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。
[0033] 1.4启动子序列分析
[0034] 应用在线植物转录元件分析工具 PLACE (http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/)、 PlantCARE(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)对花生 AhLEClB启动子序列进行分析，结果见图2。
[0035] 1. 5不同长度花生AhLEClB基因启动子片段的扩增
[0036] 设计克隆AhLEClB基因不同长度启动子所需的引物，引物Rl和R2为3'端下游引 物，序列如Seq ID No: 14和15所示；引物Fl为5'端上游引物，序列如Seq ID No: 16所示。 Rl和R2中下划线部分CCATGG为Nco I酶切位点；引物Fl中下划线部分AAGCTT为Hind III 酶切位点。利用引物Fl分别与RU R2,以已克隆的含有AhLEClB基因1289bp启动子的重 组质粒为模板，扩增不同长度的启动子片段，扩增片段长度分别为1281bp(Ql)、930bp(Q2)， 如图3所示；
[0037] PCR扩增体系为 20 μ 1 :包括 10 X PCR buffer 2 μ I，dNTP mixure (各 2. 5mM) 1 μ 1， 上、下游引物各0.5 μ 1，模板DNA 1 μ 1，Taq酶0.25 μ 1，加 CldH2O补足20 μ 1。反应程序为： 预变性 94°C 2min;变性 94°C 30sec，退火 55°C 30sec，延伸 72°C lmin-lmin 30sec (根据 扩增片段长度调整），30个循环；最后72°C继续延伸10m in。
[0038] 扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小正确，回收目的片段，克隆到 PEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测 序仪进行双向测序。
[0039] 表LAhLEClB基因不同启动子分析引物
[0040]
[0041] 实施例2植物表达载体的构建与转化
[0042] 2. 1花生AhLEClB基因启动子序列与⑶S报告基因的融合
[0043] 选择PCAMBIA3301作为植物表达载体，将测序正确的连有目的片段的克隆载体酶 切，电泳并胶回收目的片段。同时用限制性内切酶HindIII和Nco I酶切表达载体，并回收 载体片段。连接启动子片段与载体片段，经质粒酶切图谱鉴定筛选含不同长度启动子的 PCAMBIA3301-AhLEClB启动子重组载体。具体过程可参考图4所示：
[0044] 1.用带有酶切位点的引物Fl分别与R1、R2扩增AhLEClB基因的不同长度启动子 区段，并凝胶电泳分离和回收目的片段，克隆至PEASY-T3载体，测序。
[0045] 2.用Hind III和Nco I双酶切回收目的片段和植物表达载体pCAMBIA3301。
[0046] 3.回收：进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有AhLEClB启动子序列的DNA片段和 PCAMBIA3301载体片段。
[0047] 4.连接，连接体系如下：
[0048]
[0049] 混匀后16°C连接过夜。
[0050] 5.转化：取5 μ 1连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉 素的固体培养基平板上。
[0051] 6.重组子的筛选：对长出的菌落进行重组质粒酶切图谱鉴定。
[0052] 2. 2农杆菌感受态细胞的制备
[0053] L挑取单菌落GV3101，接种于5ml加有50mg利福平（Rifampicin)的液体LB培 养基中，28 °C，200rpm，过夜培养。
[0054] 2.取2ml培养物至100mL液体LB培养基中，继续培养至0D600为0. 8左右。将培 养物冰浴 30min，4°C，5000rpm，离心 5min。
[0055] 3.弃上清。用 IOml 0· lmol/L 冷的 NaCl 悬浮菌体；4°C，5000rpm，离心 5min。
[0056] 4.弃上清。用1111120臟〇1/1冷的0&(：12悬浮菌体，分装成50以1/管，液氮中速冻 后，-80°C保存。
[0057] 2. 3冻融法转化农杆菌
[0058] 1.冰上融化农杆菌GV3101感受态细胞，加入1 μ 1带有目的片段的pCAMBIA3301 质粒，冰冻30min，液氮中冷冻lmin，然后在37°C水浴5min。
[0059] 2.加入1ml无抗生素的YEP培养基，28 °C，200rpm，振荡培养3h。
[0060] 3. 10, OOOrpm离心Imin收集菌体，用100 μ IYEP液体培养基重悬菌体。
[0061] 4.将重悬的菌体涂布于附加50mg/L卡那霉素 （Kanamycin sulfate)和100mg/L 利福平的固体YEP培养基上，28°C下培养2-3天。
[0062] 5.酶切及PCR鉴定阳性克隆。
[0063] 2. 4农杆菌介导转化拟南芥
[0064] 1.农杆菌的培养：从_80°C冰箱中取出所需要的菌种，在冰浴中融化。分别取 30 μ 1的农杆菌接种于5ml的YEP培养基（含100mg/L利福平，50mg/L卡那霉素），28°C， 200rpm，振荡培养过夜。然后在附加50mg/L卡那霉素和lOOmg/1利福平的固体YEP培养基 上划板培养，已挑选单菌落。
[0065] 2.花序浸染液的配制：配制50ml浸染液，需加入2. 5g蔗糖（终浓度5% )和15 μ 1 Si Iwet L-77 (终浓度 0· 03 % )。
[0066] 3.花序浸染：将拟南芥种子表面消毒后播种于MS固体培养基平板上，待种子萌发 长出子叶后，移入蛭石中培养至拟南芥开花，期间浇营养液维持幼苗健壮生长。浸染前，提 前准备菌液。挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种于含l〇〇mg/L利福平和50mg/L卡那 霉素的YEP培养基中，28°C，200rpm，振荡培养至对数生长期（约48h);将菌液用MS液体培 养基稀释10倍备用。将摇好的菌液转入离心管中5000rpm离心10min ;去上清，用适量浸 染液重悬菌体，轻微振荡混匀。去掉开过的花，将整个花序浸入菌液中30s，然后用保鲜膜包 裹花序，至黑暗中平放2天后，转至光下培养。
[0067] 2. 5转基因植株的鉴定
[0068] 待浸染后的拟南芥接种后，将种子在4°C春化10天，然后播种于含10mg/L除草剂 的MS培养基中筛选，能在含除草剂培养基中萌发生长的拟南芥，可初步确定为转基因的拟 南芥。种子萌发长出子叶后，移入蛭石中生长。为进一步鉴定抗除草剂植株为转入目的启 动子片段的转基因植株，取每个植株的一片小叶提取基因组DNA，通过PCR的方法进行目的 片段鉴定。所用引物和程序如扩增启动子时所用的引物和程序。得到目的片段，经测序证 明所得植株中确实转入了该发明所克隆的不同长度的启动子片段。
[0069] 3. 1⑶S活性组织化学染色的方法：
[0070] 1.样品放入冰水混合物冰浴2min ;
[0071] 2.样品用滤纸吸干后放入离心管中，加入90%丙酮浸泡样品IOmin ;
[0072] 3.用⑶S染色buffer迅速清洗一遍样品后，加入⑶S染色液浸染5min，倒掉染 液；
[0073] 4.加入适量染液浸没样品，抽气2次，每次5min ;
[0074] 5. 37 °C恒温保存过夜；
[0075] 6.加入无水乙醇脱色，然后转移至水中。肉眼或解剖镜下观察、照相。
[0076] 3. 2⑶S 染色 buffer 配方：
[0077] 100ml buffer
[0078]
[0079] CldH2O 定容至 100ml。
[0080] 3· 3⑶S染色液配方
[0081] 用 800 μ I DMSO 溶解 IOOmg X-Gluc，加入⑶S 染色 buffer 定容至 100ml。
[0082] 3. 4对转基因植株不同组织和不同发育时期的种子进行⑶S活性组织化学染色
[0083] 分别取各转基因株系营养生长期的根、叶（4片莲座叶）和茎，以及繁殖期刚刚开 放的花和种胚进行⑶S活性组织化学染色，如图5所示，发现AhLEClB启动子1281bp区段 (Ql)能驱动GUS基因在种子中高效表达，而在根、茎、叶、花器官中表达量极低；缺失了 3' 端351bp的930bp启动子区段（Q2)则仅能驱动⑶S基因在幼嫩的茎中微量表达，其他组织 中几乎没有表达。
[0084] 由此可知，本发明提供的1281bp 5'端上游调控区包括非翻译区52bp和其 上游启动子1229bp区段，其基因序列Seq ID N〇:2所示；以及包括5'端非翻译区 C UTR)54bp和其上游1235bp启动子区，其核苷酸序列如Seq ID No:l所示的1289bp花 生AhLEClB基因的启动子，两者具有在种胚中高效表达的特性。同时这种在种胚中高效表 达的特性，可以应用在提尚种子储减物质含量中；构建该启动子和相关基因的表达载体，调 控淀粉、油脂或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量。因此，上述 启动子的克隆对植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
【主权项】
1. 一种花生种子中优势表达启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SeqIDN〇:l所示。2. -种花生种子中优势表达启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SeqIDN〇:2所示。3. 根据权利要求1或2所述的启动子，其特征在于：该启动子能驱动GUS基因主要在 花生种子高效表达。4. 根据权利要求1或2所述的启动子，其特征在于：该启动子还包括含有如SeqID No: 2所示核苷酸序列的其他序列。5. 如权利要求1或2所述的启动子，在研宄植物种子发育和储藏物质积累上的应用。6. 如权利要求1或2所述的启动子，在提高种子中储藏物质和作物产量上的应用。
【专利摘要】一种花生种子中优势表达启动子的克隆和应用。本发明属于生物技术领域，从花生中克隆获得了两个花生AhLEC1B基因的启动子，其核苷酸序列如Seq ID No:1或Seq ID No:2所示，上述两个启动子通过GUS组织化学染色证实其驱动基因主要在种子中表达，而在植物根、茎、叶、花器官中表达量极低，发明人基于该启动子的上述功能，构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥，证实该启动子可用于种子发育及储藏物质积累的研究及基因工程遗传改良。
【IPC分类】C12N15/11, A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN104894114
【申请号】CN201510271340
【发明人】单雷, 唐桂英, 徐平丽, 柳展基
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心, 单雷
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的 可在花生种子中优势表达启动子的克隆和应用。
【背景技术】
[0002] 种子在农业生产和国民经济中占有举足轻重的地位。统计数据表明，人类粮食的 80%直接取自植物的种子，稻、麦等种子中富含淀粉，是人类赖以生存的主粮；大豆、花生、 油菜、芝麻等种子的含油量高，是食用油的主要来源。种子中储存物质的多少和组成成份， 直接影响作物的产量和品质。因此，提高粮食作物和油料作物产量、改善作物品质的根本在 于提高和改善其种子中储藏物质的积累量和组成。尽管常规育种技术所培育的优良作物品 种，为解决世界粮食安全问题、改善人民生活做出了重大贡献。然而，常规育种技术在继续 提高作物产量和品质方面的潜力有限。因此，挖掘新的功能基因，利用转基因技术提高花生 等作物产量及种子的含油量具有巨大的应用价值。
[0003] 花生作为重要的油料作物，不仅在国内农业经济中具有重要地位，而且在世界贸 易中也具有举足轻重的作用。研宄表明，不同植物种子储藏油脂的含量存在很大差异如主 要油料作物油菜为28% -48%、大豆15% -22%、花生44% -54%、芝麻45% -57%，并且 其主要脂肪酸组成也不同，油菜油中含有大量的芥酸（31-55% )，其他含量较高的不饱和 脂肪酸为油酸14-19%、亚油酸12-24%和亚麻酸1-10% ;大豆油中含量最高的为亚油酸 52-65%和油酸25-36%，并且棕榈酸（6-8% )、硬脂酸（3-5% )和亚麻酸（2-3% )也占 有较大比例；花生种子脂肪酸组成主要是：棕榈酸、油酸和亚油酸，分别占总脂肪酸含量的 10%、36-67%和15-43%，是除橄榄油外单不饱和脂肪酸油酸含量最高的。研宄花生种子发 育和储藏物质积累相关基因的表达调控，阐明相关基因的功能，对于通过基因工程改良其 他作物具有一定指导意义。
[0004] 启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板 DNA准确的结合并起始基因特异性地转录。启动子决定着基因转录的方向、效率和时空特 性，是理解基因表达和转录调控机制的关键。按作用方式和功能，可将启动子分为组成型 启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前在植物基因工程研宄中，组成型启动子的 应用最为广泛，如花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、玉米的Ubiquitin启动子和水稻的 Actinl启动子等。这些启动子能够驱动外源基因在植物的所有组织和器官中高效表达。然 而，许多具有时空表达特异性基因的过量表达往往造成能量浪费，有些外源基因的组成性 高表达还影响了植物的正常发育。为在确保植物正常生长的情况下，对目标性状进行更为 有效的定点、定时遗传改良，在植物基因功能鉴定研宄和基因工程遗传改良实践中更加倾 向于使用组织特异性或诱导型启动子。
[0005] 近年来，国内外多个实验室开展了花生种子发育和籽粒储藏物质积累相关基因启 动子的克隆与研宄，旨在充分了解基因的表达调控特征，为作物遗传改良提供依据。花生 籽粒中多个主要储藏蛋白一过敏原Arahl、2、3和6基因的启动子已被克隆和鉴定（Viquez 等，2003 ;2004 ;Zhong 等，2006 ;Bhattacharya 等，2012)，花生 Arah2 启动子驱动 GUS 在种 胚中特异表达，且强度高于35S启动子，而在种皮中基本无表达；花生Arah 6启动子驱动 ⑶S在子叶中表达，而在真叶中表达较弱。花生油体蛋白基因 Ah01eol7.8、Ah01eol8. 5启动 子（Li et al.，2009)和脂肪酸合成与油脂积累相关的基因如AhDGAT3(唐桂英等，2013)、 AhACP (单雷等，2014)启动子，也相继获得克隆与分析。调控种子发育的关键转录因子基 因 AhLEClA的启动子分析发现，其驱动的GUS基因在早期发育的种胚中特异表达，并且其特 异性表达受多个种子特异性调控元件和抑制其在营养组织中表达的负调控元件共同调节 (唐桂英等，2013)。
【发明内容】
[0006] 基于上述现有技术，本发明的发明人经过深入研宄，从花生中克隆获得了一个新 的1289bp花生AhLEClB基因的启动子，该启动子包括Y端非翻译区^ UTR)54bp和其 上游1235bp启动子区，其核苷酸序列如Seq ID N〇:l所示；同时本发明为了进一步验证其 功能，还构建了 1281bp启动子（包括52bp 5' UTR和1229bp启动子区，其基因序列如Seq IDNo:2所示）以及：y端缺失351bp(缺失部分包括52bp5 ,UTR和 299bp启动子区）的 930bp(其基因序列如Seq ID No:3所示）的启动子驱动的⑶S报告基因植物表达载体，并 转化拟南芥。实验表明，该1281bp启动子驱动的GUS基因主要在转基因植株的种子中高效 表达，在根、茎、叶、花中有极低水平的表达；而：V端缺失351bp的930bp启动子仅驱动⑶S 基因在幼嫩的茎中表达，因此利用1281bp和1289bp的启动子在种胚中高效表达的特性，可 以应用在提高种子储藏物质含量中；构建该启动子和相关基因的表达载体，调控淀粉、油脂 或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量。因此，该启动子的克隆对 植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
[0007] 该启动子是在已得到的花生AhLEClB基因的基因组序列（该基因其核苷酸序列如 Seq ID No:4所示）的基础上，通过染色体步移技术得到的1289bp AhLEClB基因 Y端上 游序列，其核苷酸序列如Seq ID No: 1所示。经转录起始位点分析发现，AhLEClB基因转录 起始位点位于翻译起始密码ATG上游-83nt处，通过PlantCARE和PLACE软件对该启动子 进行顺式调控元件分析，该序列除包含启动子中心元件TATA BOX，还包含光响应调控元件 GATA BOX(GATA)、GT1C0NSENSUS(GRWAAW)、S0RLIP1AT(GCCAC)以及莲座叶和根中高表达调 控元件RAVlA AT(CAACA)等；包含许多种子储藏蛋白和胚胎发育相关基因启动子中均含有 的 E BOX (CANNTG)、CARGCW8GAT (CffffffffffffffffG)以及胚表达调控元件 DPBF CORE (ACACNNG)、 SEF4M0TIF(RTTTTTR)等；包含细胞分裂素、赤霉素、乙烯等植物激素响应调控元件CPB Sequence (TATTAG)、CARE element (CAACTC)、ERE Motif(AWTTCAAA)等；另外，还含有一些 负调控基因表达的元件 WRKY710S (TGAC)、SREATMSD (TTATCC)、HDZIP2ATATHB2 (TAATMATTA) 等。
[0008] 与已知的AhLEClA相比，本发明所针对的AhLEClB有着显著的不同之处，它们核 苷酸序列存在28个碱基的差异，编码蛋白有11个不同的氨基酸，氨基酸相似性达95%。 AhLEClA 和 AhLEClB 基因组 DNA 长度分别为 2279bp 和 2166bp。AhLEClA 和 AhLEClB 在根、 茎、叶、花和未成熟种子及种子发育过程中的表达特征均不同。而根据其获得的相应启动子 也有着明显的不同之处。
[0009] 为了完成该启动子的初步功能分析，本发明以pCAMBIA3301为出发载体，分别以 Fl为正向引物、Rl和R2为反向引物，扩增相应的启动子片段，构建了含有AhLEClB基因 1281bp启动子片段和Y端缺失351bp (包括Y UTR和300bp启动子区）的930bp启动子 片段的⑶S基因植物表达载体，即用不同启动子片段取代pCAMBIA3301中驱动⑶S基因表 达的35S启动子，获得的植物表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，即待拟南 芥繁殖开花时，配制浸染液，用农杆菌浸染将要开放的花序。
[0010] 本发明分别取转基因拟南芥的根、茎、叶、花和种胚，通过现有的方法检测GUS基 因的表达情况。本发明所提供的1281bp启动子区域中，包括5'端非翻译区52bp和其上 游启动子1229bp区段，其基因序列如Seq ID N〇:2所示，即可驱动⑶S基因在种胚中高 效表达，而在植物根、茎、叶、花器官中表达量极低；而缺失了:V端351bp的930bp启动子 区段由于缺失了核心区域的TATA BOX及其他重要的诱导型调控元件，故驱动功能基本丧 失。由此可见本发明克隆的花生AhLEClB基因的包括Y端非翻译区52bp和其上游启动子 1229bp区段具有在种子中高效表达的特性。
[0011] 通过上述实验，发明人证实了，在本发明提供的1281bp 5'端上游调控区包括非 翻译区52bp和其上游启动子1229bp区段，其基因序列Seq ID No: 2所示；以及包括Y端 非翻译区C UTR)54bp和其上游1235bp启动子区，其核苷酸序列如Seq ID No:l所示的 1289bp花生AhLEClB基因的启动子，两者具有在种胚中高效表达的特性。同时这种在种胚 中尚效表达的特性，可以应用在提尚种子储减物质含量中；构建该启动子和相关基因的表 达载体，调控淀粉、油脂或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量。 因此，该启动子的克隆对植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
【附图说明】
[0012] 图1为扩增获得的花生AhLEClB基因1289bp 5'端上游序列扩增的电泳图，
[0013] 图中M为Trans2K DNA Marker，LD、LE、LP和LS为不同基因组文库扩增结果， LP泳道箭头所指为扩增的目的启动子片段；由图中结合实施例可知，扩增得到的序列为 1289bp，包括1235bp的启动子序列、54bp 5'非编码区序列；
[0014] 图2为花生AhLEClB基因启动子区域可能的顺式作用元件；
[0015] 图3为花生AhLEClB基因启动子驱动⑶S表达的载体构建流程图；
[0016] 图4为不同长度启动子片段PCR扩增；
[0017] 图中Ql启动子大小1281bp，Q2为930bp ;
[0018] 图5为本发明所提供的1281bp和930bp启动子片段驱动的⑶S基因表达结构转 基因拟南芥根、茎、叶、花和种胚GUS活性组织化学检测图；
[0019] 图中自上而下为拟南芥根和叶、茎、花和种胚；CK-P为转基因阳性对照，CK-N为未 转基因阴性对照；
[0020] 该图中Ql启动子驱动⑶S基因的转基因拟南芥种胚染色较深，其他组织未染色； Q2启动子驱动GUS基因的转基因拟南芥除了在幼茎中有较浅染色外，其余组织均无染色； CK-P为35S驱动⑶S基因的转基因阳性对照，植株的各组织均有染色；CK-N为未转基因阴 性对照，植株各组织均为无色；
[0021] 由图可见包括52bp 5' UTR和其上游1229bp区段启动子可驱动⑶S基因在种胚 中高效表达；而缺失了：V端351bp的930bp启动子区段则仅能驱动⑶S基因在幼嫩的茎 中表达。
【具体实施方式】
[0022] 本发明的实施步骤是根据花生AhLEClB基因的基因组DNA序列用染色体步移的方 法克隆得到该基因的启动子序列一启动子顺式作用元件分析及功能预测一设计带有酶切 位点Hind III和Nco I的引物从启动子DNA上扩增得到不同长度的目的启动子序列一用同 样的酶Hind III和Nco I酶切载体pCAMBIA3301 -目的片段连接到酶切的pCAMBIA3301载 体上一含植物表达载体的农杆菌转化拟南芥一转基因拟南芥鉴定和筛选纯合体转基因株 系一⑶S组织化学染色检测⑶S表达部位及强度，分析启动子功能。本实施例中的其他技 术均采用已有技术。
[0023] 实施例1花生AhLEClB基因启动子的克隆
[0024] I. 1花生基因组DNA的提取
[0025] 用植物DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司产品）提供的方法提取花生 幼叶的DNA，溶解于适量TE (pH8. 0)缓冲液中；
[0026] 1. 2花生AhLEClB基因启动子的克隆
[0027] 分别取2. 5yg花生基因组DNA经Dral、EcoRV、PvuII、StuI内切酶酶切、苯酚 抽提纯化后，溶解于20 μ I TE (pH 7. 5)缓冲液中。分别取4 μ 1酶切完全的DNA，按照BD GenomeWalker Universal Kit 的要求连接上 Adaptor (序列：5'GTAATACGACTCACTATAGGG CACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 3'，如 Seq ID No: 5 所示），构建 4 个花生基因组 DNA 文 库（LD、LE、LP、LS)。根据已获得的花生AhLEClB基因的基因组序列，设计该基因的2个嵌 套的 3'端特异性引物 LEC1BGSP2-1(5'CCTTGTTCCCATGTAAAACCATGAAAGCA 3'，如 Seq ID No:6 所示）和 LEC1BGSP2-2(5'AGGTAAAGCAGCCGCTAATCTAGTTAGT 3'，如 Seq ID No:7 所 示）。以 API C 端接头引物：5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'，如 Seq ID No:8 所示）和 LEC1BGSP2-1为引物进行第一轮扩增，扩增体系为25 μ 1，模板量为1 μ 1，扩增条件为：94°C 25sec，72°C 3min，7 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，32 个循环；最后 67°C继续延伸 7min。 第二轮巢式PCR模板为1 μ 1第一轮PCR产物10倍稀释液，引物为5 '端巢式接头引物 轮 PCR 相同，扩增条件 94°C 25sec，72°C 3min，5 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，20 个循 环；最后67°C继续延伸7min。1%琼脂糖电泳检测PCR结果（见图I);
[0028] 挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆 经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。
[0029] I. 3RNA提取和转录起始位点确定
[0030] 用CTAB法提取不同发育时期种子的总RNA，经琼脂糖电泳检测RNA质量和分光光 度计定量后，等量混合储存于_80°C冰箱备用。为防止RNA酶污染，研钵、研锤、药匙均以 180°C烘烤6h，所用塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡，于室温下过夜后，高温灭菌处理。
[0031] 用Invitrogen公司GeneRacer? Kit提供的方法和试剂，取5 μ g混合好的LH14种 子总RNA，按照说明书要求用碱性磷酸酶（CIP)将截断的mRNA或其他非mRNA5'端去磷酸 化，然后将抽提纯化并沉淀的全长mRNA脱去帽子结构，并连接上RNA接头（GeneRacer RNA 01igo:5'CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA3'JnSeqIDNo:l(^；f*); 以此RNA为模板，用试剂盒提供的随机引物和SurperScript?III RT酶反转录合成cDNA ;最 终将合成的cDNA克隆至载体pCR4-T0P0中，获得LH14不同发育时期种子全长cDNA文库， 用于随后转录起始位点扩增。根据已获得的花生AhLEClB基因的cDNA序列，设计2个该 基因的 3'端特异性引物，引物序列为：TSS GSP1-15'TCTTTTGCGTCGTCGGAGATTTTAGC 3'， 如Seq ID No: 11所示，TSS GSP2与LEC1BGSP2-2相同。以构建的cDNA文库为模板，分别 以 TSS GSPl-I 引物与 GeneRacer? 5'Primer(5'CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3'，如 Seq ID No: 12所示）进行第一轮PCR扩增，PCR体系参照BD Advantage?2PCR Kit要求，扩增条件 为：94°C预变性 2min ;94°C 30sec，72°C 30sec，5 个循环；94°C 30sec，70°C 30sec，5 个循 环；94°C 30sec，63°C 30sec，68°C 30sec，20-25 个循环；最后 68°C继续延伸 lOmin。第一 轮PCR产物经电泳检测后，用缓冲液稀释50倍，用于第二轮巢式PCR。取1 μ 1第一轮PCR 产物，以 TSS GSP2 和 GeneRacer? 5，Nested Primer(5，GGACACTGACATGG ACTGAAGGAGTA 3'， 如569 10此：13所示）进行第二轮？0?，扩增条件为：94°0预变性2!1^11;94°0 3〇86(3,65°〇 30sec，68°C IOsec，35个循环；最后68°C继续延伸IOmin。I. 5 %琼脂糖电泳检测PCR结果。
[0032] 挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆 经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。
[0033] 1.4启动子序列分析
[0034] 应用在线植物转录元件分析工具 PLACE (http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/)、 PlantCARE(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)对花生 AhLEClB启动子序列进行分析，结果见图2。
[0035] 1. 5不同长度花生AhLEClB基因启动子片段的扩增
[0036] 设计克隆AhLEClB基因不同长度启动子所需的引物，引物Rl和R2为3'端下游引 物，序列如Seq ID No: 14和15所示；引物Fl为5'端上游引物，序列如Seq ID No: 16所示。 Rl和R2中下划线部分CCATGG为Nco I酶切位点；引物Fl中下划线部分AAGCTT为Hind III 酶切位点。利用引物Fl分别与RU R2,以已克隆的含有AhLEClB基因1289bp启动子的重 组质粒为模板，扩增不同长度的启动子片段，扩增片段长度分别为1281bp(Ql)、930bp(Q2)， 如图3所示；
[0037] PCR扩增体系为 20 μ 1 :包括 10 X PCR buffer 2 μ I，dNTP mixure (各 2. 5mM) 1 μ 1， 上、下游引物各0.5 μ 1，模板DNA 1 μ 1，Taq酶0.25 μ 1，加 CldH2O补足20 μ 1。反应程序为： 预变性 94°C 2min;变性 94°C 30sec，退火 55°C 30sec，延伸 72°C lmin-lmin 30sec (根据 扩增片段长度调整），30个循环；最后72°C继续延伸10m in。
[0038] 扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小正确，回收目的片段，克隆到 PEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测 序仪进行双向测序。
[0039] 表LAhLEClB基因不同启动子分析引物
[0040]
[0041] 实施例2植物表达载体的构建与转化
[0042] 2. 1花生AhLEClB基因启动子序列与⑶S报告基因的融合
[0043] 选择PCAMBIA3301作为植物表达载体，将测序正确的连有目的片段的克隆载体酶 切，电泳并胶回收目的片段。同时用限制性内切酶HindIII和Nco I酶切表达载体，并回收 载体片段。连接启动子片段与载体片段，经质粒酶切图谱鉴定筛选含不同长度启动子的 PCAMBIA3301-AhLEClB启动子重组载体。具体过程可参考图4所示：
[0044] 1.用带有酶切位点的引物Fl分别与R1、R2扩增AhLEClB基因的不同长度启动子 区段，并凝胶电泳分离和回收目的片段，克隆至PEASY-T3载体，测序。
[0045] 2.用Hind III和Nco I双酶切回收目的片段和植物表达载体pCAMBIA3301。
[0046] 3.回收：进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有AhLEClB启动子序列的DNA片段和 PCAMBIA3301载体片段。
[0047] 4.连接，连接体系如下：
[0048]
[0049] 混匀后16°C连接过夜。
[0050] 5.转化：取5 μ 1连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉 素的固体培养基平板上。
[0051] 6.重组子的筛选：对长出的菌落进行重组质粒酶切图谱鉴定。
[0052] 2. 2农杆菌感受态细胞的制备
[0053] L挑取单菌落GV3101，接种于5ml加有50mg利福平（Rifampicin)的液体LB培 养基中，28 °C，200rpm，过夜培养。
[0054] 2.取2ml培养物至100mL液体LB培养基中，继续培养至0D600为0. 8左右。将培 养物冰浴 30min，4°C，5000rpm，离心 5min。
[0055] 3.弃上清。用 IOml 0· lmol/L 冷的 NaCl 悬浮菌体；4°C，5000rpm，离心 5min。
[0056] 4.弃上清。用1111120臟〇1/1冷的0&(：12悬浮菌体，分装成50以1/管，液氮中速冻 后，-80°C保存。
[0057] 2. 3冻融法转化农杆菌
[0058] 1.冰上融化农杆菌GV3101感受态细胞，加入1 μ 1带有目的片段的pCAMBIA3301 质粒，冰冻30min，液氮中冷冻lmin，然后在37°C水浴5min。
[0059] 2.加入1ml无抗生素的YEP培养基，28 °C，200rpm，振荡培养3h。
[0060] 3. 10, OOOrpm离心Imin收集菌体，用100 μ IYEP液体培养基重悬菌体。
[0061] 4.将重悬的菌体涂布于附加50mg/L卡那霉素 （Kanamycin sulfate)和100mg/L 利福平的固体YEP培养基上，28°C下培养2-3天。
[0062] 5.酶切及PCR鉴定阳性克隆。
[0063] 2. 4农杆菌介导转化拟南芥
[0064] 1.农杆菌的培养：从_80°C冰箱中取出所需要的菌种，在冰浴中融化。分别取 30 μ 1的农杆菌接种于5ml的YEP培养基（含100mg/L利福平，50mg/L卡那霉素），28°C， 200rpm，振荡培养过夜。然后在附加50mg/L卡那霉素和lOOmg/1利福平的固体YEP培养基 上划板培养，已挑选单菌落。
[0065] 2.花序浸染液的配制：配制50ml浸染液，需加入2. 5g蔗糖（终浓度5% )和15 μ 1 Si Iwet L-77 (终浓度 0· 03 % )。
[0066] 3.花序浸染：将拟南芥种子表面消毒后播种于MS固体培养基平板上，待种子萌发 长出子叶后，移入蛭石中培养至拟南芥开花，期间浇营养液维持幼苗健壮生长。浸染前，提 前准备菌液。挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种于含l〇〇mg/L利福平和50mg/L卡那 霉素的YEP培养基中，28°C，200rpm，振荡培养至对数生长期（约48h);将菌液用MS液体培 养基稀释10倍备用。将摇好的菌液转入离心管中5000rpm离心10min ;去上清，用适量浸 染液重悬菌体，轻微振荡混匀。去掉开过的花，将整个花序浸入菌液中30s，然后用保鲜膜包 裹花序，至黑暗中平放2天后，转至光下培养。
[0067] 2. 5转基因植株的鉴定
[0068] 待浸染后的拟南芥接种后，将种子在4°C春化10天，然后播种于含10mg/L除草剂 的MS培养基中筛选，能在含除草剂培养基中萌发生长的拟南芥，可初步确定为转基因的拟 南芥。种子萌发长出子叶后，移入蛭石中生长。为进一步鉴定抗除草剂植株为转入目的启 动子片段的转基因植株，取每个植株的一片小叶提取基因组DNA，通过PCR的方法进行目的 片段鉴定。所用引物和程序如扩增启动子时所用的引物和程序。得到目的片段，经测序证 明所得植株中确实转入了该发明所克隆的不同长度的启动子片段。
[0069] 3. 1⑶S活性组织化学染色的方法：
[0070] 1.样品放入冰水混合物冰浴2min ;
[0071] 2.样品用滤纸吸干后放入离心管中，加入90%丙酮浸泡样品IOmin ;
[0072] 3.用⑶S染色buffer迅速清洗一遍样品后，加入⑶S染色液浸染5min，倒掉染 液；
[0073] 4.加入适量染液浸没样品，抽气2次，每次5min ;
[0074] 5. 37 °C恒温保存过夜；
[0075] 6.加入无水乙醇脱色，然后转移至水中。肉眼或解剖镜下观察、照相。
[0076] 3. 2⑶S 染色 buffer 配方：
[0077] 100ml buffer
[0078]
[0079] CldH2O 定容至 100ml。
[0080] 3· 3⑶S染色液配方
[0081] 用 800 μ I DMSO 溶解 IOOmg X-Gluc，加入⑶S 染色 buffer 定容至 100ml。
[0082] 3. 4对转基因植株不同组织和不同发育时期的种子进行⑶S活性组织化学染色
[0083] 分别取各转基因株系营养生长期的根、叶（4片莲座叶）和茎，以及繁殖期刚刚开 放的花和种胚进行⑶S活性组织化学染色，如图5所示，发现AhLEClB启动子1281bp区段 (Ql)能驱动GUS基因在种子中高效表达，而在根、茎、叶、花器官中表达量极低；缺失了 3' 端351bp的930bp启动子区段（Q2)则仅能驱动⑶S基因在幼嫩的茎中微量表达，其他组织 中几乎没有表达。
[0084] 由此可知，本发明提供的1281bp 5'端上游调控区包括非翻译区52bp和其 上游启动子1229bp区段，其基因序列Seq ID N〇:2所示；以及包括5'端非翻译区 C UTR)54bp和其上游1235bp启动子区，其核苷酸序列如Seq ID No:l所示的1289bp花 生AhLEClB基因的启动子，两者具有在种胚中高效表达的特性。同时这种在种胚中高效表 达的特性，可以应用在提尚种子储减物质含量中；构建该启动子和相关基因的表达载体，调 控淀粉、油脂或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量。因此，上述 启动子的克隆对植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
【主权项】
1. 一种花生种子中优势表达启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SeqIDN〇:l所示。2. -种花生种子中优势表达启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SeqIDN〇:2所示。3. 根据权利要求1或2所述的启动子，其特征在于：该启动子能驱动GUS基因主要在 花生种子高效表达。4. 根据权利要求1或2所述的启动子，其特征在于：该启动子还包括含有如SeqID No: 2所示核苷酸序列的其他序列。5. 如权利要求1或2所述的启动子，在研宄植物种子发育和储藏物质积累上的应用。6. 如权利要求1或2所述的启动子，在提高种子中储藏物质和作物产量上的应用。
【专利摘要】一种花生种子中优势表达启动子的克隆和应用。本发明属于生物技术领域，从花生中克隆获得了两个花生AhLEC1B基因的启动子，其核苷酸序列如Seq ID No:1或Seq ID No:2所示，上述两个启动子通过GUS组织化学染色证实其驱动基因主要在种子中表达，而在植物根、茎、叶、花器官中表达量极低，发明人基于该启动子的上述功能，构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥，证实该启动子可用于种子发育及储藏物质积累的研究及基因工程遗传改良。
【IPC分类】C12N15/11, A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN104894114
【申请号】CN201510271340
【发明人】单雷, 唐桂英, 徐平丽, 柳展基
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心, 单雷
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
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