陆川猪肺炎支原体p36基因原位杂交检测方法及其探针和试剂盒的制作方法
陆川猪肺炎支原体p36基因原位杂交检测方法及其探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检 测方法及其探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪支原体肺炎或猪地方性支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae of Swine, MPS)是一种慢性呼吸道接触性传染病，该病的病原是猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)，常与猪多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合症病 毒、猪流感病毒等协同作用引起的猪呼吸道综合症，严重威胁现代养猪业，是造成比较高致 死率的主要原因。自然感染只见于猪，各种猪不分年龄、性别、品种均能感染。陆川猪具有 皮薄、肉嫩、脆而不腻等特征，是全国八大地方优良品种之一。其呼吸系统中颈粗而短，属于 上呼吸道的气管和支气管较短小，胸腔较其他品种窄小，对猪支原体肺炎比其他猪种更为 易感，病情发展的过程更加严重，猪支原体肺炎一直是制约陆川猪规模化养殖产业发展的 瓶颈。
[0003] Mhp的P36蛋白具有细菌L一乳酸脱氢酶（L-Lactate Dehydrogenase, LDH)的典型 区域，并具有较高的同源性。当机体感染了 Mhp后，能够产生较多的对抗P36蛋白的抗体。 并且针对P36蛋白产生的抗体具有很强的种属特异性，既不与其他的LDH发生交叉反应，又 不会与猪鼻支原体或猪絮状支原体的蛋白发生免疫反应。因此，针对Mhp P36蛋白进行检 测，对于临床诊断和研宄Mhp的致病机理具有重要的意义。目前，检测广西陆川猪Mhp主要 运用PCR检测方法，但该方法仅仅局限于对病原体的检测，并不能对Mhp的感染过程进行定 位的研宄。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种方便快速、特异性强、灵敏度高的陆川猪肺 炎支原体P36基因原位杂交检测方法及其探针和试剂盒。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：陆川猪肺炎支原体P36基因原 位杂交检测探针，该探针为寡核苷酸探针，探针分别具有以下碱基序列：
[0006] 探针 1 5'-ATACC TTAAT AACTA TAATT AGGAC TAAAA CGGCT-DIG-3'，
[0007] 探针 2 5'- ATACT TATAT TTCTA GATTT TCTAC GACTA AAATA - DIG-3'，
[0008] 探针 3 5' -TTAGG ACAAC TATAT TAATG TTCCC GAATG GCCCT-DIG-3'，
[0009] 寡核苷酸探针3'端采用地高辛标记DIG。
[0010] 使用上述探针的陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方法。
[0011] 上述检测方法采用三条寡核苷酸探针1、探针2、探针3的混合液对陆川猪肺炎支 原体P36基因417~452、516~551、687~722位点的核苷酸序列进行混合检测。
[0012] 上述检测方法包括以下步骤：
[0013] (1)特异性寡核苷酸探针的制备：根据猪肺炎支原体P36基因417~452、516~ 551、687~722三个基因位点设计三条寡核苷酸探针，并采用地高辛进行标记；
[0014] (2)检测样品制备及预处理：将经过4%缓冲多聚甲醛溶液固定后的组织样品进 行脱水、石蜡包埋后进行切片，切片贴附于经过多聚赖氨酸处理且已经消除内源性酶的载 玻片上；样品切片置于37°C干燥箱内烤片，过夜；次日脱蜡，水化处理；
[0015] ⑶消除内源性酶和暴露mRNA核酸片段：分别用3% H2O2溶液和消化液进行处理， 消化液包含ImL 3%柠檬酸溶液和100 μ L浓缩型胃蛋白酶；
[0016] (4)预杂交和杂交：先加入预杂交液，放入湿盒中42°C温箱内预杂交2h，吸取多余 的液体；然后，加入已进行地高辛标记的混合寡核苷酸探针液进行杂交；
[0017] (5)杂交后信号放大处理：特异性寡核苷酸探针先和生物素化鼠抗地高辛液结 合，再结合链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，最后与生物素化过氧化物酶；
[0018] (6)滴加 DAB反应后显色。
[0019] 步骤⑷中探针与mRNA杂交结合的条件为：杂交温度为42°C，时间为20-24小时。
[0020] 步骤（6)中DAB反应时间控制在Imin内。
[0021] 含有上述探针的陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测试剂盒。
[0022] 上述检测试剂盒包括胃蛋白酶、预杂交液、混合寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生 物素化鼠抗地高辛、SABC - P0D、生物素化过氧化物酶，混合寡核苷酸探针杂交液中含有三 条寡核苷酸探针1、探针2、探针3。
[0023] 发明人根据陆川猪肺炎支原体P36全基因片段设计合成了三条寡核苷酸探针，在 上述特异探针的基础上，发明人研宄建立了陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方 法，并制备了相关试剂盒。本发明的特异探针特异性强、灵敏度高，据此建立的检测方法和 试剂盒，可方便快速地用于地高辛标记原位杂交检测陆川猪肺炎支原体P36基因。将本发 明应用于广西陆川猪肺炎支原体的检测与监测研宄，可实现快速且准确地鉴定陆川猪肺炎 支原体，从而确定肺炎支原体DNA在陆川猪肺脏组织中的分布情况，从组织学的角度将陆 川猪肺炎支原体病原核酸分布情况与其相关的病理组织变化相结合对Mhp的病原进行精 确地定位研宄，从而达到准确检测预报的目的，为进一步研宄广西陆川猪Mhp致病机理奠 定基础。
【附图说明】
[0024] 图1阴性对照检测结果图。
[0025] 图2阳性对照检测结果图一。
[0026] 图3阳性对照检测结果图二。
[0027] 图4阳性对照检测结果图三。
【具体实施方式】
[0028] 一、特异性寡核苷酸探针及标记
[0029] 根据陆川猪肺炎支原体P36全基因片段（X67286，1394bp)中的三段特异的DNA序 列，对应碱基区域分别为417~452、516~551、687~722,设计合成了的三条寡核苷酸探 针，合成后于每一探针的3'末端标记地高辛DIG。
[0030] 二、陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方法的建立
[0031] 1.试验材料
[0032] 检测样品为2014年10-12月期间采集的广西陆川猪猪肺组织。眼观病理变化疑 似猪支原体肺炎、经细菌分离和PCR检测为猪肺炎支原体阳性肺组织，作为阳性对照。阴 性对照组为检测为猪肺炎支原体阴性，且眼观病变正常的肺组织；并设不包含核酸探针的 PBS缓冲液代替专项寡核苷酸杂交液的试剂阴性对照组。
[0033] 用于原位杂交检测的试剂盒包括胃蛋白酶、预杂交液、混合寡核苷酸探针杂交液、 封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC - P0D、生物素化过氧化物酶。其中，混合寡核苷酸探针 杂交液中含有三相寡核苷酸探针1、探针2、探针3,探针分别具有以下碱基序列：
[0034] 探针 1 5'- ATACC TTAAT AACTA TAATT AGGAC TAAAA CGGCT - DIG-3' (见序列表 SEQ. ID. No. 1)，
[0035] 探针 2 5'- ATACT TATAT TTCTA GATTT TCTAC GACTA AAATA - DIG-3' (见序列表 SEQ. ID. No. 2)，
[0036] 探针 3 5'- TTAGG ACAAC TATAT TAATG TTCCC GAATG GCCCT - DIG-3' (见序列表 SEQ. ID. No. 3)，
[0037] 寡核苷酸探针3'端采用地高辛标记DIG。
[0038] 试剂盒中的其它液体和试剂组成如下：
[0039] 胃蛋白酶液--用时配制成浓度为20mg/mL。2g/管，1管/盒，无色透明液体；
[0040] 预杂交液--2mL/管，1管/盒，无色透明液体。成分包括酵母RNA 500mg，20XSSC 250ml，肝素 50mg，10%Tween20 10ml，柠檬酸（单水）1.89g。以上试剂用 500mL DEPC 水溶 解后（定容至500)再加入500ml去离子甲酰氨。溶液的pH调节至6. 0-6. 5。各种试剂的 终浓度为酵母RNA: 500 μ g/ml ;肝素50 μ g/ml ;柠檬酸：9mM ;去离子甲酰氨：50%，溶液-20 度保存；
[0041] 洗涤液--SSC干粉2包/盒，使用时1000 mL蒸馏水加2 X SSC干粉一包充分溶 解；
[0042] 混合寡核苷酸探针杂交液--浓度为2 μ g/mL，2mL/管，无色透明液体；
[0043] 封闭液--IOg Blocking Reagent 加至 100mL 0· IM TBS 含 0· 1% DEPC，PH7. 4 缓 冲液中，2mL/管，无色透明液体；
[0044] 内源酶消除液一一30% H2O2溶液，5mL/管，现用现配成3% H2O2溶液，4°C避光保 存；
[0045] 消化液--3 %柠檬酸溶液，5mL/管。用时加入IOOuL胃蛋白酶液（浓度20mg/ mL)
[0046] 生物素化鼠抗地高辛--10 μ L生物素化鼠抗地高辛用IOmL封闭液稀释，5mL/ 管，1管/盒，无色透明液体；
[0047] SABC-P0D--5mL/管，1管/盒，黄色透明液体；
[0048] 生物素化过氧化物酶--5mL/管，1管/盒，无色透明液体。
[0049] DAB显色试剂盒，康为世纪，北京；
[0050] 焦碳酸二乙酯（DEPC)，Sigma，美国；
[0051] 多聚甲醛干粉，Sigma，美国；
[0052] 柠檬酸三钠，Sigma，美国；
[0053] 柠檬酸，Sigma，美国；
[0054] 2 X SSC干粉，博士德公司，武汉；
[0055] PBS缓冲液干粉，Sigma，美国；
[0056] 30% H2O2，南京化学试剂有限公司，江苏；
[0057] 甲醇，南京化学试剂有限公司，江苏；
[0058] PBS缓冲液：2000mL蒸馏水中加 PBS缓冲液干粉一包，充分溶解即可；
[0059] 含DEPC的多聚甲醛固定液：1000 mL PBS加入多聚甲醛干粉40g，加热搅拌溶解后 趁热加 DEPC至终浓度0. 1 % ;
[0060] 2X SSC :1000 mL蒸馏水加2X SSC干粉一包充分溶解即可；
[0061] 0· 5XSSC :300mL 蒸馏水加 IOOmL 2XSSC ;
[0062] 0· 2 X SSC : 270mL 蒸馏水加 30mL 2 X SSC ;
[0063] 3% H2O2-甲醇溶液：IOmL 30%明2加入甲醇90mL，现配现用，4°C避光保存；
[0064] 3%柠檬酸溶液：100mL蒸馏水中加3g柠檬酸粉末，pH 2. 0左右；
[0065] 2.试验操作
[0066] (1)检测样品固定：检测样品于4 %缓冲多聚甲醛溶液中固定24h。
[0067] (2)原位杂交检测样品制备及预处理：将经过4%缓冲多聚甲醛溶液固定后的组 织样品进行脱水、石蜡包埋后进行切片，切片贴附于经过多聚赖氨酸处理且已经消除内源 性酶的载玻片上；样品切片置于37°C干燥箱内烤片，过夜；次日脱蜡，水化处理。
[0068] ⑶消除内源性酶和暴露mRNA核酸片段：分别用3% H2O2溶液和消化液进行处理， 室温放置lOmin，蒸馏水洗3次，每次5min ;后加入消化液，消化液包含ImL 3 %柠檬酸溶液 和IOOuL胃蛋白酶液，37°C恒温箱内消化lOmin，PBS洗3次，每次5min，蒸馏水洗5min。
[0069] (4)预杂交和杂交：先加入预杂交液，放入湿盒中42°C温箱内预杂交2h，吸取多余 的液体；然后加入已进行地高辛标记的混合寡核苷酸探针液进行杂交，放入湿盒置于42°C 恒温箱内杂交20~24h。杂交后洗涤用37 °C的2 X SSC洗涤5minX 2次，0. 5 X SSC洗涤 15minXl 次，0· 2XSSC 洗涤 15minXl 次。
[0070] (5)滴加封闭液：每片滴加20yL封闭液，37°C孵育30min。甩去多余的液体，不 洗。滴加生物素化鼠抗地高辛，37°C孵育lh，PBS洗5minX4次。切勿用其他缓冲液和蒸馏 水洗绦。
[0071] (6)滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC):每片滴加20 μ L SABC， 37°C孵育 20min，PBS 洗 5minX4 次。
[0072] (8)滴加生物素化过氧化物酶：每片滴加20 yL生物素化过氧化物酶，37°C孵育 20min，PBS 洗 5minX4 次。
[0073] (9) DAB显色：每个组织片滴加20 μ L DAB显色液后，置于显微镜下观察，当看到组 织片颜色变黄（DAB反应时间在Imin内）立即置于蒸馏水中终止反应，自来水洗IOmin后， 蒸馏水洗5min。
[0074] (10)复染、水洗：苏木素复染Imin -蒸馏水洗3min - 1%盐酸酒精5s -自来水 洗 IOmin0
[0075] (11)脱水封片：75%酒精211^11 - 85%酒精21^11 - 90%酒精21^11 - 95%酒 精 3min - 100 % 酒精 I 3min (I) - 100 % 酒精⑵ 3min -二甲苯（I) IOmin -二甲苯 (2)10min-中性树胶封片。
[0076] 结果：如图1至4所示，检测样本肺组织细胞核染成蓝色，猪肺炎支原体阳性样本 原位杂交后在气管、支气管黏膜上皮细胞表面出现棕黄色至深棕色信号，即特异性阳性信 号；阴性对照样本无特异性信号。
【主权项】
1. 陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测探针，其特征在于该探针为寡核苷酸探 针，所述探针分别具有以下碱基序列： 探针 1 5'-ATACCTTAATAACTATAATTAGGACTAAAACGGCT-DIG-3'， 探针 2 5'-ATACTTATATTTCTAGATTTTCTACGACTAAAATA-DIG-3'， 探针 3 5'-TTAGGACAACTATATTAATGTTCCCGAATGGCCCT-DIG-3'， 寡核苷酸探针3'端采用地高辛标记DIG。2. 使用权利要求1所述探针的陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方法。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于采用三条寡核苷酸探针1、探针2、探针 3的混合液对陆川猪肺炎支原体P36基因417~452、516~551、687~722位点的核苷酸 序列进彳T检测。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 特异性寡核苷酸探针的制备：根据猪肺炎支原体P36基因417~452、516~551、 687~722三个基因位点设计三条寡核苷酸探针，并采用地高辛进行标记； (2) 检测样品制备及预处理：将经过4%缓冲多聚甲醛溶液固定后的组织样品进行脱 水、石蜡包埋后进行切片，切片贴附于经过多聚赖氨酸处理且已经消除内源性酶的载玻片 上；样品切片置于37°C干燥箱内烤片，过夜；次日脱蜡，水化处理； (3) 消除内源性酶和暴露mRNA核酸片段：分别用3% 11202溶液和消化液进行处理，消化 液包含ImL3%柠檬酸溶液和100yL浓缩型胃蛋白酶； (4) 预杂交和杂交：先加入预杂交液，放入湿盒中42°C温箱内预杂交2h，吸取多余的液 体；然后，加入已进行地高辛标记的混合寡核苷酸探针液进行杂交； (5) 杂交后信号放大处理：特异性寡核苷酸探针先和生物素化鼠抗地高辛液结合，再 结合链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，最后与生物素化过氧化物酶； (6) 滴加DAB反应后显色。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于步骤（4)中探针与mRNA杂交结合的条 件为：杂交温度为42°C，时间为20-24小时。6. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于步骤（6)中DAB反应时间控制在Imin 内。7. 含有权利要求1所述探针的陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测试剂盒。8. 根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于包括胃蛋白酶、预杂交液、混合寡核 苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC-POD、生物素化过氧化物酶，所述混 合寡核苷酸探针杂交液中含有三条寡核苷酸探针1、探针2、探针3。
【专利摘要】本发明公开了一种陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方法及其探针和试剂盒，发明人根据陆川猪肺炎支原体P36全基因片段中的三段特异的DNA序列设计合成了的三条寡核苷酸探针。同时，发明人研究建立或制备相关了检测方法和试剂盒。本发明的特异探针特异性强、灵敏度高，据此建立的检测方法和试剂盒，可方便快速地用于地高辛标记原位杂交检测陆川猪肺炎支原体P36基因。将本发明应用于广西陆川猪肺炎支原体的检测与监测研究，可实现快速且准确地鉴定陆川猪肺炎支原体，从而确定肺炎支原体DNA在陆川猪肺脏组织中的分布情况，将陆川猪肺炎支原体病原核酸分布情况与其相关的病理组织变化相结合，从而达到准确检测预报的目的。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN104894116
【申请号】CN201510277503
【发明人】韦英益, 何颖, 陈忠伟, 赵武, 黎珂钰, 秦毅斌, 卢冰霞, 梁家幸, 李斌, 苏乾莲, 杨思仪, 周英宁, 蒋冬福, 卢定专
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所, 广西大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日...
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检 测方法及其探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪支原体肺炎或猪地方性支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae of Swine, MPS)是一种慢性呼吸道接触性传染病，该病的病原是猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)，常与猪多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合症病 毒、猪流感病毒等协同作用引起的猪呼吸道综合症，严重威胁现代养猪业，是造成比较高致 死率的主要原因。自然感染只见于猪，各种猪不分年龄、性别、品种均能感染。陆川猪具有 皮薄、肉嫩、脆而不腻等特征，是全国八大地方优良品种之一。其呼吸系统中颈粗而短，属于 上呼吸道的气管和支气管较短小，胸腔较其他品种窄小，对猪支原体肺炎比其他猪种更为 易感，病情发展的过程更加严重，猪支原体肺炎一直是制约陆川猪规模化养殖产业发展的 瓶颈。
[0003] Mhp的P36蛋白具有细菌L一乳酸脱氢酶（L-Lactate Dehydrogenase, LDH)的典型 区域，并具有较高的同源性。当机体感染了 Mhp后，能够产生较多的对抗P36蛋白的抗体。 并且针对P36蛋白产生的抗体具有很强的种属特异性，既不与其他的LDH发生交叉反应，又 不会与猪鼻支原体或猪絮状支原体的蛋白发生免疫反应。因此，针对Mhp P36蛋白进行检 测，对于临床诊断和研宄Mhp的致病机理具有重要的意义。目前，检测广西陆川猪Mhp主要 运用PCR检测方法，但该方法仅仅局限于对病原体的检测，并不能对Mhp的感染过程进行定 位的研宄。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种方便快速、特异性强、灵敏度高的陆川猪肺 炎支原体P36基因原位杂交检测方法及其探针和试剂盒。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：陆川猪肺炎支原体P36基因原 位杂交检测探针，该探针为寡核苷酸探针，探针分别具有以下碱基序列：
[0006] 探针 1 5'-ATACC TTAAT AACTA TAATT AGGAC TAAAA CGGCT-DIG-3'，
[0007] 探针 2 5'- ATACT TATAT TTCTA GATTT TCTAC GACTA AAATA - DIG-3'，
[0008] 探针 3 5' -TTAGG ACAAC TATAT TAATG TTCCC GAATG GCCCT-DIG-3'，
[0009] 寡核苷酸探针3'端采用地高辛标记DIG。
[0010] 使用上述探针的陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方法。
[0011] 上述检测方法采用三条寡核苷酸探针1、探针2、探针3的混合液对陆川猪肺炎支 原体P36基因417~452、516~551、687~722位点的核苷酸序列进行混合检测。
[0012] 上述检测方法包括以下步骤：
[0013] (1)特异性寡核苷酸探针的制备：根据猪肺炎支原体P36基因417~452、516~ 551、687~722三个基因位点设计三条寡核苷酸探针，并采用地高辛进行标记；
[0014] (2)检测样品制备及预处理：将经过4%缓冲多聚甲醛溶液固定后的组织样品进 行脱水、石蜡包埋后进行切片，切片贴附于经过多聚赖氨酸处理且已经消除内源性酶的载 玻片上；样品切片置于37°C干燥箱内烤片，过夜；次日脱蜡，水化处理；
[0015] ⑶消除内源性酶和暴露mRNA核酸片段：分别用3% H2O2溶液和消化液进行处理， 消化液包含ImL 3%柠檬酸溶液和100 μ L浓缩型胃蛋白酶；
[0016] (4)预杂交和杂交：先加入预杂交液，放入湿盒中42°C温箱内预杂交2h，吸取多余 的液体；然后，加入已进行地高辛标记的混合寡核苷酸探针液进行杂交；
[0017] (5)杂交后信号放大处理：特异性寡核苷酸探针先和生物素化鼠抗地高辛液结 合，再结合链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，最后与生物素化过氧化物酶；
[0018] (6)滴加 DAB反应后显色。
[0019] 步骤⑷中探针与mRNA杂交结合的条件为：杂交温度为42°C，时间为20-24小时。
[0020] 步骤（6)中DAB反应时间控制在Imin内。
[0021] 含有上述探针的陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测试剂盒。
[0022] 上述检测试剂盒包括胃蛋白酶、预杂交液、混合寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生 物素化鼠抗地高辛、SABC - P0D、生物素化过氧化物酶，混合寡核苷酸探针杂交液中含有三 条寡核苷酸探针1、探针2、探针3。
[0023] 发明人根据陆川猪肺炎支原体P36全基因片段设计合成了三条寡核苷酸探针，在 上述特异探针的基础上，发明人研宄建立了陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方 法，并制备了相关试剂盒。本发明的特异探针特异性强、灵敏度高，据此建立的检测方法和 试剂盒，可方便快速地用于地高辛标记原位杂交检测陆川猪肺炎支原体P36基因。将本发 明应用于广西陆川猪肺炎支原体的检测与监测研宄，可实现快速且准确地鉴定陆川猪肺炎 支原体，从而确定肺炎支原体DNA在陆川猪肺脏组织中的分布情况，从组织学的角度将陆 川猪肺炎支原体病原核酸分布情况与其相关的病理组织变化相结合对Mhp的病原进行精 确地定位研宄，从而达到准确检测预报的目的，为进一步研宄广西陆川猪Mhp致病机理奠 定基础。
【附图说明】
[0024] 图1阴性对照检测结果图。
[0025] 图2阳性对照检测结果图一。
[0026] 图3阳性对照检测结果图二。
[0027] 图4阳性对照检测结果图三。
【具体实施方式】
[0028] 一、特异性寡核苷酸探针及标记
[0029] 根据陆川猪肺炎支原体P36全基因片段（X67286，1394bp)中的三段特异的DNA序 列，对应碱基区域分别为417~452、516~551、687~722,设计合成了的三条寡核苷酸探 针，合成后于每一探针的3'末端标记地高辛DIG。
[0030] 二、陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方法的建立
[0031] 1.试验材料
[0032] 检测样品为2014年10-12月期间采集的广西陆川猪猪肺组织。眼观病理变化疑 似猪支原体肺炎、经细菌分离和PCR检测为猪肺炎支原体阳性肺组织，作为阳性对照。阴 性对照组为检测为猪肺炎支原体阴性，且眼观病变正常的肺组织；并设不包含核酸探针的 PBS缓冲液代替专项寡核苷酸杂交液的试剂阴性对照组。
[0033] 用于原位杂交检测的试剂盒包括胃蛋白酶、预杂交液、混合寡核苷酸探针杂交液、 封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC - P0D、生物素化过氧化物酶。其中，混合寡核苷酸探针 杂交液中含有三相寡核苷酸探针1、探针2、探针3,探针分别具有以下碱基序列：
[0034] 探针 1 5'- ATACC TTAAT AACTA TAATT AGGAC TAAAA CGGCT - DIG-3' (见序列表 SEQ. ID. No. 1)，
[0035] 探针 2 5'- ATACT TATAT TTCTA GATTT TCTAC GACTA AAATA - DIG-3' (见序列表 SEQ. ID. No. 2)，
[0036] 探针 3 5'- TTAGG ACAAC TATAT TAATG TTCCC GAATG GCCCT - DIG-3' (见序列表 SEQ. ID. No. 3)，
[0037] 寡核苷酸探针3'端采用地高辛标记DIG。
[0038] 试剂盒中的其它液体和试剂组成如下：
[0039] 胃蛋白酶液--用时配制成浓度为20mg/mL。2g/管，1管/盒，无色透明液体；
[0040] 预杂交液--2mL/管，1管/盒，无色透明液体。成分包括酵母RNA 500mg，20XSSC 250ml，肝素 50mg，10%Tween20 10ml，柠檬酸（单水）1.89g。以上试剂用 500mL DEPC 水溶 解后（定容至500)再加入500ml去离子甲酰氨。溶液的pH调节至6. 0-6. 5。各种试剂的 终浓度为酵母RNA: 500 μ g/ml ;肝素50 μ g/ml ;柠檬酸：9mM ;去离子甲酰氨：50%，溶液-20 度保存；
[0041] 洗涤液--SSC干粉2包/盒，使用时1000 mL蒸馏水加2 X SSC干粉一包充分溶 解；
[0042] 混合寡核苷酸探针杂交液--浓度为2 μ g/mL，2mL/管，无色透明液体；
[0043] 封闭液--IOg Blocking Reagent 加至 100mL 0· IM TBS 含 0· 1% DEPC，PH7. 4 缓 冲液中，2mL/管，无色透明液体；
[0044] 内源酶消除液一一30% H2O2溶液，5mL/管，现用现配成3% H2O2溶液，4°C避光保 存；
[0045] 消化液--3 %柠檬酸溶液，5mL/管。用时加入IOOuL胃蛋白酶液（浓度20mg/ mL)
[0046] 生物素化鼠抗地高辛--10 μ L生物素化鼠抗地高辛用IOmL封闭液稀释，5mL/ 管，1管/盒，无色透明液体；
[0047] SABC-P0D--5mL/管，1管/盒，黄色透明液体；
[0048] 生物素化过氧化物酶--5mL/管，1管/盒，无色透明液体。
[0049] DAB显色试剂盒，康为世纪，北京；
[0050] 焦碳酸二乙酯（DEPC)，Sigma，美国；
[0051] 多聚甲醛干粉，Sigma，美国；
[0052] 柠檬酸三钠，Sigma，美国；
[0053] 柠檬酸，Sigma，美国；
[0054] 2 X SSC干粉，博士德公司，武汉；
[0055] PBS缓冲液干粉，Sigma，美国；
[0056] 30% H2O2，南京化学试剂有限公司，江苏；
[0057] 甲醇，南京化学试剂有限公司，江苏；
[0058] PBS缓冲液：2000mL蒸馏水中加 PBS缓冲液干粉一包，充分溶解即可；
[0059] 含DEPC的多聚甲醛固定液：1000 mL PBS加入多聚甲醛干粉40g，加热搅拌溶解后 趁热加 DEPC至终浓度0. 1 % ;
[0060] 2X SSC :1000 mL蒸馏水加2X SSC干粉一包充分溶解即可；
[0061] 0· 5XSSC :300mL 蒸馏水加 IOOmL 2XSSC ;
[0062] 0· 2 X SSC : 270mL 蒸馏水加 30mL 2 X SSC ;
[0063] 3% H2O2-甲醇溶液：IOmL 30%明2加入甲醇90mL，现配现用，4°C避光保存；
[0064] 3%柠檬酸溶液：100mL蒸馏水中加3g柠檬酸粉末，pH 2. 0左右；
[0065] 2.试验操作
[0066] (1)检测样品固定：检测样品于4 %缓冲多聚甲醛溶液中固定24h。
[0067] (2)原位杂交检测样品制备及预处理：将经过4%缓冲多聚甲醛溶液固定后的组 织样品进行脱水、石蜡包埋后进行切片，切片贴附于经过多聚赖氨酸处理且已经消除内源 性酶的载玻片上；样品切片置于37°C干燥箱内烤片，过夜；次日脱蜡，水化处理。
[0068] ⑶消除内源性酶和暴露mRNA核酸片段：分别用3% H2O2溶液和消化液进行处理， 室温放置lOmin，蒸馏水洗3次，每次5min ;后加入消化液，消化液包含ImL 3 %柠檬酸溶液 和IOOuL胃蛋白酶液，37°C恒温箱内消化lOmin，PBS洗3次，每次5min，蒸馏水洗5min。
[0069] (4)预杂交和杂交：先加入预杂交液，放入湿盒中42°C温箱内预杂交2h，吸取多余 的液体；然后加入已进行地高辛标记的混合寡核苷酸探针液进行杂交，放入湿盒置于42°C 恒温箱内杂交20~24h。杂交后洗涤用37 °C的2 X SSC洗涤5minX 2次，0. 5 X SSC洗涤 15minXl 次，0· 2XSSC 洗涤 15minXl 次。
[0070] (5)滴加封闭液：每片滴加20yL封闭液，37°C孵育30min。甩去多余的液体，不 洗。滴加生物素化鼠抗地高辛，37°C孵育lh，PBS洗5minX4次。切勿用其他缓冲液和蒸馏 水洗绦。
[0071] (6)滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC):每片滴加20 μ L SABC， 37°C孵育 20min，PBS 洗 5minX4 次。
[0072] (8)滴加生物素化过氧化物酶：每片滴加20 yL生物素化过氧化物酶，37°C孵育 20min，PBS 洗 5minX4 次。
[0073] (9) DAB显色：每个组织片滴加20 μ L DAB显色液后，置于显微镜下观察，当看到组 织片颜色变黄（DAB反应时间在Imin内）立即置于蒸馏水中终止反应，自来水洗IOmin后， 蒸馏水洗5min。
[0074] (10)复染、水洗：苏木素复染Imin -蒸馏水洗3min - 1%盐酸酒精5s -自来水 洗 IOmin0
[0075] (11)脱水封片：75%酒精211^11 - 85%酒精21^11 - 90%酒精21^11 - 95%酒 精 3min - 100 % 酒精 I 3min (I) - 100 % 酒精⑵ 3min -二甲苯（I) IOmin -二甲苯 (2)10min-中性树胶封片。
[0076] 结果：如图1至4所示，检测样本肺组织细胞核染成蓝色，猪肺炎支原体阳性样本 原位杂交后在气管、支气管黏膜上皮细胞表面出现棕黄色至深棕色信号，即特异性阳性信 号；阴性对照样本无特异性信号。
【主权项】
1. 陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测探针，其特征在于该探针为寡核苷酸探 针，所述探针分别具有以下碱基序列： 探针 1 5'-ATACCTTAATAACTATAATTAGGACTAAAACGGCT-DIG-3'， 探针 2 5'-ATACTTATATTTCTAGATTTTCTACGACTAAAATA-DIG-3'， 探针 3 5'-TTAGGACAACTATATTAATGTTCCCGAATGGCCCT-DIG-3'， 寡核苷酸探针3'端采用地高辛标记DIG。2. 使用权利要求1所述探针的陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方法。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于采用三条寡核苷酸探针1、探针2、探针 3的混合液对陆川猪肺炎支原体P36基因417~452、516~551、687~722位点的核苷酸 序列进彳T检测。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 特异性寡核苷酸探针的制备：根据猪肺炎支原体P36基因417~452、516~551、 687~722三个基因位点设计三条寡核苷酸探针，并采用地高辛进行标记； (2) 检测样品制备及预处理：将经过4%缓冲多聚甲醛溶液固定后的组织样品进行脱 水、石蜡包埋后进行切片，切片贴附于经过多聚赖氨酸处理且已经消除内源性酶的载玻片 上；样品切片置于37°C干燥箱内烤片，过夜；次日脱蜡，水化处理； (3) 消除内源性酶和暴露mRNA核酸片段：分别用3% 11202溶液和消化液进行处理，消化 液包含ImL3%柠檬酸溶液和100yL浓缩型胃蛋白酶； (4) 预杂交和杂交：先加入预杂交液，放入湿盒中42°C温箱内预杂交2h，吸取多余的液 体；然后，加入已进行地高辛标记的混合寡核苷酸探针液进行杂交； (5) 杂交后信号放大处理：特异性寡核苷酸探针先和生物素化鼠抗地高辛液结合，再 结合链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，最后与生物素化过氧化物酶； (6) 滴加DAB反应后显色。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于步骤（4)中探针与mRNA杂交结合的条 件为：杂交温度为42°C，时间为20-24小时。6. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于步骤（6)中DAB反应时间控制在Imin 内。7. 含有权利要求1所述探针的陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测试剂盒。8. 根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于包括胃蛋白酶、预杂交液、混合寡核 苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC-POD、生物素化过氧化物酶，所述混 合寡核苷酸探针杂交液中含有三条寡核苷酸探针1、探针2、探针3。
【专利摘要】本发明公开了一种陆川猪肺炎支原体P36基因原位杂交检测方法及其探针和试剂盒，发明人根据陆川猪肺炎支原体P36全基因片段中的三段特异的DNA序列设计合成了的三条寡核苷酸探针。同时，发明人研究建立或制备相关了检测方法和试剂盒。本发明的特异探针特异性强、灵敏度高，据此建立的检测方法和试剂盒，可方便快速地用于地高辛标记原位杂交检测陆川猪肺炎支原体P36基因。将本发明应用于广西陆川猪肺炎支原体的检测与监测研究，可实现快速且准确地鉴定陆川猪肺炎支原体，从而确定肺炎支原体DNA在陆川猪肺脏组织中的分布情况，将陆川猪肺炎支原体病原核酸分布情况与其相关的病理组织变化相结合，从而达到准确检测预报的目的。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN104894116
【申请号】CN201510277503
【发明人】韦英益, 何颖, 陈忠伟, 赵武, 黎珂钰, 秦毅斌, 卢冰霞, 梁家幸, 李斌, 苏乾莲, 杨思仪, 周英宁, 蒋冬福, 卢定专
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所, 广西大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日...
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