一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物、探针及试剂盒的制作方法
一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术 (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术（Lateral Flow Assay)检测牛病毒性腹泻病毒所用的引物和探针组合及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV)引起的牛病毒性腹泻 粘膜病，是牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床上以发热、腹泻、黏膜糜烂、溃疡、白细 胞减少、持续感染与免疫耐受、免疫抑制、怀孕母牛流产、产死胎和畸型胎以及致死性粘膜 病为主要特征。该病呈世界性分布，感染情况复杂，持续性感染个体症状隐蔽，动物带毒率 高，特别是BVDV严重影响感染动物的繁殖，给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。因而被 世界动物卫生组织（OIE)列为发病必须上报的动物传染病之一。
[0003] 目前检测BVDV的主要方法有病毒分离、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、血清 中和试验、电镜检查等，但这些方法不仅操作繁琐复杂、耗时耗力，而且难以用于BVDV的现 场诊断。因此，亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为该病的现场诊断提供新一代的 检测技术与手段。
[0004] 重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是不同于 PCR的核酸检测技术，主要有结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶 三种酶参与。其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻 找同源序列。在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形 成复制所需的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补链，对 模板上的目标区域进行指数式扩增。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在 RPA扩增体系中加入一个生物素标记的反向引物和5'荧光标记的探针，探针标记的荧光基 团30个碱基处有一个脱碱基位点（dSpacer)，该位点是DNA修复酶作用的底物，可被核酶 nfo识别切割，产生新的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，从而使双标信 号与扩增产物的累积同步，检测结果可在抗FAM金标结合和抗生物素捕获抗体的侧流层析 试纸条上显示。
[0005] 目前对于RPA技术的研宄尚处于起步阶段，且国内外还没有将侧流层析RPA技术 应用于BVDV检测的报道。本发明系首次采用RPA结合侧流层析技术建立快速检测BVDV的 方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BVDV的现场检测提供一种灵 敏、可靠的新方法。
【发明内容】
[0006] 针对RPA侧流层析技术应用于BVDV临床现场快速检测领域的优点，本发明提供了 一种准确、快速、简便检测BVDV的RPA检测方法。仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提 取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩 增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时 间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行牛病毒性腹泻病毒的诊治。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] -种用于通过RPA技术检测BVDV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探针序列如SEQ ID No. 3所示。
[0009] 正向引物：5' -CCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGAC-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0010] 反向引物：5' -【Biotin】CAATACAGTGGGCCTCTGCAGCACCCTATCAGGC-3' ；（SEQ ID No. 2)
[0011] 探针序列：5' -【FAM】CTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCA【dSpacer】 AGCACATCTTAACCTG【C3-spacer】3'（探针5' -端用FAM标记，距离5' -端30个碱基左右 的位置处用dSpacer替代一个碱基，3'端用C3_spacer阻断）。（SEQ ID No. 3)
[0012] 需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp， 探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度 的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。 RPA技术正处于起步研宄阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引 物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引 物进行优化、筛选才能得到。
[0013] 本发明还提供了一种检测BVDV的试剂盒，该试剂盒中包含有用于通过RPA技术检 测BVDV的引物和探针组合。
[0014] 进一步的，该检测试剂盒中还包括有：BVDV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子 水和侧流层析检测试剂。BVDV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水与引物和探针组合一 起构成RPA扩增体系。
[0015] 所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置 换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白（SSB)、280mM醋酸镁（MgAc)溶液。
[0016] 所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液 (1XPBS+0. 1% Tween20)。
[0017] 所述BVDV阳性对照模板的制备方法为：分别在SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的引物对的上游和下游设计引物：
[0018] 上游引物：5' -agtggtgagttcgttggatggc-3'（SEQ ID No. 4);
[0019] 下游引物：5' -catgtgccatgtacagcagaga-3'（SEQ ID No. 5);
[0020] 以BVDV基因组cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50yL :10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 5yL、2. 5mM dNTP Mixture 8yL、LA Taq 0.5yL(5U/yL)、模板 2yL， 10 ymol/L的上下游引物各2 yL，灭菌超纯水加至50 yL。反应程序为：94°C预变性3min，然 后进入94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s，共进行31个循环；72°C延伸10min，最后停止于4°C。 PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体（该载体为常规的 载体，商业化购买到），蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对， 正确的重组质粒为BVDV阳性对照模板。
[0021] 具体的，一种检测BVDV的试剂盒，每50yL RPA扩增体系中含有正向引物、反向引 物各 2. 1 μ L (10 μ mol/L)，探针 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，BVDV 阳性对照模板 2 μ L，Rehydration 缓冲液29. 5 μ L，去离子水11. 2 μ L和醋酸镁溶液（280mM) 2. 5 μ L。
[0022] 本发明还提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测BVDV的方法，步骤如 下：
[0023] (1)应用快速提取病毒RNA试剂盒提取BVDV细胞培养病毒上清液的RNA，按照Fe rmentas RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 RT-PCR 反应，获得 BVDV的cDNA模板；
[0024] (2)根据BVDV保守区域设计RPA特异性引物和探针，向RPA扩增试剂盒推 荐反应的50 yL扩增体系中加入正向引物、反向引物各2. I yL(10 μ mol/L)，探针 0· 6 yL(10 ymol/L)，模板 DNA 2 yL，29. 5 yLRehydration 缓冲液，11. 2 yL 去离子水和 2. 5 μ L醋酸镁溶液（280mM)，于含有冻干酶粉的0. 2mL TwistAmp nfo反应管中，恒温水浴 锅内38 °C反应25分钟；
[0025] (3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，若侧流层析试纸条上显现出检测带 和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅显示对照带，则结果为阴性。
[0026] 应用上述方法可以筛选出一套可快速有效检测出BVDV成分的引物及探针组合。
[0027] 以已知病毒滴度为2. OX IO5TCID5tZmL的BVDV用DEPC水进行10倍系列稀释后， 提取RNA并进行反转录后进行检测，结果显示可以检测到2TCID 5(I的靶标分子，证明该方法 具有较高的灵敏度 。
[0028] 以2. OX Io2TCID5qBVDV样品的cDNA作为模板，利用上述的引物和探针进行RPA 等温扩增，扩增产物在侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，而以其它病毒的DNA或 cDNA为模板扩增均仅显示对照带，表明该方法具有较好的特异性。
[0029] 以合成的2TCID5QBVDV样品的cDNA作为模板，按照上述所述的引物和探针进行RPA 等温扩增，每个模板进行3次重复，扩增产物分别在侧流层析试纸条进行检测。结果表明每 组相同量模板的扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出亮度相同的检测带和对照带，具 有较好的重复性。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] (1)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对BVDV进行检测的方法，具有较 高的灵敏度、特异性和重复性。
[0032] (2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测BVDV的方法，既可用于临床血液、 奶样、组织等临床常规样本的检测，也可对病毒气溶胶等微量样本进行检测。本发明只需对 临床样本进行cDNA合成，且恒温扩增，不需要热循环反应，扩增阶段不需要特殊的仪器；结 果可通过视觉直观检测，不需要检测仪，且反应速度快，敏感性高，可在非实验室环境下短 时间内即可完成BVDV的临床现场检测。
【附图说明】
[0033] 图1为BVDV RPA侧流层析方法的建立，其中，I :RPA试剂盒提供模板、引物及探针 组合作阳性对照；2 :BVDV阴性对照，模板为4〇 ;3 :BVDV cDNA。
[0034] 图2为BVDV灵敏度检测，其中，I :BVDV阳性对照；2 :BVDV阴性对照；从3到9模 板依次为BVDV病毒滴度为2. OX 105-2. OX KT1TCID5c^
[0035] 图3为BVDV特异性检测，其中，1 :牛病毒性腹泻病毒（BVDV) ;2 :牛肠道病毒 (BEV) ;3 :牛冠状病毒（BcoV) ;4 :牛轮状病毒（BRV) ;5 :牛副流感3型病毒（BPIV-3) ;6 :牛 流行热病毒（BEFV) ;7 :牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV)。
[0036] 图4为BVDV重复性检测，模板为BVDV cDNA，滴度为2TCID5Q。
[0037] 图5为临床样本检测，其中，I :BVDV阳性对照；2 :BVDV阴性对照；3-18 :BVDV阳性 样本；19-21 :BVDV阴性样本。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解 释本发明，并不对其内容进行限定。
[0039] 下面实施例中所用一些材料和试剂如下：分子生物学试剂，TwistAmp nfo Kits 购自 TwistDX 公司；Genline Hybridetect-I lateral flow strips 购自 Milenia GmbH(Germany) ;LA Taq DNA Polymerase，病毒RNA提取试剂盒（Code No. :9766)购自宝生 物工程（大连）有限公司；RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit (目录号：K1622) 购自Fermentas公司；pEASY-T3Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；其他生化 试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。
[0040] 仪器包括：恒温水浴锅、离心机、涡旋仪、分光光度计和纯水仪等。
[0041] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的 《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2〇01)中所 述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
[0042] 实施例1 :引物和探针的设计与筛选
[0043] 引物和探针的有效设计是决定实验成功的最关键环节。然而，RPA技术正处于起 步研宄阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依 据。目前实验中需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选，该技术引物设计要求极 其严格，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。设计时通常需要考虑以下 几个因素 ：（l)引物长度要求为 30-35bp，探针长度要求为 46-52bp，GC含量在40%-60%， 避免引物内部出现二级结构且避免引物出现重复序列。（2)检测扩增片段小于500bp。（3) 避免引物和探针之间形成二聚体，影响结果的准确性。
[0044] 本实验中依据GenBank中发表的BVDV 5' UTR的保守序列设计了 2条探针，在每 条探针的两侧分别设计了 2条上游引物和3条下游引物。以病毒RNA快速提取试剂盒提 取细胞培养病毒的基因组RNA，反转录合成的cDNA为模板，对设计的不同引物、探针组合进 行RPA扩增筛选，同时以去离子水为模板作阴性对照，以RPA扩增试剂盒提供的模板、引物 和探针组合做阳性对照，最终选出一对扩增产物能在侧流层析试纸条中显示清晰的检测条 带和对照条带（图1)，筛选出的引物和探针序列见SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3 (表 1)。
[0045] 表1筛选得到的引物和探针序列
[0046]
[0047] 注：探针5' -端用FAM标记，距离5'端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代 一个碱基，3'端用C3_spacer阻断。
[0048] Biotin :生物素；FAM :发光基团；dSpacer :脱碱基位点；C3_spacer :聚合酶延伸 阻断基团。
[0049] 实施例2 :实验室BVDV RPA扩增检测方法的建立与考察
[0050] 1.实验室BVDV RPA扩增检测方法的建立
[0051] I. I BVDV基因组cDNA的合成
[0052] 取200 μ L细胞培养病毒上清液，参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取病毒的 RNA，溶解在 50 μ L RNAase-free 水中。按照 Fermentas RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 RT-PCR 反应，获得 BVDV cDNA。
[0053] L2RPA 扩增
[0054] 本实施例中应用PRA方法扩增BVDV特异序列，具体步骤为：
[0055] (1)向离心管中加入实施例1设计的上下游引物各2. 1 μ L(10ymol/L)，LF探针 0· 6 μ L(10 ymol/L)，Rehydration 缓冲液 29. 5 μ L，模板 DNA 2 μ L，用 CldH2O 补足到体积 47. 5 μ L，漩涡混匀后短暂离心；见表2。
[0056] 表2 RPA扩增体系
[0057]
[0058] (2)将47. 5 μ L上述混合液转移到含有冻干酶粉的0. 2mL TwistAmp nfo反应管 中，用移液器反复吹打直到整个冻干三种混合酶颗粒溶解；
[0059] (3)向每个反应管中加入2. 5 μ L(280mmol/L)的醋酸镁溶液，用力上下颠倒漩涡 混匀8-10次，反应立即发生；
[0060] (4)将反应管放入38°C的恒温水浴锅中，处理4min ;
[0061] (5)反应4min后，取出反应管，用力上下颠倒漩涡混匀8-10次，短暂离心后放入 38 °C的恒温水浴锅中继续反应2 Imin，得RPA反应产物。
[0062] I. 3侧流层析试纸条进行扩增产物检测
[0063] 取一定数量的侧流层析试纸条（dipstick，Milennia GenLine HybriDetect MGHD1)，针对不同检测样本号进行标记。每一个检测样本取99 μ L杂交检测缓冲液 (HybriDetect Assay Buffer)，加入反应管中。取IyL杂交反应产物（RPA反应产物）在 离心管中混匀，杂交反应液和杂交检测缓冲液共IOOu L。将试纸条的样品反应区加入反应 液，孵育5分钟，孵育结束后，从反应液中取出试纸条，立即观察。如果试纸条反应区显示两 条可见条带，则检测样本为阳性；如果试纸条反应区对照线显示清晰，检测线未见条带，则 检测样本为阴性。
[0064] 2. BVDV RPA扩增检测方法的考察
[0065] 2. I BVDV RPA扩增检测方法的敏感性考察
[0066] 将已知病毒滴度为2. OX 105TCID5Q/100 μ L的BVDV病毒液用DEPC水进行10倍系 列稀释后，应用上述提供的方法合成BVDV cDNA，分别吸取2 yL BVDV cDNA为模板，按"1.2 引物扩增"操作方法进行扩增，取1 μ L杂交反应产物（RPA反应产物）在侧流层析试纸条 上显示，结果表明，可以检测到2TCID5(I的靶标分 子（图2)，说明用本发明设计的引物检测 BVDV具有较高的灵敏度和准确性，且操作简便。
[0067] 2. 2 BVDV RPA扩增检测方法的特异性考察
[0068] 取200 μ L牛副流感3型病毒（BPIV-3)滴度为6. 23 X IO5 6TCID5Q/mL、牛肠道病毒 (BEV)滴度为 4. IX IO7 8TCID5tZmL、牛冠状病毒（BcoV)滴度为 5. 8 X IO6 5TCID5Q/mL、牛轮状 病毒（BRV)滴度为 2· 3Χ IO7.°TCID5Q/mL和牛流行热病毒（BEFV)滴度为 3· 2Χ IO5.5TCID5tZmL 的细胞培养毒，参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取RNA，溶解在50 μ L RNAase-free水 中。按照 Fermentas RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 RT-PCR 反应，获得上述病毒的cDNA模板，同时取滴度为8. 0 X IO7TCID5cZmL牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV) 200 μ L，参照病毒DNA提取试剂盒说明书，提取50 μ L IBRV基因组DNA。
[0069] 以2. OX Io2TCID5qBVDV样品的cDNA作为阳性对照模板，利用实施例1优化筛选的 引物和探针对BEV、BcoV、BRV、BPIV-3、BEFV的cDNA和IBRV的DNA进行RPA等温扩增，扩 增产物在侧流层析试纸条进行检测。结果证实BVDV扩增产物在侧流层析试纸条反应区显 现出检测带和对照带，而以其它病毒检测样本试纸条反应区仅对照线显示清晰，检测线未 见条带，均为阴性（图3)。说明本发明的BVDV RPA扩增检测方法具有较好的特异性。
[0070] 2. 3 BVDV RPA扩增检测方法的重复性考察
[0071] 以合成的2TCID5QBVDV样品的cDNA作为模板，按照实施例1优化筛选的引物和探 针进行RPA等温扩增，对该模板进行3次重复，扩增产物分别在侧流层析试纸条进行检测。 结果证实相同量模板的扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出亮度相同的检测带和对 照带，具有较好的重复性（图4)。
[0072] 实施例3 :临床样本BVDV检测
[0073] I. BVDV基因组cDNA的合成
[0074] 分别取本实验室已建立的BVDV荧光定量RT-PCR鉴定为BVDV阳性牛的腹泻粪便 样本16份和阴性样本3份，利用实施例2中" I. IBVDV基因组cDNA的合成"的方法合成BVDV 基因组cDNA，用于RPA模板扩增。
[0075] 2.临床样本侧流层析RPA检测
[0076] 以制备的临床粪便样本的基因组cDNA分别作为模板，按照实施例2中步骤1中所 述的RPA检测方法进行扩增。经RPA扩增，杂交产物在侧流层析试纸条显示，16份样本试纸 条反应区显示对照条带和检测条带，表明16份临床样本中含有BVDV，结果与本实验其它方 法检测的符合率为100%，结果如图5所示。
[0077] 实施例4 :用于BVDV检测的试剂盒
[0078] I. BVDV阳性对照模板制备
[0079] 分别在实施例1筛选获得的引物对的上游和下游设计引物（上游引 物：5' -agtggtgagttcgttggatggc-3' ；下游引物：5' -catgtgccatgtacagcagaga-3'），以实 施例2中I. 1得到的BVDV基因组cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50 μ LdOXLA PCR Buffer II(Mg2+Plus)5yL、2.5mM dNTP Mixture 8yL、LA Taq 0.5 4 1^(5以4〇、模板 2 yL，10 μ mol/L的上下游引物各2 yL，灭菌超纯水加至50 yL。反应程序为：94°C预变性 3min，然后进入94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s，共进行31个循环；72°C延伸lOmin，最后停止 于4°C。PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体，蓝白斑筛 选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对，正确的重组质粒为BVDV阳性对 照模板。
[0080] 2.试剂盒的组成：实施例1筛选的引物和探针组合，BVDV阳性对照模板，RPA扩增 R ehydration缓冲液，冻干酶颗粒，醋酸镁（280mM)、去离子水和侧流层析试纸条。
[0081] 3.扩增体系：扩增体系为50 μ L，向含有冻干酶粉的0. 2mL TwistAmp Exo反应 管中加入正向引物、反向引物各2. I yL(10 ymol/L)，探针0· 6 yL(10 ymol/L)，BVDV模板 2 μ L，29. 5 μ LRehydration 缓冲液，IL 2 μ L 去离子水和 2. 5 μ L 醋酸镁（280mM)。
[0082] 4.检测步骤：
[0083] 4. 1病毒cDNA的合成
[0084] 利用实施例2中" I. IBVDV基因组cDNA的合成"的方法合成BVDV基因组cDNA，用 于RPA模板扩增。
[0085] 4. 2 RPA 扩增
[0086] 按照实施例2中" I. 2BVDV RPA扩增"的方法进行RPA扩增，38°C恒温水浴锅内共 反应25min〇
[0087] 4. 3侧流层析试纸条进行检测
[0088] 取1 μ L扩增产物，应用实施例2中" 1. 3侧流层析试纸条进行扩增产物检测"的方 法进行检测，若侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅 显示对照带，则结果为阴性。
【主权项】
1. 一种用于通过RPA技术检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针组合，其特征在于，其 正向引物序列如SEQIDNo. 1所示，反向引物序列如SEQIDNo. 2所示，探针序列如SEQID No. 3所示。2. 权利要求1所述的引物和探针组合在制备检测牛病毒性腹泻病毒的检测试剂中的 应用。3. -种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述 的引物和探针组合。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：BVDV阳性对照模板、 RPA扩增试剂、去离子水和侧流层析检测试剂。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲 液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白和醋酸镁溶液。6. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析 试纸条和杂交检测缓冲液。7. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述醋酸镁溶液的浓度为280mM。8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，扩增体系为50yL，向含有冻干酶粉的 0.2mLTwistAmpnfo反应管中加入正向引物、反向引物各2.IyL，探针0.6yL，BVDV阳性 对照模板2yL，11. 2yL去离子水和2. 5yL醋酸镁溶液。9. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述BVDV阳性对照模板的制备方法为： 分别以SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5所示的引物为上、下游引物，以BVDV基因组cDNA为模 板进行PCR扩增，PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载 体，蓝白斑筛选重组质粒，测序，将测序结果进行比对，正确的重组质粒为BVDV阳性对照模 板。10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的反应体系为50yL:10XLA PCRBufferII5uL、2.5mMdNTPMixture8yL、LATaq0.5卩1、模板2卩1^，10卩111〇1/1的 上下游引物各2yL，灭菌超纯水加至50yL; PCR扩增的反应程序为：94°C预变性3min，然后进入94°C30s，55°C30s，72°C40s，共进 行31个循环；72°C延伸10min，最后停止于4°C。
【专利摘要】本发明公开了一种用于通过RPA技术检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明还公开了用于牛病毒性腹泻病毒检测的试剂盒。采用本发明的引物和探针进行检测，仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行该病的诊治。
【IPC分类】C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN104894118
【申请号】CN201510292386
【发明人】何洪彬, 侯佩莉, 王洪梅
【申请人】山东省农业科学院奶牛研究中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月1日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术 (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术（Lateral Flow Assay)检测牛病毒性腹泻病毒所用的引物和探针组合及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV)引起的牛病毒性腹泻 粘膜病，是牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床上以发热、腹泻、黏膜糜烂、溃疡、白细 胞减少、持续感染与免疫耐受、免疫抑制、怀孕母牛流产、产死胎和畸型胎以及致死性粘膜 病为主要特征。该病呈世界性分布，感染情况复杂，持续性感染个体症状隐蔽，动物带毒率 高，特别是BVDV严重影响感染动物的繁殖，给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。因而被 世界动物卫生组织（OIE)列为发病必须上报的动物传染病之一。
[0003] 目前检测BVDV的主要方法有病毒分离、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、血清 中和试验、电镜检查等，但这些方法不仅操作繁琐复杂、耗时耗力，而且难以用于BVDV的现 场诊断。因此，亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为该病的现场诊断提供新一代的 检测技术与手段。
[0004] 重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是不同于 PCR的核酸检测技术，主要有结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶 三种酶参与。其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻 找同源序列。在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形 成复制所需的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补链，对 模板上的目标区域进行指数式扩增。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在 RPA扩增体系中加入一个生物素标记的反向引物和5'荧光标记的探针，探针标记的荧光基 团30个碱基处有一个脱碱基位点（dSpacer)，该位点是DNA修复酶作用的底物，可被核酶 nfo识别切割，产生新的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，从而使双标信 号与扩增产物的累积同步，检测结果可在抗FAM金标结合和抗生物素捕获抗体的侧流层析 试纸条上显示。
[0005] 目前对于RPA技术的研宄尚处于起步阶段，且国内外还没有将侧流层析RPA技术 应用于BVDV检测的报道。本发明系首次采用RPA结合侧流层析技术建立快速检测BVDV的 方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BVDV的现场检测提供一种灵 敏、可靠的新方法。
【发明内容】
[0006] 针对RPA侧流层析技术应用于BVDV临床现场快速检测领域的优点，本发明提供了 一种准确、快速、简便检测BVDV的RPA检测方法。仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提 取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩 增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时 间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行牛病毒性腹泻病毒的诊治。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] -种用于通过RPA技术检测BVDV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探针序列如SEQ ID No. 3所示。
[0009] 正向引物：5' -CCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGAC-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0010] 反向引物：5' -【Biotin】CAATACAGTGGGCCTCTGCAGCACCCTATCAGGC-3' ；（SEQ ID No. 2)
[0011] 探针序列：5' -【FAM】CTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCA【dSpacer】 AGCACATCTTAACCTG【C3-spacer】3'（探针5' -端用FAM标记，距离5' -端30个碱基左右 的位置处用dSpacer替代一个碱基，3'端用C3_spacer阻断）。（SEQ ID No. 3)
[0012] 需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp， 探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度 的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。 RPA技术正处于起步研宄阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引 物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引 物进行优化、筛选才能得到。
[0013] 本发明还提供了一种检测BVDV的试剂盒，该试剂盒中包含有用于通过RPA技术检 测BVDV的引物和探针组合。
[0014] 进一步的，该检测试剂盒中还包括有：BVDV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子 水和侧流层析检测试剂。BVDV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水与引物和探针组合一 起构成RPA扩增体系。
[0015] 所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置 换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白（SSB)、280mM醋酸镁（MgAc)溶液。
[0016] 所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液 (1XPBS+0. 1% Tween20)。
[0017] 所述BVDV阳性对照模板的制备方法为：分别在SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的引物对的上游和下游设计引物：
[0018] 上游引物：5' -agtggtgagttcgttggatggc-3'（SEQ ID No. 4);
[0019] 下游引物：5' -catgtgccatgtacagcagaga-3'（SEQ ID No. 5);
[0020] 以BVDV基因组cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50yL :10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 5yL、2. 5mM dNTP Mixture 8yL、LA Taq 0.5yL(5U/yL)、模板 2yL， 10 ymol/L的上下游引物各2 yL，灭菌超纯水加至50 yL。反应程序为：94°C预变性3min，然 后进入94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s，共进行31个循环；72°C延伸10min，最后停止于4°C。 PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体（该载体为常规的 载体，商业化购买到），蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对， 正确的重组质粒为BVDV阳性对照模板。
[0021] 具体的，一种检测BVDV的试剂盒，每50yL RPA扩增体系中含有正向引物、反向引 物各 2. 1 μ L (10 μ mol/L)，探针 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，BVDV 阳性对照模板 2 μ L，Rehydration 缓冲液29. 5 μ L，去离子水11. 2 μ L和醋酸镁溶液（280mM) 2. 5 μ L。
[0022] 本发明还提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测BVDV的方法，步骤如 下：
[0023] (1)应用快速提取病毒RNA试剂盒提取BVDV细胞培养病毒上清液的RNA，按照Fe rmentas RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 RT-PCR 反应，获得 BVDV的cDNA模板；
[0024] (2)根据BVDV保守区域设计RPA特异性引物和探针，向RPA扩增试剂盒推 荐反应的50 yL扩增体系中加入正向引物、反向引物各2. I yL(10 μ mol/L)，探针 0· 6 yL(10 ymol/L)，模板 DNA 2 yL，29. 5 yLRehydration 缓冲液，11. 2 yL 去离子水和 2. 5 μ L醋酸镁溶液（280mM)，于含有冻干酶粉的0. 2mL TwistAmp nfo反应管中，恒温水浴 锅内38 °C反应25分钟；
[0025] (3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，若侧流层析试纸条上显现出检测带 和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅显示对照带，则结果为阴性。
[0026] 应用上述方法可以筛选出一套可快速有效检测出BVDV成分的引物及探针组合。
[0027] 以已知病毒滴度为2. OX IO5TCID5tZmL的BVDV用DEPC水进行10倍系列稀释后， 提取RNA并进行反转录后进行检测，结果显示可以检测到2TCID 5(I的靶标分子，证明该方法 具有较高的灵敏度 。
[0028] 以2. OX Io2TCID5qBVDV样品的cDNA作为模板，利用上述的引物和探针进行RPA 等温扩增，扩增产物在侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，而以其它病毒的DNA或 cDNA为模板扩增均仅显示对照带，表明该方法具有较好的特异性。
[0029] 以合成的2TCID5QBVDV样品的cDNA作为模板，按照上述所述的引物和探针进行RPA 等温扩增，每个模板进行3次重复，扩增产物分别在侧流层析试纸条进行检测。结果表明每 组相同量模板的扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出亮度相同的检测带和对照带，具 有较好的重复性。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] (1)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对BVDV进行检测的方法，具有较 高的灵敏度、特异性和重复性。
[0032] (2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测BVDV的方法，既可用于临床血液、 奶样、组织等临床常规样本的检测，也可对病毒气溶胶等微量样本进行检测。本发明只需对 临床样本进行cDNA合成，且恒温扩增，不需要热循环反应，扩增阶段不需要特殊的仪器；结 果可通过视觉直观检测，不需要检测仪，且反应速度快，敏感性高，可在非实验室环境下短 时间内即可完成BVDV的临床现场检测。
【附图说明】
[0033] 图1为BVDV RPA侧流层析方法的建立，其中，I :RPA试剂盒提供模板、引物及探针 组合作阳性对照；2 :BVDV阴性对照，模板为4〇 ;3 :BVDV cDNA。
[0034] 图2为BVDV灵敏度检测，其中，I :BVDV阳性对照；2 :BVDV阴性对照；从3到9模 板依次为BVDV病毒滴度为2. OX 105-2. OX KT1TCID5c^
[0035] 图3为BVDV特异性检测，其中，1 :牛病毒性腹泻病毒（BVDV) ;2 :牛肠道病毒 (BEV) ;3 :牛冠状病毒（BcoV) ;4 :牛轮状病毒（BRV) ;5 :牛副流感3型病毒（BPIV-3) ;6 :牛 流行热病毒（BEFV) ;7 :牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV)。
[0036] 图4为BVDV重复性检测，模板为BVDV cDNA，滴度为2TCID5Q。
[0037] 图5为临床样本检测，其中，I :BVDV阳性对照；2 :BVDV阴性对照；3-18 :BVDV阳性 样本；19-21 :BVDV阴性样本。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解 释本发明，并不对其内容进行限定。
[0039] 下面实施例中所用一些材料和试剂如下：分子生物学试剂，TwistAmp nfo Kits 购自 TwistDX 公司；Genline Hybridetect-I lateral flow strips 购自 Milenia GmbH(Germany) ;LA Taq DNA Polymerase，病毒RNA提取试剂盒（Code No. :9766)购自宝生 物工程（大连）有限公司；RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit (目录号：K1622) 购自Fermentas公司；pEASY-T3Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；其他生化 试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。
[0040] 仪器包括：恒温水浴锅、离心机、涡旋仪、分光光度计和纯水仪等。
[0041] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的 《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2〇01)中所 述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
[0042] 实施例1 :引物和探针的设计与筛选
[0043] 引物和探针的有效设计是决定实验成功的最关键环节。然而，RPA技术正处于起 步研宄阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依 据。目前实验中需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选，该技术引物设计要求极 其严格，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。设计时通常需要考虑以下 几个因素 ：（l)引物长度要求为 30-35bp，探针长度要求为 46-52bp，GC含量在40%-60%， 避免引物内部出现二级结构且避免引物出现重复序列。（2)检测扩增片段小于500bp。（3) 避免引物和探针之间形成二聚体，影响结果的准确性。
[0044] 本实验中依据GenBank中发表的BVDV 5' UTR的保守序列设计了 2条探针，在每 条探针的两侧分别设计了 2条上游引物和3条下游引物。以病毒RNA快速提取试剂盒提 取细胞培养病毒的基因组RNA，反转录合成的cDNA为模板，对设计的不同引物、探针组合进 行RPA扩增筛选，同时以去离子水为模板作阴性对照，以RPA扩增试剂盒提供的模板、引物 和探针组合做阳性对照，最终选出一对扩增产物能在侧流层析试纸条中显示清晰的检测条 带和对照条带（图1)，筛选出的引物和探针序列见SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3 (表 1)。
[0045] 表1筛选得到的引物和探针序列
[0046]
[0047] 注：探针5' -端用FAM标记，距离5'端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代 一个碱基，3'端用C3_spacer阻断。
[0048] Biotin :生物素；FAM :发光基团；dSpacer :脱碱基位点；C3_spacer :聚合酶延伸 阻断基团。
[0049] 实施例2 :实验室BVDV RPA扩增检测方法的建立与考察
[0050] 1.实验室BVDV RPA扩增检测方法的建立
[0051] I. I BVDV基因组cDNA的合成
[0052] 取200 μ L细胞培养病毒上清液，参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取病毒的 RNA，溶解在 50 μ L RNAase-free 水中。按照 Fermentas RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 RT-PCR 反应，获得 BVDV cDNA。
[0053] L2RPA 扩增
[0054] 本实施例中应用PRA方法扩增BVDV特异序列，具体步骤为：
[0055] (1)向离心管中加入实施例1设计的上下游引物各2. 1 μ L(10ymol/L)，LF探针 0· 6 μ L(10 ymol/L)，Rehydration 缓冲液 29. 5 μ L，模板 DNA 2 μ L，用 CldH2O 补足到体积 47. 5 μ L，漩涡混匀后短暂离心；见表2。
[0056] 表2 RPA扩增体系
[0057]
[0058] (2)将47. 5 μ L上述混合液转移到含有冻干酶粉的0. 2mL TwistAmp nfo反应管 中，用移液器反复吹打直到整个冻干三种混合酶颗粒溶解；
[0059] (3)向每个反应管中加入2. 5 μ L(280mmol/L)的醋酸镁溶液，用力上下颠倒漩涡 混匀8-10次，反应立即发生；
[0060] (4)将反应管放入38°C的恒温水浴锅中，处理4min ;
[0061] (5)反应4min后，取出反应管，用力上下颠倒漩涡混匀8-10次，短暂离心后放入 38 °C的恒温水浴锅中继续反应2 Imin，得RPA反应产物。
[0062] I. 3侧流层析试纸条进行扩增产物检测
[0063] 取一定数量的侧流层析试纸条（dipstick，Milennia GenLine HybriDetect MGHD1)，针对不同检测样本号进行标记。每一个检测样本取99 μ L杂交检测缓冲液 (HybriDetect Assay Buffer)，加入反应管中。取IyL杂交反应产物（RPA反应产物）在 离心管中混匀，杂交反应液和杂交检测缓冲液共IOOu L。将试纸条的样品反应区加入反应 液，孵育5分钟，孵育结束后，从反应液中取出试纸条，立即观察。如果试纸条反应区显示两 条可见条带，则检测样本为阳性；如果试纸条反应区对照线显示清晰，检测线未见条带，则 检测样本为阴性。
[0064] 2. BVDV RPA扩增检测方法的考察
[0065] 2. I BVDV RPA扩增检测方法的敏感性考察
[0066] 将已知病毒滴度为2. OX 105TCID5Q/100 μ L的BVDV病毒液用DEPC水进行10倍系 列稀释后，应用上述提供的方法合成BVDV cDNA，分别吸取2 yL BVDV cDNA为模板，按"1.2 引物扩增"操作方法进行扩增，取1 μ L杂交反应产物（RPA反应产物）在侧流层析试纸条 上显示，结果表明，可以检测到2TCID5(I的靶标分 子（图2)，说明用本发明设计的引物检测 BVDV具有较高的灵敏度和准确性，且操作简便。
[0067] 2. 2 BVDV RPA扩增检测方法的特异性考察
[0068] 取200 μ L牛副流感3型病毒（BPIV-3)滴度为6. 23 X IO5 6TCID5Q/mL、牛肠道病毒 (BEV)滴度为 4. IX IO7 8TCID5tZmL、牛冠状病毒（BcoV)滴度为 5. 8 X IO6 5TCID5Q/mL、牛轮状 病毒（BRV)滴度为 2· 3Χ IO7.°TCID5Q/mL和牛流行热病毒（BEFV)滴度为 3· 2Χ IO5.5TCID5tZmL 的细胞培养毒，参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取RNA，溶解在50 μ L RNAase-free水 中。按照 Fermentas RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 RT-PCR 反应，获得上述病毒的cDNA模板，同时取滴度为8. 0 X IO7TCID5cZmL牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV) 200 μ L，参照病毒DNA提取试剂盒说明书，提取50 μ L IBRV基因组DNA。
[0069] 以2. OX Io2TCID5qBVDV样品的cDNA作为阳性对照模板，利用实施例1优化筛选的 引物和探针对BEV、BcoV、BRV、BPIV-3、BEFV的cDNA和IBRV的DNA进行RPA等温扩增，扩 增产物在侧流层析试纸条进行检测。结果证实BVDV扩增产物在侧流层析试纸条反应区显 现出检测带和对照带，而以其它病毒检测样本试纸条反应区仅对照线显示清晰，检测线未 见条带，均为阴性（图3)。说明本发明的BVDV RPA扩增检测方法具有较好的特异性。
[0070] 2. 3 BVDV RPA扩增检测方法的重复性考察
[0071] 以合成的2TCID5QBVDV样品的cDNA作为模板，按照实施例1优化筛选的引物和探 针进行RPA等温扩增，对该模板进行3次重复，扩增产物分别在侧流层析试纸条进行检测。 结果证实相同量模板的扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出亮度相同的检测带和对 照带，具有较好的重复性（图4)。
[0072] 实施例3 :临床样本BVDV检测
[0073] I. BVDV基因组cDNA的合成
[0074] 分别取本实验室已建立的BVDV荧光定量RT-PCR鉴定为BVDV阳性牛的腹泻粪便 样本16份和阴性样本3份，利用实施例2中" I. IBVDV基因组cDNA的合成"的方法合成BVDV 基因组cDNA，用于RPA模板扩增。
[0075] 2.临床样本侧流层析RPA检测
[0076] 以制备的临床粪便样本的基因组cDNA分别作为模板，按照实施例2中步骤1中所 述的RPA检测方法进行扩增。经RPA扩增，杂交产物在侧流层析试纸条显示，16份样本试纸 条反应区显示对照条带和检测条带，表明16份临床样本中含有BVDV，结果与本实验其它方 法检测的符合率为100%，结果如图5所示。
[0077] 实施例4 :用于BVDV检测的试剂盒
[0078] I. BVDV阳性对照模板制备
[0079] 分别在实施例1筛选获得的引物对的上游和下游设计引物（上游引 物：5' -agtggtgagttcgttggatggc-3' ；下游引物：5' -catgtgccatgtacagcagaga-3'），以实 施例2中I. 1得到的BVDV基因组cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50 μ LdOXLA PCR Buffer II(Mg2+Plus)5yL、2.5mM dNTP Mixture 8yL、LA Taq 0.5 4 1^(5以4〇、模板 2 yL，10 μ mol/L的上下游引物各2 yL，灭菌超纯水加至50 yL。反应程序为：94°C预变性 3min，然后进入94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s，共进行31个循环；72°C延伸lOmin，最后停止 于4°C。PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体，蓝白斑筛 选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对，正确的重组质粒为BVDV阳性对 照模板。
[0080] 2.试剂盒的组成：实施例1筛选的引物和探针组合，BVDV阳性对照模板，RPA扩增 R ehydration缓冲液，冻干酶颗粒，醋酸镁（280mM)、去离子水和侧流层析试纸条。
[0081] 3.扩增体系：扩增体系为50 μ L，向含有冻干酶粉的0. 2mL TwistAmp Exo反应 管中加入正向引物、反向引物各2. I yL(10 ymol/L)，探针0· 6 yL(10 ymol/L)，BVDV模板 2 μ L，29. 5 μ LRehydration 缓冲液，IL 2 μ L 去离子水和 2. 5 μ L 醋酸镁（280mM)。
[0082] 4.检测步骤：
[0083] 4. 1病毒cDNA的合成
[0084] 利用实施例2中" I. IBVDV基因组cDNA的合成"的方法合成BVDV基因组cDNA，用 于RPA模板扩增。
[0085] 4. 2 RPA 扩增
[0086] 按照实施例2中" I. 2BVDV RPA扩增"的方法进行RPA扩增，38°C恒温水浴锅内共 反应25min〇
[0087] 4. 3侧流层析试纸条进行检测
[0088] 取1 μ L扩增产物，应用实施例2中" 1. 3侧流层析试纸条进行扩增产物检测"的方 法进行检测，若侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅 显示对照带，则结果为阴性。
【主权项】
1. 一种用于通过RPA技术检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针组合，其特征在于，其 正向引物序列如SEQIDNo. 1所示，反向引物序列如SEQIDNo. 2所示，探针序列如SEQID No. 3所示。2. 权利要求1所述的引物和探针组合在制备检测牛病毒性腹泻病毒的检测试剂中的 应用。3. -种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述 的引物和探针组合。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：BVDV阳性对照模板、 RPA扩增试剂、去离子水和侧流层析检测试剂。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲 液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白和醋酸镁溶液。6. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析 试纸条和杂交检测缓冲液。7. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述醋酸镁溶液的浓度为280mM。8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，扩增体系为50yL，向含有冻干酶粉的 0.2mLTwistAmpnfo反应管中加入正向引物、反向引物各2.IyL，探针0.6yL，BVDV阳性 对照模板2yL，11. 2yL去离子水和2. 5yL醋酸镁溶液。9. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述BVDV阳性对照模板的制备方法为： 分别以SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5所示的引物为上、下游引物，以BVDV基因组cDNA为模 板进行PCR扩增，PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载 体，蓝白斑筛选重组质粒，测序，将测序结果进行比对，正确的重组质粒为BVDV阳性对照模 板。10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的反应体系为50yL:10XLA PCRBufferII5uL、2.5mMdNTPMixture8yL、LATaq0.5卩1、模板2卩1^，10卩111〇1/1的 上下游引物各2yL，灭菌超纯水加至50yL; PCR扩增的反应程序为：94°C预变性3min，然后进入94°C30s，55°C30s，72°C40s，共进 行31个循环；72°C延伸10min，最后停止于4°C。
【专利摘要】本发明公开了一种用于通过RPA技术检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明还公开了用于牛病毒性腹泻病毒检测的试剂盒。采用本发明的引物和探针进行检测，仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行该病的诊治。
【IPC分类】C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN104894118
【申请号】CN201510292386
【发明人】何洪彬, 侯佩莉, 王洪梅
【申请人】山东省农业科学院奶牛研究中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月1日
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