检测sf3b1基因第14、15号全外显子的方法和引物的制作方法
检测sf3b1基因第14、15号全外显子的方法和引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测SF3B1基因第14、15号全外显 子突变的引物和方法。
【背景技术】
[0002] 骨髓增生异常综合征（MDS)是一组异质性克隆性疾患，其特征是血细胞减少，髓 系细胞一系或多系发育异常，无效造血，骨髓造血功能衰竭以及演变为急性髓系白血病的 风险增高。MDS患者常伴有染色体核型异常，但目前对与其发病相关的特定基因突变研宄较 少。近年来随着第二代测序技术、SNP探针分析和比较基因组学等新技术的发展，在MDS患 者中鉴别出更多的基因异常可能与其发病机制有关，其中包括涉及信号转导的CBL基因， 调亡通路相关TP53、RAS基因，DNA甲基化调节子编码基因 TET2、DNMT3A、IDm/2等，以及影 响组氨酸功能的一些蛋白编码基因如EZH2、ASXLl和UTX。然而这些基因在其它髓系肿瘤 中突变率往往较MDS高，尚且约20% MDS患者中未检测出现有的基因异常[3]。近来几个研 宄组相继报道MDS患者存在剪切体复合物蛋白编码基因的突变包括SF3B1，SRSF2, ZRSR及 U2AF35等，从而为研宄MDS相关的分子生物学异常开拓出新的方向。
[0003] SF3B1基因即剪接因子3B复合物的第一亚单位，定位于染色体2q33. 1，含有25个 外显子，编码1个由1304个氨基酸组成的蛋白，蛋白质分子量155kDa。mRNA前体的剪接由 剪接体复合物完成，剪接体复合物由5种小核核糖核蛋白（snRNP) (Ul，U2, U4, U5, U6)及其 它蛋白质组分组成。SF3B1基因编码的SF3B1蛋白与U2snRNP形成复合物A进而参与mRNA 前体3'剪接位点的识别。由于U2snRNP位于负责mRNA前体3'剪切位点识别的剪切体复 合物的催化中心，SF3B1基因是剪切体复合物A中唯一的憐酸化位点，因此SF3B1基因突变 引起的异常剪切导致编码蛋白的改变可能与疾病发生密切相关。
[0004] SF3B1基因突变在MDS患者中的预后意义尚有争议，有的研宄小组认为突变型患 者预后良好，与野生组相比，SF3B1突变患者拥有更高的白细胞计数、血小板值、较低的骨髓 内原始细胞同时在总体生存率、无病生存率、无事件生存率等预后指标中，突变患者仍拥有 较高的生存率及较低的向白血病转化的风险，同时认为SF3B1的突变是影响患者预后的独 立因素。
[0005] SF3B1的突变集中在第12-16外显子中，即翻译后的4、5、6结构域内，主要突变类 型为K700E(700位上的赖氨酸被谷氨酸所代替）占55%。国内外文献报道，SF3B1在MDS 伴环形铁粒幼细胞的患者即MDS-RS中突变率很高，在RARS/RCMD-RS(refractory anemia with ringed sideroblasts/refractory cytopenia with multilineagedysplasia and ringed sideroblasts)中为 75. 3 %, RARS-T(refractory anemia withringed 81(^1'〇13138七8 311(11：111'〇130〇71：116111丨3)为66.7%。通过大量临床资料显不3?3131突变阳性 的病人其预后亦相对较好。
[0006] 多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验（PTT)、单链构象多态性（SSCP)、异 源双链分析（HA)、变性梯度凝胶电泳（DGGE)和温度梯度凝胶电泳（TGGE)等均被应用于 SF3B1基因突变的检测，但所有这些方法均有一定的局限性，从而限制了基因突变的检出 率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于SF3B1基因容量 大、突变类型多、突变率高、突变位点散在分布，故而阻止了对SF3B1基因突变的深入研宄， 荧光定量PCR法并不适用。
[0007] 本发明采用Sanger测序法检测SF3B1基因第14、15号全外显子序列的突变，并且 设计的引物可以扩展整个第14、15号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的 了解SF3B1基因第14、15号全外显子的基因突变情况，并不受SF3B1基因的基因突变多样 化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。
【发明内容】
[0008] 本发明提供检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，采用Sanger测序法，可 用于快速检测MDS患者体内检测SF3B1基因第14、15号全外显子突变的情况。
[0009] 本发明的目的在于提供检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，包括：扩增覆 盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子突变的2对正、反向引物；其碱基序列为：
[0010] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0011] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0012] SF3B1 E15-F :5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0013] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0014] 进一步地，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列为
[0015] SF3B1 S-E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0016] SF3B1 S-E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3，
[0017] SF3BI S-El5-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0018] SF3B1 S-E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0019] 进一步地，所述2对正、反向引物的使用浓度比为：
[0020] SF3B1 E14-F ：SF3B1 E14-R = 1 ：1 ；
[0021] SF3B1 E15-F ：SF3B1 E15-R = 1 ：1〇
[0022] 进一步地，所述2对测序引物的使用浓度比为：
[0023] SF3B1 S-E14-F :SF3B1 S-E14-R = 1 :1 ;
[0024] SF3B1 S-El5-F :SF3B1 S-El5-R = 1 :1。
[0025] 本发明的目的还在于提供一种检测SF3B1基因第31-34号全外显子的方法，其包 括如下步骤：
[0026] (1)提取样品 DNA ;
[0027] (2)利用 2 对扩增引物 SF3B1 E14-F与 SF3B1 E14-R，SF3B1 E15-F与 SF3B1 E15-R 对（1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测SF3B1基因第31-34号全外显子突变的得扩 增产物；
[0028] (3)利用 2 对测序引物 SF3B1 S-E14-F 与 SF3B1 S-E14-R，SF3B1 S-E15-F 与 SF3B1 S-E15-R对（2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
[0029] (4)将（3)中的基因序列与野生型SF3B1基因序列进行比较，确定突变位点是否存 在；其中所述引物序列为：
[0030] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0031] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0032] SF3B1 E15-F :5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0033] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0034] SF3B1 S-E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0035] SF3B1 S-E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0036] SF3BI S-El5-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0037] SF3B1 S-E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0038] 本发明的目的还在于提供一种检测SF3B1基因第14、15号全外显子的试剂盒， 所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳 性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括2对扩增引物SF3B1 E14-F 与 SF3B1 E14-R，SF3B1 E15-F 与 SF3B1 E15-R，测序体系包括 2 对测序引物 SF3B1 S-E14-F 与 SF3B1 S-E14-R，SF3B1 S-E15-F 与 SF3B1 S-E15-R，包括：
[0039] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0040] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0041] SF3B1 E15-F ：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0042] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0043] SF3B1 S-E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0044] SF3B1 S-E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3，
[0045] SF3BI S-E15-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0046] SF3B1 S-E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0047] 进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2 X PCR Buffer ;dNTPs ;KOD FX DNA Polymerase0
[0048] 进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和 Bigdye Terminator V3. 1〇
[0049] 进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0050] 本发明设计了扩增覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子的2对正、反向引物， 以及对所获得的扩增产物进行正反向测序的2对测序引物。对送检样本进行PCR扩增，采 用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地 检测SF3B1基因第14、15号全外显子序列的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火 温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。
[0051] 有益效果：利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩展整个第14、15号全外 显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解SF3B1基因第14、15号全外显子的基因 突变情况，并不受SF3B1基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有 突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多 态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
【附图说明】
[0052] 图1为SF3B1基因在染色体上定位图。
[0053] 图 2 为 SF3B1 E14-F/R 的电泳图，M 为 Marker DL 2000,1-24 为送检的 MDS 患者 血液样本1-24号，如图2所示，引物SF3B1 E14-F/R扩增有效，且条带单一。
[0054] 图 3 为 SF3B1 E15-F/R 的电泳图，M 为 Marker DL 2000,1-24 为送检的 MDS 患者 血液样本1-24号，如图2所示，引物SF3B1 E15-F/R扩增有效，且条带单一。
[0055] 图4样本114号外显子部分测序结果。
[0056] 图5样本214号外显子部分测序结果。
[0057] 图6样本314号外显子部分测序结果。
[0058] 图7样本115号外显子部分测序结果。
[0059] 图8样本215号外显子部分测序结果。
[0060] 图9样本315号外显子部分测序结果。
[0061] 其中，方框注部分为SF3B1基因第700个氨基酸编码的位置，图中测序结果显示未 发生突变，翻译为赖氨酸。
【具体实施方式】
[0062] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明 的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编 的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0063] 实施例1
[0064] 检测检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测SF3B1基因 第14、15号全外显子的2对正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：
[0065] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0066] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0067] SF3B1 E15-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0068] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0069] SF3B1 S-E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0070] SF3B1 S-E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0071] SF3BI S-El5-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0072] SF3B1 S-E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0073] 在检测中，先利用上述2对正、反向引物对覆盖检测SF3BI基因第14、15号全外显 子的DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述2对测序引物对扩增产物进行测序， 获得扩增产物的基因序列。
[0074] 在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧，即扩增区 域包括了该外显子的全部序列。虽然SF3B1基因在MDS患者中有较为主要的突变位点 K700E(在15号外显子上），但不明确的突变位点也很多，突变类型不定。因此本发明所述 引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都 不会出现漏检的情况。
[0075] 检测SF3B1基因第14、15号全外显子的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒（例如 使用天根生物的提取试剂盒）；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照 品、阴性对照品和空白对照品，其中，
[0076] 检测体系 PCR 反应液包括：2XPCR Buffer ;2mM dNTPs ;KOD FX DNA Polymerase (IU/μ I);检测目的基因用的2对上、下游引物SF3B1 EH-F(IOym)与SF3B1 E14-R(10ym)，SF3Bl E15-F(10ym)与 SF3B1 E15-R(10ym)。
[0077] 测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、HID I (高度 去离子甲酰胺）、测序引物：SF3B1 S-E14-F(3.2ym)与 SF3B1 S-E14-R(3.2ym)，SF3Bl S-E15-F(3.2 μm)与 SF3B S-E15-R(3.2 μm)，以及Bigdye Terminate) r V3.1(购买自美国 Applied Biosystems公司），其中测序纯化液包括奸碱性磷酸酶（SAP) 0. 6U和核酸外切酶 I (EXONI) I. 2U。
[0078] 检测体系PCR反应液配制如下：
[0079]
[0081] 其中，SF3B1 E14-F 与 SF3B1 E14-R，SF3B1 E15-F 与 SF3B1 E15-R 的碱基序列为：
[0082] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0083] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0084] SF3B1 E15-F :5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0085] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0086] 阳性对照品：含有SF3B1序列的溶液。
[0087] 阴性对照品：无 SF3B1序列的溶液。
[0088] 空白对照品：1 μ 1生理盐水或不加任何物质。
[0089] 实施例2
[0090] 血液DNA抽提试剂盒（天根生物）的操作流程：
[0091] (1)抽提血液中的基因组DNA:
[0092] 1)抽取500uL血液加入1000 uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再 颠倒混勾几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至 彻底混匀。
[0093] 2)加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混匀。
[0094] 3)加入200 μ 1缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短 离心以去除管盖内壁的水珠。
[0095] 4)加入200 μ 1无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0096] 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0097] 6)向吸附柱CB3中加入500 μ 1缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0098] 7)向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0099] 8)向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液PW，12, OOOrpm (13, 400 Xg)离心30秒，倒 掉废液。
[0100] 9)将吸附柱CB3放回收集管中，12, OOOrpm (13, 400 Xg)离心2分钟，倒掉废液。将 吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0101] 10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 100 μ 1洗脱缓冲液ΤΕ，室温放置2-5分钟，12, OOOrpm (13, 400 X g)离心2分钟，将溶液收集 到离心管中。
[0102] (2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X μ 1，每人份19 μ 1分 装：
[0103] X = 19 μ 1反应液X (η份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）
[0104] η为检测标本数。
[0105] (3)加样：加入2个检测体系PCR反应液中各1 μ I DNA ;阳性对照和阴性对照直接 加1 μ 1阳性对照品和阴性对照品；空白对照加1 μ 1生理盐水或不加任何物质。
[0106] (4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti (美国Applied Biosystems公司）等。反应条件如下：
[0107]
[0108] (5) sanger 测序：
[0109] 取9 μ I PCR产物与2 μ 1纯化体系。按照以下程序进行纯化：
[0110]
[0111] 将ΙμL纯化产物分别与测序引物：SF3B1 S-E14_F(3. 2μπι)与 SF3B1S-E14-R(3. 2 μπι)，SF3B1 S-E15-F(3. 2 μπι)与 SF3B1 S-E15-R(3. 2 μπι)按照如下体 系进行混合：
[0112]
[0117] 沉淀环节：
[0118] 向完成测序反应的产物中加入2μ1 125mmol的EDTA，静置5min ;加入15ml无 水乙醇，漩祸混勾；3700rpm离心30min ;倒置离心15sec，加入50ml70%乙醇，漩祸混勾； 3700rpm离心15min ;倒置离心15sec，置于95°C金属浴上；加入10 μ I HIDI后进行变性试 验。
[0119] 变性程序结束后，上测序仪（ABI3730)测序。
[0120] (6)结果判断：将测序结果与野生型参考序列（GeneBank No. :NG_009018. 1)进行 比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
[0121] 实施例3
[0122] 取临床骨髓增生异常综合征患者样本24份，检测该24份样本是否存在SF3B1基 因突变，样本编号1-24。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入 检测体系PCR反应液中ΙμL。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时 间为160分钟。
[0123] 电泳结果如图2、3所示，表明本发明所述引物SF3B1 E14-F/R、SF3B1 E15-F/R对 血液样本能有效扩增，且条带单一。
[0124] 样品1的第14号全外显子序列的部分正向测序结果如图4所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0125] 样品2的第14号全外显子序列的部分正向测序结果如图5所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0126] 样品3的第14号全外显子序列的部分正向测序结果如图6所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0127] 样品1的第15号全外显子序列的部分正向测序结果如图7所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0128] 样品2的第15号全外显子序列的部分正向测序结果如图8所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0129] 样品3的第15号全外显子序列的部分正向测序结果如图9所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0130] 从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展 出SF3B1基因第14、15号全外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的 扩展出SF3B1基因第14、15号全外显子，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表 明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出SF3B1基因突变。
【主权项】
1. 检测检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测 SF3B1基因第14、15号全外显子的正、反向引物。其碱基序列为： SF3B1E14-F:5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG3' SF3B1E14-R:5'GGAGGCTGAGCAGGAGGAT3' SF3B1E15-F:5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC3' SF3B1E15-R：5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT3' 〇2. 如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列 为： SF3B1S-E14-F:5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG3' SF3B1S-E14-R:5,GGAGGCTGAGCAGGAGGAT3， SF3BIS-E15-F:5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC3' SF3B1S-E15-R:5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT3'。3. 如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对正、反向引物的使用浓度 比为：SF3B1E14-F:SF3B1E14-R= 1 :1 ; SF3B1E15-F：SF3B1E15-R= 1 ：1〇4. 如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对测序引物的使用浓度比 为：SF3B1S-E14-F:SF3B1S-E14-R= 1 :1 ; SF3B1S-E15-F:SF3B1S-E15-R= 1 :1。5. -种检测检测SF3B1基因第14、15号全外显子序列的方法，其包括如下步骤： (1) 提取样品DNA; (2) 利用 2 对扩增引物SF3B1E14-F与SF3B1E14-R，SF3B1E15-F与SF3B1E15-R对（1) 中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子的扩增产物； (3) 利用 2 对测序引物SF3B1S-E14-F与SF3B1S-E14-R，SF3B1S-E15-F与SF3B1S-E15-R 对（2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列； (4) 将（3)中的基因序列与野生型SF3B1基因序列进行比较，确定突变位点是否存在； 其中所述引物序列为： SF3B1E14-F:5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG3' SF3B1E14-R:5'GGAGGCTGAGCAGGAGGAT3' SF3BIE15-F:5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC3' SF3B1E15-R:5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT3' SF3B1S-E14-F:5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG3' SF3B1S-E14-R:5,GGAGGCTGAGCAGGAGGAT3， SF3BIS-E15-F:5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC3' SF3BIS-E15-R:5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT3'。
【专利摘要】本发明公开了检测SF3B1基因第14、15号全外显子的方法和引物，所述引物包括扩增覆盖SF3B1基因第14、15号全外显子序列的2对正、反向引物和2对测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述2对测序引物可用于快速检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者的SF3B1基因第14、15号全外显子序列的突变情况，其中包含了位于15号外显子上的主要突变位点K700E。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894119
【申请号】CN201510304908
【发明人】黎洪奋, 林筱剑, 王淑一
【申请人】长沙艾迪康医学检验所有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月4日
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测SF3B1基因第14、15号全外显 子突变的引物和方法。
【背景技术】
[0002] 骨髓增生异常综合征（MDS)是一组异质性克隆性疾患，其特征是血细胞减少，髓 系细胞一系或多系发育异常，无效造血，骨髓造血功能衰竭以及演变为急性髓系白血病的 风险增高。MDS患者常伴有染色体核型异常，但目前对与其发病相关的特定基因突变研宄较 少。近年来随着第二代测序技术、SNP探针分析和比较基因组学等新技术的发展，在MDS患 者中鉴别出更多的基因异常可能与其发病机制有关，其中包括涉及信号转导的CBL基因， 调亡通路相关TP53、RAS基因，DNA甲基化调节子编码基因 TET2、DNMT3A、IDm/2等，以及影 响组氨酸功能的一些蛋白编码基因如EZH2、ASXLl和UTX。然而这些基因在其它髓系肿瘤 中突变率往往较MDS高，尚且约20% MDS患者中未检测出现有的基因异常[3]。近来几个研 宄组相继报道MDS患者存在剪切体复合物蛋白编码基因的突变包括SF3B1，SRSF2, ZRSR及 U2AF35等，从而为研宄MDS相关的分子生物学异常开拓出新的方向。
[0003] SF3B1基因即剪接因子3B复合物的第一亚单位，定位于染色体2q33. 1，含有25个 外显子，编码1个由1304个氨基酸组成的蛋白，蛋白质分子量155kDa。mRNA前体的剪接由 剪接体复合物完成，剪接体复合物由5种小核核糖核蛋白（snRNP) (Ul，U2, U4, U5, U6)及其 它蛋白质组分组成。SF3B1基因编码的SF3B1蛋白与U2snRNP形成复合物A进而参与mRNA 前体3'剪接位点的识别。由于U2snRNP位于负责mRNA前体3'剪切位点识别的剪切体复 合物的催化中心，SF3B1基因是剪切体复合物A中唯一的憐酸化位点，因此SF3B1基因突变 引起的异常剪切导致编码蛋白的改变可能与疾病发生密切相关。
[0004] SF3B1基因突变在MDS患者中的预后意义尚有争议，有的研宄小组认为突变型患 者预后良好，与野生组相比，SF3B1突变患者拥有更高的白细胞计数、血小板值、较低的骨髓 内原始细胞同时在总体生存率、无病生存率、无事件生存率等预后指标中，突变患者仍拥有 较高的生存率及较低的向白血病转化的风险，同时认为SF3B1的突变是影响患者预后的独 立因素。
[0005] SF3B1的突变集中在第12-16外显子中，即翻译后的4、5、6结构域内，主要突变类 型为K700E(700位上的赖氨酸被谷氨酸所代替）占55%。国内外文献报道，SF3B1在MDS 伴环形铁粒幼细胞的患者即MDS-RS中突变率很高，在RARS/RCMD-RS(refractory anemia with ringed sideroblasts/refractory cytopenia with multilineagedysplasia and ringed sideroblasts)中为 75. 3 %, RARS-T(refractory anemia withringed 81(^1'〇13138七8 311(11：111'〇130〇71：116111丨3)为66.7%。通过大量临床资料显不3?3131突变阳性 的病人其预后亦相对较好。
[0006] 多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验（PTT)、单链构象多态性（SSCP)、异 源双链分析（HA)、变性梯度凝胶电泳（DGGE)和温度梯度凝胶电泳（TGGE)等均被应用于 SF3B1基因突变的检测，但所有这些方法均有一定的局限性，从而限制了基因突变的检出 率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于SF3B1基因容量 大、突变类型多、突变率高、突变位点散在分布，故而阻止了对SF3B1基因突变的深入研宄， 荧光定量PCR法并不适用。
[0007] 本发明采用Sanger测序法检测SF3B1基因第14、15号全外显子序列的突变，并且 设计的引物可以扩展整个第14、15号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的 了解SF3B1基因第14、15号全外显子的基因突变情况，并不受SF3B1基因的基因突变多样 化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。
【发明内容】
[0008] 本发明提供检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，采用Sanger测序法，可 用于快速检测MDS患者体内检测SF3B1基因第14、15号全外显子突变的情况。
[0009] 本发明的目的在于提供检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，包括：扩增覆 盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子突变的2对正、反向引物；其碱基序列为：
[0010] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0011] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0012] SF3B1 E15-F :5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0013] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0014] 进一步地，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列为
[0015] SF3B1 S-E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0016] SF3B1 S-E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3，
[0017] SF3BI S-El5-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0018] SF3B1 S-E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0019] 进一步地，所述2对正、反向引物的使用浓度比为：
[0020] SF3B1 E14-F ：SF3B1 E14-R = 1 ：1 ；
[0021] SF3B1 E15-F ：SF3B1 E15-R = 1 ：1〇
[0022] 进一步地，所述2对测序引物的使用浓度比为：
[0023] SF3B1 S-E14-F :SF3B1 S-E14-R = 1 :1 ;
[0024] SF3B1 S-El5-F :SF3B1 S-El5-R = 1 :1。
[0025] 本发明的目的还在于提供一种检测SF3B1基因第31-34号全外显子的方法，其包 括如下步骤：
[0026] (1)提取样品 DNA ;
[0027] (2)利用 2 对扩增引物 SF3B1 E14-F与 SF3B1 E14-R，SF3B1 E15-F与 SF3B1 E15-R 对（1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测SF3B1基因第31-34号全外显子突变的得扩 增产物；
[0028] (3)利用 2 对测序引物 SF3B1 S-E14-F 与 SF3B1 S-E14-R，SF3B1 S-E15-F 与 SF3B1 S-E15-R对（2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
[0029] (4)将（3)中的基因序列与野生型SF3B1基因序列进行比较，确定突变位点是否存 在；其中所述引物序列为：
[0030] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0031] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0032] SF3B1 E15-F :5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0033] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0034] SF3B1 S-E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0035] SF3B1 S-E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0036] SF3BI S-El5-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0037] SF3B1 S-E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0038] 本发明的目的还在于提供一种检测SF3B1基因第14、15号全外显子的试剂盒， 所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳 性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括2对扩增引物SF3B1 E14-F 与 SF3B1 E14-R，SF3B1 E15-F 与 SF3B1 E15-R，测序体系包括 2 对测序引物 SF3B1 S-E14-F 与 SF3B1 S-E14-R，SF3B1 S-E15-F 与 SF3B1 S-E15-R，包括：
[0039] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0040] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0041] SF3B1 E15-F ：5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0042] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0043] SF3B1 S-E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0044] SF3B1 S-E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3，
[0045] SF3BI S-E15-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0046] SF3B1 S-E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0047] 进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2 X PCR Buffer ;dNTPs ;KOD FX DNA Polymerase0
[0048] 进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和 Bigdye Terminator V3. 1〇
[0049] 进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0050] 本发明设计了扩增覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子的2对正、反向引物， 以及对所获得的扩增产物进行正反向测序的2对测序引物。对送检样本进行PCR扩增，采 用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地 检测SF3B1基因第14、15号全外显子序列的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火 温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。
[0051] 有益效果：利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩展整个第14、15号全外 显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解SF3B1基因第14、15号全外显子的基因 突变情况，并不受SF3B1基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有 突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多 态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
【附图说明】
[0052] 图1为SF3B1基因在染色体上定位图。
[0053] 图 2 为 SF3B1 E14-F/R 的电泳图，M 为 Marker DL 2000,1-24 为送检的 MDS 患者 血液样本1-24号，如图2所示，引物SF3B1 E14-F/R扩增有效，且条带单一。
[0054] 图 3 为 SF3B1 E15-F/R 的电泳图，M 为 Marker DL 2000,1-24 为送检的 MDS 患者 血液样本1-24号，如图2所示，引物SF3B1 E15-F/R扩增有效，且条带单一。
[0055] 图4样本114号外显子部分测序结果。
[0056] 图5样本214号外显子部分测序结果。
[0057] 图6样本314号外显子部分测序结果。
[0058] 图7样本115号外显子部分测序结果。
[0059] 图8样本215号外显子部分测序结果。
[0060] 图9样本315号外显子部分测序结果。
[0061] 其中，方框注部分为SF3B1基因第700个氨基酸编码的位置，图中测序结果显示未 发生突变，翻译为赖氨酸。
【具体实施方式】
[0062] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明 的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编 的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0063] 实施例1
[0064] 检测检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测SF3B1基因 第14、15号全外显子的2对正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：
[0065] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0066] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0067] SF3B1 E15-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0068] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0069] SF3B1 S-E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0070] SF3B1 S-E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0071] SF3BI S-El5-F : 5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0072] SF3B1 S-E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0073] 在检测中，先利用上述2对正、反向引物对覆盖检测SF3BI基因第14、15号全外显 子的DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述2对测序引物对扩增产物进行测序， 获得扩增产物的基因序列。
[0074] 在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧，即扩增区 域包括了该外显子的全部序列。虽然SF3B1基因在MDS患者中有较为主要的突变位点 K700E(在15号外显子上），但不明确的突变位点也很多，突变类型不定。因此本发明所述 引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都 不会出现漏检的情况。
[0075] 检测SF3B1基因第14、15号全外显子的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒（例如 使用天根生物的提取试剂盒）；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照 品、阴性对照品和空白对照品，其中，
[0076] 检测体系 PCR 反应液包括：2XPCR Buffer ;2mM dNTPs ;KOD FX DNA Polymerase (IU/μ I);检测目的基因用的2对上、下游引物SF3B1 EH-F(IOym)与SF3B1 E14-R(10ym)，SF3Bl E15-F(10ym)与 SF3B1 E15-R(10ym)。
[0077] 测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、HID I (高度 去离子甲酰胺）、测序引物：SF3B1 S-E14-F(3.2ym)与 SF3B1 S-E14-R(3.2ym)，SF3Bl S-E15-F(3.2 μm)与 SF3B S-E15-R(3.2 μm)，以及Bigdye Terminate) r V3.1(购买自美国 Applied Biosystems公司），其中测序纯化液包括奸碱性磷酸酶（SAP) 0. 6U和核酸外切酶 I (EXONI) I. 2U。
[0078] 检测体系PCR反应液配制如下：
[0079]
[0081] 其中，SF3B1 E14-F 与 SF3B1 E14-R，SF3B1 E15-F 与 SF3B1 E15-R 的碱基序列为：
[0082] SF3B1 E14-F :5' TATGCTAGAGTGGAAGGCCG 3'
[0083] SF3B1 E14-R:5' GGAGGCTGAGCAGGAGGAT 3'
[0084] SF3B1 E15-F :5' TCTGCTGACAGGCTATGGTTC 3'
[0085] SF3B1 E15-R:5' AGAAAGCAGCCAAACCCTATT 3'
[0086] 阳性对照品：含有SF3B1序列的溶液。
[0087] 阴性对照品：无 SF3B1序列的溶液。
[0088] 空白对照品：1 μ 1生理盐水或不加任何物质。
[0089] 实施例2
[0090] 血液DNA抽提试剂盒（天根生物）的操作流程：
[0091] (1)抽提血液中的基因组DNA:
[0092] 1)抽取500uL血液加入1000 uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再 颠倒混勾几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至 彻底混匀。
[0093] 2)加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混匀。
[0094] 3)加入200 μ 1缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短 离心以去除管盖内壁的水珠。
[0095] 4)加入200 μ 1无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0096] 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0097] 6)向吸附柱CB3中加入500 μ 1缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0098] 7)向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0099] 8)向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液PW，12, OOOrpm (13, 400 Xg)离心30秒，倒 掉废液。
[0100] 9)将吸附柱CB3放回收集管中，12, OOOrpm (13, 400 Xg)离心2分钟，倒掉废液。将 吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0101] 10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 100 μ 1洗脱缓冲液ΤΕ，室温放置2-5分钟，12, OOOrpm (13, 400 X g)离心2分钟，将溶液收集 到离心管中。
[0102] (2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X μ 1，每人份19 μ 1分 装：
[0103] X = 19 μ 1反应液X (η份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）
[0104] η为检测标本数。
[0105] (3)加样：加入2个检测体系PCR反应液中各1 μ I DNA ;阳性对照和阴性对照直接 加1 μ 1阳性对照品和阴性对照品；空白对照加1 μ 1生理盐水或不加任何物质。
[0106] (4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti (美国Applied Biosystems公司）等。反应条件如下：
[0107]
[0108] (5) sanger 测序：
[0109] 取9 μ I PCR产物与2 μ 1纯化体系。按照以下程序进行纯化：
[0110]
[0111] 将ΙμL纯化产物分别与测序引物：SF3B1 S-E14_F(3. 2μπι)与 SF3B1S-E14-R(3. 2 μπι)，SF3B1 S-E15-F(3. 2 μπι)与 SF3B1 S-E15-R(3. 2 μπι)按照如下体 系进行混合：
[0112]
[0117] 沉淀环节：
[0118] 向完成测序反应的产物中加入2μ1 125mmol的EDTA，静置5min ;加入15ml无 水乙醇，漩祸混勾；3700rpm离心30min ;倒置离心15sec，加入50ml70%乙醇，漩祸混勾； 3700rpm离心15min ;倒置离心15sec，置于95°C金属浴上；加入10 μ I HIDI后进行变性试 验。
[0119] 变性程序结束后，上测序仪（ABI3730)测序。
[0120] (6)结果判断：将测序结果与野生型参考序列（GeneBank No. :NG_009018. 1)进行 比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
[0121] 实施例3
[0122] 取临床骨髓增生异常综合征患者样本24份，检测该24份样本是否存在SF3B1基 因突变，样本编号1-24。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入 检测体系PCR反应液中ΙμL。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时 间为160分钟。
[0123] 电泳结果如图2、3所示，表明本发明所述引物SF3B1 E14-F/R、SF3B1 E15-F/R对 血液样本能有效扩增，且条带单一。
[0124] 样品1的第14号全外显子序列的部分正向测序结果如图4所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0125] 样品2的第14号全外显子序列的部分正向测序结果如图5所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0126] 样品3的第14号全外显子序列的部分正向测序结果如图6所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0127] 样品1的第15号全外显子序列的部分正向测序结果如图7所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0128] 样品2的第15号全外显子序列的部分正向测序结果如图8所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0129] 样品3的第15号全外显子序列的部分正向测序结果如图9所示，为野生型，未检 测出SF3B1突变。
[0130] 从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展 出SF3B1基因第14、15号全外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的 扩展出SF3B1基因第14、15号全外显子，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表 明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出SF3B1基因突变。
【主权项】
1. 检测检测SF3B1基因第14、15号全外显子的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测 SF3B1基因第14、15号全外显子的正、反向引物。其碱基序列为： SF3B1E14-F:5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG3' SF3B1E14-R:5'GGAGGCTGAGCAGGAGGAT3' SF3B1E15-F:5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC3' SF3B1E15-R：5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT3' 〇2. 如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括2对测序引物，其碱基序列 为： SF3B1S-E14-F:5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG3' SF3B1S-E14-R:5,GGAGGCTGAGCAGGAGGAT3， SF3BIS-E15-F:5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC3' SF3B1S-E15-R:5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT3'。3. 如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对正、反向引物的使用浓度 比为：SF3B1E14-F:SF3B1E14-R= 1 :1 ; SF3B1E15-F：SF3B1E15-R= 1 ：1〇4. 如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述2对测序引物的使用浓度比 为：SF3B1S-E14-F:SF3B1S-E14-R= 1 :1 ; SF3B1S-E15-F:SF3B1S-E15-R= 1 :1。5. -种检测检测SF3B1基因第14、15号全外显子序列的方法，其包括如下步骤： (1) 提取样品DNA; (2) 利用 2 对扩增引物SF3B1E14-F与SF3B1E14-R，SF3B1E15-F与SF3B1E15-R对（1) 中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测SF3B1基因第14、15号全外显子的扩增产物； (3) 利用 2 对测序引物SF3B1S-E14-F与SF3B1S-E14-R，SF3B1S-E15-F与SF3B1S-E15-R 对（2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列； (4) 将（3)中的基因序列与野生型SF3B1基因序列进行比较，确定突变位点是否存在； 其中所述引物序列为： SF3B1E14-F:5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG3' SF3B1E14-R:5'GGAGGCTGAGCAGGAGGAT3' SF3BIE15-F:5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC3' SF3B1E15-R:5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT3' SF3B1S-E14-F:5'TATGCTAGAGTGGAAGGCCG3' SF3B1S-E14-R:5,GGAGGCTGAGCAGGAGGAT3， SF3BIS-E15-F:5'TCTGCTGACAGGCTATGGTTC3' SF3BIS-E15-R:5'AGAAAGCAGCCAAACCCTATT3'。
【专利摘要】本发明公开了检测SF3B1基因第14、15号全外显子的方法和引物，所述引物包括扩增覆盖SF3B1基因第14、15号全外显子序列的2对正、反向引物和2对测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述2对测序引物可用于快速检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者的SF3B1基因第14、15号全外显子序列的突变情况，其中包含了位于15号外显子上的主要突变位点K700E。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894119
【申请号】CN201510304908
【发明人】黎洪奋, 林筱剑, 王淑一
【申请人】长沙艾迪康医学检验所有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月4日
最新回复(0)