一种用于鉴定前胡的引物对及其应用
一种用于鉴定前胡的引物对及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种用 于鉴定前胡的引物对及其应用。
【背景技术】
[0002] 前胡为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根。由于历 史上各地区用药习惯不同，前胡的植物来源比较复杂，混伪品较多，目前市场上主要的混伪 品为滨海前胡、碎叶山芹、紫花前胡、蕨叶藁本、异叶茴芹、石防风、短片藁本等。
[0003] 前胡药材与同科或同属混伪品的形态特征比较相近，外形鉴别比较困难，采用传 统的鉴定方法有一定的局限。因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保前胡药材 鉴定的准确性。熊永兴等采用的DNA条形码技术对前胡及其混伪品进行鉴定（熊永兴、邬 兰，刘义梅，陈科力，前胡及其混伪品的DNA条形码鉴定研宄，中药材，2013, 36 (11) :1762)， 但该方法耗时较长，且使用大型仪器，不利于实现快速、现场检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定前胡的引物对。
[0005] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定前胡的引物对为由序列表中序列1和序列2 所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
[0006] 所述引物对中，两条单链DNA分子既可以分别单独包装，也可以按照摩尔比为1:1 的比例混合后包装在一起。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定前胡的试剂盒。
[0008] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定前胡的试剂盒，具体可含有所述引物对、 dNTP和DNA聚合酶。
[0009] 制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。
[0010] 制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别 单独包装的步骤。
[0011] 制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
[0012] 制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链 DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内。
[0013] 所述引物对或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定前胡中的应用也属于本发明的保护 范围。
[0014] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测样品中是否含有前胡的方法。
[0015] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品中是否 含有前胡的方法，具体可包括如下步骤：
[0016] (a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增；
[0017] (b)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品中是否含 有前胡：若PCR产物中含有400-500bp (如485bp)的DNA片段，则所述待测样品中含有或候 选含有前胡；若PCR产物中不含有400-500bp (如485bp)的DNA片段，则所述待测样品中不 含有或候选不含有前胡。
[0018] 在所述方法中，所述前胡为中药材。当然所述方法也可以用于检测前胡的基原植 物--白花前胡（Peucedanum praeruptorum)。相应的，所述待测样品既可为单一或混合的 中药材成品，也可以为植株或取自所述植株的组织或器官。
[0019] 本发明的第四个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测样品为前胡还是紫花前胡的方法。
[0020] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品为前胡， 还是紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中 的任一种的方法，具体可包括如下步骤：
[0021] (a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增；
[0022] (b)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品为前胡， 还是紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中 的任一种：若PCR产物中含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为前胡；若 PCR产物中不含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为紫花前胡、滨海前胡、 华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种；
[0023] 所述待测样品为前胡、紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山 芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种（既可为中药材也可为基原植物）。
[0024] 在上述两方法的步骤（a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为55°C。
[0025] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应条件如下：95°C 5min ; 95°〇3〇8,55°〇3〇8,72°〇3〇8,25个循环；72°〇1〇11^11。
[0026] 在上述两方法的步骤（a)中，在进行所述PCR扩增的反应体系中，所述引物对中每 条单链DNA分子的终浓度均为400nM。
[0027] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应体系如下：0. 5yL模板 0嫩，1.04 1^序列1所示的引物（10?111〇1)，1.(^1^序列2所示的引物（10?111〇1)，2.54 1^ IOXbuffer 缓冲液，I. 5yL 浓度为 25mM 的 MgCljK溶液，0. 5yL 浓度为 IOmM 的 dNTPs， 0· 5 μ L Taq DNA聚合酶（5U/ μ L)，无菌双蒸水补足至25 μ L。
[0028] 在上述两方法中，所述400-500bp (如485bp)的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳图谱 上位于DNA分子量标准400和500bp之间。
[0029] 在实际应用中，判断所述PCR产物中是否含有400-500bp (如485bp)的DNA片段， 可通过将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示含有400-500bp (如 485bp)目的条带，则所述PCR产物中含有400-500bp (如485bp)的DNA片段；反之，则不含 有400-500bp (如485bp)的DNA片段。当然也通过测序的方法判定所述PCR产物中是否含 有 400-500bp (如 485bp)的 DNA 片段。
[0030] 在本发明中，所述400-500bp (如485bp)的DNA片段为485bp的DNA片段，具体为 序列3所示的DNA片段。
[0031] 实验证明，采用本发明所提供的引物，通过快速PCR方法实现了前胡与紫花前胡 等混伪品的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
【附图说明】
[0032] 图1为前胡及混淆品的系统发育树。其中，谱系分支节点上方为BI树的后验概率 PP和MP树的自举支持度BS，在斜线的左边为PP值，斜线的右边为BS值。
[0033] 图2为通用引物扩增凝胶电泳图。M :DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为 600、500、400、300、200 和10(^?);1:前胡；2:紫花前胡。
[0034] 图3为特异性PCR引物对QH-CP19 (上下游引物分别为QH-CP19S和QH-CP19a)扩 增凝胶电泳图。M:DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为600、500、400、300、200和 IOObp) ;1到4 :用特异性PCR引物对QH-CP19扩增4个前胡（白花前胡）样本的结果；5到 8 :用特异性PCR引物对QH-CP19扩增4个紫花前胡样本的结果。
[0035] 图4为特异性PCR引物对QH-CP19 (上下游引物分别为QH-CP19S和QH-CP19a)扩 增凝胶电泳图。M:DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为600、500、400、300、200和 IOObp) ;1 到 7 :前胡 DNA 模板浓度依次为 42ng/ μ l、21ng/ μ l、llng/ μ l、5ng/ μ 1、2· 5ng/ μ 1、L 25ng/ μ I 和 0· 625ng/ μ I ;8 到 14 :紫花前胡 DNA 模板浓度依次为 42ng/ μ l、21ng/ μ l、llng/ μ l、5ng/ μ 1、2· 5ng/ μ 1、L 25ng/ μ 1 和 0· 625ng/ μ I。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 实施例1、用于鉴定前胡的试剂盒的制备及使用方法
[0039] -、用于鉴定前胡的引物对的设计与合成
[0040] 从GenBank查找前胡及混淆品的ITS序列，详见下表1。
[0041] 表1前胡及混淆品的ITS序列
[0042]
[0043]
[0044] 分别用贝叶斯法（Bayesian inference, BI)和简约法（maximum parsimony, MP) 进行系统发育分析，构建BI和MP两种系统树。其中BI树用MrBayes version 3. I. 2软件 构建，MP 树用 PAUP*version 4. Obeta 10 软件构建。构建 BI 树时，用 MrModeltest version 2. 3软件根据AIC(Akaike Information Criterion)检验标准选择数据的最适模型，所选 最适模型是（GTR+I+G)。马尔科夫链的蒙特卡洛方法（Markov Chains Monte Carlo, MCMC) 设置为四条链并运行500000代。为了确定其收敛情况，MCMC分别运行两次。每100代抽 取一个样本，共形成10002个样本。经过分析得知，整个运行在20000代后达到平稳，这样， 总共剩余的样本数为9602,用剩余样本重建系统树并估计其后验概率值。构建MP树时，设 置自举重复次数bootstrap nr印s为1000次，使用启发式搜索分析自举重复数据集，启发 式搜索设置为由随机逐步添加法产生起始树，重复10次，采用TBR分支交换。通过BI法 和MP法构建的系统发育树表明，2种方法构建的系统树完全一致（图1)。图1中各谱系分 支的节点处标有BI树的后验概率（posterior probability, PP)值和MP树的自举支持度 (Bootstrap, BS)。结果表明，前胡所有序列的单倍型形成单系（PP = L 00, BS = 99)。
[0045] 在确定前胡为单系群的前提下，用软件Clustal X 1. 81对表1中所有ITS序列进 行对位排序和比较，找到差异片段，设计前胡检测特异性PCR引物，如下：
[0046] QH-CP19S :5' -TGGCCACTCCCGGaTT-3'（序列 1);
[0047] QH -CP19a :5' -GCCTAAGGGTCCTGAATCTC-3'（序列 2)。
[0048] 理论PCR产物长度为485bp (序列3)
[0049] 二、用于鉴定前胡的试剂盒的组装
[0050] 将步骤一设计合成的引物QH-CP19S和QH-CP19a分别单独包装后，与分别单独包 装的dNTP、DNA聚合酶、IOXbuffer缓冲液等包装于同一个试剂盒内，即得到本发明用于鉴 定前胡的试剂盒。
[0051] 三、鉴定待测样品中是否含有前胡的方法
[0052] 采用步骤二的试剂盒按照包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有前胡：
[0053] I、PCR 扩增
[0054] 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用步骤一设计合成的引物QH-CP19S和 QH-CP19a (序列1和序列2)按照如下进行PCR扩增：
[0055] PCR反应总体积25 μ L，包括以下试剂：0. 5 μ L模板DNA，I. 0 μ L上游引物 (IOpmol)，I. 0 μ L 下游引物（IOpmol)，2. 5 μ L 10 Xbuffer 缓冲液，1. 5 μ L 浓度为 25mM 的 MgCljK溶液，0· 5 μ L浓度为IOmM的dNTPs，0· 5 μ L Taq DNA聚合酶（5U/ μ L)，无菌双蒸水 补足至25 μ L。
[0056] PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体 反应条件如下：95°〇5111丨11 ;95°〇3〇8,55°〇3〇8,72°〇3〇8,25个循环；72°〇1〇11^11。
[0057] 2、PCR产物检测
[0058] 采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物，具体如下：
[0059] 取5 μ L扩增产物，采用2 %的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成 像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有前胡： 若获得大小约为485bp的目的条带（序列3)，则所述待测样品中含有前胡；若没有获得大 小为485bp的目的条带（序列3)，则所述待测样品中不含有前胡。
[0060] 实施例2、采用实施例1制备的试剂盒鉴定前胡的特异性分析
[0061] 待测样品：前胡（采自于安徽宁国）、紫花前胡（采自于安徽金寨）。均符合中国 药典（2010年版）一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符， 质量符合标准。
[0062] 一、从待测样品中提取基因组DNA
[0063] 分别取约50mg干燥样品（当然也可采用IOOmg新鲜样品进行基因组DNA提取）， 用CTAB法提取总DNA。具体如下：
[0064] 将无霉变的干燥药材置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2. OmL的 微量离心管中，加入90(^1^已灭菌的0^提取液（配方：2%(28/10〇1111)0^，10〇111111〇1/1 Tris-HCl pH = 8.0, 20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl)、0.02g PVP 40000、10 μ L0-巯基乙 醇充分振荡混匀，65°C水浴I. 5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900 μ L 氯仿-异戊醇（体积比24 :1)，充分振荡混勾，12000g离心10min。取上清，加入等体积氯 仿-异戊醇（体积比24 :1)，充分振荡混勾，12000g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷 的异丙醇溶液，-20°C放置0. 5h以上。取出，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70% (体 积分数）乙醇洗涤两次，37°C挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，_20°C保存。
[0065] 用通用引物QH-TYls和QH-TYla检测以上提取的前胡、紫花前胡的基因组DNA质 量。
[0066] QH-TYls :5, -CGGATATCTCGGC-3,；
[0067] QH-TYla :5, -CAACTTGCGTTCAA-3,。
[0068] 反应总体系为25 μ L，包括DNA模板(λ 5 μ L (5-50ng)，上游引物1 μ L (IOpmol)，下 游引物 1 μ L(IOpmol)，IOXPCR Buffer 2. 5 μ L，MgCl2 (25mM) 1. 5 μ L，dNTPs (IOmM)O. 5 μ L， Taq DNA聚合酶（5U/yL)0. 5yL，ddH20补足至25yL。通用引物PCR反应条件为：95°C5min、 25 个循环（每个循环包括 95°C 30s，55°C 30s，72°C 30s)、72°C lOmin。
[0069] 结果发现所有样品均能扩增出DNA条带（图2)。
[0070] 二、PCR 扩增
[0071] 以步骤一从待测样品中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一设计的引 物对（引物QH-CP19S和QH-CP19a)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例 1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。
[0072] 反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。
[0073] 结果如图3所示，从图中可以看出：
[0074] 利用本发明的引物对（引物QH-CP19S和QH_CP19a)对前胡（即白花前胡）和紫 花前胡进行检测，前胡（即白花前胡）能够扩增出片段大小约为485bp的目的条带。而紫 花前胡未扩增出目的条带。这表明该反应体系能将前胡（即白花前胡）与紫花前胡准确的 鉴别出来。将大小约为485bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。
[0075] 实施例3、采用实施例1制备的试剂盒鉴定前胡的灵敏度分析
[0076] 待测样品：前胡（采自于安徽宁国）。均符合中国药典（2010年版）一部正文各 药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合标准。
[0077] 一、从待测样品中提取基因组DNA
[0078] 分别取约50mg干燥样品（当然也可采用IOOmg新鲜样品进行基因组DNA提取）， 用CTAB法提取总DNA。具体操作参见实施例2步骤一。
[0079] 二、PCR 扩增
[0080] 将步骤一从前胡中提取的基因组DNA进行倍比稀释，得到基因组DNA浓度分别为 42ng/ μ l、21ng/ μ l、llng/ μ l、5ng/ μ 1、2· 5ng/ μ 1、L 25ng/ μ 1 和 0· 625ng/ μ 1 的系列 稀释液，以系列稀释液分别为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对（引物QH-CP19s和 QH-CP19a)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设 置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。
[0081] 反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。
[0082] 结果如图4所示，从图中可以看出：
[0083] 利用本发明的引物对（引物QH-CP19S和QH_CP19a)对前胡（即白花前胡）进行 检测，当模板浓度为5ng/ μ 1时仍能够检测到大小约为485bp的目的条带，但模板浓度为 42ng/ μ 1时，在PCR扩增为25循环的条件下，条带较亮。将大小约为485bp的目的条带回 收测序，其序列正为序列表中序列3。
【主权项】
1. 用于鉴定或辅助鉴定前胡的引物对，其特征在于：所述引物对为由序列表中序列I 和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。2. 用于鉴定或辅助鉴定前胡的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所 述的引物对、dNTP和DNA聚合酶。3. 制备权利要求1所述引物对的方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分 别单独包装的步骤。4. 制备权利要求2所述试剂盒的方法，包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链 DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内。5. 权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定前胡中的应 用。6. 利用权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品 中是否含有前胡的方法，包括如下步骤： (a) 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩 增； (b) 根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品中是否含有前 胡：若PCR产物中含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有前胡；若 PCR产物中不含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有前胡。7. 利用权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品 为前胡还是紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶 茴芹中的任一种的方法，包括如下步骤： (a) 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩 增； (b) 根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品为前胡，还是 紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任 一种：若PCR产物中含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为前胡；若PCR 产物中不含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为紫花前胡、滨海前胡、华 中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种； 所述待测样品为前胡、紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨 叶藁本和异叶茴芹中的任一种。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：在步骤（a)中，进行所述PCR扩增时 采用的退火温度为55 °C。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：进行所述PCR扩增时采用的扩增程序为： 95。〇51^11;951：3〇8,551：3〇8,721：3〇8,25个循环 ；721：1〇111111。10. 根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述400-500bp的DNA片段为 485bp的DNA片段； 所述485bp的DNA片段具体为序列表中序列3所示的DNA片段。
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定前胡的引物对及其应用。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定前胡的引物对，具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。实验证明，采用本发明所提供的引物，通过快速PCR方法实现了前胡与紫花前胡等混伪品的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/10
【公开号】CN104894121
【申请号】CN201510315753
【发明人】黄璐琦, 袁媛, 赵群
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月10日
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种用 于鉴定前胡的引物对及其应用。
【背景技术】
[0002] 前胡为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根。由于历 史上各地区用药习惯不同，前胡的植物来源比较复杂，混伪品较多，目前市场上主要的混伪 品为滨海前胡、碎叶山芹、紫花前胡、蕨叶藁本、异叶茴芹、石防风、短片藁本等。
[0003] 前胡药材与同科或同属混伪品的形态特征比较相近，外形鉴别比较困难，采用传 统的鉴定方法有一定的局限。因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保前胡药材 鉴定的准确性。熊永兴等采用的DNA条形码技术对前胡及其混伪品进行鉴定（熊永兴、邬 兰，刘义梅，陈科力，前胡及其混伪品的DNA条形码鉴定研宄，中药材，2013, 36 (11) :1762)， 但该方法耗时较长，且使用大型仪器，不利于实现快速、现场检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定前胡的引物对。
[0005] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定前胡的引物对为由序列表中序列1和序列2 所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
[0006] 所述引物对中，两条单链DNA分子既可以分别单独包装，也可以按照摩尔比为1:1 的比例混合后包装在一起。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定前胡的试剂盒。
[0008] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定前胡的试剂盒，具体可含有所述引物对、 dNTP和DNA聚合酶。
[0009] 制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。
[0010] 制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别 单独包装的步骤。
[0011] 制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
[0012] 制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链 DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内。
[0013] 所述引物对或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定前胡中的应用也属于本发明的保护 范围。
[0014] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测样品中是否含有前胡的方法。
[0015] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品中是否 含有前胡的方法，具体可包括如下步骤：
[0016] (a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增；
[0017] (b)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品中是否含 有前胡：若PCR产物中含有400-500bp (如485bp)的DNA片段，则所述待测样品中含有或候 选含有前胡；若PCR产物中不含有400-500bp (如485bp)的DNA片段，则所述待测样品中不 含有或候选不含有前胡。
[0018] 在所述方法中，所述前胡为中药材。当然所述方法也可以用于检测前胡的基原植 物--白花前胡（Peucedanum praeruptorum)。相应的，所述待测样品既可为单一或混合的 中药材成品，也可以为植株或取自所述植株的组织或器官。
[0019] 本发明的第四个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测样品为前胡还是紫花前胡的方法。
[0020] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品为前胡， 还是紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中 的任一种的方法，具体可包括如下步骤：
[0021] (a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增；
[0022] (b)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品为前胡， 还是紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中 的任一种：若PCR产物中含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为前胡；若 PCR产物中不含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为紫花前胡、滨海前胡、 华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种；
[0023] 所述待测样品为前胡、紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山 芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种（既可为中药材也可为基原植物）。
[0024] 在上述两方法的步骤（a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为55°C。
[0025] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应条件如下：95°C 5min ; 95°〇3〇8,55°〇3〇8,72°〇3〇8,25个循环；72°〇1〇11^11。
[0026] 在上述两方法的步骤（a)中，在进行所述PCR扩增的反应体系中，所述引物对中每 条单链DNA分子的终浓度均为400nM。
[0027] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应体系如下：0. 5yL模板 0嫩，1.04 1^序列1所示的引物（10?111〇1)，1.(^1^序列2所示的引物（10?111〇1)，2.54 1^ IOXbuffer 缓冲液，I. 5yL 浓度为 25mM 的 MgCljK溶液，0. 5yL 浓度为 IOmM 的 dNTPs， 0· 5 μ L Taq DNA聚合酶（5U/ μ L)，无菌双蒸水补足至25 μ L。
[0028] 在上述两方法中，所述400-500bp (如485bp)的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳图谱 上位于DNA分子量标准400和500bp之间。
[0029] 在实际应用中，判断所述PCR产物中是否含有400-500bp (如485bp)的DNA片段， 可通过将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示含有400-500bp (如 485bp)目的条带，则所述PCR产物中含有400-500bp (如485bp)的DNA片段；反之，则不含 有400-500bp (如485bp)的DNA片段。当然也通过测序的方法判定所述PCR产物中是否含 有 400-500bp (如 485bp)的 DNA 片段。
[0030] 在本发明中，所述400-500bp (如485bp)的DNA片段为485bp的DNA片段，具体为 序列3所示的DNA片段。
[0031] 实验证明，采用本发明所提供的引物，通过快速PCR方法实现了前胡与紫花前胡 等混伪品的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
【附图说明】
[0032] 图1为前胡及混淆品的系统发育树。其中，谱系分支节点上方为BI树的后验概率 PP和MP树的自举支持度BS，在斜线的左边为PP值，斜线的右边为BS值。
[0033] 图2为通用引物扩增凝胶电泳图。M :DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为 600、500、400、300、200 和10(^?);1:前胡；2:紫花前胡。
[0034] 图3为特异性PCR引物对QH-CP19 (上下游引物分别为QH-CP19S和QH-CP19a)扩 增凝胶电泳图。M:DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为600、500、400、300、200和 IOObp) ;1到4 :用特异性PCR引物对QH-CP19扩增4个前胡（白花前胡）样本的结果；5到 8 :用特异性PCR引物对QH-CP19扩增4个紫花前胡样本的结果。
[0035] 图4为特异性PCR引物对QH-CP19 (上下游引物分别为QH-CP19S和QH-CP19a)扩 增凝胶电泳图。M:DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为600、500、400、300、200和 IOObp) ;1 到 7 :前胡 DNA 模板浓度依次为 42ng/ μ l、21ng/ μ l、llng/ μ l、5ng/ μ 1、2· 5ng/ μ 1、L 25ng/ μ I 和 0· 625ng/ μ I ;8 到 14 :紫花前胡 DNA 模板浓度依次为 42ng/ μ l、21ng/ μ l、llng/ μ l、5ng/ μ 1、2· 5ng/ μ 1、L 25ng/ μ 1 和 0· 625ng/ μ I。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 实施例1、用于鉴定前胡的试剂盒的制备及使用方法
[0039] -、用于鉴定前胡的引物对的设计与合成
[0040] 从GenBank查找前胡及混淆品的ITS序列，详见下表1。
[0041] 表1前胡及混淆品的ITS序列
[0042]
[0043]
[0044] 分别用贝叶斯法（Bayesian inference, BI)和简约法（maximum parsimony, MP) 进行系统发育分析，构建BI和MP两种系统树。其中BI树用MrBayes version 3. I. 2软件 构建，MP 树用 PAUP*version 4. Obeta 10 软件构建。构建 BI 树时，用 MrModeltest version 2. 3软件根据AIC(Akaike Information Criterion)检验标准选择数据的最适模型，所选 最适模型是（GTR+I+G)。马尔科夫链的蒙特卡洛方法（Markov Chains Monte Carlo, MCMC) 设置为四条链并运行500000代。为了确定其收敛情况，MCMC分别运行两次。每100代抽 取一个样本，共形成10002个样本。经过分析得知，整个运行在20000代后达到平稳，这样， 总共剩余的样本数为9602,用剩余样本重建系统树并估计其后验概率值。构建MP树时，设 置自举重复次数bootstrap nr印s为1000次，使用启发式搜索分析自举重复数据集，启发 式搜索设置为由随机逐步添加法产生起始树，重复10次，采用TBR分支交换。通过BI法 和MP法构建的系统发育树表明，2种方法构建的系统树完全一致（图1)。图1中各谱系分 支的节点处标有BI树的后验概率（posterior probability, PP)值和MP树的自举支持度 (Bootstrap, BS)。结果表明，前胡所有序列的单倍型形成单系（PP = L 00, BS = 99)。
[0045] 在确定前胡为单系群的前提下，用软件Clustal X 1. 81对表1中所有ITS序列进 行对位排序和比较，找到差异片段，设计前胡检测特异性PCR引物，如下：
[0046] QH-CP19S :5' -TGGCCACTCCCGGaTT-3'（序列 1);
[0047] QH -CP19a :5' -GCCTAAGGGTCCTGAATCTC-3'（序列 2)。
[0048] 理论PCR产物长度为485bp (序列3)
[0049] 二、用于鉴定前胡的试剂盒的组装
[0050] 将步骤一设计合成的引物QH-CP19S和QH-CP19a分别单独包装后，与分别单独包 装的dNTP、DNA聚合酶、IOXbuffer缓冲液等包装于同一个试剂盒内，即得到本发明用于鉴 定前胡的试剂盒。
[0051] 三、鉴定待测样品中是否含有前胡的方法
[0052] 采用步骤二的试剂盒按照包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有前胡：
[0053] I、PCR 扩增
[0054] 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用步骤一设计合成的引物QH-CP19S和 QH-CP19a (序列1和序列2)按照如下进行PCR扩增：
[0055] PCR反应总体积25 μ L，包括以下试剂：0. 5 μ L模板DNA，I. 0 μ L上游引物 (IOpmol)，I. 0 μ L 下游引物（IOpmol)，2. 5 μ L 10 Xbuffer 缓冲液，1. 5 μ L 浓度为 25mM 的 MgCljK溶液，0· 5 μ L浓度为IOmM的dNTPs，0· 5 μ L Taq DNA聚合酶（5U/ μ L)，无菌双蒸水 补足至25 μ L。
[0056] PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体 反应条件如下：95°〇5111丨11 ;95°〇3〇8,55°〇3〇8,72°〇3〇8,25个循环；72°〇1〇11^11。
[0057] 2、PCR产物检测
[0058] 采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物，具体如下：
[0059] 取5 μ L扩增产物，采用2 %的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成 像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有前胡： 若获得大小约为485bp的目的条带（序列3)，则所述待测样品中含有前胡；若没有获得大 小为485bp的目的条带（序列3)，则所述待测样品中不含有前胡。
[0060] 实施例2、采用实施例1制备的试剂盒鉴定前胡的特异性分析
[0061] 待测样品：前胡（采自于安徽宁国）、紫花前胡（采自于安徽金寨）。均符合中国 药典（2010年版）一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符， 质量符合标准。
[0062] 一、从待测样品中提取基因组DNA
[0063] 分别取约50mg干燥样品（当然也可采用IOOmg新鲜样品进行基因组DNA提取）， 用CTAB法提取总DNA。具体如下：
[0064] 将无霉变的干燥药材置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2. OmL的 微量离心管中，加入90(^1^已灭菌的0^提取液（配方：2%(28/10〇1111)0^，10〇111111〇1/1 Tris-HCl pH = 8.0, 20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl)、0.02g PVP 40000、10 μ L0-巯基乙 醇充分振荡混匀，65°C水浴I. 5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900 μ L 氯仿-异戊醇（体积比24 :1)，充分振荡混勾，12000g离心10min。取上清，加入等体积氯 仿-异戊醇（体积比24 :1)，充分振荡混勾，12000g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷 的异丙醇溶液，-20°C放置0. 5h以上。取出，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70% (体 积分数）乙醇洗涤两次，37°C挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，_20°C保存。
[0065] 用通用引物QH-TYls和QH-TYla检测以上提取的前胡、紫花前胡的基因组DNA质 量。
[0066] QH-TYls :5, -CGGATATCTCGGC-3,；
[0067] QH-TYla :5, -CAACTTGCGTTCAA-3,。
[0068] 反应总体系为25 μ L，包括DNA模板(λ 5 μ L (5-50ng)，上游引物1 μ L (IOpmol)，下 游引物 1 μ L(IOpmol)，IOXPCR Buffer 2. 5 μ L，MgCl2 (25mM) 1. 5 μ L，dNTPs (IOmM)O. 5 μ L， Taq DNA聚合酶（5U/yL)0. 5yL，ddH20补足至25yL。通用引物PCR反应条件为：95°C5min、 25 个循环（每个循环包括 95°C 30s，55°C 30s，72°C 30s)、72°C lOmin。
[0069] 结果发现所有样品均能扩增出DNA条带（图2)。
[0070] 二、PCR 扩增
[0071] 以步骤一从待测样品中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一设计的引 物对（引物QH-CP19S和QH-CP19a)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例 1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。
[0072] 反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。
[0073] 结果如图3所示，从图中可以看出：
[0074] 利用本发明的引物对（引物QH-CP19S和QH_CP19a)对前胡（即白花前胡）和紫 花前胡进行检测，前胡（即白花前胡）能够扩增出片段大小约为485bp的目的条带。而紫 花前胡未扩增出目的条带。这表明该反应体系能将前胡（即白花前胡）与紫花前胡准确的 鉴别出来。将大小约为485bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。
[0075] 实施例3、采用实施例1制备的试剂盒鉴定前胡的灵敏度分析
[0076] 待测样品：前胡（采自于安徽宁国）。均符合中国药典（2010年版）一部正文各 药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合标准。
[0077] 一、从待测样品中提取基因组DNA
[0078] 分别取约50mg干燥样品（当然也可采用IOOmg新鲜样品进行基因组DNA提取）， 用CTAB法提取总DNA。具体操作参见实施例2步骤一。
[0079] 二、PCR 扩增
[0080] 将步骤一从前胡中提取的基因组DNA进行倍比稀释，得到基因组DNA浓度分别为 42ng/ μ l、21ng/ μ l、llng/ μ l、5ng/ μ 1、2· 5ng/ μ 1、L 25ng/ μ 1 和 0· 625ng/ μ 1 的系列 稀释液，以系列稀释液分别为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对（引物QH-CP19s和 QH-CP19a)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设 置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。
[0081] 反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。
[0082] 结果如图4所示，从图中可以看出：
[0083] 利用本发明的引物对（引物QH-CP19S和QH_CP19a)对前胡（即白花前胡）进行 检测，当模板浓度为5ng/ μ 1时仍能够检测到大小约为485bp的目的条带，但模板浓度为 42ng/ μ 1时，在PCR扩增为25循环的条件下，条带较亮。将大小约为485bp的目的条带回 收测序，其序列正为序列表中序列3。
【主权项】
1. 用于鉴定或辅助鉴定前胡的引物对，其特征在于：所述引物对为由序列表中序列I 和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。2. 用于鉴定或辅助鉴定前胡的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所 述的引物对、dNTP和DNA聚合酶。3. 制备权利要求1所述引物对的方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分 别单独包装的步骤。4. 制备权利要求2所述试剂盒的方法，包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链 DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内。5. 权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定前胡中的应 用。6. 利用权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品 中是否含有前胡的方法，包括如下步骤： (a) 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩 增； (b) 根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品中是否含有前 胡：若PCR产物中含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有前胡；若 PCR产物中不含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有前胡。7. 利用权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品 为前胡还是紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶 茴芹中的任一种的方法，包括如下步骤： (a) 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩 增； (b) 根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品为前胡，还是 紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任 一种：若PCR产物中含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为前胡；若PCR 产物中不含有400-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为紫花前胡、滨海前胡、华 中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨叶藁本和异叶茴芹中的任一种； 所述待测样品为前胡、紫花前胡、滨海前胡、华中前胡、石防风、短片藁本、碎叶山芹、蕨 叶藁本和异叶茴芹中的任一种。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：在步骤（a)中，进行所述PCR扩增时 采用的退火温度为55 °C。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：进行所述PCR扩增时采用的扩增程序为： 95。〇51^11;951：3〇8,551：3〇8,721：3〇8,25个循环 ；721：1〇111111。10. 根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述400-500bp的DNA片段为 485bp的DNA片段； 所述485bp的DNA片段具体为序列表中序列3所示的DNA片段。
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定前胡的引物对及其应用。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定前胡的引物对，具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。实验证明，采用本发明所提供的引物，通过快速PCR方法实现了前胡与紫花前胡等混伪品的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/10
【公开号】CN104894121
【申请号】CN201510315753
【发明人】黄璐琦, 袁媛, 赵群
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月10日
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