能够鉴定吴江香青菜的issr-scar标记及其鉴定方法
能够鉴定吴江香青菜的issr-scar标记及其鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子标记鉴定领域，特别涉及一种能够鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR 标记及其鉴定方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 青菜（Ara1S1Sica CAiflefl1Si1S L.)也叫小白菜、不结球白菜，属十字花科芸薹属，为 一年生或二年生草本，是重要的蔬菜和油料作物。青菜原产中国，但是近年来东南亚及欧美 等一些国家也逐步引种栽培，目前成为世界性的蔬菜。其中香青菜不仅是我国独有的青菜 品种，而且是苏州地方传统特色珍稀蔬菜品种。至今已有100多年的栽培历史，主要种植在 沿东太湖及太湖西南岸，涉及吴江的震泽、横扇、七都、桃源以及松陵、平望、盛泽等镇的部 分地区。由于吴江香青菜香味浓郁，品质柔嫩，风味独特，其优势别的地方无法复制，2009 年，经农业部评定，吴江香青菜成为江苏省省首批、苏州市第一个国家农产品地理标志登记 保护的农产品。目前对吴江香青菜的鉴别主要依据其形态学特征，如植株半披张、叶片长椭 圆形、叶缘程浅波纹皱褶、叶面邹成波状突起等。但由于大部分青菜品种苗期相似，直到成 株才开始表现出品种的特性，所以对其品种的鉴定往往需要一定时间。因此，为了更加有效 地区分外形相似的不同青菜品种，保护地理标志产品的种质资源，开发出稳定、准确地鉴别 地理标志产品的技术体系迫在眉睫。
[0004] 近年来，DNA分子标记技术逐步成熟和完善，在遗传图谱构建、品种鉴定、亲缘关系 分析和基因定位等方面得到了广泛的应用。目前常用的DNA分子标记主要有基于DNA分 子杂交的RFLP、小卫星DNA等和基于PCR反应的RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP等。其中序 列特异性扩增区域（SeqKence characterized amplified regions, SCARs)标记通常是由 RAPD、SRAP、ISSR标记转化而来，是将上述分子标记筛选出的特异标记片段进行克隆和测 序，根据其碱基序列设计一对特异引物，用于对特征扩增区域的特异性扩增。SCAR标记一般 表现为扩增片段的有无，是一种显性标记，具有稳定性好、可重复性强等优点，目前已成为 育种实践中能直接应用的首选标记。
[0005] 虽然目前DNA分子标记技术在青菜中已取得了一定的研宄成果，但主要集中在遗 传多样性和遗传图谱构建方面，在品种鉴定方面的报道大多是通过SSR指纹图谱对青菜品 种进行鉴别，但由于该方法操作繁琐、重复性差，并且不是可直接应用的专一性、特异性分 子标记，因此不适合用于稳定、快速、准确的品种鉴别体系的开发。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种能够鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法， 通过提供鉴别吴江香青菜的一个DNA片段、一组特异性鉴别引物和一种鉴别方法，实现对 吴江香青菜品种的特异性鉴定，为保护地理标志产品的种质资源提供有力的技术支持。
[0008] 本发明采用的技术方案是： 本发明涉及一个能够在吴江香青菜中扩增出特异性条带的ISSR引物，所述引物的核 苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 本发明所述核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示的引物是通过22条ISSR引物对香吴 江青菜和其它10种江淮地区主栽的青菜品种(包括上海青、小八叶、黑心乌、中其白、苏州 青、五月慢、高梗白、矮脚黄、四月慢和黄心乌)进行PCR扩增，筛选出的能够在吴江香青菜中 扩增出特异性条带的引物。
[0010] 本发明涉及一个吴江香青菜特异性DNA片段，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本发明所述核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示的基因是使用核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示的引物在吴江香青菜中扩增出的一条特异性条带，该扩增条带只出现在吴江香青 菜中，而在其它青菜品种中没有。将该特异性条带进行克隆和测序获得其核苷酸序列。
[0012] 本发明涉及一组特异性鉴别吴江香青菜的SCAR引物，其中上游引物为SEQ ID NO. 3,下游引物为SEQ ID NO. 4,分布对应于SEQ ID NO. 2片段的ll-33nt及1168-1191nt 位点。
[0013] 本发明提供一种吴江香青菜的DNA分子鉴别方法，其特征在于利用特异性鉴别吴 江香青菜的SCAR引物对待检青菜品种的10个个体DNA样品进行PCR反应，PCR反应产物 通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。在IlSlbp处出现扩增条带的样品为吴江香青菜，而相同部 位没有出现条带的样品不是香青菜。
[0014] 本发明所述的鉴别吴江香青菜的PCR反应体系为20 μL，其组分及终浓度为：DNA 模板（20 ng/^l)1.0 μ1，2Χ 反应混合物（含20 mM Tris-HCl，100 mM KC1，3 mM MgC12,400 μΜ 的 dNTPs，溴酚蓝）10.0 μL，引物（10 mM)各 0.8 Pl，Taq DNA 聚合酶（2·5υ/μ1)0·4 μL， 最后用双蒸水补齐至20 μL。PCR程序为：94°C，5min预变性；94°C变性45s，55°C退火45s， 72°C延伸Imin，30个循环；最后72°C延伸8 min。PCR扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭（EB)染色，电压80V，电泳0. 5h后用凝胶成像系统观察、拍照，用2000bp的DNA ladder作为分子量标记。
[0015] 有益效果：本发明是首次对国家农产品地理标志登记保护的农产品一一吴江香青 菜进行分子标记的研宄，本发明提供的鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记方法具有操作简 单、灵敏度高、重复性好等优点，能够实现对吴江香青菜品种的特异性鉴定，对于保护地理 标志产品的种质资源具有重要的意义。
[0016]
【附图说明】
[0017] 图1是香青菜和10个其它青菜品种的ISSR引物（SEQ ID NO. 1)扩增图谱。
[0018] 泳道1-11从左至右依次为：香青菜、上海青、小八叶、黑心乌、中其白、苏州青、五 月慢、高梗白、矮脚黄、四月慢和黄心乌，泳道M为DNA Marker。
[0019] 图2是香青菜和其它青菜品种各10个单株的ISSR-SCAR(SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)检测图谱。
[0020] A为香青菜，B为上海青，C为小八叶；D为黑心乌；E为中其白；F为苏州青；G为五 月慢；H为高梗白；I为矮脚黄；J为四月慢；K为黄心乌。泳道1-10为该品种的10个不同 单株，泳道M为DNA Ma rker。
[0021]
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
[0023] 1、待检样品DNA的提取 选取待检的植物生长状况良好的植株(表1)，采集健康嫩叶100 mg，利用Easy Pure Plant Genomic DNA Kit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司），参照说明书，提取样品总 DNA。用核酸蛋白检测仪（印pendorf，美国)检测DNA的浓度及纯度，调整DNA浓度为20ng/ μ 1，并将DNA样品于-20°C保存备用。
[0024] 表1实验材料表
2、ISSR引物的筛选 PCR反应在BioMetra Tl型PCR仪上进行，反应体系为20 μL，其组分及终浓度为：20 ng DNA 模板（20 ng/μL) 1.0 Pl，2XReaction Mix (20 mM Tris-HCl，100 mM KC1，3 mM MgC12,400 μΜ 的 dNTPs，溴酚蓝)10.0 μL，引物（10 mM)各 0.8 Pl，Taq DNA 聚合酶（2.5U/ μL) 0. 4 μL，最后用双蒸水补齐至20 μΚΡΟ?程序为：94°C，7 min预变性；94°C变性lmin， 53°C退火45 s，72°C延伸I min，35个循环；最后72°C延伸10 min。扩增产物经3. 0%琼脂 糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB)染色，电压80V，电泳I. 5h。用凝胶成像系统观察、拍照，用 2000bp的DNA ladder作为分子量标记。
[0025] 3、ISSR-SCAR 克隆及测序 经过筛选22条ISSR引物，其中序列SEQ ID NO. 1的引物能在香青菜中扩增出特异性 条带。利用上海捷瑞生物工程有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)对该 特异性条带进行回收、纯化。连接反应参照PMD19-T Vector (购自Takara公司）说明书， 反应体系10 μL，包括以下组分！Vector lPl，Solution I 5μ1，?ΝΑ 4 μ1，4?过夜连接。次 日，将连接产物转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞(购自Takara公司）。具体步骤为：取5 μL 连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42 °C热激90 s，冰浴5 min，加500 μL 液体SOC溶液，于37°C，180 rpm的摇床中培养1小时，涂平板，放在培养箱中过夜培养。次 日，挑取单菌落，用通用引物M13和RV-M进行菌落PCR检验，将含有正确条带的克隆交由 南京锐真生物技术有限公司进行测序。
[0026] 4、ISSR-SCAR 标记的验证 根据本发明中吴江香青菜的特异性序列SEQ ID NO. 2,设计出一组特异性引物（SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)用于SCAR反应。具体为：以吴江香青菜和其它10个青菜品种为待 检样品，每个品种随机选取10个个体，用合成的SCAR引物进行品种特异性单株验证，反应 体系为20 μ 1，其组分及终浓度为：DNA模板（20 ng)l μ L，2XReaction Mix (20 mM 1'1^8-!1(：1，100 11111((：1，3 11111%(：12,400 4]\1的(1阶138，溴酚蓝）10.(^1，引物（10 4111〇1/1) 各为0.8 μ 1，Taq DNA聚合酶（2. 5U/μ I) 0.4 μ 1，最后用双蒸水补齐至20 μL。扩增程 序为：94°C，5 min预变性；94°C变性45 s，55°C退火45s，72°C延伸I min，30个循环；最后 72°C延伸8 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB)染色，电压80 V，电 泳0.5 h后用凝胶成像系统观察、拍照，用2000 bp的DNA ladder作为分子量标记。
【主权项】
1. 能够在吴江香青菜中扩增出特异性条带的ISSR引物，其特征在于该引物的核苷酸 序列如SEQIDNO: 1所述。2. 能够在吴江香青菜中扩增得到的特异性DNA片段，其特征在于该片段的核苷酸序列 如SEQIDNO: 2 所述。3. -组能够鉴别吴江香青菜的SCAR引物，其特征在于该引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO: 3 和SEQIDNO: 4 所述。4. 一种吴江香青菜的DNA分子鉴别方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：利用 序列为SEQIDNO: 3和SEQIDNO: 4所示的SCAR引物，对吴江香青菜和其它10种青菜 的DNA样品用PCR反应体系进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴别：电泳结果 中出现一条IlSlbp条带的样品为香青菜，而相同部位没有出现条带的样品则不是香青菜。5. 根据权利要求4所述的一种吴江香青菜的DNA分子鉴别方法，其特征在于该PCR反 应体系为20W，其组分及终浓度为：DNA模板（20ng/W) 1.0W，2X反应混合物(含20 mMTris-HCl，100mMKC1，3mMMgCl2,400 剛的dNTPs，溴酚蓝）10.0P1，引物（10mM)各 0.8Pl，TaqDNA聚合酶（2. 5U/W) 0.4W，最后用双蒸水补齐至20W;PCR扩增程序为： 94°C，5min预变性；94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，30个循环；最后72°C延伸 8min;PCR扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB)染色，电压80V，电泳0. 5h后 用凝胶成像系统观察、拍照，用2000bp的DNAladder作为分子量标记。
【专利摘要】本发明公开了一种能够鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法。本方法是通过对吴江香青菜和其它10种青菜品种进行总DNA提取、PCR扩增、引物筛选和ISSR-SCAR检测，最终确定了吴江香青菜的ISSR-SCAR分子标记及其分子鉴别方法。使用本发明公开序列如SEQ ID NO: 1所示的引物扩增得到序列如SEQ ID NO: 2所示的特异性片段。根据该序列，设计序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的一对引物。本发明操作简便、稳定可靠，是第一个应用于吴江香青菜品种的分子鉴定标记，可用于该品种快速鉴定，同时对保护地理标志产品的种质资源具有重要的意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894124
【申请号】CN201510344812
【发明人】林一波, 张艳梅, 沈雪林, 孙小芹, 戴华军, 杭悦宇, 曹敏旭
【申请人】苏州市种子管理站
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子标记鉴定领域，特别涉及一种能够鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR 标记及其鉴定方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 青菜（Ara1S1Sica CAiflefl1Si1S L.)也叫小白菜、不结球白菜，属十字花科芸薹属，为 一年生或二年生草本，是重要的蔬菜和油料作物。青菜原产中国，但是近年来东南亚及欧美 等一些国家也逐步引种栽培，目前成为世界性的蔬菜。其中香青菜不仅是我国独有的青菜 品种，而且是苏州地方传统特色珍稀蔬菜品种。至今已有100多年的栽培历史，主要种植在 沿东太湖及太湖西南岸，涉及吴江的震泽、横扇、七都、桃源以及松陵、平望、盛泽等镇的部 分地区。由于吴江香青菜香味浓郁，品质柔嫩，风味独特，其优势别的地方无法复制，2009 年，经农业部评定，吴江香青菜成为江苏省省首批、苏州市第一个国家农产品地理标志登记 保护的农产品。目前对吴江香青菜的鉴别主要依据其形态学特征，如植株半披张、叶片长椭 圆形、叶缘程浅波纹皱褶、叶面邹成波状突起等。但由于大部分青菜品种苗期相似，直到成 株才开始表现出品种的特性，所以对其品种的鉴定往往需要一定时间。因此，为了更加有效 地区分外形相似的不同青菜品种，保护地理标志产品的种质资源，开发出稳定、准确地鉴别 地理标志产品的技术体系迫在眉睫。
[0004] 近年来，DNA分子标记技术逐步成熟和完善，在遗传图谱构建、品种鉴定、亲缘关系 分析和基因定位等方面得到了广泛的应用。目前常用的DNA分子标记主要有基于DNA分 子杂交的RFLP、小卫星DNA等和基于PCR反应的RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP等。其中序 列特异性扩增区域（SeqKence characterized amplified regions, SCARs)标记通常是由 RAPD、SRAP、ISSR标记转化而来，是将上述分子标记筛选出的特异标记片段进行克隆和测 序，根据其碱基序列设计一对特异引物，用于对特征扩增区域的特异性扩增。SCAR标记一般 表现为扩增片段的有无，是一种显性标记，具有稳定性好、可重复性强等优点，目前已成为 育种实践中能直接应用的首选标记。
[0005] 虽然目前DNA分子标记技术在青菜中已取得了一定的研宄成果，但主要集中在遗 传多样性和遗传图谱构建方面，在品种鉴定方面的报道大多是通过SSR指纹图谱对青菜品 种进行鉴别，但由于该方法操作繁琐、重复性差，并且不是可直接应用的专一性、特异性分 子标记，因此不适合用于稳定、快速、准确的品种鉴别体系的开发。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种能够鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法， 通过提供鉴别吴江香青菜的一个DNA片段、一组特异性鉴别引物和一种鉴别方法，实现对 吴江香青菜品种的特异性鉴定，为保护地理标志产品的种质资源提供有力的技术支持。
[0008] 本发明采用的技术方案是： 本发明涉及一个能够在吴江香青菜中扩增出特异性条带的ISSR引物，所述引物的核 苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 本发明所述核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示的引物是通过22条ISSR引物对香吴 江青菜和其它10种江淮地区主栽的青菜品种(包括上海青、小八叶、黑心乌、中其白、苏州 青、五月慢、高梗白、矮脚黄、四月慢和黄心乌)进行PCR扩增，筛选出的能够在吴江香青菜中 扩增出特异性条带的引物。
[0010] 本发明涉及一个吴江香青菜特异性DNA片段，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本发明所述核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示的基因是使用核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示的引物在吴江香青菜中扩增出的一条特异性条带，该扩增条带只出现在吴江香青 菜中，而在其它青菜品种中没有。将该特异性条带进行克隆和测序获得其核苷酸序列。
[0012] 本发明涉及一组特异性鉴别吴江香青菜的SCAR引物，其中上游引物为SEQ ID NO. 3,下游引物为SEQ ID NO. 4,分布对应于SEQ ID NO. 2片段的ll-33nt及1168-1191nt 位点。
[0013] 本发明提供一种吴江香青菜的DNA分子鉴别方法，其特征在于利用特异性鉴别吴 江香青菜的SCAR引物对待检青菜品种的10个个体DNA样品进行PCR反应，PCR反应产物 通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。在IlSlbp处出现扩增条带的样品为吴江香青菜，而相同部 位没有出现条带的样品不是香青菜。
[0014] 本发明所述的鉴别吴江香青菜的PCR反应体系为20 μL，其组分及终浓度为：DNA 模板（20 ng/^l)1.0 μ1，2Χ 反应混合物（含20 mM Tris-HCl，100 mM KC1，3 mM MgC12,400 μΜ 的 dNTPs，溴酚蓝）10.0 μL，引物（10 mM)各 0.8 Pl，Taq DNA 聚合酶（2·5υ/μ1)0·4 μL， 最后用双蒸水补齐至20 μL。PCR程序为：94°C，5min预变性；94°C变性45s，55°C退火45s， 72°C延伸Imin，30个循环；最后72°C延伸8 min。PCR扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭（EB)染色，电压80V，电泳0. 5h后用凝胶成像系统观察、拍照，用2000bp的DNA ladder作为分子量标记。
[0015] 有益效果：本发明是首次对国家农产品地理标志登记保护的农产品一一吴江香青 菜进行分子标记的研宄，本发明提供的鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记方法具有操作简 单、灵敏度高、重复性好等优点，能够实现对吴江香青菜品种的特异性鉴定，对于保护地理 标志产品的种质资源具有重要的意义。
[0016]
【附图说明】
[0017] 图1是香青菜和10个其它青菜品种的ISSR引物（SEQ ID NO. 1)扩增图谱。
[0018] 泳道1-11从左至右依次为：香青菜、上海青、小八叶、黑心乌、中其白、苏州青、五 月慢、高梗白、矮脚黄、四月慢和黄心乌，泳道M为DNA Marker。
[0019] 图2是香青菜和其它青菜品种各10个单株的ISSR-SCAR(SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)检测图谱。
[0020] A为香青菜，B为上海青，C为小八叶；D为黑心乌；E为中其白；F为苏州青；G为五 月慢；H为高梗白；I为矮脚黄；J为四月慢；K为黄心乌。泳道1-10为该品种的10个不同 单株，泳道M为DNA Ma rker。
[0021]
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
[0023] 1、待检样品DNA的提取 选取待检的植物生长状况良好的植株(表1)，采集健康嫩叶100 mg，利用Easy Pure Plant Genomic DNA Kit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司），参照说明书，提取样品总 DNA。用核酸蛋白检测仪（印pendorf，美国)检测DNA的浓度及纯度，调整DNA浓度为20ng/ μ 1，并将DNA样品于-20°C保存备用。
[0024] 表1实验材料表
2、ISSR引物的筛选 PCR反应在BioMetra Tl型PCR仪上进行，反应体系为20 μL，其组分及终浓度为：20 ng DNA 模板（20 ng/μL) 1.0 Pl，2XReaction Mix (20 mM Tris-HCl，100 mM KC1，3 mM MgC12,400 μΜ 的 dNTPs，溴酚蓝)10.0 μL，引物（10 mM)各 0.8 Pl，Taq DNA 聚合酶（2.5U/ μL) 0. 4 μL，最后用双蒸水补齐至20 μΚΡΟ?程序为：94°C，7 min预变性；94°C变性lmin， 53°C退火45 s，72°C延伸I min，35个循环；最后72°C延伸10 min。扩增产物经3. 0%琼脂 糖凝胶电泳检测，溴化乙锭（EB)染色，电压80V，电泳I. 5h。用凝胶成像系统观察、拍照，用 2000bp的DNA ladder作为分子量标记。
[0025] 3、ISSR-SCAR 克隆及测序 经过筛选22条ISSR引物，其中序列SEQ ID NO. 1的引物能在香青菜中扩增出特异性 条带。利用上海捷瑞生物工程有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)对该 特异性条带进行回收、纯化。连接反应参照PMD19-T Vector (购自Takara公司）说明书， 反应体系10 μL，包括以下组分！Vector lPl，Solution I 5μ1，?ΝΑ 4 μ1，4?过夜连接。次 日，将连接产物转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞(购自Takara公司）。具体步骤为：取5 μL 连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42 °C热激90 s，冰浴5 min，加500 μL 液体SOC溶液，于37°C，180 rpm的摇床中培养1小时，涂平板，放在培养箱中过夜培养。次 日，挑取单菌落，用通用引物M13和RV-M进行菌落PCR检验，将含有正确条带的克隆交由 南京锐真生物技术有限公司进行测序。
[0026] 4、ISSR-SCAR 标记的验证 根据本发明中吴江香青菜的特异性序列SEQ ID NO. 2,设计出一组特异性引物（SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)用于SCAR反应。具体为：以吴江香青菜和其它10个青菜品种为待 检样品，每个品种随机选取10个个体，用合成的SCAR引物进行品种特异性单株验证，反应 体系为20 μ 1，其组分及终浓度为：DNA模板（20 ng)l μ L，2XReaction Mix (20 mM 1'1^8-!1(：1，100 11111((：1，3 11111%(：12,400 4]\1的(1阶138，溴酚蓝）10.(^1，引物（10 4111〇1/1) 各为0.8 μ 1，Taq DNA聚合酶（2. 5U/μ I) 0.4 μ 1，最后用双蒸水补齐至20 μL。扩增程 序为：94°C，5 min预变性；94°C变性45 s，55°C退火45s，72°C延伸I min，30个循环；最后 72°C延伸8 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB)染色，电压80 V，电 泳0.5 h后用凝胶成像系统观察、拍照，用2000 bp的DNA ladder作为分子量标记。
【主权项】
1. 能够在吴江香青菜中扩增出特异性条带的ISSR引物，其特征在于该引物的核苷酸 序列如SEQIDNO: 1所述。2. 能够在吴江香青菜中扩增得到的特异性DNA片段，其特征在于该片段的核苷酸序列 如SEQIDNO: 2 所述。3. -组能够鉴别吴江香青菜的SCAR引物，其特征在于该引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO: 3 和SEQIDNO: 4 所述。4. 一种吴江香青菜的DNA分子鉴别方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：利用 序列为SEQIDNO: 3和SEQIDNO: 4所示的SCAR引物，对吴江香青菜和其它10种青菜 的DNA样品用PCR反应体系进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴别：电泳结果 中出现一条IlSlbp条带的样品为香青菜，而相同部位没有出现条带的样品则不是香青菜。5. 根据权利要求4所述的一种吴江香青菜的DNA分子鉴别方法，其特征在于该PCR反 应体系为20W，其组分及终浓度为：DNA模板（20ng/W) 1.0W，2X反应混合物(含20 mMTris-HCl，100mMKC1，3mMMgCl2,400 剛的dNTPs，溴酚蓝）10.0P1，引物（10mM)各 0.8Pl，TaqDNA聚合酶（2. 5U/W) 0.4W，最后用双蒸水补齐至20W;PCR扩增程序为： 94°C，5min预变性；94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，30个循环；最后72°C延伸 8min;PCR扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB)染色，电压80V，电泳0. 5h后 用凝胶成像系统观察、拍照，用2000bp的DNAladder作为分子量标记。
【专利摘要】本发明公开了一种能够鉴定吴江香青菜的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法。本方法是通过对吴江香青菜和其它10种青菜品种进行总DNA提取、PCR扩增、引物筛选和ISSR-SCAR检测，最终确定了吴江香青菜的ISSR-SCAR分子标记及其分子鉴别方法。使用本发明公开序列如SEQ ID NO: 1所示的引物扩增得到序列如SEQ ID NO: 2所示的特异性片段。根据该序列，设计序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的一对引物。本发明操作简便、稳定可靠，是第一个应用于吴江香青菜品种的分子鉴定标记，可用于该品种快速鉴定，同时对保护地理标志产品的种质资源具有重要的意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894124
【申请号】CN201510344812
【发明人】林一波, 张艳梅, 沈雪林, 孙小芹, 戴华军, 杭悦宇, 曹敏旭
【申请人】苏州市种子管理站
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
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