一种检测cpt-ⅱ基因突变的引物及试剂盒的制作方法
一种检测cpt-ⅱ基因突变的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测CPT- II基因突变的引物、方法和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 肉毒喊掠桐醜转移酶 II (Carnitine Palmitoyltransferase-II，CPT-II)位于细 胞线粒体内膜上，是脂肪酸氧化过程中起关键作用的酶之一，可逆地催化从酰基辅酶A将 酰基转移至L-肉毒碱的反应，在长链脂肪酸从线粒体外膜转运到线粒体内膜过程中起重 要作用。CPT- II基因全长3090个核苷酸，定位于1ρ32染色体上，含有5个外显子及4个内 含子，编码658个氨基酸肽链。CPT- II基因突变引起CPT- II功能缺陷，肉碱依赖的转运系 统功能将遭到破坏，导致脂酰肉碱不能有效地转化成相应的脂酰辅酶A，故线粒体中长链酰 基肉碱大量聚集，血中酰基肉碱明显增高，从而引起一系列生化紊乱。
[0003] 目前已发现90多种与疾病相关的CPT-II基因突变类型，其中大部分为错义突变， 也包括含两种内含子与外显子交界区的剪切点突变。
[0004] 对于CPT- II基因突变的检测通常为针对某一个热点突变进行检测，尚未有关于 利用多个特异性引物对CPT- II基因多个突变同时进行测定的报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测CPT- II基因突变的引物和试 剂盒。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种非诊断目的检测CPT- II基因的全部外显子及外显 子/内含子交界区突变的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] 一种检测CPT- II基因突变的引物，包括扩增CPT- II基因5个外显子及外显子/ 内含子交界区的引物，其引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 16所示，具体如下：
[0009] CPT- II -Pl-F :5' - CACAGTCTCGCAAGGATGG-3, ；（SEQ ID NO. 1)
[0010] CPT- II -Pl-R:5' -GCGGAAACGGGTTCACTAG-3' ；（SEQ ID N0.2)
[0011] CPT- II -P2-F :5' - TTACACTGACCCTGCTTTCT-3' ；（SEQ ID NO. 3)
[0012] CPT- II -P2-R :5' - TTACATCTGCCACAACCCTA-3' ；（SEQ ID NO. 4)
[0013] CPT- II -P3-F :5' - TTTTAGGGCTATGCTGTTGG-3' ；（SEQ ID NO. 5)
[0014] CPT- II -P3-R :5' - TTAGCAGGAAGTATGTCAGG-3' ；（SEQ ID NO. 6)
[0015] CPT- II -P4-1-F :5' -GTGGAGGACGCCTGTAATC-3' ；（SEQ ID NO. 7)
[0016] CPT- II -P4-1-R :5' - ACGCATTGACCAGGTAGGC-3' ；（SEQ ID NO. 8)
[0017] CPT- II -P4-2-F :5' - CCGGTTTCTGAAGACACTCC-3' ；（SEQ ID NO. 9)
[0018] CPT- II -P4-2-R :5' - CCAGATGTCTCGGTTCTCAC-3' ；（SEQ ID NO. 10)
[0019] CPT- II -P4-3-F :5' - TCGGAAATCCAGGCACATC-3' ；（SEQ ID NO. 11)
[0020] CPT- II -P4-3-R :5' - AGAGCCATCCTTGGCGATA-3' ；（SEQ ID NO. 12)
[0021] CPT- II -P4-4-F :5' - AAGATGGGAACATTGTGAGC-3' ；（SEQ ID NO. 13)
[0022] CPT- II -P4-4-R:5' -GATTTAGGCTTGCTTACCCA-3' ；（SEQ ID NO. 14)
[0023] CPT- II -P5-F :5' - AGGTTAGTCAGTTGGTGGTG-3' ；（SEQ ID NO. 15)
[0024] CPT- II -P5-R :5' - CCTGGGTTCAAGCAATTCTG-3' ；（SEQ ID NO. 16)
[0025] 其中，F为正向引物，R为反向引物。
[0026] CPT- II基因外显子4较大，有1305个碱基，且该外显子内含有105个基因多态性， 进行引物设计比较困难。本发明通过对引物互补、发夹结构和引物交联等引物二级结构进 行了精确的分析，将CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区分成四段，即4-1、4-2、 4-3、4-4,然后为每一段分别设计一对引物，分别如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 14所示。
[0027] 本发明还提供了一种检测CPT- II基因突变的试剂盒，该试剂盒中含有扩增 CPT- II基因 5个外显子及外显子/内含子交界区的引物。
[0028] 本发明所述的试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂。
[0029] 用于PCR扩增反应的酶和试剂包括Taq酶、dNTPUOXPCR缓冲液和双蒸水。
[0030] 进一步的，所述试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。
[0031] 本发明还提供非诊断目的检测检测CPT- II基因的全部外显子及外显子/内含子 交界区突变的方法，包括如下步骤：
[0032] (1)提取待测样本DNA ;
[0033] (2)以样本DNA为模板，用扩增CPT- II基因 5个外显子及外显子/内含子交界区 的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
[0034] (3)采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物；
[0035] (4)对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的CPT- II基因序列进行比对， 从而确定CPT- II基因的突变位点。
[0036] 步骤（2)中，PCR扩增的条件为：94°C预变性3min，94°C变性35s，退火35s，特异性 扩增引物的退火温度为52. 8-57°C，72°C延伸50s，共30个循环；最后72°C延伸5min。
[0037] 步骤（3)中，所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。
[0038] 步骤（3)中，测序扩增反应的条件是：95°C预变性120s，95°C变性30s，50°C退火 10s，60°C延伸120s，共25个循环。
[0039] 测序扩增反应体系采用IOul,具体组成为：DNA模板1 μ L、引物（正、反向）各 1 μ L、BDT2 μ L、双蒸水补足至总体积10 μ L。
[0040] 步骤⑷中，测序的方法为Sanger法。
[0041] 本发明的有益效果：
[0042] 本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增 引物即可对CPT- II基因的全部外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个 潜在的突变位点检测出来。
【附图说明】
[0043] 图1为CPT- II基因外显子及外显子/内含子交界区PCR扩增产物电泳图；其中， M泳道：DNA marker，l~8泳道：分别为CPT- II基因外显子及交界区1、2、3、4-1、4-2、4-3、 4-4 和 5〇
[0044] 图2Α为CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区4-3测序的部分结果，图 的上方为NCBI数据库中标准CPT- II基因序列，其下行为检测的样本CPT- II基因序列；图 2A显示：在cDNA 1055位置，T突变为G。
[0045] 图2B为CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区4-4测序的部分结果，图 的上方为NCBI数据库中标准CPT- II基因序列，其下行为检测的样本CPT- II基因序列；图 2B显示：在cDNA 1102位置，G突变为A。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解 释本发明，并不对其内容进行限定。
[0047] 下面实施例中所用一些材料和试剂均为进口分装或国产分析纯。
[0048] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的 《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2〇01)中所 述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
[0049] 实施例1 :特异性扩增引物的设计
[0050] 根据NCBI数据库中CPT- II正常基因的参考序列设计特异性扩增引物，该特异性 扩增引物应满足以下条件：
[0051] (1)产物不能形成二级结构、碱基要随机分布，引物自身不能有连续4个碱基的互 补；
[0052] (2)所有PCR片段正反向引物退火温度相差不超过5°C，各产物退火温度在 52°C -58°C之间，保证扩增的特异性和稳定性；
[0053] (3)PCR扩增引物的正向扩增引物即为用于测序扩增的引物，长度在18-20bp之 间。
[0054] 本发明设计的特异性扩增引物如表1所示。
[0055] 实施例2 :样本DNA提取
[0056] 本发明所用的阳性样本取自山东的受试者，经医院确诊为肉毒碱棕榈酰转移酶II 缺乏症，经受试者同意，取其血液样本。[0057] 使用血液基因组提取试剂盒（天根生化科技[北京]有限公司）抽提基因组DNA， 示例性的步骤如下：
[0058] (1)取红细胞裂解液900 μ 1，置入I. 5mL的EP管中；
[0059] (2)在上述EP管中加入全血300 μ L，上下颠倒混匀，室温下温育lOmin，以使红细 胞裂解，注意温育期间至少上下颠倒混合一次；
[0060] (3)室温下13200Xg离心20s，用吸头移弃大部分上清液（注意在管内留约 20 μ L-30 μ 1此左右的上清液）；
[0061] (4)旋涡器震荡上管，使细胞悬浮于残液中，以利于下一步的白细胞裂解；
[0062] (5)向上管中加入白细胞裂解液300 μ 1，用吸头上下抽吸，使细胞裂解；
[0063] (6)室温下，加入蛋白质?几淀液100 μ L，旋祸器尚速下震汤20s，以混合；
[0064] (7)4°C下13200Xg离心3min，沉淀的蛋白质应该为致密的、黑褐色。如无蛋白质 沉淀，需要重复上一步，并在冰上温育5min，再重复该步；
[0065] (8)取含DNA的上清液放入新的EP管中，加入100%异丙醇（2-propanol) 300 μ L， 轻轻上下颠倒50次，以混匀；
[0066] (9) 4°C下13200 Xg离心lmin，DNA会形成小的白色沉淀；
[0067] (10)移弃上清液，在吸干纸上短暂吸干EP管，加70%乙醇300 μ L，轻轻上下颠倒 数次，以洗涤DNA沉淀；
[0068] (11)4°C下13200Xg离心lmin，仔细倒掉乙醇，由于DNA沉淀松软，故倒乙醇时要 慢慢进行；
[0069] (12)倒置放置离心管于吸干纸，空气干燥10~15min :
[0070] (13)加入DNA溶解液50 μ L，65°C温育Ih和/或室温过夜，如有可能轻弹EP管， 以促进DNA溶解。
[0071] 根据以上步骤可得出50 μ L DNA样品。
[0072] 实施例3 :PCR扩增
[0073] 利用本实施例1中设计的特异性扩增引物，以样本DNA为模板，进行PCR扩增，PCR 扩增的反应体系采用50yL,具体组成为：DNA模板3yL、引物（正、反向）各2yL、Taq酶 0· 4 μ L、dNTP4 μ L、10 X PCR缓冲液5 μ L、双蒸水补足至总体积50 μ L。
[0074] PCR扩增条件为：94°C预变性3min，94°C变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退 火温度为52. 8-57°C，72°C延伸50s，共30个循环；最后72°C延伸5min。
[0075] 对特异性扩增引物的退火温度进行考察和优化，优化得到的各特异性扩增引物的 退火温度见表1。
[0076] 表1. CPT- II基因 5个外显子及外显子/内含子交界区特异性扩增引物及退火温 度
[0077]
[0078] 实施例4:凝胶电泳检测
[0079] 对实施例3中PCR扩增后的产物进行凝胶电泳检测，检测扩增出的片段是否为需 要的目的片段的大小，Marker采用Marker II (天根生化科技[北京]有限公司），电泳采用 的是2%琼脂糖凝胶，电泳条件：90V，40分钟。PCR扩增产物的电泳结果如图1所示。图1 显示了 CPT- II基因5个外显子及外显子/内含子交界区扩增产物，根据Marker (Marker II， 天根生化科技[北京]有限公司）的比对，可以确定8个条带的大小，分别是297bp~ 937bp，与预测结果一致。
[0080] 实施例5 :PCR扩增产物的切胶纯化
[0081] 对实施例3中PCR扩增出的产物凝胶电泳后，在紫外灯下切取目的条带，采用琼脂 糖凝胶回收试剂盒（天根生化科技[北京]有限公司）将切取得到的凝胶回收纯化，示例 性的步骤如下：
[0082] (1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净 的离心管中，称取重量。
[0083] (2)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μ 1平衡液BL， 12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0084] (3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0. lg，其体积可视为IOOyL^ 加入100 μ L PN溶液），50°C水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分 溶解。
[0085] (4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置 2min，12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心30_60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入 收集管中。
[0086] (5)向吸附柱CA2中加入600 μ L漂洗液PW(使用前加入无水乙醇），12, OOOrpm(~ 13, 400Xg)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
[0087] (6)重复操作步骤（5)。
[0088] (7)将吸附柱CA2放回收集管中，12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心2min，尽量除尽 漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步 的实验。
[0089] (8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 30 μ L洗脱 缓冲液ΕΒ，室温放置2min。12, OOOrpm(~13, 400 Xg)离心2min收集DNA溶液。
[0090] 根据以上步骤可得出30 μ L纯化PCR扩增产物样品。
[0091] 实施例6 :测序扩增产物的制备
[0092] 采用测序引物对实施例5中纯化的PCR产物进行测序扩增，得到测序扩增产物。测 序引物为表1中的正向引物。
[0093] 测序扩增反应的条件是：95°C预变性120s，95°C变性30s，50°C退火10s，60°C延伸 120s，共25个循环。
[0094] 测序扩增反应体系采用IOul,具体组成为：DNA模板1 μ L、引物（正、反向）各 1 μ L、BDT 2 μ L、双蒸水补足至总体积10 μ L。
[0095] 将测序扩增产物进行切胶回收纯化，示例性的步骤与实施例5相同。
[0096] 实施例7 :在ΑΒΙ3730测序仪上进行扩测序
[0097] 使用ΑΒΙ3730测序仪对实施例6纯化的测序扩增产物进行测序。示例性的测序结 果示于图2Α和图2Β。
[0098] 图2Α和图2Β显示了 CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区2段即4-3、 4-4测序的部分结果，每个图的最上方为NCBI数据库中标准CPT- II基因序列，其下行为为 检测样本的0?1'-11基因序列。图24显示：在〇0嫩1055位置，1'突变为6(10551'^352(：， 杂合子，61〇114)。图28显示：在〇0嫩1102位置，6突变为4(11026-4,3681，杂合子，61〇11 4)〇
【主权项】
1. 一种检测CPT-II基因突变的引物，其特征在于，包括扩增CPT-II基因5个外显子及 外显子/内含子交界区的引物，其引物序列如SEQIDNO.I-SEQIDNO. 16所示。2. -种检测CPT-II基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的 检测CPT-II基因突变的引物。3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：用于PCR扩增反应的 酶和试剂。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述用于PCR扩增反应的酶和试剂，包括 Taq酶、dNTP、10XPCR缓冲液和双蒸水。5. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试 剂。6. -种非诊断目的检测检测CPT-II基因的全部外显子及外显子/内含子交界区突变 的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 提取待测样本DNA; (2) 以样本DNA为模板，用扩增CPT-II基因5个外显子及外显子/内含子交界区的引 物进行PCR扩增，得到扩增产物； (3) 采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物； (4) 对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的CPT-II基因序列进行比对，从而 确定CPT-II基因的突变位点。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，PCR扩增的条件为：94°C预变 性3min，94°C变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退火温度为52. 8-57°C，72°C延伸50s， 共30个循环；最后72°C延伸5min。8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，所述测序引物为PCR扩增引物 对中的正向引物。9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4)中，测序的方法为Sanger法。
【专利摘要】本发明公开了一种检测CPT-Ⅱ基因突变的引物，包括扩增CPT-Ⅱ基因全部外显子及外显子/内含子交界区突变的引物，其引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16所示。本发明还公开了一种检测CPT-Ⅱ基因突变的试剂盒，以及一种非诊断目的检测CPT-Ⅱ基因突变的方法。本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增引物即可对CPT-Ⅱ基因的全部外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个潜在的突变位点检测出来。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894126
【申请号】CN201510350438
【发明人】王广新, 马衍辉, 王大伟, 伊长英
【申请人】济南市儿童医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月23日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测CPT- II基因突变的引物、方法和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 肉毒喊掠桐醜转移酶 II (Carnitine Palmitoyltransferase-II，CPT-II)位于细 胞线粒体内膜上，是脂肪酸氧化过程中起关键作用的酶之一，可逆地催化从酰基辅酶A将 酰基转移至L-肉毒碱的反应，在长链脂肪酸从线粒体外膜转运到线粒体内膜过程中起重 要作用。CPT- II基因全长3090个核苷酸，定位于1ρ32染色体上，含有5个外显子及4个内 含子，编码658个氨基酸肽链。CPT- II基因突变引起CPT- II功能缺陷，肉碱依赖的转运系 统功能将遭到破坏，导致脂酰肉碱不能有效地转化成相应的脂酰辅酶A，故线粒体中长链酰 基肉碱大量聚集，血中酰基肉碱明显增高，从而引起一系列生化紊乱。
[0003] 目前已发现90多种与疾病相关的CPT-II基因突变类型，其中大部分为错义突变， 也包括含两种内含子与外显子交界区的剪切点突变。
[0004] 对于CPT- II基因突变的检测通常为针对某一个热点突变进行检测，尚未有关于 利用多个特异性引物对CPT- II基因多个突变同时进行测定的报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测CPT- II基因突变的引物和试 剂盒。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种非诊断目的检测CPT- II基因的全部外显子及外显 子/内含子交界区突变的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] 一种检测CPT- II基因突变的引物，包括扩增CPT- II基因5个外显子及外显子/ 内含子交界区的引物，其引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 16所示，具体如下：
[0009] CPT- II -Pl-F :5' - CACAGTCTCGCAAGGATGG-3, ；（SEQ ID NO. 1)
[0010] CPT- II -Pl-R:5' -GCGGAAACGGGTTCACTAG-3' ；（SEQ ID N0.2)
[0011] CPT- II -P2-F :5' - TTACACTGACCCTGCTTTCT-3' ；（SEQ ID NO. 3)
[0012] CPT- II -P2-R :5' - TTACATCTGCCACAACCCTA-3' ；（SEQ ID NO. 4)
[0013] CPT- II -P3-F :5' - TTTTAGGGCTATGCTGTTGG-3' ；（SEQ ID NO. 5)
[0014] CPT- II -P3-R :5' - TTAGCAGGAAGTATGTCAGG-3' ；（SEQ ID NO. 6)
[0015] CPT- II -P4-1-F :5' -GTGGAGGACGCCTGTAATC-3' ；（SEQ ID NO. 7)
[0016] CPT- II -P4-1-R :5' - ACGCATTGACCAGGTAGGC-3' ；（SEQ ID NO. 8)
[0017] CPT- II -P4-2-F :5' - CCGGTTTCTGAAGACACTCC-3' ；（SEQ ID NO. 9)
[0018] CPT- II -P4-2-R :5' - CCAGATGTCTCGGTTCTCAC-3' ；（SEQ ID NO. 10)
[0019] CPT- II -P4-3-F :5' - TCGGAAATCCAGGCACATC-3' ；（SEQ ID NO. 11)
[0020] CPT- II -P4-3-R :5' - AGAGCCATCCTTGGCGATA-3' ；（SEQ ID NO. 12)
[0021] CPT- II -P4-4-F :5' - AAGATGGGAACATTGTGAGC-3' ；（SEQ ID NO. 13)
[0022] CPT- II -P4-4-R:5' -GATTTAGGCTTGCTTACCCA-3' ；（SEQ ID NO. 14)
[0023] CPT- II -P5-F :5' - AGGTTAGTCAGTTGGTGGTG-3' ；（SEQ ID NO. 15)
[0024] CPT- II -P5-R :5' - CCTGGGTTCAAGCAATTCTG-3' ；（SEQ ID NO. 16)
[0025] 其中，F为正向引物，R为反向引物。
[0026] CPT- II基因外显子4较大，有1305个碱基，且该外显子内含有105个基因多态性， 进行引物设计比较困难。本发明通过对引物互补、发夹结构和引物交联等引物二级结构进 行了精确的分析，将CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区分成四段，即4-1、4-2、 4-3、4-4,然后为每一段分别设计一对引物，分别如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 14所示。
[0027] 本发明还提供了一种检测CPT- II基因突变的试剂盒，该试剂盒中含有扩增 CPT- II基因 5个外显子及外显子/内含子交界区的引物。
[0028] 本发明所述的试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂。
[0029] 用于PCR扩增反应的酶和试剂包括Taq酶、dNTPUOXPCR缓冲液和双蒸水。
[0030] 进一步的，所述试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。
[0031] 本发明还提供非诊断目的检测检测CPT- II基因的全部外显子及外显子/内含子 交界区突变的方法，包括如下步骤：
[0032] (1)提取待测样本DNA ;
[0033] (2)以样本DNA为模板，用扩增CPT- II基因 5个外显子及外显子/内含子交界区 的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
[0034] (3)采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物；
[0035] (4)对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的CPT- II基因序列进行比对， 从而确定CPT- II基因的突变位点。
[0036] 步骤（2)中，PCR扩增的条件为：94°C预变性3min，94°C变性35s，退火35s，特异性 扩增引物的退火温度为52. 8-57°C，72°C延伸50s，共30个循环；最后72°C延伸5min。
[0037] 步骤（3)中，所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。
[0038] 步骤（3)中，测序扩增反应的条件是：95°C预变性120s，95°C变性30s，50°C退火 10s，60°C延伸120s，共25个循环。
[0039] 测序扩增反应体系采用IOul,具体组成为：DNA模板1 μ L、引物（正、反向）各 1 μ L、BDT2 μ L、双蒸水补足至总体积10 μ L。
[0040] 步骤⑷中，测序的方法为Sanger法。
[0041] 本发明的有益效果：
[0042] 本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增 引物即可对CPT- II基因的全部外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个 潜在的突变位点检测出来。
【附图说明】
[0043] 图1为CPT- II基因外显子及外显子/内含子交界区PCR扩增产物电泳图；其中， M泳道：DNA marker，l~8泳道：分别为CPT- II基因外显子及交界区1、2、3、4-1、4-2、4-3、 4-4 和 5〇
[0044] 图2Α为CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区4-3测序的部分结果，图 的上方为NCBI数据库中标准CPT- II基因序列，其下行为检测的样本CPT- II基因序列；图 2A显示：在cDNA 1055位置，T突变为G。
[0045] 图2B为CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区4-4测序的部分结果，图 的上方为NCBI数据库中标准CPT- II基因序列，其下行为检测的样本CPT- II基因序列；图 2B显示：在cDNA 1102位置，G突变为A。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解 释本发明，并不对其内容进行限定。
[0047] 下面实施例中所用一些材料和试剂均为进口分装或国产分析纯。
[0048] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的 《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2〇01)中所 述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
[0049] 实施例1 :特异性扩增引物的设计
[0050] 根据NCBI数据库中CPT- II正常基因的参考序列设计特异性扩增引物，该特异性 扩增引物应满足以下条件：
[0051] (1)产物不能形成二级结构、碱基要随机分布，引物自身不能有连续4个碱基的互 补；
[0052] (2)所有PCR片段正反向引物退火温度相差不超过5°C，各产物退火温度在 52°C -58°C之间，保证扩增的特异性和稳定性；
[0053] (3)PCR扩增引物的正向扩增引物即为用于测序扩增的引物，长度在18-20bp之 间。
[0054] 本发明设计的特异性扩增引物如表1所示。
[0055] 实施例2 :样本DNA提取
[0056] 本发明所用的阳性样本取自山东的受试者，经医院确诊为肉毒碱棕榈酰转移酶II 缺乏症，经受试者同意，取其血液样本。[0057] 使用血液基因组提取试剂盒（天根生化科技[北京]有限公司）抽提基因组DNA， 示例性的步骤如下：
[0058] (1)取红细胞裂解液900 μ 1，置入I. 5mL的EP管中；
[0059] (2)在上述EP管中加入全血300 μ L，上下颠倒混匀，室温下温育lOmin，以使红细 胞裂解，注意温育期间至少上下颠倒混合一次；
[0060] (3)室温下13200Xg离心20s，用吸头移弃大部分上清液（注意在管内留约 20 μ L-30 μ 1此左右的上清液）；
[0061] (4)旋涡器震荡上管，使细胞悬浮于残液中，以利于下一步的白细胞裂解；
[0062] (5)向上管中加入白细胞裂解液300 μ 1，用吸头上下抽吸，使细胞裂解；
[0063] (6)室温下，加入蛋白质?几淀液100 μ L，旋祸器尚速下震汤20s，以混合；
[0064] (7)4°C下13200Xg离心3min，沉淀的蛋白质应该为致密的、黑褐色。如无蛋白质 沉淀，需要重复上一步，并在冰上温育5min，再重复该步；
[0065] (8)取含DNA的上清液放入新的EP管中，加入100%异丙醇（2-propanol) 300 μ L， 轻轻上下颠倒50次，以混匀；
[0066] (9) 4°C下13200 Xg离心lmin，DNA会形成小的白色沉淀；
[0067] (10)移弃上清液，在吸干纸上短暂吸干EP管，加70%乙醇300 μ L，轻轻上下颠倒 数次，以洗涤DNA沉淀；
[0068] (11)4°C下13200Xg离心lmin，仔细倒掉乙醇，由于DNA沉淀松软，故倒乙醇时要 慢慢进行；
[0069] (12)倒置放置离心管于吸干纸，空气干燥10~15min :
[0070] (13)加入DNA溶解液50 μ L，65°C温育Ih和/或室温过夜，如有可能轻弹EP管， 以促进DNA溶解。
[0071] 根据以上步骤可得出50 μ L DNA样品。
[0072] 实施例3 :PCR扩增
[0073] 利用本实施例1中设计的特异性扩增引物，以样本DNA为模板，进行PCR扩增，PCR 扩增的反应体系采用50yL,具体组成为：DNA模板3yL、引物（正、反向）各2yL、Taq酶 0· 4 μ L、dNTP4 μ L、10 X PCR缓冲液5 μ L、双蒸水补足至总体积50 μ L。
[0074] PCR扩增条件为：94°C预变性3min，94°C变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退 火温度为52. 8-57°C，72°C延伸50s，共30个循环；最后72°C延伸5min。
[0075] 对特异性扩增引物的退火温度进行考察和优化，优化得到的各特异性扩增引物的 退火温度见表1。
[0076] 表1. CPT- II基因 5个外显子及外显子/内含子交界区特异性扩增引物及退火温 度
[0077]
[0078] 实施例4:凝胶电泳检测
[0079] 对实施例3中PCR扩增后的产物进行凝胶电泳检测，检测扩增出的片段是否为需 要的目的片段的大小，Marker采用Marker II (天根生化科技[北京]有限公司），电泳采用 的是2%琼脂糖凝胶，电泳条件：90V，40分钟。PCR扩增产物的电泳结果如图1所示。图1 显示了 CPT- II基因5个外显子及外显子/内含子交界区扩增产物，根据Marker (Marker II， 天根生化科技[北京]有限公司）的比对，可以确定8个条带的大小，分别是297bp~ 937bp，与预测结果一致。
[0080] 实施例5 :PCR扩增产物的切胶纯化
[0081] 对实施例3中PCR扩增出的产物凝胶电泳后，在紫外灯下切取目的条带，采用琼脂 糖凝胶回收试剂盒（天根生化科技[北京]有限公司）将切取得到的凝胶回收纯化，示例 性的步骤如下：
[0082] (1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净 的离心管中，称取重量。
[0083] (2)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μ 1平衡液BL， 12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0084] (3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0. lg，其体积可视为IOOyL^ 加入100 μ L PN溶液），50°C水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分 溶解。
[0085] (4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置 2min，12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心30_60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入 收集管中。
[0086] (5)向吸附柱CA2中加入600 μ L漂洗液PW(使用前加入无水乙醇），12, OOOrpm(~ 13, 400Xg)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
[0087] (6)重复操作步骤（5)。
[0088] (7)将吸附柱CA2放回收集管中，12, OOOrpm(~13, 400Xg)离心2min，尽量除尽 漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步 的实验。
[0089] (8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 30 μ L洗脱 缓冲液ΕΒ，室温放置2min。12, OOOrpm(~13, 400 Xg)离心2min收集DNA溶液。
[0090] 根据以上步骤可得出30 μ L纯化PCR扩增产物样品。
[0091] 实施例6 :测序扩增产物的制备
[0092] 采用测序引物对实施例5中纯化的PCR产物进行测序扩增，得到测序扩增产物。测 序引物为表1中的正向引物。
[0093] 测序扩增反应的条件是：95°C预变性120s，95°C变性30s，50°C退火10s，60°C延伸 120s，共25个循环。
[0094] 测序扩增反应体系采用IOul,具体组成为：DNA模板1 μ L、引物（正、反向）各 1 μ L、BDT 2 μ L、双蒸水补足至总体积10 μ L。
[0095] 将测序扩增产物进行切胶回收纯化，示例性的步骤与实施例5相同。
[0096] 实施例7 :在ΑΒΙ3730测序仪上进行扩测序
[0097] 使用ΑΒΙ3730测序仪对实施例6纯化的测序扩增产物进行测序。示例性的测序结 果示于图2Α和图2Β。
[0098] 图2Α和图2Β显示了 CPT- II基因外显子4及外显子/内含子交界区2段即4-3、 4-4测序的部分结果，每个图的最上方为NCBI数据库中标准CPT- II基因序列，其下行为为 检测样本的0?1'-11基因序列。图24显示：在〇0嫩1055位置，1'突变为6(10551'^352(：， 杂合子，61〇114)。图28显示：在〇0嫩1102位置，6突变为4(11026-4,3681，杂合子，61〇11 4)〇
【主权项】
1. 一种检测CPT-II基因突变的引物，其特征在于，包括扩增CPT-II基因5个外显子及 外显子/内含子交界区的引物，其引物序列如SEQIDNO.I-SEQIDNO. 16所示。2. -种检测CPT-II基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的 检测CPT-II基因突变的引物。3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：用于PCR扩增反应的 酶和试剂。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述用于PCR扩增反应的酶和试剂，包括 Taq酶、dNTP、10XPCR缓冲液和双蒸水。5. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试 剂。6. -种非诊断目的检测检测CPT-II基因的全部外显子及外显子/内含子交界区突变 的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 提取待测样本DNA; (2) 以样本DNA为模板，用扩增CPT-II基因5个外显子及外显子/内含子交界区的引 物进行PCR扩增，得到扩增产物； (3) 采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物； (4) 对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的CPT-II基因序列进行比对，从而 确定CPT-II基因的突变位点。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，PCR扩增的条件为：94°C预变 性3min，94°C变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退火温度为52. 8-57°C，72°C延伸50s， 共30个循环；最后72°C延伸5min。8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，所述测序引物为PCR扩增引物 对中的正向引物。9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4)中，测序的方法为Sanger法。
【专利摘要】本发明公开了一种检测CPT-Ⅱ基因突变的引物，包括扩增CPT-Ⅱ基因全部外显子及外显子/内含子交界区突变的引物，其引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16所示。本发明还公开了一种检测CPT-Ⅱ基因突变的试剂盒，以及一种非诊断目的检测CPT-Ⅱ基因突变的方法。本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增引物即可对CPT-Ⅱ基因的全部外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个潜在的突变位点检测出来。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894126
【申请号】CN201510350438
【发明人】王广新, 马衍辉, 王大伟, 伊长英
【申请人】济南市儿童医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月23日
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