抑制Grb2基因表达的siRNA及其应用
抑制Grb2基因表达的siRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体为一种高效抑制生长因子受体结合蛋白 2 (Growth factor receptor-bound protein2，Grb2)基因表达的 siRNA 及其在抗 71 型肠 道病毒（enterovirus71，EV71)药物方面的应用。
【背景技术】
[0002] 手足口病自1974年首次报道以来，1975,1978,1997和1998年分别在保加利亚， 匈牙利，马来西亚和台湾等国家和地区引起了不同程度的爆发，涉及数十人死亡。2008年3 月在我国安徽省阜阳地区开始爆发手足口病疫情，导致23人死亡，3000多人感染。之后，在 北京、上海、浙江、广东等地区也相继有EV71感染的报道，到2008年底，中国手足口病感染 人数累计达48. 9万多，而且死亡人数为126人。2009年继河南省明泉县报道手足口病感染 并有10例病人死亡后，相继在山东、北京、四川、广西、云南、甘肃、贵州等多个省市流行，患 病人数和死亡人数超过了 2008年（将近两倍）。仅2010年上半年，中国有500多人死于手 足口病。根据世界卫生组织报道，2013年，截至11月中国死于手足口病的死亡人数达569 人。
[0003] 从这几年的情况看，我国每隔几年就有局部爆发，患者人数多，分布广，大部分还 在不发达地区，给国家和人民带来了巨大损失，同时也影响着国家的经济和社会安全。手足 口病等流行性疾病成为了民众关注的焦点，有效的控制疫情对国家和社会都有着重要的意 义。正因如此，2009年开始卫生部已经将其列入法定丙级传染病，以更好的监控疫情，为防 控和治疗提供必要的资料和信息。
[0004] 手足口病的主要病原体有71型肠道病毒（Enterovirus71，EV71)、柯沙奇病毒 A16(Coxsackieviruses A16，CAV16)等，但是引起神经性症状和死亡的主要是EV71。
[0005] EV71是1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离 出来的。它属于微小病毒科（Picornaviridae)中的肠病毒群（Enterovirus)。微小病毒 科的病毒包括很多引起人和动物疾病的病毒如口蹄疫病毒、肠道病毒以及引起肝炎的甲型 肝炎病毒（HAV或者EV72)。其中肠病毒属的病毒包括脊髓灰质炎病毒（Polioviruses ;具 3种型别）、柯沙奇病毒（A型23种型别、B型具6种型别）、埃可病毒（Echoviruses ;具31 种型别）及肠病毒（Enteroviruses68~72型）。
[0006] 目前针对EV71病毒的药物开发主要集中于病毒自身的蛋白。由于EV71病毒在传 播过程中往往会出现基因型的转变，从而有可能产生耐药性。而EV71的侵染是病毒和宿主 细胞互作的结果，病毒需要宿主提供侵入，脱壳，复制，表达和组装等细胞因子。可以说，阻 断这些细胞因子，将从根本上解决与EV71相关的医学问题。
[0007] RNA干扰（RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用 RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能 和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。而随着RNAi作为制药技术的日趋成熟，已有 siRNA药物进入临床实验，siRNA药物具有如下优点：1)特异性强，完全配对的碱基序列决 定了其高特异性；2)设计便利，人类基因组测序早已完成，这为SiRNA的设计应用带来了极 大的便利；3)临床便利，作为核酸类药物，siRNA药物具有相似的药物代谢，药物毒性和药 物分布；4)由于RNAi是针对特定基因，所以其药理学途径明确。
[0008] 我们经过对与EV71侵染有关的宿主基因的筛选研究后，进一步挑选Grb2作为可 能性的靶标基因，利用siRNA技术，结合分子生物学和细胞生物学手段对其在EV71的侵染， 增殖等过程中的功能进行分析，为EV71的治疗提供可行性药物。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于获得商效抑制Grb2基因表达的siRNA，并进行临床应用。
[0010] 本发明利用RNAi技术，根据SiRNA的设计原理，对靶标基因 Grb2设计并合成5条 siRNA，将这5条siRNA转染至横纹肌肉瘤细胞（Rhabdomyosarcoma，RD)细胞进行基因沉默 效用的评定之后，将能够最高效抑制Grb2基因表达的siRNA转染至RD细胞后，通过EV71 侵染检测该siRNA抵抗EV71侵染的效果，证明其在临床上应用的可行性。
[0011] 具体来说分为以下几步：
[0012] 第一步，按照本发明提供的技术方案，以Grb2为靶标基因，设计并合成5条siRNA， 序列见表1 ;
[0013] 第二步，转染这些siRNA至RD细胞，通过Northern blotting检测细胞中 Grb2mRNA的表达水平的变化；
[0014] 第三步，选择最高效抑制Grb2基因表达的siRNA，转染至RD细胞，并用EV71对其 进行侵染，检测细胞的存活率，从而鉴定该siRNA抗EV71的有效性。
[0015] 上述siRNA序列可用于制备治疗EV71的药物，将有可能成为抗EV71的一种很有 潜力的siRNA药物。
【附图说明】
[0016] 图1为RD细胞转染siRNA后，通过Northern blotting检测细胞内的Grb2基因 表达水平；
[0017] 图2为转染siRNA的RD细胞在EV71的侵染下，存活率大大提高；
[0018] 图3为EV71在转染siRNA后RD细胞中的复制量大大减少。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明
[0020] 本发明利用Northern blotting和Western blotting技术确定了 RD细胞能够 在RNA水平大量表达Grb2基因，EV71可以在RD细胞中大量复制，所以本发明采用RD细 胞（来自中科院细胞所）作为siRNA筛选细胞和EV71侵染细胞，该细胞在DMEM(Gibco， 12800-017)培养基（含10% FBS)中培养培养条件为37度，5% C02。
[0021] 1、siRNA的设计合成
[0022] 根据siRNA设计原理，针对Grb2基因的mRNA设计5对siRNA (参见表1)。设计方 法及步骤为：1)利用NCBI的核甘酸数据库分别找到人源Grb2基因的RNA序列，它在NCBI 的 Accession 为 ΝΜ_002086· 4 ;3)利用 WHITEHEAD 网站（网址为：http://sirna.wi. mit. edu/)上发布的siRNA设计软件，结果显示这5对siRNA的效率最高。上述siRNA均由上海 吉玛制药技术有限公司提供合成。为提高所述siRNA的基因沉默效率，所述SiRNA的3'端 垂悬有两个脱氧核苷酸组成的碱基TT。
[0023] 表1 :根据软件设计并合成的siRNA序列
[0026] 2、siRNA 筛选
[0027] 将RD细胞传代至标准6孔细胞培养板，转染前长至60% -70%。转染时更换新鲜 培养基后每孔加入终浓度30nM siRNA和5ul siRNA转染试剂（Hyperfect，301705)，转染方 法按说明书进行。转染后24小时后采用Trizol (Invitrogenl5596-026)提取RNA，RNA电 泳后转膜至PVDF膜上进行Northern blotting。Northern Blotting用的探针为SEQ ID NO. 11 为 5'-CGTGCCGCTGTTTGCTAAGC-3'，SEQ ID NO. 12 为 5'-CCATCTCGGAGCACCTTGAA-3'， 并用磷酸化酶（NEB，M0201S)将γ [32P]-ATP上的32P标记在探针的5'端。最后以Northern blotting的结果检测各条siRNA对Grb2基因表达的抑制效果。检测结果如图1表明：Grb2 基因的表达明显受到siRNA的抑制而降低，其中Grb2-lsiRNA的抑制效果最佳。
[0028] 3、有效性验证
[0029] 选择上述最高效抑制Grb2基因表达的siRNA进行RD细胞转染，24小时后用EV71 侵染，侵染过程持续72小时，拍照记录细胞状态，结果如图2所示转染siRNA后的RD细胞仍 然存活而未转染的RD细胞则死亡；之后采用细胞裂解液消化细胞并离心，收集上清液后进 行SDS-PAGE并将蛋白转至PVDF膜，最后用VPl抗体进行Western blotting检测EV71在 细胞内的表达量。结果如图3所示：siRNA的转染明显导致EV71的VP蛋白复制受到影响。
[0030] 综上所述，用最高效抑制Grb2基因表达的Grb2-lsiRNA转染RD细胞后可大大减 少EV71在细胞内的复制，从而使细胞存活。所以，抑制Grb2基因表达的siRNA就能有效延 缓甚至阻断EV71的病理进程，从而为EV71的治疗提供可行性药物。
【主权项】
1. 抑制Grb2基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA为： Grb-2-l： 正义链序列SEQIDNO. 1 为 5' -GTACAAGGCAGAGCTTAAITT-3' 反义链序列SEQIDNO. 2 为 5' -ATTAAGCTCTGCCTTGTACTT-3'。2. 如权利要求1所述的抑制Grb2基因表达的siRNA，其特征还在于所述siRNA的3' 端垂悬有两个用于提高基因沉默效率的由脱氧核苷酸组成的悬挂碱基TT。3. 如权利要求1或2所述抑制Grb2基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA用于 制备治疗EV71的药物。
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域，具体为一种高效抑制生长因子受体结合蛋白2(Growth factor receptor-bound protein2，Grb2)基因表达的siRNA及其在抗71型肠道病毒(Enterovirus71，EV71)药物方面的应用。根据siRNA设计原理，针对Grb2基因的mRNA序列设计了5对siRNA，该5对siRNA可以用于抑制Grb2基因表达。由于Grb2基因的表达水平与EV71的复制密切相关，所以抑制Grb2基因表达的siRNA就能有效延缓甚至阻断EV71的病理进程，从而为EV71的治疗提供可行性药物。
【IPC分类】C12N15/113, A61K48/00, A61P31/14
【公开号】CN104894127
【申请号】CN201410075283
【发明人】赵志敬, 沈文婷, 胡广
【申请人】北大工学院绍兴技术研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月3日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体为一种高效抑制生长因子受体结合蛋白 2 (Growth factor receptor-bound protein2，Grb2)基因表达的 siRNA 及其在抗 71 型肠 道病毒（enterovirus71，EV71)药物方面的应用。
【背景技术】
[0002] 手足口病自1974年首次报道以来，1975,1978,1997和1998年分别在保加利亚， 匈牙利，马来西亚和台湾等国家和地区引起了不同程度的爆发，涉及数十人死亡。2008年3 月在我国安徽省阜阳地区开始爆发手足口病疫情，导致23人死亡，3000多人感染。之后，在 北京、上海、浙江、广东等地区也相继有EV71感染的报道，到2008年底，中国手足口病感染 人数累计达48. 9万多，而且死亡人数为126人。2009年继河南省明泉县报道手足口病感染 并有10例病人死亡后，相继在山东、北京、四川、广西、云南、甘肃、贵州等多个省市流行，患 病人数和死亡人数超过了 2008年（将近两倍）。仅2010年上半年，中国有500多人死于手 足口病。根据世界卫生组织报道，2013年，截至11月中国死于手足口病的死亡人数达569 人。
[0003] 从这几年的情况看，我国每隔几年就有局部爆发，患者人数多，分布广，大部分还 在不发达地区，给国家和人民带来了巨大损失，同时也影响着国家的经济和社会安全。手足 口病等流行性疾病成为了民众关注的焦点，有效的控制疫情对国家和社会都有着重要的意 义。正因如此，2009年开始卫生部已经将其列入法定丙级传染病，以更好的监控疫情，为防 控和治疗提供必要的资料和信息。
[0004] 手足口病的主要病原体有71型肠道病毒（Enterovirus71，EV71)、柯沙奇病毒 A16(Coxsackieviruses A16，CAV16)等，但是引起神经性症状和死亡的主要是EV71。
[0005] EV71是1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离 出来的。它属于微小病毒科（Picornaviridae)中的肠病毒群（Enterovirus)。微小病毒 科的病毒包括很多引起人和动物疾病的病毒如口蹄疫病毒、肠道病毒以及引起肝炎的甲型 肝炎病毒（HAV或者EV72)。其中肠病毒属的病毒包括脊髓灰质炎病毒（Polioviruses ;具 3种型别）、柯沙奇病毒（A型23种型别、B型具6种型别）、埃可病毒（Echoviruses ;具31 种型别）及肠病毒（Enteroviruses68~72型）。
[0006] 目前针对EV71病毒的药物开发主要集中于病毒自身的蛋白。由于EV71病毒在传 播过程中往往会出现基因型的转变，从而有可能产生耐药性。而EV71的侵染是病毒和宿主 细胞互作的结果，病毒需要宿主提供侵入，脱壳，复制，表达和组装等细胞因子。可以说，阻 断这些细胞因子，将从根本上解决与EV71相关的医学问题。
[0007] RNA干扰（RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用 RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能 和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。而随着RNAi作为制药技术的日趋成熟，已有 siRNA药物进入临床实验，siRNA药物具有如下优点：1)特异性强，完全配对的碱基序列决 定了其高特异性；2)设计便利，人类基因组测序早已完成，这为SiRNA的设计应用带来了极 大的便利；3)临床便利，作为核酸类药物，siRNA药物具有相似的药物代谢，药物毒性和药 物分布；4)由于RNAi是针对特定基因，所以其药理学途径明确。
[0008] 我们经过对与EV71侵染有关的宿主基因的筛选研究后，进一步挑选Grb2作为可 能性的靶标基因，利用siRNA技术，结合分子生物学和细胞生物学手段对其在EV71的侵染， 增殖等过程中的功能进行分析，为EV71的治疗提供可行性药物。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于获得商效抑制Grb2基因表达的siRNA，并进行临床应用。
[0010] 本发明利用RNAi技术，根据SiRNA的设计原理，对靶标基因 Grb2设计并合成5条 siRNA，将这5条siRNA转染至横纹肌肉瘤细胞（Rhabdomyosarcoma，RD)细胞进行基因沉默 效用的评定之后，将能够最高效抑制Grb2基因表达的siRNA转染至RD细胞后，通过EV71 侵染检测该siRNA抵抗EV71侵染的效果，证明其在临床上应用的可行性。
[0011] 具体来说分为以下几步：
[0012] 第一步，按照本发明提供的技术方案，以Grb2为靶标基因，设计并合成5条siRNA， 序列见表1 ;
[0013] 第二步，转染这些siRNA至RD细胞，通过Northern blotting检测细胞中 Grb2mRNA的表达水平的变化；
[0014] 第三步，选择最高效抑制Grb2基因表达的siRNA，转染至RD细胞，并用EV71对其 进行侵染，检测细胞的存活率，从而鉴定该siRNA抗EV71的有效性。
[0015] 上述siRNA序列可用于制备治疗EV71的药物，将有可能成为抗EV71的一种很有 潜力的siRNA药物。
【附图说明】
[0016] 图1为RD细胞转染siRNA后，通过Northern blotting检测细胞内的Grb2基因 表达水平；
[0017] 图2为转染siRNA的RD细胞在EV71的侵染下，存活率大大提高；
[0018] 图3为EV71在转染siRNA后RD细胞中的复制量大大减少。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明
[0020] 本发明利用Northern blotting和Western blotting技术确定了 RD细胞能够 在RNA水平大量表达Grb2基因，EV71可以在RD细胞中大量复制，所以本发明采用RD细 胞（来自中科院细胞所）作为siRNA筛选细胞和EV71侵染细胞，该细胞在DMEM(Gibco， 12800-017)培养基（含10% FBS)中培养培养条件为37度，5% C02。
[0021] 1、siRNA的设计合成
[0022] 根据siRNA设计原理，针对Grb2基因的mRNA设计5对siRNA (参见表1)。设计方 法及步骤为：1)利用NCBI的核甘酸数据库分别找到人源Grb2基因的RNA序列，它在NCBI 的 Accession 为 ΝΜ_002086· 4 ;3)利用 WHITEHEAD 网站（网址为：http://sirna.wi. mit. edu/)上发布的siRNA设计软件，结果显示这5对siRNA的效率最高。上述siRNA均由上海 吉玛制药技术有限公司提供合成。为提高所述siRNA的基因沉默效率，所述SiRNA的3'端 垂悬有两个脱氧核苷酸组成的碱基TT。
[0023] 表1 :根据软件设计并合成的siRNA序列
[0026] 2、siRNA 筛选
[0027] 将RD细胞传代至标准6孔细胞培养板，转染前长至60% -70%。转染时更换新鲜 培养基后每孔加入终浓度30nM siRNA和5ul siRNA转染试剂（Hyperfect，301705)，转染方 法按说明书进行。转染后24小时后采用Trizol (Invitrogenl5596-026)提取RNA，RNA电 泳后转膜至PVDF膜上进行Northern blotting。Northern Blotting用的探针为SEQ ID NO. 11 为 5'-CGTGCCGCTGTTTGCTAAGC-3'，SEQ ID NO. 12 为 5'-CCATCTCGGAGCACCTTGAA-3'， 并用磷酸化酶（NEB，M0201S)将γ [32P]-ATP上的32P标记在探针的5'端。最后以Northern blotting的结果检测各条siRNA对Grb2基因表达的抑制效果。检测结果如图1表明：Grb2 基因的表达明显受到siRNA的抑制而降低，其中Grb2-lsiRNA的抑制效果最佳。
[0028] 3、有效性验证
[0029] 选择上述最高效抑制Grb2基因表达的siRNA进行RD细胞转染，24小时后用EV71 侵染，侵染过程持续72小时，拍照记录细胞状态，结果如图2所示转染siRNA后的RD细胞仍 然存活而未转染的RD细胞则死亡；之后采用细胞裂解液消化细胞并离心，收集上清液后进 行SDS-PAGE并将蛋白转至PVDF膜，最后用VPl抗体进行Western blotting检测EV71在 细胞内的表达量。结果如图3所示：siRNA的转染明显导致EV71的VP蛋白复制受到影响。
[0030] 综上所述，用最高效抑制Grb2基因表达的Grb2-lsiRNA转染RD细胞后可大大减 少EV71在细胞内的复制，从而使细胞存活。所以，抑制Grb2基因表达的siRNA就能有效延 缓甚至阻断EV71的病理进程，从而为EV71的治疗提供可行性药物。
【主权项】
1. 抑制Grb2基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA为： Grb-2-l： 正义链序列SEQIDNO. 1 为 5' -GTACAAGGCAGAGCTTAAITT-3' 反义链序列SEQIDNO. 2 为 5' -ATTAAGCTCTGCCTTGTACTT-3'。2. 如权利要求1所述的抑制Grb2基因表达的siRNA，其特征还在于所述siRNA的3' 端垂悬有两个用于提高基因沉默效率的由脱氧核苷酸组成的悬挂碱基TT。3. 如权利要求1或2所述抑制Grb2基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA用于 制备治疗EV71的药物。
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域，具体为一种高效抑制生长因子受体结合蛋白2(Growth factor receptor-bound protein2，Grb2)基因表达的siRNA及其在抗71型肠道病毒(Enterovirus71，EV71)药物方面的应用。根据siRNA设计原理，针对Grb2基因的mRNA序列设计了5对siRNA，该5对siRNA可以用于抑制Grb2基因表达。由于Grb2基因的表达水平与EV71的复制密切相关，所以抑制Grb2基因表达的siRNA就能有效延缓甚至阻断EV71的病理进程，从而为EV71的治疗提供可行性药物。
【IPC分类】C12N15/113, A61K48/00, A61P31/14
【公开号】CN104894127
【申请号】CN201410075283
【发明人】赵志敬, 沈文婷, 胡广
【申请人】北大工学院绍兴技术研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月3日
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