长链非编码rnaafap1-as1的原位杂交探针、试剂及其应用
长链非编码rna afap1-as1的原位杂交探针、试剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂 交探针、检测试剂及其应用方法。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENC0DE)研宄成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序 列的1-3%，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中 IncRNA序列的比例也相应地增大，提示IncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着IncRNA 不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现IncRNA广泛而活跃地参与到生命活动 不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研宄领域新的前沿 与热点。
[0003] LncRNA可作为功能蛋白质的信号（signal)、诱导（guide)、诱馆（decoy)或支架 (scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基 因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一 起。因此，深入研宄IncRNA的功能，揭示由IncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网 络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现 生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的 发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。
[0004] 鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研 宄表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在鼻咽 癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们利用IncRNA芯片，构建了鼻咽 癌活检组织及正常对照样品中IncRNA的表达谱，从中筛选了一些在鼻咽癌中差异表达的 IncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number:NR_026892)在鼻咽癌中表达显著上调，且AFAP1-AS1的表达水平与鼻咽癌的淋巴 结转移及临床分期密切相关，针对该IncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的辅助诊断。 随后，我们进一步增加样本，在112例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位 杂交（in situ hybridization)的方法检测了 AFAP1-AS1的表达水平，发现AFAP1-AS1表 达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该IncRNA表达低的患者，因此针对该IncRNA 的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判断。
[0005] 我们通过设计并合成革E向AFAP1-AS1的短发夹RNA (short-hairpin RNA, shRNAs) 序列，构建了靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和 裸鼠转移瘤体内模型中均证实靶向干扰AFAP1-AS1的表达可明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭 与转移能力。将AFAP1-AS1的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳 米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护AFAP1-AS1的RNA干扰载体免受核酸 酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂交探针、试剂及其应用 方法，利用长链非编码RNA AFAP1-AS1序列可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的 制剂。
[0007] LncRNA AFAP1-AS1的应用方法，用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂， 该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所示。
[0008] 所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。
[0009] 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸 探针，序列如下：
[0010] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' 如 SEQ N0:2 所示，
[0011] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3' 如 SEQ N0:3 所示，
[0012] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3' 如 SEQ N0:4 所示。
[0013] 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
[0014] 试剂盒中含有上述用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针：
[0015] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'
[0016] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3，
[0017] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'，
[0018] 阳性对照探针（检测看豕基因 GAPDH):
[0019] GAPDH 探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，如 SEQ NO: 5 所示，
[0020] GAPDH 探针 2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'，如 SEQ NO: 6 所示，
[0021] GAPDH 探针 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'，如 SEQ NO: 7 所示。
[0022] 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物 检测试剂、DAB染色试剂；
[0023] 其它常规生物化学试剂，包括20x柠檬酸钠缓冲溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去离子甲酰胺（Deionized Formamide)， 多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸（polydeoxyadenylic acid， Poly dA)，变性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)， 酵母转运 RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇（DTT)，50x 邓罕氏缓冲液（Denhardts' s solution)，磷酸缓冲液（PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白（BSA)，三乙醇胺 (TEA)，醋酸酐，阻断试剂（Blocking reagent agent)，TNB 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 5 % 阻断试剂），TNT 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 05% Tween 20) 〇
[0024] 我们通过原位杂交在鼻咽癌和正常鼻咽上皮存档石蜡组织标本中发现AFAP1-AS1 在鼻咽癌中表达显著上调，且AFAP1-AS1的表达与预后密切相关，AFAP1-AS1表达高的患者 生存时间更短，提示AFAP1-AS1可作为鼻咽癌预后预测的分子标志。本发明为鼻咽癌的辅 助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应 用前景。
【附图说明】
[0025] 图1为实时荧光定量PCR技术验证IncRNA AFAP1-AS1在鼻咽癌和正常鼻咽上皮 中的表达情况；
[0026] AFAP1-AS1在鼻咽癌（NPC)中的表达比正常鼻咽上皮（Normal)中显著提高，且与 淋巴结转移（左）及临床分期（右）密切相关，AFAP1-AS1的表达在有淋巴结转移的鼻咽 癌组织（NPC_Nl/2)中比没有淋巴结转移（NPC_N0)的更高（左图），AFAP1-AS1的表达也随 鼻咽癌患者临床分期逐渐增高（右图，I、II、III分别代表临床I、II、III期）。
[0027] 图2为原位杂交检测AFAP1-AS1在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；
[0028] 正常鼻咽上皮（NPE)中表达水平较低（仅在2例正常鼻咽上皮组织中检测到有低 表达，其余8例中检测不到表达），而在69. 64%的鼻咽癌（112例鼻咽癌组织中的78例） 中检测到有AFAP1-AS1的表达，其中55例为低表达（NPC_Low)，23例为高表达（NPC_High)， 其余的34例鼻咽癌组织中未检测到AFAP1-AS1的表达（NPC_negative) ;P〈0. 001。
[0029] 图3为鼻咽癌中AFAP1-AS1的表达与鼻咽癌患者预后的关系
[0030] 鼻咽癌中AFAP1-AS1的高表达与鼻咽癌患者的不良预后相关，即AFAP1-AS1高 表达的患者总的生存时间（Over-all survival，左）和无复发生存时间（Relapse-free sruvival，右）要明显低于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者。
[0031] 图4为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体，可显著抑制AFAP1-AS1在鼻 咽癌细胞中的表达
[0032] 在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中导入靶向AFAP1-AS1的干扰载体（sh-1， sh-2, sh-3)后，实时荧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中AFAP1-AS1的表达情况， AFAP1-AS1的表达均受到明显的抑制。阴性对照（NC)为scramble干扰载体，Mock为未经 任何处理的鼻咽癌细胞。
[0033] 图5为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞 侵袭能力降低
[0034] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向 AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低。
[0035] 图6为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞 迀移能力降低
[0036] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向AFAP1-AS1的 干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移速度明显减 慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低。
[0037] 图7.动物实验进一步证实干扰AFAP1-AS1的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力
[0038] 在鼻咽癌细胞5-8F中转入shRNA干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，经尾静脉 将鼻咽癌细胞注射到裸鼠体内，观察肺转移情况，发现与对照组（NC)相比，shRNA敲低 AFAP1-AS1表达的5-8F细胞肺转移灶的数目变少（图7A-C，P〈0. 05)，转移灶的体积变小 (图7D)，表明鼻咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【具体实施方式】
[0039] 以下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0040] 实施例1，实时荧光定量PCR法检测证实AFAP1-AS1在鼻咽癌中表达上调
[0041] 1.材料与方法：
[0042] 收集10例正常鼻咽上皮组织和31例鼻咽癌组织，抽提总RNA，2 μ g RNA经逆转录 成cDNA后，进行实 时荧光定量PCR。AFAP-ASl正向引物为5' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3' 如 SEQ N0:8 所示，和反向引物 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3' 如 SEQ N0:9 所示。
[0043] 用于对照的 GAPDH 正向引物为 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'如 SEQ NO: 10 所示， 和反向引物5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，如SEQ N0:11所示，实时荧光定量PCR反应体 系
[0044] SYBR? Prcmix Ex Taqi vi (2χ) 10μ1 PCR Forward Primer ( 1 Ομηι) 0·4μΙ PCR Reverse Primer ( ΙΟμηι) 0.4μ1 cDNA 模板 2.0μ1 dH20 7.2μΙ Total 20μΙ
[0045] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0046] 1 94 C 5 nun 2 95'C IOscc 3 58°C 30 see 4 72 °C 20 see 5 Plate read 6 82°C 30 see
[0047] 7 Plate read 8 Go to step 2 for more 39 limes 9 Perform melting curve from 55.O C Io 95.O C , read every 0.2 C , hold for I see
[0048] 反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根 据 CT值（threshold cycle values)、内参基因（GAPDH)标化后，采用 group t-test 检验计 算P值。2.结果
[0049] AFAP1-AS1在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在鼻咽癌组织中高表达 Ρ〈0· 001(图 1)
[0050] 实施例2,原位杂交检测发现AFAP1-AS1在鼻咽癌中的表达与患者预后相关
[0051] 1.材料方法
[0052] I. 1设计并合成杂交探针
[0053] 为了采用原位杂交方法检测AFAP1-AS1的表达情况，我们设计了针对原位杂交检 测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各3条。
[0054] 用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针：
[0055] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'
[0056] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3，
[0057] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'
[0058] 阳性对照探针（检测看家基因 GAPDH):
[0059] GAPDH 探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'
[0060] GAPDH 探针 2 :5, -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3，
[0061] GAPDH 探针 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'
[0062] 采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。
[0063] 1. 2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂
[0064] 地高辛寡核苷酸加尾试剂（Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation， Roche公司），抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒（Anti-Digoxigenin-POD， Fab fragments，Roche公司），增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统（TSA? Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司），DAB染色试剂盒（北京中山公司），20x朽 1檬 酸钠缓冲溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去离子 甲酰胺（Deionized Formamide)，多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺 苷酸（polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的娃精 DNA (denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运 RNA (yeast t_RNA，tRNA)，二硫苏糖醇（DTT)，50x 邓 罕氏缓冲液（Denhardts's solution)，磷酸缓冲液（PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋 白（BSA)，三乙醇胺（TEA)，TNB Buffer(0.1 M Tris-HCl，pH7. 5,0· 15Μ NaCL，0. 5%Blocking Reagent)，TNT Buffer(0· IM Tris-HCl，ρΗ7· 5,0· 15M NaCL，0.05% Tween 20)，醋酸酐，阻 断试剂（Blocking reagent agent，Roche 公司）。
[0065] I. 3其他主要试剂和材料
[0066] 无水乙醇、90%酒精、70%酒精、50%酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液（pH7. 2~ 7. 4, NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L，Na2HP044. 3mmol/L，KH2PO4L 4mmol/L) ;3 % 甲 醇-双氧水溶液（80%甲醇和30%双氧水配置）；0.0 lmol/L梓檬酸盐缓冲液（citrate buffer, CB，pH6. 0±0. l，9ml 0.1 M柠檬酸溶液和41ml 0.1 M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏 水中临时配置后再校正工作液pH值）；0. 1%胰蛋白酶；苏木素；1%盐酸酒精（1ml浓盐酸 +99ml 70%酒精配置）；封片胶（PTS Cure Mount II );专用盖玻片（480X240mm2)定制于 郑州玻璃仪器厂。Leica低熔点（58°C)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10%中性多聚 甲醛（0.0 lmol/L，pH7. 4, DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制），苏木素，伊红，中性封片树胶，盖 玻片，载玻片。
[0067] 1. 4标记探针
[0068] 利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如 下。
[0069] IOOpmol oligonucleotide+ddH20 = 9 μ I (control:control oligonucleutide 5 μ l+ddH20 4 μ I)
[0070] Reaction buffer 4μ1 Cocb 4μ1 Dig-dUTP ΙμL dATP ΙμL Terminal transferase ΙμL
[0071] 混匀，稍离心。37°C水浴反应30min，加2μ1 EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。
[0072] 1. 5寡核苷酸探针标记后纯化
[0073] 为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：
[0074] 1)探针反应混合物（22以1)+2.5以14]\11^0^75 4 1100%冷乙醇（-20°〇·
[0075] 2) -70°C 沉淀 60min，or-2(TC 2h〇
[0076] 3) 13. OOOXg 4°C离心 15min。
[0077] 4)弃上清，用50 μ I冰冷的70% (V/V)乙醇洗涤。
[0078] 5) 13. OOOxg 4°C，离心 5min。
[0079] 6)弃上清，真空4°C干燥。
[0080] 7)用无菌双蒸水重溶探针。
[0081] 1. 6原位杂交检测存档石蜡切片中AFAP1-AS1的表达
[0082] 石蜡切片杂交前处理
[0083] I)4°C保存的石蜡切片置于58°C烤片30min，熔化表面石蜡。
[0084] 2)二甲苯依次脱蜡3 X 5min。
[0085] 3)梯级酒精洗涤，100 %酒精2X2min - 95 %酒精lX5min - 70 %酒精 I X 5min - 50 % 酒精 I X 5min - DEPC 水洗涤 2 X 3min - DEPC-PBS 洗涤 2 X 5min。
[0086] 4)滴加300 μ1胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37°C消化20min。
[0087] 5)切片入PBS (0· IM PBS+2mg/ml谷氨酸）洗涤lmin，中止反应。
[0088] 6)切片入(λ 2N HCL，于37°C反应20-30min，增加组织的通透性。
[0089] 7)切片用4%多聚甲醛（0· IM PBS溶解）后固定10min，室温。
[0090] 8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25%乙酸酐 Buffer I (0· IM 三乙醇胺），室温 IOmin。
[0091] 9)1M PBS 洗涤 2X5min。
[0092] 预杂交和杂交
[0093] 预杂交：-20 °C保存的预杂交液，先置于37 °C孵育60min，预杂交液的用量为 50 μ 1，石蜡膜履盖切片，37 °C湿盒中预杂交2小时。（预杂交液成份包括：2XSSC，10% Dextran sulphate，IX Denhardt? s solution,50mM Phosphate Buffer(PH 7. 0)，50mM DTT, 250 μ 1,100 μ g/ml poly A,5μg/ml poly dA,250 μg/ml yeast t-RNA, 500 μ g/ml ssDNA,47% Deionized formamide) 〇
[0094] I)移去石赌膜，甩掉预杂交液，切片置于2 X SSC中5min。
[0095] 2)杂交反应：37°C杂交过夜（18-20h)。每一切片加入250 μ 1杂交液并用石蜡膜 履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37°C孵育， 使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度 配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其 与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和IOOpmol 30个碱基的裸探针标记反应理论 探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。
[0096] 3)杂交后洗绦，切片浸入2XSSC，10min，揭去石赌膜。依次于摇床上摇动洗绦， 2 X SSC (0. 5% SDS),2X15min ^ 0. 25 X SSC (0. 5% SDS), 2 X 15min〇
[0097] 杂交后显色检测反应
[0098] 1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系 统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。
[0099] 2)切片转至TNT缓冲液中，3 X 5min。
[0100] 3)滴加 TNB 阻断缓冲液，300 μ 1/TMAs，室温，30min。
[0101] 4)吸去多余阻断剂，1:100 稀释的 Anti-Digoxigenin-POD (TBS+0.1 % Triton X-100+1 %阻断剂），室温4小时。
[0102] 5)TNT Buffer(0.1 M Tris-CL，ρΗ7· 5,0· 15M NaCL，0. 05 % Tween 20)洗涤， 3x5min〇
[0103 ] 6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300 μ 1/TMAs，（Biotinyl Tyramid IC存液：Biotinyl Tyramid 溶解于 0· 2ml DMS0，Biotinyl Tyramid 工作液：1 X 稀释液， 1:50 稀释 Biotinyl Tyramid IC存液），室温 10 分钟。
[0104] 7)丁町洗，3\511^11。
[0105] 8)切片滴加 SA-HRP (链霉卵白素-辣根过氧化物酶），300 μ Ι/TMAs，室温30min。
[0106] 9)丁町洗，3\511^11。
[0107] 10)蒸溜水洗涤，I X lmin。
[0108] 11) DAB显色，显微镜下控制显色反应。
[0109] 12)苏木素复染，
[0110] 13)酒精梯级脱水，切片干燥。
[0111] 14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片lmin。
[0112] 1. 7结果判断及标准
[0113] 应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达 信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。
[0114] 再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进 行综合评分，判断标准为：（1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细 胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅 棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。（2)依 据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记O分；b.阳性表达细胞数< 25%，记1分； c. 25%<阳性细胞数< 50%，记2分；d.阳性表达细胞数彡50%，记3分。
[0115] 为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自 进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①〇分者最终计为〇分，认为阴性表达；②1 分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性 表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。
[0116] 1.8分析和统计软件
[0117] 应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用x2test或 Fisher exact test，相关性分析米用Spearmen correlation方法；P <0· 05即差异有统 计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test;多变量分析采用 Cox' s proportional hazards model ;P <0· 05 即差异有统计学意义。
[0118] 2 结果
[0119] 2. I AFAP1-AS1在鼻咽癌中的表达比正常对照组织中的表达显著升高
[0120] AFAP1-AS1在69. 64 %的鼻咽癌组织中（78/112例）有表达，而仅在20 % (10例正 常组织样本中的2例）的正常鼻咽上皮组织中有表达（图2)，两者之间具有明显的统计学 差异（Ρ〈0· 001)。
[0121] 2. 2 AFAP1-AS1高表达的鼻咽癌患者预后较差
[0122] 我们对112例鼻咽癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情 况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对鼻 咽癌组织中AFAP1-AS1的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现AFAP1-AS1 高表达患者平均生存时间明显短于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者（图3)。说明 AFAP1-AS1是一个与鼻咽癌预后相关的分子标记，该IncRNA表达高，病人预后差。
[0123] 实施例3,构建shRNA载体干扰AFAP1-AS1的表达
[0124] 1.材料方法
[0125] I. 1试剂及试剂盒
[0126] 限制性内切酶Hind III、Bgl II、EcoR I及Cla I，T4DNA连接酶等购自TakaRa公 司；
[0127] TRIZ0L? Reagent (Invitrogen);
[0128] 质粒抽提试剂盒（#D6943_01，OMEGA);
[0129] 胶回收试剂盒（#M5212, OMEGA);
[0130] 逆转录试剂盒（#A3500, Promega);
[0131] 抗生素 G418 (Ameresc)。
[0132] I. 2 shRNA 的设计
[0133] 首先将 AFAP1-AS1 序列输入 Invitrogen 公司的 Block-It RNAi designer 软件， 寻找该IncRNA的shRNA最佳祀点，挑选最佳的3条相应的祀点序列如下：
[0134] shRNA-Ι :GCAATTCACTGAGTGGTTACG 如 SEQ NO: 12 所示，
[0135] shRNA-2 :GCTTACTCTCTTGGTGATTCT 如 SEQ NO: 13 所示，
[0136] shRNA-3 :GCAAGACATCCGATGGTATAC 如 SEQ NO: 14 所示，
[0137] 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其 序列如下：
[0138] Scramble :5' -GACACGCGACTTGTACCAC-3' 如 SEQ NO: 15 所示。
[0139] 针对这3条IncRNA祀点序列，及Scramble序列，根据OligoEngine公司pSUPER 载体说明书，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形 成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链。具体需合成的各条 寡核苷酸序列及它们配对退火后形成的DNA双链如下：
[0140] shRNA-Ι ：
[0141] 5, -GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGAATTGC TTTTTA-3' 3' -GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAAAATTCGA-5'如SEQN0:16、17所示，
[0142] shRNA-2 ：
[0143] 5, -GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA-3' 3' -GGG CGAATGAGAGAACCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAAAATTCGA-5'如SEQN0:18、19所示，
[0144] shRNA-3 ：
[0145] 5' -GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA-3' 3' -GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5' 如 SEQ N0:20、21 所示，
[0146] Scramble
[0147] 5, -GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3' 3' -GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5' 如 SEQ N0:22、23 所示。
[0148] 两条互补配对的DNA退火后，左边是限制性内切酶Bgl II的粘性末端，右边是 Hind III的粘性末端。
[0149] 1.3 shRNA 载体构建
[0150] 化学合成上述4个shRNA对应的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20 μ M，互补单链各取10 μ 1混合。然后将oligo混合物在PCR 仪中95°C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段。
[0151] 用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3. Ikb的载体片段，将退火后的 粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质量的比例混合，用T4连接酶，16°C连接 过夜。转化E. coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla I和EcoR I酶 切构建好的pSUPER质粒，2%的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入 了目的片段的阳性克隆，阳性克隆测序验证后用于干扰细胞内AFAP1-AS1的表达。
[0152] 1.4细胞培养与转染
[0153] 鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640 培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。
[0154] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2按2X IO5个细胞/孔接种于 6孔板中，将6孔板置于37°C，5% 0)2培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始 shRNA表达载体的转染；转染过程如下：
[0155] 在无菌EP管中加入3 μ 1的Iipofectamine 2000于100 μ 1无血清培养基中混勾 静置5min ;
[0156] 将构建的shRNA表达载体加入100 μ 1无血清培养基中；然后与上述包含 Iipofectamine的100 μ 1无血清培养基温和混勾，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成 复合体；
[0157] 用D-Hank' s液洗涤细胞3次；
[0158] 将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板 中的1个孔；
[0159] 将6孔板置于CO2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续 培养48小时。
[0160] 1. 5实时定量PCR检测shRNA干扰IncRNA表达的效果：
[0161] 将各种shRNA载体转染后的鼻咽癌细胞抽提总RNA，2yg RNA经逆转录成 cDNA 后，进行实时荧光定量 PCR。AFAP1-AS1 引物为 5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，和 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3'。
[0162] 用于对照的 GAPDH 引物为 5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 和 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' ，
[0163] 实时荧光定量PCR反应体系
[0164] SYBR? Premix Ex TaqTM (2χ ) 10μ1 PCR Forward Primer ( ΙΟμηι) 0.4μΙ PCR Reverse Primer ( ΙΟμηι) 0.4μΙ cDNA 模板 2.0μ1
[0165] ClH2O 7.2μΙ Total 20μΙ
[0166] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0167] 1 94 0C 5 min 2 95 C IOscc 3 58'C 30 see 4 72 °C 20 sec 5 Plate read 6 82 °C 30 sec 7 Plate read 8 Go to step 2 for more 39 limes 9 Perform melting cixrve from 55.0°C to 95.O C, read every 0.2°C, hold for I sec
[0168] 反应结束后确认实时荧光定量 PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根 据 CT值（threshold cycle values)、内参基因（GAPDH)标化后，采用 group t-test 检验计 算P值。
[0169] 2.结果
[0170] 这三个shRNA载体转染鼻咽癌细胞5-8F、HKl和HNE2后，均可显著下调鼻咽癌细 胞中AFAP1-AS1的表达水平（图4)。
[0171] 实施例4,制备荷载shRNA干扰载体的纳米颗粒抑制鼻咽癌细胞中AFAP1-AS1的表 达
[0172] L材料方法
[0173] I. 1制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒
[0174] 多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用OPlO/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行 娃纳米颗粒（silica nanoparticle, SiNP)的合成，并利用娃纳米颗粒的表面能和通过离 子静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒；所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得 到：
[0175] 1)将0P-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯（TEOS)，继续搅 拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80°C干 燥，研细得硅纳米颗粒（SiNP)。其中H 2O与0P-10及H2O与TEOS的摩尔比为2~10、氨水 浓度为1. 6~28%、TEOS在环己烷中的摩尔浓度为0. 1~3mol/L。
[0176] 2)将SiNP按(λ 1~10mg/ml重悬于(λ 6M似0)3溶液中，超声分散，离心，弃上清， 再将沉淀物按0. 1~l〇mg/ml重悬于PBS (pH 7. 4)中，超声分散，加多聚赖氨酸（终浓度 为4~15nmol/mL)，充分混勾，室温混摇；离心，弃上清，沉淀重悬于双蒸水中，得到多聚赖 氨酸修饰的硅纳米颗粒。多聚赖氨酸的终浓度为4~15nmol/mL。
[0177] 3)将改性硅纳米颗粒超声分散，按质量比5~30:1与实施例3中所述的靶向 AFAP1-AS1的RNA干扰载体混合，室温静置使其结合。
[0178] 1.2细胞培养与转染
[0179] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞5-8F、HK2和HNE2按2X IO5个细胞/孔接种于6 孔板中，将6孔板置于37 °C，5 % 0)2培养箱中，待培养细胞生长至50-70 %密度即可开始 AFAP1-AS1真核表达载体的转染；转染过程如下：
[0180] 在无菌EP管中加入100 μ 1制备好的携带AFAP1-AS1真核表达质粒的多聚赖氨酸 修饰的硅纳米颗粒悬液，与100 μ 1无血清培养基温和混匀；用D-Hank' s液洗涤细胞3次； 将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板中的1个 孔；将6孔板置于CO2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过 夜。用携带Scramble序列的多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒作为实验对照。
[0181] 1.3细胞穿膜实验
[0182] 细胞穿膜（(transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小 室（孔径8 μπι)及基质胶（Matrigel)购自美国BD公司，4%多聚甲醛固定液、结晶紫染液 (0· 1 % g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的 上室面，置37°C 30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水 化。
[0183] 在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和I X IO5个转染了 AFAPl-ASlshRNA干扰载体或对照载体（scramble)的鼻咽癌细胞，在Transwell小室下层加 入含20%胎牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4%多聚甲醛固定液固定，结晶 紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迀移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的 鼻咽癌细胞。
[0184] 1.4细胞划痕实验
[0185] 细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迀移能力的实验方法。转染了 AFAP1-AS1 shRNA 干扰载体或对照载体（scramble)的鼻咽癌细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90%时，用 200ul pipet在每个6孔板中划一条直线（划痕），随后在0、8、12、16、24、32、48小时等各 个时间点（视不同细胞迀移能力而定）在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细 胞迀移速度。
[0186] 2.结果
[0187] 2. 1在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1后，细胞侵袭能力 降低
[0188] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向 AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低（图5)。
[0189] 2. 2在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞迀移 能力降低
[0190] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向AFAP1-AS1的 干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移的速度减慢， 划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低（图6)。
[0191] 实施例5,裸鼠转移瘤模型证实抑制AFAP1-AS1的表达可以抑制鼻咽癌细胞的转 移能力
[0192] 1.材料与方法
[0193] 16只雄性BALB/C裸鼠，4周龄，重量为19±2g，购买于上海斯莱克实验动物有限 公司。所有裸鼠均质检合格，在中南大学实验动物部于无特定病原体（SPF)条件下饲养。 AFAP1-AS1干扰载体构建及多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒的制备、细胞培养与转染等同实 施例4。转染AFAP1-AS1干扰载体或scramble载体（NC)的5-8F细胞各取I X IO6个，经尾 静脉注入裸鼠体内（8只每组），10周后处死裸鼠，观察鼻咽癌细胞的转移情况（主要转移 到裸鼠肺中）。
[0194] 2.结果
[0195] 动物实验进一步证实干扰AFAP1-AS1的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力（图 7)。与对照组（NC)相比，敲低AFAP1-AS1的5-8F细胞肺转移灶的数目（图7A-C，P〈0. 05) 变少，转移灶的体积变小（图7D)，表明鼻咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【主权项】
1.长链非编码RNA AFAP1-AS1的应用方法，其特征在于，用于制备鼻咽癌辅助诊断或 者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预 测的制剂为原位杂交检测试剂。3. 根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针， 序列如下： AFAP1-AS1探针1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' AFAP1-AS1探针2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3， AFAP1-AS1探针3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'。4. 根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。5. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于， 试剂盒中含有用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针： AFAP1-AS1探针1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' AFAP1-AS1探针2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3， AFAP1-AS1探针3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'， 试剂盒中还含有阳性对照探针， GAPDH探针I :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH探针2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3， GAPDH探针3 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3, 〇6. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于， 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、DAB染色试剂； 其它常规生物化学试剂，包括20xSSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脱氧腺苷酸，变性剪切的蛙精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts'ssolution， PBSbuffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄缓冲液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻断试剂； TNT缓冲液：pH7. 5的0? IM Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。7. 用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂的寡核苷酸探针，序列 如下： AFAP1-AS1探针1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' AFAP1-AS1探针2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3， AFAP1-AS1探针3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'。8. 用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂，是包含有权利要求7所述 的寡核苷酸探针的试剂盒。9. 根据权利要求8所述的原位杂交检测试剂，其特征在于，试剂盒中还含有阳性对照 探针： GAPDH探针I :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH探针2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3， GAPDH探针3 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3, 〇10.根据权利要求8或9所述的原位杂交检测试剂，其特征在于， 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、DAB染色试剂； 其它常规生物化学试剂，包括20xSSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脱氧腺苷酸，变性剪切的蛙精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts'ssolution， PBSbuffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄缓冲液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻断试剂； TNT缓冲液：pH7. 5的0? IM Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。
【专利摘要】本发明公开了一种长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂交探针、试剂及其应用。该长链非编码RNA可以用于制备鼻咽癌患者的预后制剂，特别是制备出原位杂交检测法预测鼻咽癌患者预后的试剂盒。通过研究证实AFAP1-AS1在鼻咽癌组织中表达上调，高表达AFAP1-AS1的鼻咽癌患者比低表达AFAP1-AS1的鼻咽癌患者预后差，因此，将AFAP1-AS1的表达用于鼻咽癌患者的预后预测，可以为鼻咽癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/113, C12N15/11
【公开号】CN104894128
【申请号】CN201510239144
【发明人】曾朝阳, 孛昊, 李桂源, 熊炜, 李小玲, 李夏雨, 龚朝建, 曾勇, 张文玲, 石磊, 连瑜, 荆益州
【申请人】中南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂 交探针、检测试剂及其应用方法。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENC0DE)研宄成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序 列的1-3%，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中 IncRNA序列的比例也相应地增大，提示IncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着IncRNA 不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现IncRNA广泛而活跃地参与到生命活动 不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研宄领域新的前沿 与热点。
[0003] LncRNA可作为功能蛋白质的信号（signal)、诱导（guide)、诱馆（decoy)或支架 (scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基 因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一 起。因此，深入研宄IncRNA的功能，揭示由IncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网 络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现 生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的 发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。
[0004] 鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研 宄表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在鼻咽 癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们利用IncRNA芯片，构建了鼻咽 癌活检组织及正常对照样品中IncRNA的表达谱，从中筛选了一些在鼻咽癌中差异表达的 IncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number:NR_026892)在鼻咽癌中表达显著上调，且AFAP1-AS1的表达水平与鼻咽癌的淋巴 结转移及临床分期密切相关，针对该IncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的辅助诊断。 随后，我们进一步增加样本，在112例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位 杂交（in situ hybridization)的方法检测了 AFAP1-AS1的表达水平，发现AFAP1-AS1表 达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该IncRNA表达低的患者，因此针对该IncRNA 的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判断。
[0005] 我们通过设计并合成革E向AFAP1-AS1的短发夹RNA (short-hairpin RNA, shRNAs) 序列，构建了靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和 裸鼠转移瘤体内模型中均证实靶向干扰AFAP1-AS1的表达可明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭 与转移能力。将AFAP1-AS1的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳 米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护AFAP1-AS1的RNA干扰载体免受核酸 酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂交探针、试剂及其应用 方法，利用长链非编码RNA AFAP1-AS1序列可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的 制剂。
[0007] LncRNA AFAP1-AS1的应用方法，用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂， 该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所示。
[0008] 所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。
[0009] 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸 探针，序列如下：
[0010] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' 如 SEQ N0:2 所示，
[0011] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3' 如 SEQ N0:3 所示，
[0012] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3' 如 SEQ N0:4 所示。
[0013] 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
[0014] 试剂盒中含有上述用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针：
[0015] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'
[0016] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3，
[0017] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'，
[0018] 阳性对照探针（检测看豕基因 GAPDH):
[0019] GAPDH 探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，如 SEQ NO: 5 所示，
[0020] GAPDH 探针 2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'，如 SEQ NO: 6 所示，
[0021] GAPDH 探针 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'，如 SEQ NO: 7 所示。
[0022] 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物 检测试剂、DAB染色试剂；
[0023] 其它常规生物化学试剂，包括20x柠檬酸钠缓冲溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去离子甲酰胺（Deionized Formamide)， 多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸（polydeoxyadenylic acid， Poly dA)，变性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)， 酵母转运 RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇（DTT)，50x 邓罕氏缓冲液（Denhardts' s solution)，磷酸缓冲液（PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白（BSA)，三乙醇胺 (TEA)，醋酸酐，阻断试剂（Blocking reagent agent)，TNB 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 5 % 阻断试剂），TNT 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 05% Tween 20) 〇
[0024] 我们通过原位杂交在鼻咽癌和正常鼻咽上皮存档石蜡组织标本中发现AFAP1-AS1 在鼻咽癌中表达显著上调，且AFAP1-AS1的表达与预后密切相关，AFAP1-AS1表达高的患者 生存时间更短，提示AFAP1-AS1可作为鼻咽癌预后预测的分子标志。本发明为鼻咽癌的辅 助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应 用前景。
【附图说明】
[0025] 图1为实时荧光定量PCR技术验证IncRNA AFAP1-AS1在鼻咽癌和正常鼻咽上皮 中的表达情况；
[0026] AFAP1-AS1在鼻咽癌（NPC)中的表达比正常鼻咽上皮（Normal)中显著提高，且与 淋巴结转移（左）及临床分期（右）密切相关，AFAP1-AS1的表达在有淋巴结转移的鼻咽 癌组织（NPC_Nl/2)中比没有淋巴结转移（NPC_N0)的更高（左图），AFAP1-AS1的表达也随 鼻咽癌患者临床分期逐渐增高（右图，I、II、III分别代表临床I、II、III期）。
[0027] 图2为原位杂交检测AFAP1-AS1在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；
[0028] 正常鼻咽上皮（NPE)中表达水平较低（仅在2例正常鼻咽上皮组织中检测到有低 表达，其余8例中检测不到表达），而在69. 64%的鼻咽癌（112例鼻咽癌组织中的78例） 中检测到有AFAP1-AS1的表达，其中55例为低表达（NPC_Low)，23例为高表达（NPC_High)， 其余的34例鼻咽癌组织中未检测到AFAP1-AS1的表达（NPC_negative) ;P〈0. 001。
[0029] 图3为鼻咽癌中AFAP1-AS1的表达与鼻咽癌患者预后的关系
[0030] 鼻咽癌中AFAP1-AS1的高表达与鼻咽癌患者的不良预后相关，即AFAP1-AS1高 表达的患者总的生存时间（Over-all survival，左）和无复发生存时间（Relapse-free sruvival，右）要明显低于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者。
[0031] 图4为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体，可显著抑制AFAP1-AS1在鼻 咽癌细胞中的表达
[0032] 在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中导入靶向AFAP1-AS1的干扰载体（sh-1， sh-2, sh-3)后，实时荧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中AFAP1-AS1的表达情况， AFAP1-AS1的表达均受到明显的抑制。阴性对照（NC)为scramble干扰载体，Mock为未经 任何处理的鼻咽癌细胞。
[0033] 图5为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞 侵袭能力降低
[0034] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向 AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低。
[0035] 图6为在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞 迀移能力降低
[0036] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向AFAP1-AS1的 干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移速度明显减 慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低。
[0037] 图7.动物实验进一步证实干扰AFAP1-AS1的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力
[0038] 在鼻咽癌细胞5-8F中转入shRNA干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，经尾静脉 将鼻咽癌细胞注射到裸鼠体内，观察肺转移情况，发现与对照组（NC)相比，shRNA敲低 AFAP1-AS1表达的5-8F细胞肺转移灶的数目变少（图7A-C，P〈0. 05)，转移灶的体积变小 (图7D)，表明鼻咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【具体实施方式】
[0039] 以下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0040] 实施例1，实时荧光定量PCR法检测证实AFAP1-AS1在鼻咽癌中表达上调
[0041] 1.材料与方法：
[0042] 收集10例正常鼻咽上皮组织和31例鼻咽癌组织，抽提总RNA，2 μ g RNA经逆转录 成cDNA后，进行实 时荧光定量PCR。AFAP-ASl正向引物为5' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3' 如 SEQ N0:8 所示，和反向引物 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3' 如 SEQ N0:9 所示。
[0043] 用于对照的 GAPDH 正向引物为 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'如 SEQ NO: 10 所示， 和反向引物5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，如SEQ N0:11所示，实时荧光定量PCR反应体 系
[0044] SYBR? Prcmix Ex Taqi vi (2χ) 10μ1 PCR Forward Primer ( 1 Ομηι) 0·4μΙ PCR Reverse Primer ( ΙΟμηι) 0.4μ1 cDNA 模板 2.0μ1 dH20 7.2μΙ Total 20μΙ
[0045] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0046] 1 94 C 5 nun 2 95'C IOscc 3 58°C 30 see 4 72 °C 20 see 5 Plate read 6 82°C 30 see
[0047] 7 Plate read 8 Go to step 2 for more 39 limes 9 Perform melting curve from 55.O C Io 95.O C , read every 0.2 C , hold for I see
[0048] 反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根 据 CT值（threshold cycle values)、内参基因（GAPDH)标化后，采用 group t-test 检验计 算P值。2.结果
[0049] AFAP1-AS1在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在鼻咽癌组织中高表达 Ρ〈0· 001(图 1)
[0050] 实施例2,原位杂交检测发现AFAP1-AS1在鼻咽癌中的表达与患者预后相关
[0051] 1.材料方法
[0052] I. 1设计并合成杂交探针
[0053] 为了采用原位杂交方法检测AFAP1-AS1的表达情况，我们设计了针对原位杂交检 测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各3条。
[0054] 用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针：
[0055] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'
[0056] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3，
[0057] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'
[0058] 阳性对照探针（检测看家基因 GAPDH):
[0059] GAPDH 探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'
[0060] GAPDH 探针 2 :5, -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3，
[0061] GAPDH 探针 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'
[0062] 采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。
[0063] 1. 2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂
[0064] 地高辛寡核苷酸加尾试剂（Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation， Roche公司），抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒（Anti-Digoxigenin-POD， Fab fragments，Roche公司），增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统（TSA? Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司），DAB染色试剂盒（北京中山公司），20x朽 1檬 酸钠缓冲溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去离子 甲酰胺（Deionized Formamide)，多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺 苷酸（polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的娃精 DNA (denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运 RNA (yeast t_RNA，tRNA)，二硫苏糖醇（DTT)，50x 邓 罕氏缓冲液（Denhardts's solution)，磷酸缓冲液（PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋 白（BSA)，三乙醇胺（TEA)，TNB Buffer(0.1 M Tris-HCl，pH7. 5,0· 15Μ NaCL，0. 5%Blocking Reagent)，TNT Buffer(0· IM Tris-HCl，ρΗ7· 5,0· 15M NaCL，0.05% Tween 20)，醋酸酐，阻 断试剂（Blocking reagent agent，Roche 公司）。
[0065] I. 3其他主要试剂和材料
[0066] 无水乙醇、90%酒精、70%酒精、50%酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液（pH7. 2~ 7. 4, NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L，Na2HP044. 3mmol/L，KH2PO4L 4mmol/L) ;3 % 甲 醇-双氧水溶液（80%甲醇和30%双氧水配置）；0.0 lmol/L梓檬酸盐缓冲液（citrate buffer, CB，pH6. 0±0. l，9ml 0.1 M柠檬酸溶液和41ml 0.1 M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏 水中临时配置后再校正工作液pH值）；0. 1%胰蛋白酶；苏木素；1%盐酸酒精（1ml浓盐酸 +99ml 70%酒精配置）；封片胶（PTS Cure Mount II );专用盖玻片（480X240mm2)定制于 郑州玻璃仪器厂。Leica低熔点（58°C)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10%中性多聚 甲醛（0.0 lmol/L，pH7. 4, DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制），苏木素，伊红，中性封片树胶，盖 玻片，载玻片。
[0067] 1. 4标记探针
[0068] 利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如 下。
[0069] IOOpmol oligonucleotide+ddH20 = 9 μ I (control:control oligonucleutide 5 μ l+ddH20 4 μ I)
[0070] Reaction buffer 4μ1 Cocb 4μ1 Dig-dUTP ΙμL dATP ΙμL Terminal transferase ΙμL
[0071] 混匀，稍离心。37°C水浴反应30min，加2μ1 EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。
[0072] 1. 5寡核苷酸探针标记后纯化
[0073] 为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：
[0074] 1)探针反应混合物（22以1)+2.5以14]\11^0^75 4 1100%冷乙醇（-20°〇·
[0075] 2) -70°C 沉淀 60min，or-2(TC 2h〇
[0076] 3) 13. OOOXg 4°C离心 15min。
[0077] 4)弃上清，用50 μ I冰冷的70% (V/V)乙醇洗涤。
[0078] 5) 13. OOOxg 4°C，离心 5min。
[0079] 6)弃上清，真空4°C干燥。
[0080] 7)用无菌双蒸水重溶探针。
[0081] 1. 6原位杂交检测存档石蜡切片中AFAP1-AS1的表达
[0082] 石蜡切片杂交前处理
[0083] I)4°C保存的石蜡切片置于58°C烤片30min，熔化表面石蜡。
[0084] 2)二甲苯依次脱蜡3 X 5min。
[0085] 3)梯级酒精洗涤，100 %酒精2X2min - 95 %酒精lX5min - 70 %酒精 I X 5min - 50 % 酒精 I X 5min - DEPC 水洗涤 2 X 3min - DEPC-PBS 洗涤 2 X 5min。
[0086] 4)滴加300 μ1胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37°C消化20min。
[0087] 5)切片入PBS (0· IM PBS+2mg/ml谷氨酸）洗涤lmin，中止反应。
[0088] 6)切片入(λ 2N HCL，于37°C反应20-30min，增加组织的通透性。
[0089] 7)切片用4%多聚甲醛（0· IM PBS溶解）后固定10min，室温。
[0090] 8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25%乙酸酐 Buffer I (0· IM 三乙醇胺），室温 IOmin。
[0091] 9)1M PBS 洗涤 2X5min。
[0092] 预杂交和杂交
[0093] 预杂交：-20 °C保存的预杂交液，先置于37 °C孵育60min，预杂交液的用量为 50 μ 1，石蜡膜履盖切片，37 °C湿盒中预杂交2小时。（预杂交液成份包括：2XSSC，10% Dextran sulphate，IX Denhardt? s solution,50mM Phosphate Buffer(PH 7. 0)，50mM DTT, 250 μ 1,100 μ g/ml poly A,5μg/ml poly dA,250 μg/ml yeast t-RNA, 500 μ g/ml ssDNA,47% Deionized formamide) 〇
[0094] I)移去石赌膜，甩掉预杂交液，切片置于2 X SSC中5min。
[0095] 2)杂交反应：37°C杂交过夜（18-20h)。每一切片加入250 μ 1杂交液并用石蜡膜 履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37°C孵育， 使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度 配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其 与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和IOOpmol 30个碱基的裸探针标记反应理论 探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。
[0096] 3)杂交后洗绦，切片浸入2XSSC，10min，揭去石赌膜。依次于摇床上摇动洗绦， 2 X SSC (0. 5% SDS),2X15min ^ 0. 25 X SSC (0. 5% SDS), 2 X 15min〇
[0097] 杂交后显色检测反应
[0098] 1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系 统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。
[0099] 2)切片转至TNT缓冲液中，3 X 5min。
[0100] 3)滴加 TNB 阻断缓冲液，300 μ 1/TMAs，室温，30min。
[0101] 4)吸去多余阻断剂，1:100 稀释的 Anti-Digoxigenin-POD (TBS+0.1 % Triton X-100+1 %阻断剂），室温4小时。
[0102] 5)TNT Buffer(0.1 M Tris-CL，ρΗ7· 5,0· 15M NaCL，0. 05 % Tween 20)洗涤， 3x5min〇
[0103 ] 6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300 μ 1/TMAs，（Biotinyl Tyramid IC存液：Biotinyl Tyramid 溶解于 0· 2ml DMS0，Biotinyl Tyramid 工作液：1 X 稀释液， 1:50 稀释 Biotinyl Tyramid IC存液），室温 10 分钟。
[0104] 7)丁町洗，3\511^11。
[0105] 8)切片滴加 SA-HRP (链霉卵白素-辣根过氧化物酶），300 μ Ι/TMAs，室温30min。
[0106] 9)丁町洗，3\511^11。
[0107] 10)蒸溜水洗涤，I X lmin。
[0108] 11) DAB显色，显微镜下控制显色反应。
[0109] 12)苏木素复染，
[0110] 13)酒精梯级脱水，切片干燥。
[0111] 14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片lmin。
[0112] 1. 7结果判断及标准
[0113] 应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达 信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。
[0114] 再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进 行综合评分，判断标准为：（1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细 胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅 棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。（2)依 据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记O分；b.阳性表达细胞数< 25%，记1分； c. 25%<阳性细胞数< 50%，记2分；d.阳性表达细胞数彡50%，记3分。
[0115] 为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自 进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①〇分者最终计为〇分，认为阴性表达；②1 分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性 表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。
[0116] 1.8分析和统计软件
[0117] 应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用x2test或 Fisher exact test，相关性分析米用Spearmen correlation方法；P <0· 05即差异有统 计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test;多变量分析采用 Cox' s proportional hazards model ;P <0· 05 即差异有统计学意义。
[0118] 2 结果
[0119] 2. I AFAP1-AS1在鼻咽癌中的表达比正常对照组织中的表达显著升高
[0120] AFAP1-AS1在69. 64 %的鼻咽癌组织中（78/112例）有表达，而仅在20 % (10例正 常组织样本中的2例）的正常鼻咽上皮组织中有表达（图2)，两者之间具有明显的统计学 差异（Ρ〈0· 001)。
[0121] 2. 2 AFAP1-AS1高表达的鼻咽癌患者预后较差
[0122] 我们对112例鼻咽癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情 况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对鼻 咽癌组织中AFAP1-AS1的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现AFAP1-AS1 高表达患者平均生存时间明显短于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者（图3)。说明 AFAP1-AS1是一个与鼻咽癌预后相关的分子标记，该IncRNA表达高，病人预后差。
[0123] 实施例3,构建shRNA载体干扰AFAP1-AS1的表达
[0124] 1.材料方法
[0125] I. 1试剂及试剂盒
[0126] 限制性内切酶Hind III、Bgl II、EcoR I及Cla I，T4DNA连接酶等购自TakaRa公 司；
[0127] TRIZ0L? Reagent (Invitrogen);
[0128] 质粒抽提试剂盒（#D6943_01，OMEGA);
[0129] 胶回收试剂盒（#M5212, OMEGA);
[0130] 逆转录试剂盒（#A3500, Promega);
[0131] 抗生素 G418 (Ameresc)。
[0132] I. 2 shRNA 的设计
[0133] 首先将 AFAP1-AS1 序列输入 Invitrogen 公司的 Block-It RNAi designer 软件， 寻找该IncRNA的shRNA最佳祀点，挑选最佳的3条相应的祀点序列如下：
[0134] shRNA-Ι :GCAATTCACTGAGTGGTTACG 如 SEQ NO: 12 所示，
[0135] shRNA-2 :GCTTACTCTCTTGGTGATTCT 如 SEQ NO: 13 所示，
[0136] shRNA-3 :GCAAGACATCCGATGGTATAC 如 SEQ NO: 14 所示，
[0137] 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其 序列如下：
[0138] Scramble :5' -GACACGCGACTTGTACCAC-3' 如 SEQ NO: 15 所示。
[0139] 针对这3条IncRNA祀点序列，及Scramble序列，根据OligoEngine公司pSUPER 载体说明书，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形 成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链。具体需合成的各条 寡核苷酸序列及它们配对退火后形成的DNA双链如下：
[0140] shRNA-Ι ：
[0141] 5, -GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGAATTGC TTTTTA-3' 3' -GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAAAATTCGA-5'如SEQN0:16、17所示，
[0142] shRNA-2 ：
[0143] 5, -GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA-3' 3' -GGG CGAATGAGAGAACCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAAAATTCGA-5'如SEQN0:18、19所示，
[0144] shRNA-3 ：
[0145] 5' -GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA-3' 3' -GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5' 如 SEQ N0:20、21 所示，
[0146] Scramble
[0147] 5, -GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3' 3' -GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5' 如 SEQ N0:22、23 所示。
[0148] 两条互补配对的DNA退火后，左边是限制性内切酶Bgl II的粘性末端，右边是 Hind III的粘性末端。
[0149] 1.3 shRNA 载体构建
[0150] 化学合成上述4个shRNA对应的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20 μ M，互补单链各取10 μ 1混合。然后将oligo混合物在PCR 仪中95°C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段。
[0151] 用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3. Ikb的载体片段，将退火后的 粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质量的比例混合，用T4连接酶，16°C连接 过夜。转化E. coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla I和EcoR I酶 切构建好的pSUPER质粒，2%的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入 了目的片段的阳性克隆，阳性克隆测序验证后用于干扰细胞内AFAP1-AS1的表达。
[0152] 1.4细胞培养与转染
[0153] 鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640 培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。
[0154] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2按2X IO5个细胞/孔接种于 6孔板中，将6孔板置于37°C，5% 0)2培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始 shRNA表达载体的转染；转染过程如下：
[0155] 在无菌EP管中加入3 μ 1的Iipofectamine 2000于100 μ 1无血清培养基中混勾 静置5min ;
[0156] 将构建的shRNA表达载体加入100 μ 1无血清培养基中；然后与上述包含 Iipofectamine的100 μ 1无血清培养基温和混勾，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成 复合体；
[0157] 用D-Hank' s液洗涤细胞3次；
[0158] 将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板 中的1个孔；
[0159] 将6孔板置于CO2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续 培养48小时。
[0160] 1. 5实时定量PCR检测shRNA干扰IncRNA表达的效果：
[0161] 将各种shRNA载体转染后的鼻咽癌细胞抽提总RNA，2yg RNA经逆转录成 cDNA 后，进行实时荧光定量 PCR。AFAP1-AS1 引物为 5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，和 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3'。
[0162] 用于对照的 GAPDH 引物为 5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 和 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' ，
[0163] 实时荧光定量PCR反应体系
[0164] SYBR? Premix Ex TaqTM (2χ ) 10μ1 PCR Forward Primer ( ΙΟμηι) 0.4μΙ PCR Reverse Primer ( ΙΟμηι) 0.4μΙ cDNA 模板 2.0μ1
[0165] ClH2O 7.2μΙ Total 20μΙ
[0166] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0167] 1 94 0C 5 min 2 95 C IOscc 3 58'C 30 see 4 72 °C 20 sec 5 Plate read 6 82 °C 30 sec 7 Plate read 8 Go to step 2 for more 39 limes 9 Perform melting cixrve from 55.0°C to 95.O C, read every 0.2°C, hold for I sec
[0168] 反应结束后确认实时荧光定量 PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根 据 CT值（threshold cycle values)、内参基因（GAPDH)标化后，采用 group t-test 检验计 算P值。
[0169] 2.结果
[0170] 这三个shRNA载体转染鼻咽癌细胞5-8F、HKl和HNE2后，均可显著下调鼻咽癌细 胞中AFAP1-AS1的表达水平（图4)。
[0171] 实施例4,制备荷载shRNA干扰载体的纳米颗粒抑制鼻咽癌细胞中AFAP1-AS1的表 达
[0172] L材料方法
[0173] I. 1制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒
[0174] 多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用OPlO/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行 娃纳米颗粒（silica nanoparticle, SiNP)的合成，并利用娃纳米颗粒的表面能和通过离 子静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒；所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得 到：
[0175] 1)将0P-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯（TEOS)，继续搅 拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80°C干 燥，研细得硅纳米颗粒（SiNP)。其中H 2O与0P-10及H2O与TEOS的摩尔比为2~10、氨水 浓度为1. 6~28%、TEOS在环己烷中的摩尔浓度为0. 1~3mol/L。
[0176] 2)将SiNP按(λ 1~10mg/ml重悬于(λ 6M似0)3溶液中，超声分散，离心，弃上清， 再将沉淀物按0. 1~l〇mg/ml重悬于PBS (pH 7. 4)中，超声分散，加多聚赖氨酸（终浓度 为4~15nmol/mL)，充分混勾，室温混摇；离心，弃上清，沉淀重悬于双蒸水中，得到多聚赖 氨酸修饰的硅纳米颗粒。多聚赖氨酸的终浓度为4~15nmol/mL。
[0177] 3)将改性硅纳米颗粒超声分散，按质量比5~30:1与实施例3中所述的靶向 AFAP1-AS1的RNA干扰载体混合，室温静置使其结合。
[0178] 1.2细胞培养与转染
[0179] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞5-8F、HK2和HNE2按2X IO5个细胞/孔接种于6 孔板中，将6孔板置于37 °C，5 % 0)2培养箱中，待培养细胞生长至50-70 %密度即可开始 AFAP1-AS1真核表达载体的转染；转染过程如下：
[0180] 在无菌EP管中加入100 μ 1制备好的携带AFAP1-AS1真核表达质粒的多聚赖氨酸 修饰的硅纳米颗粒悬液，与100 μ 1无血清培养基温和混匀；用D-Hank' s液洗涤细胞3次； 将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板中的1个 孔；将6孔板置于CO2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过 夜。用携带Scramble序列的多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒作为实验对照。
[0181] 1.3细胞穿膜实验
[0182] 细胞穿膜（(transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小 室（孔径8 μπι)及基质胶（Matrigel)购自美国BD公司，4%多聚甲醛固定液、结晶紫染液 (0· 1 % g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的 上室面，置37°C 30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水 化。
[0183] 在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和I X IO5个转染了 AFAPl-ASlshRNA干扰载体或对照载体（scramble)的鼻咽癌细胞，在Transwell小室下层加 入含20%胎牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4%多聚甲醛固定液固定，结晶 紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迀移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的 鼻咽癌细胞。
[0184] 1.4细胞划痕实验
[0185] 细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迀移能力的实验方法。转染了 AFAP1-AS1 shRNA 干扰载体或对照载体（scramble)的鼻咽癌细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90%时，用 200ul pipet在每个6孔板中划一条直线（划痕），随后在0、8、12、16、24、32、48小时等各 个时间点（视不同细胞迀移能力而定）在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细 胞迀移速度。
[0186] 2.结果
[0187] 2. 1在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1后，细胞侵袭能力 降低
[0188] 细胞穿膜（transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向 AFAP1-AS1的干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著 减少，表明细胞侵袭能力降低（图5)。
[0189] 2. 2在鼻咽癌细胞中导入AFAP1-AS1的干扰载体抑制AFAP1-AS1表达后，细胞迀移 能力降低
[0190] 细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2中转入靶向AFAP1-AS1的 干扰载体，抑制AFAP1-AS1的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迀移的速度减慢， 划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迀移能力降低（图6)。
[0191] 实施例5,裸鼠转移瘤模型证实抑制AFAP1-AS1的表达可以抑制鼻咽癌细胞的转 移能力
[0192] 1.材料与方法
[0193] 16只雄性BALB/C裸鼠，4周龄，重量为19±2g，购买于上海斯莱克实验动物有限 公司。所有裸鼠均质检合格，在中南大学实验动物部于无特定病原体（SPF)条件下饲养。 AFAP1-AS1干扰载体构建及多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒的制备、细胞培养与转染等同实 施例4。转染AFAP1-AS1干扰载体或scramble载体（NC)的5-8F细胞各取I X IO6个，经尾 静脉注入裸鼠体内（8只每组），10周后处死裸鼠，观察鼻咽癌细胞的转移情况（主要转移 到裸鼠肺中）。
[0194] 2.结果
[0195] 动物实验进一步证实干扰AFAP1-AS1的表达可抑制鼻咽癌细胞的转移能力（图 7)。与对照组（NC)相比，敲低AFAP1-AS1的5-8F细胞肺转移灶的数目（图7A-C，P〈0. 05) 变少，转移灶的体积变小（图7D)，表明鼻咽癌细胞的转移能力受到明显抑制。
【主权项】
1.长链非编码RNA AFAP1-AS1的应用方法，其特征在于，用于制备鼻咽癌辅助诊断或 者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预 测的制剂为原位杂交检测试剂。3. 根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针， 序列如下： AFAP1-AS1探针1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' AFAP1-AS1探针2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3， AFAP1-AS1探针3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'。4. 根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。5. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于， 试剂盒中含有用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针： AFAP1-AS1探针1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' AFAP1-AS1探针2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3， AFAP1-AS1探针3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'， 试剂盒中还含有阳性对照探针， GAPDH探针I :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH探针2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3， GAPDH探针3 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3, 〇6. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于， 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、DAB染色试剂； 其它常规生物化学试剂，包括20xSSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脱氧腺苷酸，变性剪切的蛙精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts'ssolution， PBSbuffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄缓冲液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻断试剂； TNT缓冲液：pH7. 5的0? IM Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。7. 用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂的寡核苷酸探针，序列 如下： AFAP1-AS1探针1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3' AFAP1-AS1探针2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3， AFAP1-AS1探针3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'。8. 用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂，是包含有权利要求7所述 的寡核苷酸探针的试剂盒。9. 根据权利要求8所述的原位杂交检测试剂，其特征在于，试剂盒中还含有阳性对照 探针： GAPDH探针I :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH探针2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3， GAPDH探针3 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3, 〇10.根据权利要求8或9所述的原位杂交检测试剂，其特征在于， 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、DAB染色试剂； 其它常规生物化学试剂，包括20xSSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脱氧腺苷酸，变性剪切的蛙精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts'ssolution， PBSbuffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄缓冲液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻断试剂； TNT缓冲液：pH7. 5的0? IM Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。
【专利摘要】本发明公开了一种长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂交探针、试剂及其应用。该长链非编码RNA可以用于制备鼻咽癌患者的预后制剂，特别是制备出原位杂交检测法预测鼻咽癌患者预后的试剂盒。通过研究证实AFAP1-AS1在鼻咽癌组织中表达上调，高表达AFAP1-AS1的鼻咽癌患者比低表达AFAP1-AS1的鼻咽癌患者预后差，因此，将AFAP1-AS1的表达用于鼻咽癌患者的预后预测，可以为鼻咽癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/113, C12N15/11
【公开号】CN104894128
【申请号】CN201510239144
【发明人】曾朝阳, 孛昊, 李桂源, 熊炜, 李小玲, 李夏雨, 龚朝建, 曾勇, 张文玲, 石磊, 连瑜, 荆益州
【申请人】中南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
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