一种花生AhLEC1B组成型启动子的克隆和应用
一种花生AhLEC1B组成型启动子的克隆和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的 来源于花生AhLEClB基因的组成型启动子的克隆和应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板 DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子决定着转录的方向和转录的效率，同时 对所使用的RNA聚合酶类型也起着决定性作用，是理解基因表达和转录调控机制的关键， 是植物基因转录调控的中心。按作用方式和功能，可将启动子分为组成型启动子、组织特异 型启动子和诱导型启动子。目前在植物基因工程研宄中，组成型启动子的应用最早、最为广 泛。在转基因育种或用于研宄基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能一般都 使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。
[0003] 在双子叶转基因植物中使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒的CaMV35S 启动子。单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和水稻的ActinI启动 子，另外还有来自章鱼碱合成酶基因 Ocs启动子和根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱 合成酶基因 Nos启动子。有研宄表明内源型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效稳定 表达中比外源启动子更具有优势。此外在植物基因工程中应用从病毒中克隆出来的启动子 序列，可能存在潜在的生物不安全性。并且，重复使用同一种组成型启动子驱动两个或两个 以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或共抑制现象。因此，寻找双子叶植物组成型启 动子，对于双子叶植物的遗传改良具有重要应用价值。
[0004] 近年来，国内外多个实验室开展了花生抗逆和籽粒储藏物质积累相关基因启动 子的克隆与研宄，旨在充分了解基因的表达调控特征，为作物遗传改良提供依据。花生籽 粒中多个主要储藏蛋白一过敏原Arahl、2、3和6基因的启动子已被克隆和鉴定（Viquez 等，2003 ;2004 ;Zhong 等，2006 ;Bhattacharya 等，2012)，花生 Arah2 启动子驱动 GUS 在种 胚中特异表达，且强度高于35S启动子，而在种皮中基本无表达；花生Arah 6启动子驱动 ⑶S在子叶中表达，而在真叶中表达较弱。花生油体蛋白基因 Ah01eol7.8、Ah01eol8. 5启动 子（Li et al.，2009)和脂肪酸合成与油脂积累相关的基因如AhDGAT3(唐桂英等，2013)、 AhACP (单雷等，2014)启动子，也相继获得克隆与分析。干旱胁迫下花生中调控脱落酸生物 合成的AhNCEDl基因启动子（梁建华等，2007)、抵御外来病害相关的ARAhPRlO基因启动子 (温世杰等，2012)也已被克隆研宄。
【发明内容】
[0005] 基于上述现有技术，本发明的发明人经过深入研宄，从花生中克隆获得了一个新 的组成型启动子，该启动子来源于花生AhLEClB基因，该启动子核苷酸序列如Seq ID No: 1 所示，包括5'端非翻译区52bp和其上游66bp区段，具有高效驱动功能。本发明构建了 该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，自起始密码 起-32~-149调控区的启动子驱动的⑶S基因在转基因植株的根、茎、叶、花、种胚中均能 高效表达，且驱动效率与CaMV35S近似。
[0006] 该启动子是在通过染色体步移技术获得AhLEClB基因 Y端上游1289bp序列 (其核苷酸序列如Seq ID N〇:2所示）的基础上，设计特异引物进行扩增得到的IlSbp AhLEClB基因 Y端上游序列，其核苷酸序列如Seq ID No: 1所示。经转录起始位点分析发 现，花生AhLEClB基因转录起始位点位于翻译起始密码ATG上游-83nt处，通过PlantCARE 和PLACE软件对该118bp AhLEClB基因启动子进行顺式调控元件分析，该序列除包含启 动子中心元件TATA BOX、增强启动子活性的CCAAT BOX，还包含叶肉表达调控元件CACTFT PPCAl (YACT)、花粉中表达调控元件GTGA Motif (GTGA)，另外，还包含植物特有的碳代谢相 关的Dof蛋白结合位点DOF CORE、细胞分裂素响应调控元件ARRlAT(NGATT)及光响应调控 元件GATA BOX(GATA)、GTl CONSENSUS (GRWAAW)。存在启动子调控元件的位置如说明书附 图2所示。
[0007] 为了完成该启动子的初步功能分析，本发明以PCAMBIA3301为出发载体构建了含 有本发明所述花生AhLEClB基因启动子驱动的⑶S基因植物表达载体，即用花生AhLEClB 基因启动子118bp片段取代pCAMBIA3301中驱动⑶S基因表达的35S启动子，获得的植物 表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，即待拟南芥繁殖开花时，配制浸染液， 用农杆菌浸染将要开放的花序。
[0008] 本发明分别取转基因拟南芥的根、茎、叶、花和种胚，通过现有的方法检测GUS基 因的表达情况。本发明所提供的启动子区域，包括5'端非翻译区52bp和其上游启动子 66bp区段，其基因序列如Seq ID No: 1所示，可驱动⑶S基因在根、茎、叶、花和种胚中高效 表达。由此可见本发明克隆获得的花生AhLEClB基因的启动子组成型表达特性。
[0009] 通过上述实验，发明人证实了，在本发明提供的IlSbp 5'端上游调控区包括非翻 译区52bp和其上游启动子66bp区段具有高效组成型表达特性，可以应用在植物遗传工程， 构建该启动子和相关基因的表达载体，通过转基因手段定向改变植物性状，如增强植物耐 受生物或非生物胁迫能力、提高植物对除草剂抗性、改善粮食营养组分等。因此，该启动子 的克隆对植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
【附图说明】
[0010] 图1为扩增的花生AhLEClB基因118bp 5'端上游序列扩增的电泳图，
[0011] 图中M为Trans2K DNA Marker ;P为扩增的目的启动子片段；由图中结合实施例可 知，扩增得到的序列为118bp，包括66bp的启动子序列、52bp 5'非编码区序列；
[0012] 图2为本发明所述花生AhLEClB组成型启动子区域可能的顺式作用元件；
[0013] 图3为扩增花生AhLEClB基因1289bp 5'端上游序列扩增的电泳图，
[0014] 图中M为Trans2K DNA Marker，LD、LE、LP和LS为不同基因组文库扩增结果，LP 泳道箭头所指为扩增的目的启动子片段；
[0015] 图4为花生AhLEClB基因启动子序列与⑶S基因的融合表达载体的构建流程图；
[0016] 图5为本发明所提供的包括52bp5'非编码区序列和66bp的启动子序列区段驱动 的GUS基因表达结构转基因拟南芥根、茎、叶、花和种胚GUS活性组织化学检测图；
[0017] 图中自上而下为拟南芥的根和叶、莖、花和种胚；CK-P为转基因阳性对照，CK-N为 未转基因阴性对照，AhLEClB-Pl为本发明启动子；
[0018] 由图可见转基因拟南芥AhLEClB-Pl整个植株染色较深，与35S驱动⑶S基因作阳 性对照CK-P的转基因植株染色程度近似，而非转基因阴性对照CK-N为无色，说明该启动子 驱动GUS基因在转基因植株根、茎、叶、花和种胚中均高水平表达，且与35S具有近似的驱动 效率。
【具体实施方式】
[0019] 本发明的实施步骤是根据花生AhLEClB基因的基因组DNA序列用染色体步移的方 法克隆得到该基因的启动子序列一启动子顺式作用元件分析及功能预测一设计带有酶切 位点Hind III和Nco I的引物从启动子DNA上扩增目的启动子序列一用同样的酶Hind III和 Nco I酶切载体pCAMBIA3301 -目的片段连接到酶切的pCAMBIA3301载体上一含植物表达 载体的农杆菌转化拟南芥一转基因拟南芥鉴定和筛选纯合体转基因株系一GUS组织化学 染色检测GUS表达部位及强度，分析启动子功能。本实施例中的其他技术均采用已有技术。
[0020] 实施例1花生AhLEClB基因启动子的克隆
[0021] I. 1花生基因组DNA的提取
[0022] 用植物DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司产品）提供的方法提取花生 幼叶的DNA，溶解于适量TE (pH8. 0)缓冲液中；
[0023] 1. 2花生AhLEClB基因启动子的克隆
[0024] 分别取2. 5yg花生基因组DNA经Dral、EcoRV、PvuII、StuI内切酶酶切、苯酚 抽提纯化后，溶解于20 μ I TE (pH 7. 5)缓冲液中。分别取4 μ 1酶切完全的DNA，按照BD GenomeWalker Universal Kit 的要求连接上 Adaptor (序列：5'GTAATACGACTCACTATAGGG CACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 3'，如 Seq ID No: 3 所示），构建 4 个花生基因组 DNA 文 库（LD、LE、LP、LS)。根据已获得的花生AhLEClB基因的基因组序列，设计该基因的2个嵌 套的 3'端特异性引物 LEC1BGSP2-1(5'CCTTGTTCCCATGTAAAACCATGAAAGCA 3'，如 Seq ID 示）。以 API C 端接头引物：5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'，如 Seq ID No:6 所示）和 LEC1BGSP2-1为引物进行第一轮扩增，扩增体系为25 μ 1，模板量为1 μ 1，扩增条件为：94°C 25sec，72°C 3min，7 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，32 个循环；最后 67°C继续延伸 7min。 第二轮巢式PCR模板为1 μ 1第一轮PCR产物10倍稀释液，引物为5 '端巢式接头引物 轮 PCR 相同，扩增条件 94°C 25sec，72°C 3min，5 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，20 个循 环；最后67°C继续延伸7min。1%琼脂糖电泳检测PCR结果；
[0025] 挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆 经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。
[0026] I. 3 RNA提取和转录起始位点确定
[0027] 用CTAB法提取不同发育时期种子的总RNA，经琼脂糖电泳检测RNA质量和分光光 度计定量后，等量混合储存于_80°C冰箱备用。为防止RNA酶污染，研钵、研锤、药匙均以 180°C烘烤6h，所用塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡，于室温下过夜后，高温灭菌处理。
[0028] 用Invitrogen公司GeneRacer? Kit提供的方法和试剂，取5 μ g混合好的LH14种 子总RNA，按照说明书要求用碱性磷酸酶（CIP)将截断的mRNA或其他非mRNA5'端去磷酸 化，然后将抽提纯化并沉淀的全长mRNA脱去帽子结构，并连接上RNA接头（GeneRacer RNA 01igo:5'CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA3'JnSeqIDNo:8**); 以此RNA为模板，用试剂盒提供的随机引物和SurperScript?III RT酶反转录合成cDNA ;最 终将合成的cDNA克隆至载体pCR4-T0P0中，获得LH14不同发育时期种子全长cDNA文 库， 用于随后转录起始位点扩增。根据已获得的花生AhLEClB基因的cDNA序列，设计2个该基 因的 3'端特异性引物，引物序列为：TSS GSP1-15'TCTTTTGCGTCG TCGGAGATTTTAGC 3'，如 569 10此:9所示，了55 65?2与1^(：1865?2-2相同。以构建的〇0嫩文库为模板，分别以丁53 GSPl-I 引物与 GeneRacer? 5，Primer(5，CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3，，如 Seq ID No:10 所示）进行第一轮PCR扩增，PCR体系参照BD AdvantageTM2PCR Kit要求，扩增条件为：94°C 预变性 2min;94°C 30sec，72°C 30sec，5 个循环；94°C 30sec，7(TC 30sec，5 个循环；94°C 30sec，63°C 30sec，68°C 30sec，20-25 个循环；最后 68°C继续延伸 lOmin。第一轮 PCR 产 物经电泳检测后，用缓冲液稀释50倍，用于第二轮巢式PCR。取1 μ 1第一轮PCR产物，以 TSS GSP2 和 GeneRacer? 5, Nested Primer (5, GGACACTGACATGG ACTGAAGGAGTA 3, JDSeq ID No:ll 所示）进行第二轮 PCR，扩增条件为：94°C 预变性 2min;94°C 30sec，65°C 30sec， 68<€1〇86〇，35个循环；最后68<€继续延伸1〇111；[11。1.5%琼脂糖电泳检测？0?结果。
[0029] 挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆 经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。
[0030] 1.4启动子序列分析
[0031] 应用在线植物转录元件分析工具 PLACE (http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/)、 PlantCARE(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)对花生 AhLEClB启动子序列进行分析。
[0032] 1. 5目标启动子片段的扩增
[0033] 设计带有酶切位点的引物Fl和R1，序列如Seq ID No: 12和13所示，下划线部分为 酶切位点，以已克隆的含有花生AhLEClB基因1289bp启动子的重组质粒为模板，扩增118bp 启动子片段，如图1所示；
[0034] PCR扩增体系为 20 μ 1 :包括 10 X PCR buffer 2 μ I，dNTP mixure (各 2. 5mM) 1 μ 1， 上、下游引物各0.5 μ 1，模板DNA 1 μ 1，Taq酶0.25 μ 1，加 CldH2O补足20 μ 1。反应程序为： 预变性94°C 2min;变性94°C 30sec，退火55°C 30sec，延伸72°C 10sec，30个循环；最后 72°C继续延伸IOmin。
[0035] 扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小正确，回收目的片段，克隆到 PEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测 序仪进行双向测序。
[0036] 表1. AhLEClB基因启动子功能分析引物
[0037]
[0038] 实施例2植物表达载体的构建与转化
[0039] 2. 1花生AhLEClB基因启动子序列与⑶S报告基因的融合
[0040] 选择PCAMBIA3301作为植物表达载体，将测序正确的连有目的片段的克隆载体酶 切，电泳并胶回收目的片段。同时用限制性内切酶HindIII和Nco I酶切表达载体，并回收 载体片段。连接启动子片段与载体片段，经质粒酶切图谱鉴定筛选含不同长度启动子的 PCAMBIA3301-AhLEClB启动子重组载体。具体过程可参考附图4 :
[0041] 1.用带有酶切位点的引物Fl和Rl扩增花生AhLEClB基因的启动子区段，并凝胶 电泳分离和回收目的片段，克隆至PEASY-T3载体，测序。
[0042] 2.用Hind III和Nco I双酶切回收目的片段和植物表达载体pCAMBIA3301。
[0043] 3.回收：进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有AhLEClB启动子序列的DNA片段和 PCAMBIA3301载体片段。
[0044] 4.连接，连接体系如下：
[0045]
[0046] 混匀后16°C连接过夜。
[0047] 5.转化：取5 μ 1连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉 素的固体培养基平板上。
[0048] 6.重组子的筛选：对长出的菌落进行重组质粒酶切图谱鉴定。
[0049] 2. 2农杆菌感受态细胞的制备
[0050] 1.挑取单菌落GV3101，接种于5ml加有50mg利福平（Rifampicin)的液体LB培 养基中，28 °C，200rpm，过夜培养。
[0051] 2.取2ml培养物至100mL液体LB培养基中，继续培养至0D600为0. 8左右。将培 养物冰浴 30min，4°C，5000rpm，离心 5min。
[0052] 3.弃上清。用 IOml 0· lmol/L 冷的 NaCl 悬浮菌体；4°C，5000rpm，离心 5min。
[0053] 4.弃上清。用1111120臟〇1/1冷的0&(：12悬浮菌体，分装成50以1/管，液氮中速冻 后，-80°C保存。
[0054] 2. 3冻融法转化农杆菌
[0055] 1.冰上融化农杆菌GV3101感受态细胞，加入1 μ 1带有目的片段的pCAMBIA3301 质粒，冰浴30min，液氮中冷冻lmin，然后在37°C水浴5min。
[0056] 2.加入1ml无抗生素的YEP培养基，28 °C，200rpm，振荡培养3h。
[0057] 3. 10, OOOrpm离心Imin收集菌体，用100 μ IYEP液体培养基重悬菌体。
[0058] 4.将重悬的菌体涂布于附加50mg/L卡那霉素 （Kanamycin sulfate)和100mg/L 利福平的固体YEP培养基上，28°C下培养2-3天。
[0059] 5.酶切及PCR鉴定阳性克隆。
[0060] 2. 4农杆菌介导转化拟南芥
[0061] 1.农杆菌的培养：从_80°C冰箱中取出所需要的菌种，在冰浴中融化。分别取 30 μ 1的农杆菌接种于5ml的YEP培养基（含100mg/L利福平，50mg/L卡那霉素），28°C， 200rpm，振荡培养过夜。然后在附加50mg/L卡那霉素和lOOmg/1利福平的固体YEP培养基 上划板培养，已挑选单菌落。
[0062] 2.花序浸染液的配制：配制50ml浸染液，需加入2. 5g蔗糖（终浓度5% )和15 μ 1 Si Iwet L-77 (终浓度 0· 03 % )。
[0063] 3.花序浸染：将拟南芥种子表面消毒后播种于MS固体培养基平板上，待种子萌发 长出子叶后，移入蛭石中培养至拟南芥开花，期间浇营养液维持幼苗健壮生长。浸染前，提 前准备菌液。挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种于含l〇〇mg/L利福平和50mg/L卡那 霉素的YEP培养基中，28°C，200rpm，振荡培养至对数生长期（约48h);将菌液用MS液体培 养基稀释10倍备用。将摇好的菌液转入离心管中5000rpm离心10min ;去上清，用适量浸 染液重悬菌体，轻微振荡混匀。去掉开过的花，将整个花序浸入菌液中30s，然后用保鲜膜包 裹花序，至黑暗中平放2天后，转至光下培养。
[0064] 2. 5转基因植株的鉴定
[0065] 待浸染后的拟南芥接种后，将种子在4°C春化10天，然后播种于含10mg/L的除草 剂的MS培养基中筛选，能在含除草剂培养基中萌发生长的拟南芥，可初步确定为转基因的 拟南芥。种子萌发长出子叶后，移入蛭石中生长。为进一步鉴定抗除草剂植株为转入目的 启动子片段的转基因植株，取每个植株的一片小叶提取基因组DNA，通过PCR的方法进行目 的片段鉴定。所用引物和程序如扩增启动子时所用的引物和程序。得到目的片段，经测序 证明所得植株中确实转入了该发明所克隆的不同长度的启动子片段。
[0066] 3. 1⑶S活性组织化学染色的方法：
[0067] 1.样品放入冰水混合物冰浴2min ;
[0068] 2.样品用滤纸吸干后放入离心管中，加入90%丙酮浸泡样品IOmin ;
[0069] 3.用⑶S染色buffer迅速清洗一遍样品后，加入⑶S染色液浸染5min，倒掉染 液；
[0070] 4.加入适量染液浸没样品，抽气2次，每次5min ;
[0071] 5. 37 °C恒温保存过夜；
[0072] 6.加入无水乙醇脱色，然后转移至水中。肉眼或解剖镜下观察、照相。
[0073] 3. 2 GUS 染色 buffer 配方：
[0074] 100mL buffer
[0075]
[0076] ddH20 定容至 100mL。
[0077] 3. 3⑶S染色液配方
[0078] 用 800 μ I DMSO 溶解 IOOmg X-Gluc，加入⑶S 染色 buffer 定容至 100mL。
[0079] 3. 4对转基因植株不同组织和不同发育时期的种子进行⑶S活性组织化学染色
[0080] 分别取各转基因株系营养生长期的根、叶（4片莲座叶）和茎，以及繁殖期刚刚开 放的花和种胚进行⑶S活性组织化学染色，如图5所示，发现转基因植株AhLEClB-Pl根、 茎、叶、花和种胚均有染色，且染色程度与阳性对照CK-P近似，而转基因阴性对照CK-N则为 无色。说明本发明所获得的AhLEClB组成型启动子片段能高效驱动⑶S基因在各器官组成 型表达。
【主权项】
1. 一种花生AhLEClB组成型启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示。2. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于：该启动子能驱动GUS基因主要在花生 各器官尚效组成型表达。3. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于：该启动子还包括含有如SeqIDNo: 1所 示核苷酸序列的其他序列。4. 如权利要求1所述启动子具有高效组成型驱动功能的应用。
【专利摘要】一种花生AhLEC1B组成型启动子的克隆和应用。本发明属于生物技术领域，从花生中克隆获得了一种花生AhLEC1B组成型启动子，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，该启动子通过GUS组织化学染色证实其驱动基因在植物根、茎、叶、花和种胚等器官中呈组成型高效表达，发明人基于该启动子的上述功能，构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥，证实该启动子对于GUS基因的驱动功效与CaMV35S近似，且该启动子片段大小适中，利于构建，适于实验室和工业应用。
【IPC分类】C12N15/113
【公开号】CN104894131
【申请号】CN201510270784
【发明人】唐桂英, 单雷, 徐平丽, 柳展基
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心, 唐桂英
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的 来源于花生AhLEClB基因的组成型启动子的克隆和应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板 DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子决定着转录的方向和转录的效率，同时 对所使用的RNA聚合酶类型也起着决定性作用，是理解基因表达和转录调控机制的关键， 是植物基因转录调控的中心。按作用方式和功能，可将启动子分为组成型启动子、组织特异 型启动子和诱导型启动子。目前在植物基因工程研宄中，组成型启动子的应用最早、最为广 泛。在转基因育种或用于研宄基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能一般都 使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。
[0003] 在双子叶转基因植物中使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒的CaMV35S 启动子。单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和水稻的ActinI启动 子，另外还有来自章鱼碱合成酶基因 Ocs启动子和根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱 合成酶基因 Nos启动子。有研宄表明内源型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效稳定 表达中比外源启动子更具有优势。此外在植物基因工程中应用从病毒中克隆出来的启动子 序列，可能存在潜在的生物不安全性。并且，重复使用同一种组成型启动子驱动两个或两个 以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或共抑制现象。因此，寻找双子叶植物组成型启 动子，对于双子叶植物的遗传改良具有重要应用价值。
[0004] 近年来，国内外多个实验室开展了花生抗逆和籽粒储藏物质积累相关基因启动 子的克隆与研宄，旨在充分了解基因的表达调控特征，为作物遗传改良提供依据。花生籽 粒中多个主要储藏蛋白一过敏原Arahl、2、3和6基因的启动子已被克隆和鉴定（Viquez 等，2003 ;2004 ;Zhong 等，2006 ;Bhattacharya 等，2012)，花生 Arah2 启动子驱动 GUS 在种 胚中特异表达，且强度高于35S启动子，而在种皮中基本无表达；花生Arah 6启动子驱动 ⑶S在子叶中表达，而在真叶中表达较弱。花生油体蛋白基因 Ah01eol7.8、Ah01eol8. 5启动 子（Li et al.，2009)和脂肪酸合成与油脂积累相关的基因如AhDGAT3(唐桂英等，2013)、 AhACP (单雷等，2014)启动子，也相继获得克隆与分析。干旱胁迫下花生中调控脱落酸生物 合成的AhNCEDl基因启动子（梁建华等，2007)、抵御外来病害相关的ARAhPRlO基因启动子 (温世杰等，2012)也已被克隆研宄。
【发明内容】
[0005] 基于上述现有技术，本发明的发明人经过深入研宄，从花生中克隆获得了一个新 的组成型启动子，该启动子来源于花生AhLEClB基因，该启动子核苷酸序列如Seq ID No: 1 所示，包括5'端非翻译区52bp和其上游66bp区段，具有高效驱动功能。本发明构建了 该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，自起始密码 起-32~-149调控区的启动子驱动的⑶S基因在转基因植株的根、茎、叶、花、种胚中均能 高效表达，且驱动效率与CaMV35S近似。
[0006] 该启动子是在通过染色体步移技术获得AhLEClB基因 Y端上游1289bp序列 (其核苷酸序列如Seq ID N〇:2所示）的基础上，设计特异引物进行扩增得到的IlSbp AhLEClB基因 Y端上游序列，其核苷酸序列如Seq ID No: 1所示。经转录起始位点分析发 现，花生AhLEClB基因转录起始位点位于翻译起始密码ATG上游-83nt处，通过PlantCARE 和PLACE软件对该118bp AhLEClB基因启动子进行顺式调控元件分析，该序列除包含启 动子中心元件TATA BOX、增强启动子活性的CCAAT BOX，还包含叶肉表达调控元件CACTFT PPCAl (YACT)、花粉中表达调控元件GTGA Motif (GTGA)，另外，还包含植物特有的碳代谢相 关的Dof蛋白结合位点DOF CORE、细胞分裂素响应调控元件ARRlAT(NGATT)及光响应调控 元件GATA BOX(GATA)、GTl CONSENSUS (GRWAAW)。存在启动子调控元件的位置如说明书附 图2所示。
[0007] 为了完成该启动子的初步功能分析，本发明以PCAMBIA3301为出发载体构建了含 有本发明所述花生AhLEClB基因启动子驱动的⑶S基因植物表达载体，即用花生AhLEClB 基因启动子118bp片段取代pCAMBIA3301中驱动⑶S基因表达的35S启动子，获得的植物 表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，即待拟南芥繁殖开花时，配制浸染液， 用农杆菌浸染将要开放的花序。
[0008] 本发明分别取转基因拟南芥的根、茎、叶、花和种胚，通过现有的方法检测GUS基 因的表达情况。本发明所提供的启动子区域，包括5'端非翻译区52bp和其上游启动子 66bp区段，其基因序列如Seq ID No: 1所示，可驱动⑶S基因在根、茎、叶、花和种胚中高效 表达。由此可见本发明克隆获得的花生AhLEClB基因的启动子组成型表达特性。
[0009] 通过上述实验，发明人证实了，在本发明提供的IlSbp 5'端上游调控区包括非翻 译区52bp和其上游启动子66bp区段具有高效组成型表达特性，可以应用在植物遗传工程， 构建该启动子和相关基因的表达载体，通过转基因手段定向改变植物性状，如增强植物耐 受生物或非生物胁迫能力、提高植物对除草剂抗性、改善粮食营养组分等。因此，该启动子 的克隆对植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
【附图说明】
[0010] 图1为扩增的花生AhLEClB基因118bp 5'端上游序列扩增的电泳图，
[0011] 图中M为Trans2K DNA Marker ;P为扩增的目的启动子片段；由图中结合实施例可 知，扩增得到的序列为118bp，包括66bp的启动子序列、52bp 5'非编码区序列；
[0012] 图2为本发明所述花生AhLEClB组成型启动子区域可能的顺式作用元件；
[0013] 图3为扩增花生AhLEClB基因1289bp 5'端上游序列扩增的电泳图，
[0014] 图中M为Trans2K DNA Marker，LD、LE、LP和LS为不同基因组文库扩增结果，LP 泳道箭头所指为扩增的目的启动子片段；
[0015] 图4为花生AhLEClB基因启动子序列与⑶S基因的融合表达载体的构建流程图；
[0016] 图5为本发明所提供的包括52bp5'非编码区序列和66bp的启动子序列区段驱动 的GUS基因表达结构转基因拟南芥根、茎、叶、花和种胚GUS活性组织化学检测图；
[0017] 图中自上而下为拟南芥的根和叶、莖、花和种胚；CK-P为转基因阳性对照，CK-N为 未转基因阴性对照，AhLEClB-Pl为本发明启动子；
[0018] 由图可见转基因拟南芥AhLEClB-Pl整个植株染色较深，与35S驱动⑶S基因作阳 性对照CK-P的转基因植株染色程度近似，而非转基因阴性对照CK-N为无色，说明该启动子 驱动GUS基因在转基因植株根、茎、叶、花和种胚中均高水平表达，且与35S具有近似的驱动 效率。
【具体实施方式】
[0019] 本发明的实施步骤是根据花生AhLEClB基因的基因组DNA序列用染色体步移的方 法克隆得到该基因的启动子序列一启动子顺式作用元件分析及功能预测一设计带有酶切 位点Hind III和Nco I的引物从启动子DNA上扩增目的启动子序列一用同样的酶Hind III和 Nco I酶切载体pCAMBIA3301 -目的片段连接到酶切的pCAMBIA3301载体上一含植物表达 载体的农杆菌转化拟南芥一转基因拟南芥鉴定和筛选纯合体转基因株系一GUS组织化学 染色检测GUS表达部位及强度，分析启动子功能。本实施例中的其他技术均采用已有技术。
[0020] 实施例1花生AhLEClB基因启动子的克隆
[0021] I. 1花生基因组DNA的提取
[0022] 用植物DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司产品）提供的方法提取花生 幼叶的DNA，溶解于适量TE (pH8. 0)缓冲液中；
[0023] 1. 2花生AhLEClB基因启动子的克隆
[0024] 分别取2. 5yg花生基因组DNA经Dral、EcoRV、PvuII、StuI内切酶酶切、苯酚 抽提纯化后，溶解于20 μ I TE (pH 7. 5)缓冲液中。分别取4 μ 1酶切完全的DNA，按照BD GenomeWalker Universal Kit 的要求连接上 Adaptor (序列：5'GTAATACGACTCACTATAGGG CACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 3'，如 Seq ID No: 3 所示），构建 4 个花生基因组 DNA 文 库（LD、LE、LP、LS)。根据已获得的花生AhLEClB基因的基因组序列，设计该基因的2个嵌 套的 3'端特异性引物 LEC1BGSP2-1(5'CCTTGTTCCCATGTAAAACCATGAAAGCA 3'，如 Seq ID 示）。以 API C 端接头引物：5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'，如 Seq ID No:6 所示）和 LEC1BGSP2-1为引物进行第一轮扩增，扩增体系为25 μ 1，模板量为1 μ 1，扩增条件为：94°C 25sec，72°C 3min，7 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，32 个循环；最后 67°C继续延伸 7min。 第二轮巢式PCR模板为1 μ 1第一轮PCR产物10倍稀释液，引物为5 '端巢式接头引物 轮 PCR 相同，扩增条件 94°C 25sec，72°C 3min，5 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，20 个循 环；最后67°C继续延伸7min。1%琼脂糖电泳检测PCR结果；
[0025] 挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆 经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。
[0026] I. 3 RNA提取和转录起始位点确定
[0027] 用CTAB法提取不同发育时期种子的总RNA，经琼脂糖电泳检测RNA质量和分光光 度计定量后，等量混合储存于_80°C冰箱备用。为防止RNA酶污染，研钵、研锤、药匙均以 180°C烘烤6h，所用塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡，于室温下过夜后，高温灭菌处理。
[0028] 用Invitrogen公司GeneRacer? Kit提供的方法和试剂，取5 μ g混合好的LH14种 子总RNA，按照说明书要求用碱性磷酸酶（CIP)将截断的mRNA或其他非mRNA5'端去磷酸 化，然后将抽提纯化并沉淀的全长mRNA脱去帽子结构，并连接上RNA接头（GeneRacer RNA 01igo:5'CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA3'JnSeqIDNo:8**); 以此RNA为模板，用试剂盒提供的随机引物和SurperScript?III RT酶反转录合成cDNA ;最 终将合成的cDNA克隆至载体pCR4-T0P0中，获得LH14不同发育时期种子全长cDNA文 库， 用于随后转录起始位点扩增。根据已获得的花生AhLEClB基因的cDNA序列，设计2个该基 因的 3'端特异性引物，引物序列为：TSS GSP1-15'TCTTTTGCGTCG TCGGAGATTTTAGC 3'，如 569 10此:9所示，了55 65?2与1^(：1865?2-2相同。以构建的〇0嫩文库为模板，分别以丁53 GSPl-I 引物与 GeneRacer? 5，Primer(5，CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3，，如 Seq ID No:10 所示）进行第一轮PCR扩增，PCR体系参照BD AdvantageTM2PCR Kit要求，扩增条件为：94°C 预变性 2min;94°C 30sec，72°C 30sec，5 个循环；94°C 30sec，7(TC 30sec，5 个循环；94°C 30sec，63°C 30sec，68°C 30sec，20-25 个循环；最后 68°C继续延伸 lOmin。第一轮 PCR 产 物经电泳检测后，用缓冲液稀释50倍，用于第二轮巢式PCR。取1 μ 1第一轮PCR产物，以 TSS GSP2 和 GeneRacer? 5, Nested Primer (5, GGACACTGACATGG ACTGAAGGAGTA 3, JDSeq ID No:ll 所示）进行第二轮 PCR，扩增条件为：94°C 预变性 2min;94°C 30sec，65°C 30sec， 68<€1〇86〇，35个循环；最后68<€继续延伸1〇111；[11。1.5%琼脂糖电泳检测？0?结果。
[0029] 挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆 经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。
[0030] 1.4启动子序列分析
[0031] 应用在线植物转录元件分析工具 PLACE (http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/)、 PlantCARE(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)对花生 AhLEClB启动子序列进行分析。
[0032] 1. 5目标启动子片段的扩增
[0033] 设计带有酶切位点的引物Fl和R1，序列如Seq ID No: 12和13所示，下划线部分为 酶切位点，以已克隆的含有花生AhLEClB基因1289bp启动子的重组质粒为模板，扩增118bp 启动子片段，如图1所示；
[0034] PCR扩增体系为 20 μ 1 :包括 10 X PCR buffer 2 μ I，dNTP mixure (各 2. 5mM) 1 μ 1， 上、下游引物各0.5 μ 1，模板DNA 1 μ 1，Taq酶0.25 μ 1，加 CldH2O补足20 μ 1。反应程序为： 预变性94°C 2min;变性94°C 30sec，退火55°C 30sec，延伸72°C 10sec，30个循环；最后 72°C继续延伸IOmin。
[0035] 扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小正确，回收目的片段，克隆到 PEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测 序仪进行双向测序。
[0036] 表1. AhLEClB基因启动子功能分析引物
[0037]
[0038] 实施例2植物表达载体的构建与转化
[0039] 2. 1花生AhLEClB基因启动子序列与⑶S报告基因的融合
[0040] 选择PCAMBIA3301作为植物表达载体，将测序正确的连有目的片段的克隆载体酶 切，电泳并胶回收目的片段。同时用限制性内切酶HindIII和Nco I酶切表达载体，并回收 载体片段。连接启动子片段与载体片段，经质粒酶切图谱鉴定筛选含不同长度启动子的 PCAMBIA3301-AhLEClB启动子重组载体。具体过程可参考附图4 :
[0041] 1.用带有酶切位点的引物Fl和Rl扩增花生AhLEClB基因的启动子区段，并凝胶 电泳分离和回收目的片段，克隆至PEASY-T3载体，测序。
[0042] 2.用Hind III和Nco I双酶切回收目的片段和植物表达载体pCAMBIA3301。
[0043] 3.回收：进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有AhLEClB启动子序列的DNA片段和 PCAMBIA3301载体片段。
[0044] 4.连接，连接体系如下：
[0045]
[0046] 混匀后16°C连接过夜。
[0047] 5.转化：取5 μ 1连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉 素的固体培养基平板上。
[0048] 6.重组子的筛选：对长出的菌落进行重组质粒酶切图谱鉴定。
[0049] 2. 2农杆菌感受态细胞的制备
[0050] 1.挑取单菌落GV3101，接种于5ml加有50mg利福平（Rifampicin)的液体LB培 养基中，28 °C，200rpm，过夜培养。
[0051] 2.取2ml培养物至100mL液体LB培养基中，继续培养至0D600为0. 8左右。将培 养物冰浴 30min，4°C，5000rpm，离心 5min。
[0052] 3.弃上清。用 IOml 0· lmol/L 冷的 NaCl 悬浮菌体；4°C，5000rpm，离心 5min。
[0053] 4.弃上清。用1111120臟〇1/1冷的0&(：12悬浮菌体，分装成50以1/管，液氮中速冻 后，-80°C保存。
[0054] 2. 3冻融法转化农杆菌
[0055] 1.冰上融化农杆菌GV3101感受态细胞，加入1 μ 1带有目的片段的pCAMBIA3301 质粒，冰浴30min，液氮中冷冻lmin，然后在37°C水浴5min。
[0056] 2.加入1ml无抗生素的YEP培养基，28 °C，200rpm，振荡培养3h。
[0057] 3. 10, OOOrpm离心Imin收集菌体，用100 μ IYEP液体培养基重悬菌体。
[0058] 4.将重悬的菌体涂布于附加50mg/L卡那霉素 （Kanamycin sulfate)和100mg/L 利福平的固体YEP培养基上，28°C下培养2-3天。
[0059] 5.酶切及PCR鉴定阳性克隆。
[0060] 2. 4农杆菌介导转化拟南芥
[0061] 1.农杆菌的培养：从_80°C冰箱中取出所需要的菌种，在冰浴中融化。分别取 30 μ 1的农杆菌接种于5ml的YEP培养基（含100mg/L利福平，50mg/L卡那霉素），28°C， 200rpm，振荡培养过夜。然后在附加50mg/L卡那霉素和lOOmg/1利福平的固体YEP培养基 上划板培养，已挑选单菌落。
[0062] 2.花序浸染液的配制：配制50ml浸染液，需加入2. 5g蔗糖（终浓度5% )和15 μ 1 Si Iwet L-77 (终浓度 0· 03 % )。
[0063] 3.花序浸染：将拟南芥种子表面消毒后播种于MS固体培养基平板上，待种子萌发 长出子叶后，移入蛭石中培养至拟南芥开花，期间浇营养液维持幼苗健壮生长。浸染前，提 前准备菌液。挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种于含l〇〇mg/L利福平和50mg/L卡那 霉素的YEP培养基中，28°C，200rpm，振荡培养至对数生长期（约48h);将菌液用MS液体培 养基稀释10倍备用。将摇好的菌液转入离心管中5000rpm离心10min ;去上清，用适量浸 染液重悬菌体，轻微振荡混匀。去掉开过的花，将整个花序浸入菌液中30s，然后用保鲜膜包 裹花序，至黑暗中平放2天后，转至光下培养。
[0064] 2. 5转基因植株的鉴定
[0065] 待浸染后的拟南芥接种后，将种子在4°C春化10天，然后播种于含10mg/L的除草 剂的MS培养基中筛选，能在含除草剂培养基中萌发生长的拟南芥，可初步确定为转基因的 拟南芥。种子萌发长出子叶后，移入蛭石中生长。为进一步鉴定抗除草剂植株为转入目的 启动子片段的转基因植株，取每个植株的一片小叶提取基因组DNA，通过PCR的方法进行目 的片段鉴定。所用引物和程序如扩增启动子时所用的引物和程序。得到目的片段，经测序 证明所得植株中确实转入了该发明所克隆的不同长度的启动子片段。
[0066] 3. 1⑶S活性组织化学染色的方法：
[0067] 1.样品放入冰水混合物冰浴2min ;
[0068] 2.样品用滤纸吸干后放入离心管中，加入90%丙酮浸泡样品IOmin ;
[0069] 3.用⑶S染色buffer迅速清洗一遍样品后，加入⑶S染色液浸染5min，倒掉染 液；
[0070] 4.加入适量染液浸没样品，抽气2次，每次5min ;
[0071] 5. 37 °C恒温保存过夜；
[0072] 6.加入无水乙醇脱色，然后转移至水中。肉眼或解剖镜下观察、照相。
[0073] 3. 2 GUS 染色 buffer 配方：
[0074] 100mL buffer
[0075]
[0076] ddH20 定容至 100mL。
[0077] 3. 3⑶S染色液配方
[0078] 用 800 μ I DMSO 溶解 IOOmg X-Gluc，加入⑶S 染色 buffer 定容至 100mL。
[0079] 3. 4对转基因植株不同组织和不同发育时期的种子进行⑶S活性组织化学染色
[0080] 分别取各转基因株系营养生长期的根、叶（4片莲座叶）和茎，以及繁殖期刚刚开 放的花和种胚进行⑶S活性组织化学染色，如图5所示，发现转基因植株AhLEClB-Pl根、 茎、叶、花和种胚均有染色，且染色程度与阳性对照CK-P近似，而转基因阴性对照CK-N则为 无色。说明本发明所获得的AhLEClB组成型启动子片段能高效驱动⑶S基因在各器官组成 型表达。
【主权项】
1. 一种花生AhLEClB组成型启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示。2. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于：该启动子能驱动GUS基因主要在花生 各器官尚效组成型表达。3. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于：该启动子还包括含有如SeqIDNo: 1所 示核苷酸序列的其他序列。4. 如权利要求1所述启动子具有高效组成型驱动功能的应用。
【专利摘要】一种花生AhLEC1B组成型启动子的克隆和应用。本发明属于生物技术领域，从花生中克隆获得了一种花生AhLEC1B组成型启动子，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，该启动子通过GUS组织化学染色证实其驱动基因在植物根、茎、叶、花和种胚等器官中呈组成型高效表达，发明人基于该启动子的上述功能，构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥，证实该启动子对于GUS基因的驱动功效与CaMV35S近似，且该启动子片段大小适中，利于构建，适于实验室和工业应用。
【IPC分类】C12N15/113
【公开号】CN104894131
【申请号】CN201510270784
【发明人】唐桂英, 单雷, 徐平丽, 柳展基
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心, 唐桂英
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
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