一种鸡mda5基因启动子及其应用
一种鸡mda5基因启动子及其应用
【专利说明】-种鸡MDA5基因启动子及其应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸡天然免疫相关基因 MDA5启动子 区域的分离鉴定及其应用。
【背景技术】
[0003] 天然免疫又称非特异性免疫或者固有免疫，主要通过天然免疫分子和细胞来具体 实现对病原体的清除和杀灭。宿主细胞通过对病原体的识别，激活一系列的下游级联反应， 最终导致I型干扰素、促炎症细胞因子、趋化因子等的产生从而抑制病原体的复制、抵抗感 染并清除病原体。天然免疫对于病原的识别依赖的是病原分子模式识别受体（PRR)。
[0004] 黑素瘤差异化相关基因 5 (Melanoma Differentiation-Associated protein 5， MDA5,又称Helicard、IFIH1)是胞质内病原分子模式识别受体，维甲酸诱导基因 I样受体 家族（RLRs)，包括维甲酸诱导基因蛋白 I (retinoic acid-inducible gene I，RIG-I);遗 传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)的重要成 员之一，其激活的信号转导途径对机体启动抗病毒天然免疫发挥着重作用。MDA5是DexD/H RNA解旋酶。N端包括2个串联重复的半胱天冬酶募集结构域即CARD(Caspase activation and recruitment domain)域，中间为DExD/H 解旋酶区（DExD/H helicases)，C端是无活 性的抑制域（repressor domain，RD)。其解旋酶结构域介导双链RNA的识别，而CARD结构 域能够招募下游信号分子从而活化干扰素调节因子3 (Interferon regulatory Factor 3， IRF3)和核转录因子 NF-κ B (nuclear transcription factor-κ B，NF-κ B，NF_kB)〇
[0005] 在哺乳动物中，MDA5和RIG-I是RIG-I样解旋酶家族中进化保守的成员，在机体 对抗外源RNA病毒感染的过程中起重要的作用。然而，鸡中缺少RIG-I，因此关于MDA5对 病毒的识别，自身的激活以及受到的调控的研宄就显得尤为重要，例如解释为何鸡对某些 特定的流感病毒有抵抗力，却对另一些毒株具有高易感性，进而找到增强鸡抗病毒能力的 方法。
[0006] 启动子是目的基因的开关，控制基因的表达，因此研宄一个基因启动子的影响和 调控因素，是明白这个基因作用机制及调节因素的一个重要环节，因此对于一个基因研宄 其启动子的区间及特性就显得尤为重要。
[0007] 研宄显示，在正常情况下，机体MDA5只有基础水平少量表达，当病毒入侵后，MDA5 的表达会大量上调。目前对RIG-I的调控机制研宄较多，对MDA5的调控机制尚不清楚，对 鸡MDA5基因的启动子的研宄未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是研宄鸡抗病毒能力，增强鸡的免疫力。提供一种鸡MDA5基因启动 子，所述的MDA5基因启动子序列如序列表SEQ ID NO :3所示。利用NCBI数据库查找鸡黑 色素瘤差异化相关基因 MDA5的上游调控序列，预测MDA5启动子的大概区域。设计如序列表 SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的引物片段，以白羽鸡基因组DNA为模板，PCR扩增其天然 免疫的启动子区域，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收，将 片段连接在PMD19-T载体上并将扩增到的启动子序列SEQ ID N0:3片段命名为MDA5-pro， 其片段长度为2487b。
[0009] 将连接在PMD19-T载体上的MDA5启动子作为模板，设计引物进行PCR扩增，引进 Pci I和BamH I两个切酶位点，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯 化回收后，用全式金的pEASY-Tl Cloning Kit试剂盒，将其连接在pEASY-Tl载体上，获得 MDA5基因启动子转染载体。Pci I和BamH I两个切酶位点的酶切体系是： 试剂 体积（（Volume/ μ 1)) Buffer 5 目的片段DNA/载体DNA 12/4 Pci I 1 BamH I 1 CldH2O 31/39 总量 50 ; 所述的酶切条件是37°C，时间为5-6小时。
[0010] 一种鸡MDA5基因启动子的应用，所述的MDA5基因启动子用于启动鸡表达目的基 因。
[0011] 以上所述的MDA5基因启动子还可应用于在受到病毒、干扰素 、Poly I:C和IBDV刺 激后能驱动目的基因表达。
[0012] 从白羽鸡的基因组中分离并鉴定出MDA5基因的启动子序列。克隆鸡MDA5基因5' 侧翼2483bp序列，利用TESS和TFSEARCH等在线软件分析，发现该片段含有启动子的特征 元件TATA box和多个转录结合因子结合位点，如C/EBP、GATA、NF-El、c-Rel、AP-l和c-Jun 等。构建含有MDA5基因启动子的PB-MDA5-DsRed的报告质粒，转染鸡胚胎成纤维细胞（DF-1 细胞），通过流式细胞仪和RT-QPCR的方法分析转染后的细胞在受到刺激时红色荧光蛋白 的相对表达量，来确定启动子的活性，进而确定鸡细胞或机体对刺激物的敏感性。
[0013] 本发明优点是：本发明验证了鸡MDA5基因启动子在细胞中启动基因表达的能力， 验证了不同的刺激物对启动子表达的调控，为MDA5基因的表达调控带来了更深层次的认 知。
[0014] 本发明中构建的启动子表达载体，能够持续表达绿色荧光蛋白，受调控表达红色 荧光蛋白，便于筛选，且利于观察鉴定启动子活性，以方便验证和预测病毒等外源抗原对鸡 细胞和机体的危害性。
【附图说明】
[0015] 图1重组质粒构建流程图。
[0016] 图2重组质粒载体的双酶切鉴定图3号泳道为DNA Marker，2号泳道为重组质粒 PB-MDA5-DsRed双酶切结果，1号泳道为重组质粒PB-MDA5-DsRed单酶切结果。
[0017] 图3稳定转染重组质粒DF-I细胞图。
[0018] 图4携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理24 h后，荧光显微镜 观察IFN 24h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0019] 图5携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理24 h后，荧光显微镜 观察P〇ly(I:C) 24 h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0020] 图6携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理24 h后，荧光显微镜 观察NDV 24 h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0021] 图7携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理72 h后，荧光显微镜 观察IBDV 72 h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0022]
【具体实施方式】
[0023] 在下述描述中，具体描述了本发明鸡MDA5基因启动子的克隆方法、鉴定方法和表 达方法。
[0024] 实施例1 :鸡黑素瘤差异化相关基因5 (MDA5)启动子片段及相应获得 NCBI数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov)查找鸡黑色素瘤差异化相关基因 MDA5 的上游调控序列，预测MDA5启动子的大概区域，以此序列作为研宄对象。设计引物(该引物 序列见表1所示)，以白羽鸡基因组DNA为模板，PCR扩增MDA5的启动子区域，扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收，将片段连接在PMD19-T (Takara)载 体上，送英俊公司测序。得到的启动子序列如SEQ ID NO :3所示。
[0025] 表1 MDA5的启动子片段的扩增引物
实施例2 :鸡黑素瘤差异化相关基因5 (MDA5)启动子转染载体的构建 将连接在PMD19-T载体上的MDA5启动子作为模板，设计引物进行PCR扩增，引进Pci I 和BamH I两个切酶位点，引物序列如表2所示。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并 用天根回收试剂盒纯化回收后，用全式金的pEASY-Tl Cloning Kit试剂盒，将其连接在 pEASY-Tl载体 上，并送至英俊公司测序。经过序列比对，选择测序正确的样本备用。
[0026] 表2引进Pci I和BamH I酶切位点扩增引物
用限制性内切酶Pci I和BamH I (均购于NEB公司）分别双酶切载体PDsRedl-Nl质 粒（Clontech)及连接在pEASY-Tl上的启动子片段，酶切体系如下表所示
37°C酶切6h后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收目的片段，载体 pDsRedl-ΝΙ回收较大的片段，连接有启动子的pEASY-Tl回收较小的片段。
[0027] 将回收后的载体片段和目的片段按照摩尔比例1 :10,按照如下体系，16°C过夜连 接：
连接产物的转化及阳性克隆的筛选按如下步骤进行： (1)10 μ 1连接产物加入到100 μ 1融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。 (2)混合物于42°C水浴准确热激90s，不要摇动，迅速移至冰上放置3min。（3)加入400 μ 1 LB培养基，37°C振荡培养45-60min，摇速200rpm。（4) 3000rpm离心I min，弃去大部分培 养基，将100 μ 1菌液均匀涂在含100 μ g/ml卡那霉素的平板上，待菌液被平板吸收后（约 0. 5 h)，将平板放在37°C温箱中倒置培养过夜。（5)16-20h后，挑取单克隆并用菌落PCR法 筛选阳性克隆。（6)挑选3-4个阳性克隆，摇菌送测序。
[0028] 经过序列比对，选择测序正确的菌液扩大培养，用天根质粒小提试剂盒，按照说明 书步骤提取质粒，利用Pci I和BamH I双酶切鉴定提取到的质粒，酶切体系如下表所示：
选择上述酶切与测序均正确的质粒MDA5-DsRed，以其为模板，设计引物进行PCR扩增， 引进sfi I和Nhe I两个酶切位点。引物序列如表3所示。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳 鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收后，将其连接在PMD19-T载体上，并送至英俊公司测序。 经过序列比对，选择测序正确的样本备用。
[0029] 表3引进sfi I和Nhe I酶切位点扩增引物 1
用限制性内切酶sfi I和Nhe I (均购于fermentas公司）双酶切载体PB513B-1_SBI GFP vector质粒及连接在上的启动子片段，酶切体系如下表所示
将回收后的载体片段和目的片段按照摩尔比例1 :1〇,按照如下体系，16°C过夜连接：
连接产物的转化及阳性克隆的筛选按如下步骤进行： (I) 10 μ 1连接产物加入到100 μ 1融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。 (2)混合物于42°C水浴准确热激90s，不要摇动，迅速移至冰上放置3min。（3)加入400 μ 1 LB培养基，37°C振荡培养45-60min，摇速200rpm。（4) 3000rpm离心lmin，弃去大部分培养 基，将100 μ 1菌液均匀涂在含100 μ g/ml氨苄青霉素的平板上，待菌液被平板吸收后（约 0. 5 h)，将平板放在37°C温箱中倒置培养过夜。（5)16-20h后，挑取单克隆并用菌落PCR法 筛选阳性克隆。（6)挑选3-4个阳性克隆，摇菌送测序。
[0030] 经过序列比对，选择测序正确的菌液扩大培养，用天根质粒小提试剂盒，按照说明 书步骤提取质粒，利用sfi I和Nhe I双酶切鉴定提取到的质粒，酶切体系如下表所示: PB-MDA5-DsRed酶切结采图2所不。
[0031] 实施例3 :重组质粒的细胞转染 本研宄中鸡胚胎成纤维细胞（DF-1)为贴壁细胞，采用贴壁细胞培养方法培养。将细胞 传代于培养皿或者孔板中，置于二氧化碳浓度为5%的37°C培养箱中进行培养，通过显微镜 来观察细胞的生长状况，如细胞形态和密度。通常状况下三天传代一次。细胞培养液为含 有10%胎牛血清，0. 01%青霉素链霉素溶液的DMEM高糖培养基。
[0032] 在进行细胞转染之前，将细胞传入24孔板，使之在24h内密度达到70-80%。24h 左右用脂质体法对进行细胞转染。所用脂质体为Lipofectamine? LTX & PLUS Reagent (Invitrogen)，具体操作严格按照说明书进行。
[0033] 细胞转染后36h左右，将细胞传代至35mm培养皿，并加适量嘌呤霉素进行药物筛 选。细胞传代2-3次得到稳定表达重组质粒的细胞系，阳性细胞率达90%以上。荧光显微 镜观察如图3所示。
[0034] 实施例4 :MDA5基因启动子功能验证 分别用干扰素、上海源叶、新城疫强毒株病毒和传染性法氏囊病病毒处理细胞。将稳定 转染重组质粒的DF-I细胞传代至24孔板中，使之在24h内密度达到70-80%。用脂质体转 染法，加入阳性刺激物干扰素（IFN)直接加入培养液中处理细胞，浓度分别为0、0. 1、0. 25 和0.548/!111。上海源叶〈?〇17(1:〇>，浓度分别为0、0.5、2.5、5.0和1048/1111。新城 疫强毒株病毒（NDV)原液用不含血清和抗生素的DMEM分别稀释至10- 5、10' KT7和KT8倍， 并感染细胞。传染性法氏囊病病毒（IBDV)稀释至KT 4倍。期间每隔30 min摇晃一次细 胞，2 h后换液为含2%血清的DMEM维持液。在处理细胞后的2、8、16、24、36、48、60和72h 分别观察细胞常光、荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白发光情况和荧光显微镜观察细胞红 色荧光蛋白发光情况。图4为IFN，时间为24h、浓度为0和0. 5 μ g/ml的结果；图5为 Poly (I: C)，时间为24h、浓度为0和10 μ g/ml的结果；图6为NDV，时间为24h、浓度为0和 KT5倍的结果；图7为IBDV，时间为72h、浓度为0和原液稀释至KT4倍的结果。
【主权项】
1. 一种鸡MDA5基因启动子，其特征在于，所述的MDA5基因启动子序列如序列表SEQ ID NO : 3所示。2. 根据权利要求1所述的鸡MDA5基因启动子，其特征在于，所述的MDA5基因启动子序 列长度为2487bp。3.根据权利要求1所述的鸡MDA5基因启动子的克隆方法，其特征在于，包括设计核苷 酸序列如序列表SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的引物片段，以白羽鸡基因组DNA为模 板，PCR扩增其天然免疫的启动子区域，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收 试剂盒纯化回收，将片段连接在PMD19-T载体上。4.根据权利要求3所述的鸡MDA5基因启动子的克隆方法，其特征在于，包括将所述的 MDA5基因启动子作为模版，将所述的引物序列进行PCR扩增，引进Pci I和BamH I两个切 酶位点，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收后，用全式金的 pEASY-Tl Cloning Kit试剂盒，将其连接在pEASY-Tl载体上，获得MDA5基因启动子转染 载体。5. 根据权利要求4所述的鸡MDA5基因启动子的克隆方法，其特征在于，所述的PciI 和BamHI两个切酶位点的酶切体系是： 试剂 体积（（Volume/ y 1)) Buffer 5 目的片段DNA/载体DNA 12/4 Pci I 1 BamH I 1 CldH2O 31/39 总量 50 ; 所述的酶切条件是37°C，时间为5-6小时。6. -种鸡MDA5基因启动子的应用，其特征在于，所述的MDA5基因启动子用于启动鸡表 达目的基因。7.根据权利要求6所述的鸡MDA5基因启动子的应用，其特征在于，所述的MDA5基因启 动子还应用于在受到病毒、干扰素、Poly I :C和IBDV刺激后能驱动目的基因表达。
【专利摘要】本发明公开了一种鸡MDA5基因启动子，其序列如序列表SEQ ID NO：3所示，所述的MDA5基因启动子序列长度为2487bp。本发明还公开了MDA5基因启动子的克隆方法及其应用。本发明验证了鸡MDA5基因启动子在细胞中启动基因表达的能力，验证了不同的刺激物对启动子表达的调控，为MDA5基因的表达调控带来了更深层次的认知。
【IPC分类】C12N15/85, C12N15/10, C12N15/55, C12N15/113
【公开号】CN104894133
【申请号】CN201510293200
【发明人】陆阳清, 张文馨, 陈东阳, 左二伟, 卢克焕
【申请人】广西大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
【专利说明】-种鸡MDA5基因启动子及其应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸡天然免疫相关基因 MDA5启动子 区域的分离鉴定及其应用。
【背景技术】
[0003] 天然免疫又称非特异性免疫或者固有免疫，主要通过天然免疫分子和细胞来具体 实现对病原体的清除和杀灭。宿主细胞通过对病原体的识别，激活一系列的下游级联反应， 最终导致I型干扰素、促炎症细胞因子、趋化因子等的产生从而抑制病原体的复制、抵抗感 染并清除病原体。天然免疫对于病原的识别依赖的是病原分子模式识别受体（PRR)。
[0004] 黑素瘤差异化相关基因 5 (Melanoma Differentiation-Associated protein 5， MDA5,又称Helicard、IFIH1)是胞质内病原分子模式识别受体，维甲酸诱导基因 I样受体 家族（RLRs)，包括维甲酸诱导基因蛋白 I (retinoic acid-inducible gene I，RIG-I);遗 传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)的重要成 员之一，其激活的信号转导途径对机体启动抗病毒天然免疫发挥着重作用。MDA5是DexD/H RNA解旋酶。N端包括2个串联重复的半胱天冬酶募集结构域即CARD(Caspase activation and recruitment domain)域，中间为DExD/H 解旋酶区（DExD/H helicases)，C端是无活 性的抑制域（repressor domain，RD)。其解旋酶结构域介导双链RNA的识别，而CARD结构 域能够招募下游信号分子从而活化干扰素调节因子3 (Interferon regulatory Factor 3， IRF3)和核转录因子 NF-κ B (nuclear transcription factor-κ B，NF-κ B，NF_kB)〇
[0005] 在哺乳动物中，MDA5和RIG-I是RIG-I样解旋酶家族中进化保守的成员，在机体 对抗外源RNA病毒感染的过程中起重要的作用。然而，鸡中缺少RIG-I，因此关于MDA5对 病毒的识别，自身的激活以及受到的调控的研宄就显得尤为重要，例如解释为何鸡对某些 特定的流感病毒有抵抗力，却对另一些毒株具有高易感性，进而找到增强鸡抗病毒能力的 方法。
[0006] 启动子是目的基因的开关，控制基因的表达，因此研宄一个基因启动子的影响和 调控因素，是明白这个基因作用机制及调节因素的一个重要环节，因此对于一个基因研宄 其启动子的区间及特性就显得尤为重要。
[0007] 研宄显示，在正常情况下，机体MDA5只有基础水平少量表达，当病毒入侵后，MDA5 的表达会大量上调。目前对RIG-I的调控机制研宄较多，对MDA5的调控机制尚不清楚，对 鸡MDA5基因的启动子的研宄未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是研宄鸡抗病毒能力，增强鸡的免疫力。提供一种鸡MDA5基因启动 子，所述的MDA5基因启动子序列如序列表SEQ ID NO :3所示。利用NCBI数据库查找鸡黑 色素瘤差异化相关基因 MDA5的上游调控序列，预测MDA5启动子的大概区域。设计如序列表 SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的引物片段，以白羽鸡基因组DNA为模板，PCR扩增其天然 免疫的启动子区域，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收，将 片段连接在PMD19-T载体上并将扩增到的启动子序列SEQ ID N0:3片段命名为MDA5-pro， 其片段长度为2487b。
[0009] 将连接在PMD19-T载体上的MDA5启动子作为模板，设计引物进行PCR扩增，引进 Pci I和BamH I两个切酶位点，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯 化回收后，用全式金的pEASY-Tl Cloning Kit试剂盒，将其连接在pEASY-Tl载体上，获得 MDA5基因启动子转染载体。Pci I和BamH I两个切酶位点的酶切体系是： 试剂 体积（（Volume/ μ 1)) Buffer 5 目的片段DNA/载体DNA 12/4 Pci I 1 BamH I 1 CldH2O 31/39 总量 50 ; 所述的酶切条件是37°C，时间为5-6小时。
[0010] 一种鸡MDA5基因启动子的应用，所述的MDA5基因启动子用于启动鸡表达目的基 因。
[0011] 以上所述的MDA5基因启动子还可应用于在受到病毒、干扰素 、Poly I:C和IBDV刺 激后能驱动目的基因表达。
[0012] 从白羽鸡的基因组中分离并鉴定出MDA5基因的启动子序列。克隆鸡MDA5基因5' 侧翼2483bp序列，利用TESS和TFSEARCH等在线软件分析，发现该片段含有启动子的特征 元件TATA box和多个转录结合因子结合位点，如C/EBP、GATA、NF-El、c-Rel、AP-l和c-Jun 等。构建含有MDA5基因启动子的PB-MDA5-DsRed的报告质粒，转染鸡胚胎成纤维细胞（DF-1 细胞），通过流式细胞仪和RT-QPCR的方法分析转染后的细胞在受到刺激时红色荧光蛋白 的相对表达量，来确定启动子的活性，进而确定鸡细胞或机体对刺激物的敏感性。
[0013] 本发明优点是：本发明验证了鸡MDA5基因启动子在细胞中启动基因表达的能力， 验证了不同的刺激物对启动子表达的调控，为MDA5基因的表达调控带来了更深层次的认 知。
[0014] 本发明中构建的启动子表达载体，能够持续表达绿色荧光蛋白，受调控表达红色 荧光蛋白，便于筛选，且利于观察鉴定启动子活性，以方便验证和预测病毒等外源抗原对鸡 细胞和机体的危害性。
【附图说明】
[0015] 图1重组质粒构建流程图。
[0016] 图2重组质粒载体的双酶切鉴定图3号泳道为DNA Marker，2号泳道为重组质粒 PB-MDA5-DsRed双酶切结果，1号泳道为重组质粒PB-MDA5-DsRed单酶切结果。
[0017] 图3稳定转染重组质粒DF-I细胞图。
[0018] 图4携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理24 h后，荧光显微镜 观察IFN 24h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0019] 图5携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理24 h后，荧光显微镜 观察P〇ly(I:C) 24 h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0020] 图6携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理24 h后，荧光显微镜 观察NDV 24 h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0021] 图7携带重组质粒的稳定转染细胞株DF-I-PMD经药物处理72 h后，荧光显微镜 观察IBDV 72 h结果(其中A、B、C为对照组，C、D、E为处理组)。
[0022]
【具体实施方式】
[0023] 在下述描述中，具体描述了本发明鸡MDA5基因启动子的克隆方法、鉴定方法和表 达方法。
[0024] 实施例1 :鸡黑素瘤差异化相关基因5 (MDA5)启动子片段及相应获得 NCBI数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov)查找鸡黑色素瘤差异化相关基因 MDA5 的上游调控序列，预测MDA5启动子的大概区域，以此序列作为研宄对象。设计引物(该引物 序列见表1所示)，以白羽鸡基因组DNA为模板，PCR扩增MDA5的启动子区域，扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收，将片段连接在PMD19-T (Takara)载 体上，送英俊公司测序。得到的启动子序列如SEQ ID NO :3所示。
[0025] 表1 MDA5的启动子片段的扩增引物
实施例2 :鸡黑素瘤差异化相关基因5 (MDA5)启动子转染载体的构建 将连接在PMD19-T载体上的MDA5启动子作为模板，设计引物进行PCR扩增，引进Pci I 和BamH I两个切酶位点，引物序列如表2所示。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并 用天根回收试剂盒纯化回收后，用全式金的pEASY-Tl Cloning Kit试剂盒，将其连接在 pEASY-Tl载体 上，并送至英俊公司测序。经过序列比对，选择测序正确的样本备用。
[0026] 表2引进Pci I和BamH I酶切位点扩增引物
用限制性内切酶Pci I和BamH I (均购于NEB公司）分别双酶切载体PDsRedl-Nl质 粒（Clontech)及连接在pEASY-Tl上的启动子片段，酶切体系如下表所示
37°C酶切6h后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收目的片段，载体 pDsRedl-ΝΙ回收较大的片段，连接有启动子的pEASY-Tl回收较小的片段。
[0027] 将回收后的载体片段和目的片段按照摩尔比例1 :10,按照如下体系，16°C过夜连 接：
连接产物的转化及阳性克隆的筛选按如下步骤进行： (1)10 μ 1连接产物加入到100 μ 1融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。 (2)混合物于42°C水浴准确热激90s，不要摇动，迅速移至冰上放置3min。（3)加入400 μ 1 LB培养基，37°C振荡培养45-60min，摇速200rpm。（4) 3000rpm离心I min，弃去大部分培 养基，将100 μ 1菌液均匀涂在含100 μ g/ml卡那霉素的平板上，待菌液被平板吸收后（约 0. 5 h)，将平板放在37°C温箱中倒置培养过夜。（5)16-20h后，挑取单克隆并用菌落PCR法 筛选阳性克隆。（6)挑选3-4个阳性克隆，摇菌送测序。
[0028] 经过序列比对，选择测序正确的菌液扩大培养，用天根质粒小提试剂盒，按照说明 书步骤提取质粒，利用Pci I和BamH I双酶切鉴定提取到的质粒，酶切体系如下表所示：
选择上述酶切与测序均正确的质粒MDA5-DsRed，以其为模板，设计引物进行PCR扩增， 引进sfi I和Nhe I两个酶切位点。引物序列如表3所示。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳 鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收后，将其连接在PMD19-T载体上，并送至英俊公司测序。 经过序列比对，选择测序正确的样本备用。
[0029] 表3引进sfi I和Nhe I酶切位点扩增引物 1
用限制性内切酶sfi I和Nhe I (均购于fermentas公司）双酶切载体PB513B-1_SBI GFP vector质粒及连接在上的启动子片段，酶切体系如下表所示
将回收后的载体片段和目的片段按照摩尔比例1 :1〇,按照如下体系，16°C过夜连接：
连接产物的转化及阳性克隆的筛选按如下步骤进行： (I) 10 μ 1连接产物加入到100 μ 1融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。 (2)混合物于42°C水浴准确热激90s，不要摇动，迅速移至冰上放置3min。（3)加入400 μ 1 LB培养基，37°C振荡培养45-60min，摇速200rpm。（4) 3000rpm离心lmin，弃去大部分培养 基，将100 μ 1菌液均匀涂在含100 μ g/ml氨苄青霉素的平板上，待菌液被平板吸收后（约 0. 5 h)，将平板放在37°C温箱中倒置培养过夜。（5)16-20h后，挑取单克隆并用菌落PCR法 筛选阳性克隆。（6)挑选3-4个阳性克隆，摇菌送测序。
[0030] 经过序列比对，选择测序正确的菌液扩大培养，用天根质粒小提试剂盒，按照说明 书步骤提取质粒，利用sfi I和Nhe I双酶切鉴定提取到的质粒，酶切体系如下表所示: PB-MDA5-DsRed酶切结采图2所不。
[0031] 实施例3 :重组质粒的细胞转染 本研宄中鸡胚胎成纤维细胞（DF-1)为贴壁细胞，采用贴壁细胞培养方法培养。将细胞 传代于培养皿或者孔板中，置于二氧化碳浓度为5%的37°C培养箱中进行培养，通过显微镜 来观察细胞的生长状况，如细胞形态和密度。通常状况下三天传代一次。细胞培养液为含 有10%胎牛血清，0. 01%青霉素链霉素溶液的DMEM高糖培养基。
[0032] 在进行细胞转染之前，将细胞传入24孔板，使之在24h内密度达到70-80%。24h 左右用脂质体法对进行细胞转染。所用脂质体为Lipofectamine? LTX & PLUS Reagent (Invitrogen)，具体操作严格按照说明书进行。
[0033] 细胞转染后36h左右，将细胞传代至35mm培养皿，并加适量嘌呤霉素进行药物筛 选。细胞传代2-3次得到稳定表达重组质粒的细胞系，阳性细胞率达90%以上。荧光显微 镜观察如图3所示。
[0034] 实施例4 :MDA5基因启动子功能验证 分别用干扰素、上海源叶、新城疫强毒株病毒和传染性法氏囊病病毒处理细胞。将稳定 转染重组质粒的DF-I细胞传代至24孔板中，使之在24h内密度达到70-80%。用脂质体转 染法，加入阳性刺激物干扰素（IFN)直接加入培养液中处理细胞，浓度分别为0、0. 1、0. 25 和0.548/!111。上海源叶〈?〇17(1:〇>，浓度分别为0、0.5、2.5、5.0和1048/1111。新城 疫强毒株病毒（NDV)原液用不含血清和抗生素的DMEM分别稀释至10- 5、10' KT7和KT8倍， 并感染细胞。传染性法氏囊病病毒（IBDV)稀释至KT 4倍。期间每隔30 min摇晃一次细 胞，2 h后换液为含2%血清的DMEM维持液。在处理细胞后的2、8、16、24、36、48、60和72h 分别观察细胞常光、荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白发光情况和荧光显微镜观察细胞红 色荧光蛋白发光情况。图4为IFN，时间为24h、浓度为0和0. 5 μ g/ml的结果；图5为 Poly (I: C)，时间为24h、浓度为0和10 μ g/ml的结果；图6为NDV，时间为24h、浓度为0和 KT5倍的结果；图7为IBDV，时间为72h、浓度为0和原液稀释至KT4倍的结果。
【主权项】
1. 一种鸡MDA5基因启动子，其特征在于，所述的MDA5基因启动子序列如序列表SEQ ID NO : 3所示。2. 根据权利要求1所述的鸡MDA5基因启动子，其特征在于，所述的MDA5基因启动子序 列长度为2487bp。3.根据权利要求1所述的鸡MDA5基因启动子的克隆方法，其特征在于，包括设计核苷 酸序列如序列表SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的引物片段，以白羽鸡基因组DNA为模 板，PCR扩增其天然免疫的启动子区域，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收 试剂盒纯化回收，将片段连接在PMD19-T载体上。4.根据权利要求3所述的鸡MDA5基因启动子的克隆方法，其特征在于，包括将所述的 MDA5基因启动子作为模版，将所述的引物序列进行PCR扩增，引进Pci I和BamH I两个切 酶位点，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用天根回收试剂盒纯化回收后，用全式金的 pEASY-Tl Cloning Kit试剂盒，将其连接在pEASY-Tl载体上，获得MDA5基因启动子转染 载体。5. 根据权利要求4所述的鸡MDA5基因启动子的克隆方法，其特征在于，所述的PciI 和BamHI两个切酶位点的酶切体系是： 试剂 体积（（Volume/ y 1)) Buffer 5 目的片段DNA/载体DNA 12/4 Pci I 1 BamH I 1 CldH2O 31/39 总量 50 ; 所述的酶切条件是37°C，时间为5-6小时。6. -种鸡MDA5基因启动子的应用，其特征在于，所述的MDA5基因启动子用于启动鸡表 达目的基因。7.根据权利要求6所述的鸡MDA5基因启动子的应用，其特征在于，所述的MDA5基因启 动子还应用于在受到病毒、干扰素、Poly I :C和IBDV刺激后能驱动目的基因表达。
【专利摘要】本发明公开了一种鸡MDA5基因启动子，其序列如序列表SEQ ID NO：3所示，所述的MDA5基因启动子序列长度为2487bp。本发明还公开了MDA5基因启动子的克隆方法及其应用。本发明验证了鸡MDA5基因启动子在细胞中启动基因表达的能力，验证了不同的刺激物对启动子表达的调控，为MDA5基因的表达调控带来了更深层次的认知。
【IPC分类】C12N15/85, C12N15/10, C12N15/55, C12N15/113
【公开号】CN104894133
【申请号】CN201510293200
【发明人】陆阳清, 张文馨, 陈东阳, 左二伟, 卢克焕
【申请人】广西大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日
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