二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子TuPMM-A1及其应用
二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子TuPMM-A1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基 因启动子TuPMM-Al及其应用。
【背景技术】
[0002] 普通小麦为六倍体（Triticum aestivium L.，2η = 42, AABBDD)，由二倍体祖先物 种乌拉尔图小麦（Triticum urartu L.，2η = 14, AA)和目前未知的B组供体，以及D组的 供体粗山羊草（Aegilops tauschii L·，2η = 14, DD)经过两次自然杂交加倍形成。
[0003] 小麦是我国的重要粮食作物，其生产水平直接与我国的粮食安全息息相关，我国 的小麦育种工作者培育了相当数量适应我国各地气候和栽培条件优良小麦品种，育种水平 不低于西方发达国家。
[0004] 植物的转基因涉及三个方面研宄内容：第一，用有效的手段将目标基因进入受体。 由于各种植物自身的特点，一种手段不可能在所有的植物中都适用，需针对不同的植物，研 宄高效的转化手段。如在拟南芥和水稻中，农杆菌介导的基因转化比较有效简易，而到目前 为止，农杆菌转化小麦的技术尚在实验室进行探索研宄中。第二，如何能够在特异的位点导 入目标基因，避免对基因组中其他功能基因的破坏。通过同源重组的定点打靶技术，在动 物的转化中获得较大成功。目前，我国的科学家在在利用TALEN和CRISPR/Cas9基因组编 辑技术在作物基因组内进行定点编辑（如定点突变、定点甲基化修饰、定点基因沉默和激 活等）方面取得了重要的进展。第三，如何能使转入后的目标基因按设计或有效地进行表 达。大部分转基因实验，均是使用组成型高表达的启动子，如在双子叶植物中通常使用花椰 菜花叶病毒CaMV35S启动子；在单子叶植物中主要采用玉米泛素 ubiquitin和水稻肌动蛋 白actin启动子等；这些组成型表达启动子调控的基因表达不受时空限制和外界环境的诱 导，即在植物所有组织中均过量表达目的基因，其结果会造成转基因植物体内物质和能量 的无谓浪费，可能引起一些副作用。
[0005] 近年来，随着对转基因安全的关注，相对安全的基因改良的农作物至少需要满足 以下几个方面的要求：（1)外源的（非宿主植物自身来源的DNA序列降低到最低程度）；（2) 目标基因的产物在人类或动物的食用组织或器官中最好不积累（对于改良目标为相应组 织或器官的除外）；（3)能经过相对较长时间的证明，改良的性状经过了严格的动物、环境 试验，并证明是安全的。就前两个条件而言，需要研宄者广泛地研宄，并对目标生物体中相 关的基因进行筛选。如水稻的Act in，玉米的Ub i qut in基因的启动子，但这类启动子也有其 明显的缺点。目前，迫切需要筛选在种子器官中不表达或表达量低，其蛋白产物不能有效积 累（翻译起始点上游的序列在种子中不同有效地驱动翻译，引起蛋白的积累）启动子序列， 尽可能地降低转基因产物在人类的食物或食物加工的原材料中的积累。
[0006] 普通小麦中有六个磷酸甘露糖变位酶基因成员（phosphomannomutase, PMM)，分别 定位在小麦的第二群（TaPMM-Al，Bl和Dl)和第四群染色体（TaPMM-A2, B2和D2)，在根、 茎、叶、旗叶和幼穗等器官中TaPMM-Al的表达量比较高，且这种表达方式在二、四倍体祖先 物种中有相同的趋势，说明在六倍体小麦PMM-Al基因的启动子序列在二、四和六倍体小麦 物种中基本相同，受到了相同的调控方式。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供乌拉尔图小麦TuPMM-Al基因的启动子p TuPMM-A。
[0008] 其中，乌拉尔图小麦TuPMM-Al基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0009] ATGGCGGCGGCGAGGAAGGACGCCGGTGTGCTCGCGCTCTTCGACGTCGACGGCACCCTCACCGCGCCC CGCAAGGAGGTGACGCCGGAGATGCTCGAGTTCATGAAGCGCCTGCGCGAGGTGAGGCCCGAATGTGACCCTGTCTG TCGTTCTCTCGTTTCAGTTTCTTTTCCGTACAATTCTCAGGCGAGATTGCTCACTGTATGTCTGGGTTGTGGCACTC TGGTTTTCTTCCTGGGAGCAGAATGTGACCGTCGGCGTGGTGGGGGGATCCGATCTGGTCAAGATCTCCGAGCAGCT CGGCAAATCAGGTACCCGCCCTGCTTGGATTCAGCAGGACACTCTGCTTGGATTCAGAGTCCCCCCTAACCGCACTG TTCACTCACCTTGTCTGTAACTGTAACTGCAAGACTGAGCTTGATATTTGTTCTCCCCACTGCAGTCATCACCGACT ATGACTACGTCTTCTCCGAGAACGGCCTGGTCGCGCACAAGGACGGCAAGCTCATCGGGACGCAAGTAAGTGCCCAC GCCGCATAATGCGCGCTGTTTTAGCACAGATGTACAACTGAATTTTGCCTGGTGTTCTTCACTCTGCAGAGCTTGAA AACGTATCTTGGAGATGACCAACTTAAGGTGAGCCTGTGTTGTGTGACGTTTTTTTTTCTTGTACTGCTGTTGAAGA TGAGTTTTGAGGCCTTGGTAGTGATGTTTATGTGTTCTTTGCAGGAATTCATTAACTTCACTCTTCATTACATCGCG GATTTGGATATCCCAATTAAAAGGTCAGTGCGGAATCCTGTTTGAGAATTCCCTCGGACGCTTGCCCTTTACTGACC GGGTAAAGTAAATGTTTCCACAGGGGTACATTCATAGAGTTCAGGAGTGGAATGATCAATGTGTCGCCTATAGGGAG GAACTGTAGTCAAGAAGAACGTGATGATTTTGAGAAGTATGATAAGGTACAGATTGTCTTATAAGAACAAGTAGTTA GTCAATAATCAGAAAGGGGGGATAGCTATTAGAAAAACATGAAACTGAACCGACTCGTTTTGTTTAGGTACATAACG TTCGGCCTAAAATGGTGTCAGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCACACCTGAACCTGACTTTTTCTATTGGAGGGCAGATC AGTTTTGATGTAAGTGTTCTGAACTCATAAAAATCTGCTAGAAATCTTCAGTTTGGTATTTACTACTGCATCACTGA ATTCAGGTATTCCCACAAGGCTGGGACAAAACCTACTGCTTGAGATATCTGGAAGAATTCAAAGAAATCCATTTCTT TGGGGACAAAACCTACAAGGTAAGATACTTTAGTTGTGCAGTGCTTCCAAGTAAAGAAATCTCCTTTTCTTTTTTTG AAGTACTTTTGTGCACACAAGATGTTGTTTGATAAACTTTTCAAGCCACTGTTAACGACATCCCATTTAATTACTAC AGTACAAACTTAGCTGTACTGTATACTACAAACTGAAACTGACATTCGTTTTTCCTCTGATTATATTTAATAGGGTG GCAATGATCATGAGATATTTGAATCTGACAGAACAGTTGGTCATACAGGTATGCTCGTTGTATGTTAAAAGCTATTC TTCTGATGGTTATGAAATCTAGGAGGCATTTATATTTATATAGAGGACATCCCTGAACGAGCAATTTTGCATTGTAA AAAATATCATAGCTTAACAGGAGATTTCTCGAAGGGTTGGTTAATAAGTAAACAGGAGAGACAGAGAGAACCTCTTT GTAGCAAACGATATTATTAGTTGCCAACTGATTCCATATTTGGCATTGTGGTCAACCATGAGGGCAGTATCATTAAT ATCTAACCACTCTGAATTGTTGATGATCGAGCTGTAGTGGCTGTCAGAAACTACCTTTTCACCATCATATCTAATCA TCCGGAGTAGCACCTTTTCAAGTCATATTCGTCCCTGAAGAGTGCACCTCGGGCTGTAACCGAGTAAATAATAGGGC ATCAATAGCCCTTCAGAAACATTACACAGCTCCCATTGTAATTTAGTTGCAAAACATTACTCTGTTACTCCGCTTTG TTAGCGAGACTAGAGCTGGTGTCTGGCCCAGTTTTTTAGCCGAGTCCCACCCATGATTTATTTATCGGGATTTGGTG CTGACTGACCGTTTACATGTGCAGTTACCAGCCCCAATGACACTGTGCAGCAGTGCAAATCCATCTTCCTGTCGGAG TGA
[0010] 根据本发明的二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子P TuPMM-A的核 苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 5' -ATCTCGCTCTGGCTCGTAGTGGAACTTTCCGAGCATAATTGGTTTGATGCCAACATTCTGCATTGC CATTATTTGGCAAGCCAACATTTGGCAAAATCAAAAGTCACCAAAATTTGGCGACTTTTTGTGAGATTGACAAGAAA AGTTGGTAGCCAACATTTGACATTTGCCAAATATTGTCATGCCAGCTTTTGGCAGCGAACCAATTATGCTCTCCGTC CTCATTTAGAACCTCTTTGTTAATGATTTTGGCCAACACCTTTTGGATGCGCTCATACTCTGTTAATAATTCCCCTA TGTCTATGTCCCTCTCCATCTCTTCGGACCACTTGACGATCTGGCTATGTTTTTGCAAATATTTGCTTTTCTTCAAT AAGTCGTATATGATGGCCATGGCACAATAGCAAGACCTATGAGAGGATTTGACATTTGGTTTTCTATAGCAACAAGC GCTAGTGAAGAACTTAATTTCGGAATGCTTTGTTATCGTCTCGTTGTAGTTCTTACACTTGGCTAGAGCATCATTTA GAACCTTCTTCAATCTGGTCCATTGCTTTTTAGGGTGTCTCGTCGAATCGAAAAAATAAGCCAAGCCCTGCGTCGGC AGTAGCGTGATTACGATCCAATATCGGTCACTGCGCAAAAAAAGAAGAAATTGGCATTGATGAGGTGAAACCAGAAG GTCATTTATATGTTTCAAAATAAATGAGTGAATGTTAACGACTTACTTGTCACAATATGGCACTAGTAAGGTGTCCT TACATGGATGATTCACAAGCATGCACGGGAACAGTAGTCCAAGATGAGCTCCTACTATTTCCGGTTTCCAGGTTGTG GCAGTGCATGTAAAAAGATCGAGTAAGGACACTTTACGATGCTGGAGTAGGCGATCTGAAGCTCCTTGAAGTACCCA AAGCCTTATTAACTCTGGGGAGGCTGCGCTGACAGAGAAGATATTCACATGGATCACCTCATTGAAGACTAGATCAA TTTTATCGGCCGAAAACTCTTGGATGAAATTGTAACCTTCTATGACCTTGGCCATGTATCCATGTTGACCTTCTTTT GATTTATCTACAACATCGGCGTGTAGAACTTGAAGATCGAGCGACCTTGCTGGGTGGCATTGGGCGTGCACAAGCCT ACATGCCAGAGCCTGGCCGAGCCCGCCTGTCGGTGTGTACGCCCCACACCGGGCTCGTCCGGTCACGACAAGCGGTT CATGCGTTGCGATCGCTCCACTGGCCGTATGTTGTGTCCGTCTTAGACGGCTCGTACATGGGGCTAGGCATCCAAGA TGCGTACCTGGGCAACCCGGCTCGGCGGTCCATGCTGGGTAGCTTTGGTCGGGCAAGCGGGGCATAGTGCGTGCGCC TGGCTCTATGGGTGTTGGTTCGTCCGTGCAAGCATTGTTCTCCGCGAGCTAGACATGCGCACTCGCCTGATGCACCC AGCCGGCTATGCAGAGGGATGTCCAGCCGTCTGTGCGGGCTGGGGGCGCTTGTCTGGGTCTTCTGGCTACCCAGCTG TGCGGATGGCCATTTAGCCGTTGTGCTGCCTATGGGAGGTGTTTTTTTGAAGGGGCCTATGGGAGGTGTTTGCCTGG CCCTTTCGGCTACCCGGTAGTTTGGCTGGGGCATTATGTCGATTTGCCGTGGCCCTGGTGTGTCTTGGCGCTTTGAT GTTTTCTTTGAGGCGGTTACATTTTCTTATAAGTTTGTTGTTTTACGGGCAATTCAGACGCGACGTTCATTGC ACAT CCTCCCCCTTTCATTTGCATGTCTCGCTCCAGAGGGCTTTGCTCATTGTAGCCGGCGATGTTTTGCTACATCGTCGA CGGGAGATGGCCGAGTTCGTGGAGGGGGAGATGGAGGGGCCTGGGCCCATGGAGGACAACAGGCTGACGGGGGAGGA GCTTGCACTGGCTAAGTAATCGGTGCTGTGGTTCAGCATGCTTCGGGAAGAACAACCGTCGCGAGCACTTTTGTTCC TGCCGATAATCAATCGGTGTCTCTTGGGCGCGTGAGAGGCTTTCATGTGAACTATGTTCGTTATGCATCGAACGAAA CTGGTTGGAAACGATCTGCCCGGTTGGAGTTGGCTAACACATTTTTTCACATGCGGGCTACCACATTGTGTTTGACC GCGAGGATGCTCAAAGGACCTATTTGTAATGTTTTTTATGTGCGGTTCGCTCTGCAATGTTTCGTGAACATTTGTCA TGTTTTCGTCTTTCTGCTAGTTTTATATGCAGTTGTATTCTGTTTTTTAGTATCCCTCTGTAAAGTAATATAAGAGC GTTTAGTTCAGTATTTCTTTACTGAGAGAGTATTAATTAATAATTCAATTAATATAATGTGTGCGGTAAAAAAAGTC CATAGCGATTTTAGCCCCAGCGTGTCTCCTACGTGGGGGGTGTGGATACGAACTCTGCGCGCAGTGCGCCACTCCGC GACCGCCACGTGGCCGGAAGCACGTCGAGGCGGCTGACGTGGCGCCCGGTCGTCGGCCCGCGCCGACCCGCGTGGGC CGACGTCATCCCCGTCCTCGCCGTCGCCGCCTCGTGGCCTCGTGGGGGGAGCGAGAAGAGATAGAGGAGCAGCCCCG GCGCATCTGGATCCGCGCCGCAAAGCTGACTTCTTTCTCCGCCGCACGCATCCTCCACCTCCTCCTCCCGGCGACCA CCCCGGGGGCGCTATATCACGCGGCCGCCGCGAGGAGCTGCGCCCCGTCCCTTCTTCTTCCTCGTAGCAGCCTCAGC AGCAGGAGGAAGATG
[0012] 根据本发明的【具体实施方式】，通过以下步骤发现了乌拉尔图小麦TuPMM-Al基因 的启动子并研宄了其发挥功能的区段：
[0013] (1)以六倍体普通小麦研宄对象，检测了六个TaPMMs在叶片以及发育的籽粒中的 表达量。
[0014] (2)提取了不同的普通小麦品种的干种子中的可溶性总蛋白，并用PMM蛋白的抗 体检测了干种子中PMM总蛋白的积累。
[0015] (3)设计TaPMMs启动子区特异的引物，利用二倍体和六倍体小麦的基因组进行扩 增后，回收PCR产物，进行常规的TA克隆和测序，成功在二倍体乌拉尔图小麦和六倍体小麦 中克隆获得TuPMM-Al，TaPMM-Al和TaPMM-Dl三个基因的上游序列。
[0016] (4)对三个序列进行多重序列比对，分析启动子区功能元件，确定对TuPMM-Al启 动子-I. 2kb范围进行进一步的功能分析。
[0017] (5)利用系列缺失法构建了七个TuPMM-Alpromoter::⑶S植物表达载体（F1-F7)， 转化拟南芥，成功获得了 Fl，F4-F7转基因阳性株系。
[0018] (6)检测了 Fl，F4-F7转基因阳性株系中的⑶S基因表达，表明TuPMM-Alpromoter 发挥功能的最下区段在ATG上游0. 42-0. 62kb范围内，其序列为如SEQ ID No. 3所示：
[0019] 5'-ATGCTCAAAGGACCTATTTGTAATGTTTTTTATGTGCGGTTCGCTCTGCAATGTTTCGTGAACATT TGTCATGTTTTCGTCTTTCTGCTAGTTTTATATGCAGTTGTATTCTGTTTTTTAGTATCCCTCTGTAAAGTAATATA AGAGCGTTTAGTTCAGTATTTCTTTACTGAGAGAGTATTAATTAATAATTCAATTAATATAATGTGTGCGGTAAAAA AAGTCCATAGCGATTTTAGCCCCAGCGTGTCTCCTACGTGGGGGGTGTGGATACGAACTCTGCGCGCAGTGCGCCAC TCCGCGACCGCCACGTGGCCGGAAGCACGTCGAGGCGGCTGACGTGGCGCCCGGTCGTCGGCCCGCGCCGACCCGCG TGGGCCGACGTCATCCCCGTCCTCGCCGTCGCCGCCTCGTGGCCTCGTGGGGGGAGCGAGAAGAGATAGAGGAGCAG CCCCGGCGCATCTGGATCCGCGCCGCAAAGCTGACTTCTTTCTCCGCCGCACGCATCCTCCACCTCCTCCTCCCGGC GACCACCCCGGGGGCGCTATATCACGCGGCCGCCGCGAGGAGCTGCGCCCCGTCCCTTCTTCTTCCTCGTAGCAGCC TCAGCAGCAGGAGGAAGATG
[0020] 本发明明确了 PMM-Al基因及其蛋白在发育种子中的积累（六倍体普通小 麦），在祖先二倍体物种中克隆TuPMM-Al基因的启动子，减少六倍体物种中基因克 隆的复杂性，且已经证明其与六倍体中的对应基因具有相同的表达模式，并通过检测 TuPMM-Alpromoter:⑶S转基因拟南芥中⑶S基因的表达，初步明确p TuPMM-A启动子的最 下功能区段，结合其自身的表达和在异源植物拟南芥叶片中驱动的报告基因的表达，该启 动子可应用于转基因的应用与研宄。
【附图说明】
[0021] 图1 :六个PMM成员在普通小麦（中国春）旗叶以及发育的种子中的表达模式。 FL :旗叶；10, 20和30DPA分别为授粉后10, 20和30天的种子。
[0022] 图2 :不同小麦品种种子可溶性蛋白SDS-PAGE电泳以及PMM蛋白印迹图。M :标准 蛋白分子量marker (全氏金基因 blue plus protein marker II);泳道 1:H6756;2:内麦 9 号；3 :豫麦67 ;4 :淮麦22 ;5 :阿夫；6 :长旱58 ;7 :晋麦54 ;8 :原核表达经过His标签纯化 的PMM蛋白；9:转化His-PMM融合基因质粒的BL21细菌诱导后总蛋白。箭头标示His-PMM 融合蛋白，植物样品中的PMM蛋白分子量小于融合蛋白。
[0023] 图3 :PMM-A1基因启动子区的扩增后1%琼脂糖凝胶电泳图。A为引物PRO-Al
[0024] FlRl配对，B为PR0-A1F2R2引物配对。M :DL5, 000 (大连宝生物），泳道1-2均为 目标产物泳道。
[0025] 图4 :构建的植物表达载体TuPMM-promoter:⑶S示意图（后续相应的转基因株系 用F1-F7表示）。
[0026] 图5 :拟南芥阳性转基因株系中⑶S基因的表达。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1
[0028] (1)以六倍体普通小麦研宄对象，设计了六个TaPMMs基因特异的引物（参见以下 表1中的引物，），检测了叶片以及发育的籽粒中的六个基因的相对表达量。
[0029] 表1本申请中用于检测普通小麦6个PMM-Al基因的引物
[0030]
[0031] 如图1所示，六个PMMs成员在普通小麦（中国春）旗叶以及发育的种子中的表达 模式，PMM-Al是所有六个PMM基因在旗叶中表达量最高的成员，所有的PMM成员在发育的 种子中的表达量相对较低，种子中PMMl的表达大约是其叶片中的1/15。
[0032] (2)提取了不同的普通小麦品种的干种子中的可溶性总蛋白，并用PMM蛋白的抗 体检测了干种子中PMM总蛋白的积累。
[0033] 如图2所示，不同小麦品种种子可溶性蛋白SDS-PAGE电泳以及PMM蛋白印迹图。 蛋白印迹检测后，在出现非特异条带的情况下，PMM特异条带未出现，说明在种子可溶性蛋 白部分未见PMM蛋白的积累
[0034] (3)设计TaPMMs启动子区特异的引物（表2中PRO Al-Fl和R1，PR0 A1-F2和R2分 别配对扩增二倍体和六倍体小麦PMM-Al的启动子；PRO Dl-Fl和Rl扩增六倍体中PMM-Dl 基因的启动子）。利用二倍体和六倍体小麦的基因组进行扩增后，回收PCR产物，进行常规 的TA克隆（Promega公司的T-easy载体，按其说明书进行克隆）和测序（送上海生物工 程有限公司进行测序）。成功在二倍体乌拉尔图小麦和六倍体小麦中克隆获得TuPMM-Al， TaPMM-Al和TaPMM-Dl三个基因的上游序列。如图3所示，PR0-A1F1R1以及PR0-A1F2R2配 对后的PCR产物经1 %琼脂糖凝胶后，切胶回收（鼎国胶回收试剂盒，按说明书进行）。产物 与Promega公司的T-easy载体连接（按说明说进行），5-10 μ L连接产物转化100-200 μ L 大肠杆菌DH5a感受态，在含有氨苄青霉素（50 μ g/ml)，X-gal以及IPTG的平板上LB培养 基上进行37°C培养过夜（每个平板加入40 μ L 200mg/mL的X-gal和4 μ L lmol/L的IPTG。 对白班进行菌落PCR，电泳检测后的克隆，用于进一步的质粒提取和测序验证。
[0035] (4)对三个序列进行多重序列比对，进行启动子区功能元件的分析，确定对 TuPMM-Al启动子-I. 2kb范围进行进一步的功能分析。
[0036] (5)利用系列缺失法构建了七个TuPMM-Alpromoter::⑶S植物表达载体。用引物 PMMP Hind III F1-F7与PMMP Bgl II R分别配对，利用测序正确的TuPMM-Al启动子TA 克隆做模板进行扩增，PCR产物经回收后，用Hind III和Bgl II进行酶切，与进行了相同 的酶切处理后的PCAMBIA1301载体进行连接，产物转化DH5a感受态，对阳性的重组子进行 测序验证扩增，获得正确的植物重组载体F1-F7,它们在翻译起始密码子上游的长度分别为 120, 220, 320,420,620,820和1120bp (如图4)。正确的质粒进一步转化农杆菌GV3101，按 浸花法克隆后转化拟南芥，成功获得了 F1，F4-F7转基因阳性株系（表2，HPT Foward和35S promoter R)引物鉴定阳性的转基因株系。所用的pCAMBIA1301载体，置换了⑶S基因上游 的CaMV 35S启动子序列。
[0037] 如图4所示，载体的骨架为pl301，⑶S为报告基因，该载体携带能在植物中表达的 潮霉素抗性基因，便于转基因植株的筛选。通过对TO植株的抗性筛选，T3纯合株系的分子 鉴定（潮霉素抗性基因和35S启动子区的引物的扩增），获得了 F1，F4-F7等五个具有不同 长度的PMM-Al-promoter的阳性转基因株系。
[0038] (6)检测了 Fl，F4-F7转基因阳性株系中的⑶S基因表达，表明TuPMM-Alpromoter 发挥功能的最下区段在ATG上游0. 42-0. 62kb范围内。如图5所示，拟南芥阳性转基因株系 中⑶S基因的表达。因 Fl和F4区段的启动子不能驱动报告基因⑶S的表达，其后F5-F7均 能驱动⑶S的表达，说明PMM-Alpromoter发挥功能的最小区段大在ATG上游0. 42-0. 62kb 范围内（如序列SEQ ID No. 3所示）。
[0039] 表2 :克隆植物表达载体和鉴定阳性转基因植物所用的引物
[0040]
【主权项】
1. 二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A，其特征在于，其核苷 酸序列如SEQIDNo. 2所示。2. 二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A的功能片段，其特征 在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示。3. 权利要求1所述的二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A在 转基因技术中的应用。4. 权利要求2所述的二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A的 功能片段在转基因技术中的应用。
【专利摘要】本发现涉及分子生物学领域，具体涉及二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子TuPMM-A1及其应用。本发明克隆了TuPMM-A1基因的启动子p TuPMM-A，证明该启动子驱动的基因表达主要在根、茎、叶、幼穗等器官中表达，在发育的种子表达量较低，干种子中未检测到PMM蛋白的积累。功能验证表明，该启动子在翻译起始点上游0.42-0.62kb范围内发挥的功能。该启动子可用于驱动目标基因主要在叶片中表达。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/113, A01H5/10
【公开号】CN104894134
【申请号】CN201510363925
【发明人】余春梅, 刘鑫燕, 曹云英, 陈艳红, 冒志宇
【申请人】南通大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基 因启动子TuPMM-Al及其应用。
【背景技术】
[0002] 普通小麦为六倍体（Triticum aestivium L.，2η = 42, AABBDD)，由二倍体祖先物 种乌拉尔图小麦（Triticum urartu L.，2η = 14, AA)和目前未知的B组供体，以及D组的 供体粗山羊草（Aegilops tauschii L·，2η = 14, DD)经过两次自然杂交加倍形成。
[0003] 小麦是我国的重要粮食作物，其生产水平直接与我国的粮食安全息息相关，我国 的小麦育种工作者培育了相当数量适应我国各地气候和栽培条件优良小麦品种，育种水平 不低于西方发达国家。
[0004] 植物的转基因涉及三个方面研宄内容：第一，用有效的手段将目标基因进入受体。 由于各种植物自身的特点，一种手段不可能在所有的植物中都适用，需针对不同的植物，研 宄高效的转化手段。如在拟南芥和水稻中，农杆菌介导的基因转化比较有效简易，而到目前 为止，农杆菌转化小麦的技术尚在实验室进行探索研宄中。第二，如何能够在特异的位点导 入目标基因，避免对基因组中其他功能基因的破坏。通过同源重组的定点打靶技术，在动 物的转化中获得较大成功。目前，我国的科学家在在利用TALEN和CRISPR/Cas9基因组编 辑技术在作物基因组内进行定点编辑（如定点突变、定点甲基化修饰、定点基因沉默和激 活等）方面取得了重要的进展。第三，如何能使转入后的目标基因按设计或有效地进行表 达。大部分转基因实验，均是使用组成型高表达的启动子，如在双子叶植物中通常使用花椰 菜花叶病毒CaMV35S启动子；在单子叶植物中主要采用玉米泛素 ubiquitin和水稻肌动蛋 白actin启动子等；这些组成型表达启动子调控的基因表达不受时空限制和外界环境的诱 导，即在植物所有组织中均过量表达目的基因，其结果会造成转基因植物体内物质和能量 的无谓浪费，可能引起一些副作用。
[0005] 近年来，随着对转基因安全的关注，相对安全的基因改良的农作物至少需要满足 以下几个方面的要求：（1)外源的（非宿主植物自身来源的DNA序列降低到最低程度）；（2) 目标基因的产物在人类或动物的食用组织或器官中最好不积累（对于改良目标为相应组 织或器官的除外）；（3)能经过相对较长时间的证明，改良的性状经过了严格的动物、环境 试验，并证明是安全的。就前两个条件而言，需要研宄者广泛地研宄，并对目标生物体中相 关的基因进行筛选。如水稻的Act in，玉米的Ub i qut in基因的启动子，但这类启动子也有其 明显的缺点。目前，迫切需要筛选在种子器官中不表达或表达量低，其蛋白产物不能有效积 累（翻译起始点上游的序列在种子中不同有效地驱动翻译，引起蛋白的积累）启动子序列， 尽可能地降低转基因产物在人类的食物或食物加工的原材料中的积累。
[0006] 普通小麦中有六个磷酸甘露糖变位酶基因成员（phosphomannomutase, PMM)，分别 定位在小麦的第二群（TaPMM-Al，Bl和Dl)和第四群染色体（TaPMM-A2, B2和D2)，在根、 茎、叶、旗叶和幼穗等器官中TaPMM-Al的表达量比较高，且这种表达方式在二、四倍体祖先 物种中有相同的趋势，说明在六倍体小麦PMM-Al基因的启动子序列在二、四和六倍体小麦 物种中基本相同，受到了相同的调控方式。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供乌拉尔图小麦TuPMM-Al基因的启动子p TuPMM-A。
[0008] 其中，乌拉尔图小麦TuPMM-Al基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0009] ATGGCGGCGGCGAGGAAGGACGCCGGTGTGCTCGCGCTCTTCGACGTCGACGGCACCCTCACCGCGCCC CGCAAGGAGGTGACGCCGGAGATGCTCGAGTTCATGAAGCGCCTGCGCGAGGTGAGGCCCGAATGTGACCCTGTCTG TCGTTCTCTCGTTTCAGTTTCTTTTCCGTACAATTCTCAGGCGAGATTGCTCACTGTATGTCTGGGTTGTGGCACTC TGGTTTTCTTCCTGGGAGCAGAATGTGACCGTCGGCGTGGTGGGGGGATCCGATCTGGTCAAGATCTCCGAGCAGCT CGGCAAATCAGGTACCCGCCCTGCTTGGATTCAGCAGGACACTCTGCTTGGATTCAGAGTCCCCCCTAACCGCACTG TTCACTCACCTTGTCTGTAACTGTAACTGCAAGACTGAGCTTGATATTTGTTCTCCCCACTGCAGTCATCACCGACT ATGACTACGTCTTCTCCGAGAACGGCCTGGTCGCGCACAAGGACGGCAAGCTCATCGGGACGCAAGTAAGTGCCCAC GCCGCATAATGCGCGCTGTTTTAGCACAGATGTACAACTGAATTTTGCCTGGTGTTCTTCACTCTGCAGAGCTTGAA AACGTATCTTGGAGATGACCAACTTAAGGTGAGCCTGTGTTGTGTGACGTTTTTTTTTCTTGTACTGCTGTTGAAGA TGAGTTTTGAGGCCTTGGTAGTGATGTTTATGTGTTCTTTGCAGGAATTCATTAACTTCACTCTTCATTACATCGCG GATTTGGATATCCCAATTAAAAGGTCAGTGCGGAATCCTGTTTGAGAATTCCCTCGGACGCTTGCCCTTTACTGACC GGGTAAAGTAAATGTTTCCACAGGGGTACATTCATAGAGTTCAGGAGTGGAATGATCAATGTGTCGCCTATAGGGAG GAACTGTAGTCAAGAAGAACGTGATGATTTTGAGAAGTATGATAAGGTACAGATTGTCTTATAAGAACAAGTAGTTA GTCAATAATCAGAAAGGGGGGATAGCTATTAGAAAAACATGAAACTGAACCGACTCGTTTTGTTTAGGTACATAACG TTCGGCCTAAAATGGTGTCAGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCACACCTGAACCTGACTTTTTCTATTGGAGGGCAGATC AGTTTTGATGTAAGTGTTCTGAACTCATAAAAATCTGCTAGAAATCTTCAGTTTGGTATTTACTACTGCATCACTGA ATTCAGGTATTCCCACAAGGCTGGGACAAAACCTACTGCTTGAGATATCTGGAAGAATTCAAAGAAATCCATTTCTT TGGGGACAAAACCTACAAGGTAAGATACTTTAGTTGTGCAGTGCTTCCAAGTAAAGAAATCTCCTTTTCTTTTTTTG AAGTACTTTTGTGCACACAAGATGTTGTTTGATAAACTTTTCAAGCCACTGTTAACGACATCCCATTTAATTACTAC AGTACAAACTTAGCTGTACTGTATACTACAAACTGAAACTGACATTCGTTTTTCCTCTGATTATATTTAATAGGGTG GCAATGATCATGAGATATTTGAATCTGACAGAACAGTTGGTCATACAGGTATGCTCGTTGTATGTTAAAAGCTATTC TTCTGATGGTTATGAAATCTAGGAGGCATTTATATTTATATAGAGGACATCCCTGAACGAGCAATTTTGCATTGTAA AAAATATCATAGCTTAACAGGAGATTTCTCGAAGGGTTGGTTAATAAGTAAACAGGAGAGACAGAGAGAACCTCTTT GTAGCAAACGATATTATTAGTTGCCAACTGATTCCATATTTGGCATTGTGGTCAACCATGAGGGCAGTATCATTAAT ATCTAACCACTCTGAATTGTTGATGATCGAGCTGTAGTGGCTGTCAGAAACTACCTTTTCACCATCATATCTAATCA TCCGGAGTAGCACCTTTTCAAGTCATATTCGTCCCTGAAGAGTGCACCTCGGGCTGTAACCGAGTAAATAATAGGGC ATCAATAGCCCTTCAGAAACATTACACAGCTCCCATTGTAATTTAGTTGCAAAACATTACTCTGTTACTCCGCTTTG TTAGCGAGACTAGAGCTGGTGTCTGGCCCAGTTTTTTAGCCGAGTCCCACCCATGATTTATTTATCGGGATTTGGTG CTGACTGACCGTTTACATGTGCAGTTACCAGCCCCAATGACACTGTGCAGCAGTGCAAATCCATCTTCCTGTCGGAG TGA
[0010] 根据本发明的二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子P TuPMM-A的核 苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 5' -ATCTCGCTCTGGCTCGTAGTGGAACTTTCCGAGCATAATTGGTTTGATGCCAACATTCTGCATTGC CATTATTTGGCAAGCCAACATTTGGCAAAATCAAAAGTCACCAAAATTTGGCGACTTTTTGTGAGATTGACAAGAAA AGTTGGTAGCCAACATTTGACATTTGCCAAATATTGTCATGCCAGCTTTTGGCAGCGAACCAATTATGCTCTCCGTC CTCATTTAGAACCTCTTTGTTAATGATTTTGGCCAACACCTTTTGGATGCGCTCATACTCTGTTAATAATTCCCCTA TGTCTATGTCCCTCTCCATCTCTTCGGACCACTTGACGATCTGGCTATGTTTTTGCAAATATTTGCTTTTCTTCAAT AAGTCGTATATGATGGCCATGGCACAATAGCAAGACCTATGAGAGGATTTGACATTTGGTTTTCTATAGCAACAAGC GCTAGTGAAGAACTTAATTTCGGAATGCTTTGTTATCGTCTCGTTGTAGTTCTTACACTTGGCTAGAGCATCATTTA GAACCTTCTTCAATCTGGTCCATTGCTTTTTAGGGTGTCTCGTCGAATCGAAAAAATAAGCCAAGCCCTGCGTCGGC AGTAGCGTGATTACGATCCAATATCGGTCACTGCGCAAAAAAAGAAGAAATTGGCATTGATGAGGTGAAACCAGAAG GTCATTTATATGTTTCAAAATAAATGAGTGAATGTTAACGACTTACTTGTCACAATATGGCACTAGTAAGGTGTCCT TACATGGATGATTCACAAGCATGCACGGGAACAGTAGTCCAAGATGAGCTCCTACTATTTCCGGTTTCCAGGTTGTG GCAGTGCATGTAAAAAGATCGAGTAAGGACACTTTACGATGCTGGAGTAGGCGATCTGAAGCTCCTTGAAGTACCCA AAGCCTTATTAACTCTGGGGAGGCTGCGCTGACAGAGAAGATATTCACATGGATCACCTCATTGAAGACTAGATCAA TTTTATCGGCCGAAAACTCTTGGATGAAATTGTAACCTTCTATGACCTTGGCCATGTATCCATGTTGACCTTCTTTT GATTTATCTACAACATCGGCGTGTAGAACTTGAAGATCGAGCGACCTTGCTGGGTGGCATTGGGCGTGCACAAGCCT ACATGCCAGAGCCTGGCCGAGCCCGCCTGTCGGTGTGTACGCCCCACACCGGGCTCGTCCGGTCACGACAAGCGGTT CATGCGTTGCGATCGCTCCACTGGCCGTATGTTGTGTCCGTCTTAGACGGCTCGTACATGGGGCTAGGCATCCAAGA TGCGTACCTGGGCAACCCGGCTCGGCGGTCCATGCTGGGTAGCTTTGGTCGGGCAAGCGGGGCATAGTGCGTGCGCC TGGCTCTATGGGTGTTGGTTCGTCCGTGCAAGCATTGTTCTCCGCGAGCTAGACATGCGCACTCGCCTGATGCACCC AGCCGGCTATGCAGAGGGATGTCCAGCCGTCTGTGCGGGCTGGGGGCGCTTGTCTGGGTCTTCTGGCTACCCAGCTG TGCGGATGGCCATTTAGCCGTTGTGCTGCCTATGGGAGGTGTTTTTTTGAAGGGGCCTATGGGAGGTGTTTGCCTGG CCCTTTCGGCTACCCGGTAGTTTGGCTGGGGCATTATGTCGATTTGCCGTGGCCCTGGTGTGTCTTGGCGCTTTGAT GTTTTCTTTGAGGCGGTTACATTTTCTTATAAGTTTGTTGTTTTACGGGCAATTCAGACGCGACGTTCATTGC ACAT CCTCCCCCTTTCATTTGCATGTCTCGCTCCAGAGGGCTTTGCTCATTGTAGCCGGCGATGTTTTGCTACATCGTCGA CGGGAGATGGCCGAGTTCGTGGAGGGGGAGATGGAGGGGCCTGGGCCCATGGAGGACAACAGGCTGACGGGGGAGGA GCTTGCACTGGCTAAGTAATCGGTGCTGTGGTTCAGCATGCTTCGGGAAGAACAACCGTCGCGAGCACTTTTGTTCC TGCCGATAATCAATCGGTGTCTCTTGGGCGCGTGAGAGGCTTTCATGTGAACTATGTTCGTTATGCATCGAACGAAA CTGGTTGGAAACGATCTGCCCGGTTGGAGTTGGCTAACACATTTTTTCACATGCGGGCTACCACATTGTGTTTGACC GCGAGGATGCTCAAAGGACCTATTTGTAATGTTTTTTATGTGCGGTTCGCTCTGCAATGTTTCGTGAACATTTGTCA TGTTTTCGTCTTTCTGCTAGTTTTATATGCAGTTGTATTCTGTTTTTTAGTATCCCTCTGTAAAGTAATATAAGAGC GTTTAGTTCAGTATTTCTTTACTGAGAGAGTATTAATTAATAATTCAATTAATATAATGTGTGCGGTAAAAAAAGTC CATAGCGATTTTAGCCCCAGCGTGTCTCCTACGTGGGGGGTGTGGATACGAACTCTGCGCGCAGTGCGCCACTCCGC GACCGCCACGTGGCCGGAAGCACGTCGAGGCGGCTGACGTGGCGCCCGGTCGTCGGCCCGCGCCGACCCGCGTGGGC CGACGTCATCCCCGTCCTCGCCGTCGCCGCCTCGTGGCCTCGTGGGGGGAGCGAGAAGAGATAGAGGAGCAGCCCCG GCGCATCTGGATCCGCGCCGCAAAGCTGACTTCTTTCTCCGCCGCACGCATCCTCCACCTCCTCCTCCCGGCGACCA CCCCGGGGGCGCTATATCACGCGGCCGCCGCGAGGAGCTGCGCCCCGTCCCTTCTTCTTCCTCGTAGCAGCCTCAGC AGCAGGAGGAAGATG
[0012] 根据本发明的【具体实施方式】，通过以下步骤发现了乌拉尔图小麦TuPMM-Al基因 的启动子并研宄了其发挥功能的区段：
[0013] (1)以六倍体普通小麦研宄对象，检测了六个TaPMMs在叶片以及发育的籽粒中的 表达量。
[0014] (2)提取了不同的普通小麦品种的干种子中的可溶性总蛋白，并用PMM蛋白的抗 体检测了干种子中PMM总蛋白的积累。
[0015] (3)设计TaPMMs启动子区特异的引物，利用二倍体和六倍体小麦的基因组进行扩 增后，回收PCR产物，进行常规的TA克隆和测序，成功在二倍体乌拉尔图小麦和六倍体小麦 中克隆获得TuPMM-Al，TaPMM-Al和TaPMM-Dl三个基因的上游序列。
[0016] (4)对三个序列进行多重序列比对，分析启动子区功能元件，确定对TuPMM-Al启 动子-I. 2kb范围进行进一步的功能分析。
[0017] (5)利用系列缺失法构建了七个TuPMM-Alpromoter::⑶S植物表达载体（F1-F7)， 转化拟南芥，成功获得了 Fl，F4-F7转基因阳性株系。
[0018] (6)检测了 Fl，F4-F7转基因阳性株系中的⑶S基因表达，表明TuPMM-Alpromoter 发挥功能的最下区段在ATG上游0. 42-0. 62kb范围内，其序列为如SEQ ID No. 3所示：
[0019] 5'-ATGCTCAAAGGACCTATTTGTAATGTTTTTTATGTGCGGTTCGCTCTGCAATGTTTCGTGAACATT TGTCATGTTTTCGTCTTTCTGCTAGTTTTATATGCAGTTGTATTCTGTTTTTTAGTATCCCTCTGTAAAGTAATATA AGAGCGTTTAGTTCAGTATTTCTTTACTGAGAGAGTATTAATTAATAATTCAATTAATATAATGTGTGCGGTAAAAA AAGTCCATAGCGATTTTAGCCCCAGCGTGTCTCCTACGTGGGGGGTGTGGATACGAACTCTGCGCGCAGTGCGCCAC TCCGCGACCGCCACGTGGCCGGAAGCACGTCGAGGCGGCTGACGTGGCGCCCGGTCGTCGGCCCGCGCCGACCCGCG TGGGCCGACGTCATCCCCGTCCTCGCCGTCGCCGCCTCGTGGCCTCGTGGGGGGAGCGAGAAGAGATAGAGGAGCAG CCCCGGCGCATCTGGATCCGCGCCGCAAAGCTGACTTCTTTCTCCGCCGCACGCATCCTCCACCTCCTCCTCCCGGC GACCACCCCGGGGGCGCTATATCACGCGGCCGCCGCGAGGAGCTGCGCCCCGTCCCTTCTTCTTCCTCGTAGCAGCC TCAGCAGCAGGAGGAAGATG
[0020] 本发明明确了 PMM-Al基因及其蛋白在发育种子中的积累（六倍体普通小 麦），在祖先二倍体物种中克隆TuPMM-Al基因的启动子，减少六倍体物种中基因克 隆的复杂性，且已经证明其与六倍体中的对应基因具有相同的表达模式，并通过检测 TuPMM-Alpromoter:⑶S转基因拟南芥中⑶S基因的表达，初步明确p TuPMM-A启动子的最 下功能区段，结合其自身的表达和在异源植物拟南芥叶片中驱动的报告基因的表达，该启 动子可应用于转基因的应用与研宄。
【附图说明】
[0021] 图1 :六个PMM成员在普通小麦（中国春）旗叶以及发育的种子中的表达模式。 FL :旗叶；10, 20和30DPA分别为授粉后10, 20和30天的种子。
[0022] 图2 :不同小麦品种种子可溶性蛋白SDS-PAGE电泳以及PMM蛋白印迹图。M :标准 蛋白分子量marker (全氏金基因 blue plus protein marker II);泳道 1:H6756;2:内麦 9 号；3 :豫麦67 ;4 :淮麦22 ;5 :阿夫；6 :长旱58 ;7 :晋麦54 ;8 :原核表达经过His标签纯化 的PMM蛋白；9:转化His-PMM融合基因质粒的BL21细菌诱导后总蛋白。箭头标示His-PMM 融合蛋白，植物样品中的PMM蛋白分子量小于融合蛋白。
[0023] 图3 :PMM-A1基因启动子区的扩增后1%琼脂糖凝胶电泳图。A为引物PRO-Al
[0024] FlRl配对，B为PR0-A1F2R2引物配对。M :DL5, 000 (大连宝生物），泳道1-2均为 目标产物泳道。
[0025] 图4 :构建的植物表达载体TuPMM-promoter:⑶S示意图（后续相应的转基因株系 用F1-F7表示）。
[0026] 图5 :拟南芥阳性转基因株系中⑶S基因的表达。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1
[0028] (1)以六倍体普通小麦研宄对象，设计了六个TaPMMs基因特异的引物（参见以下 表1中的引物，），检测了叶片以及发育的籽粒中的六个基因的相对表达量。
[0029] 表1本申请中用于检测普通小麦6个PMM-Al基因的引物
[0030]
[0031] 如图1所示，六个PMMs成员在普通小麦（中国春）旗叶以及发育的种子中的表达 模式，PMM-Al是所有六个PMM基因在旗叶中表达量最高的成员，所有的PMM成员在发育的 种子中的表达量相对较低，种子中PMMl的表达大约是其叶片中的1/15。
[0032] (2)提取了不同的普通小麦品种的干种子中的可溶性总蛋白，并用PMM蛋白的抗 体检测了干种子中PMM总蛋白的积累。
[0033] 如图2所示，不同小麦品种种子可溶性蛋白SDS-PAGE电泳以及PMM蛋白印迹图。 蛋白印迹检测后，在出现非特异条带的情况下，PMM特异条带未出现，说明在种子可溶性蛋 白部分未见PMM蛋白的积累
[0034] (3)设计TaPMMs启动子区特异的引物（表2中PRO Al-Fl和R1，PR0 A1-F2和R2分 别配对扩增二倍体和六倍体小麦PMM-Al的启动子；PRO Dl-Fl和Rl扩增六倍体中PMM-Dl 基因的启动子）。利用二倍体和六倍体小麦的基因组进行扩增后，回收PCR产物，进行常规 的TA克隆（Promega公司的T-easy载体，按其说明书进行克隆）和测序（送上海生物工 程有限公司进行测序）。成功在二倍体乌拉尔图小麦和六倍体小麦中克隆获得TuPMM-Al， TaPMM-Al和TaPMM-Dl三个基因的上游序列。如图3所示，PR0-A1F1R1以及PR0-A1F2R2配 对后的PCR产物经1 %琼脂糖凝胶后，切胶回收（鼎国胶回收试剂盒，按说明书进行）。产物 与Promega公司的T-easy载体连接（按说明说进行），5-10 μ L连接产物转化100-200 μ L 大肠杆菌DH5a感受态，在含有氨苄青霉素（50 μ g/ml)，X-gal以及IPTG的平板上LB培养 基上进行37°C培养过夜（每个平板加入40 μ L 200mg/mL的X-gal和4 μ L lmol/L的IPTG。 对白班进行菌落PCR，电泳检测后的克隆，用于进一步的质粒提取和测序验证。
[0035] (4)对三个序列进行多重序列比对，进行启动子区功能元件的分析，确定对 TuPMM-Al启动子-I. 2kb范围进行进一步的功能分析。
[0036] (5)利用系列缺失法构建了七个TuPMM-Alpromoter::⑶S植物表达载体。用引物 PMMP Hind III F1-F7与PMMP Bgl II R分别配对，利用测序正确的TuPMM-Al启动子TA 克隆做模板进行扩增，PCR产物经回收后，用Hind III和Bgl II进行酶切，与进行了相同 的酶切处理后的PCAMBIA1301载体进行连接，产物转化DH5a感受态，对阳性的重组子进行 测序验证扩增，获得正确的植物重组载体F1-F7,它们在翻译起始密码子上游的长度分别为 120, 220, 320,420,620,820和1120bp (如图4)。正确的质粒进一步转化农杆菌GV3101，按 浸花法克隆后转化拟南芥，成功获得了 F1，F4-F7转基因阳性株系（表2，HPT Foward和35S promoter R)引物鉴定阳性的转基因株系。所用的pCAMBIA1301载体，置换了⑶S基因上游 的CaMV 35S启动子序列。
[0037] 如图4所示，载体的骨架为pl301，⑶S为报告基因，该载体携带能在植物中表达的 潮霉素抗性基因，便于转基因植株的筛选。通过对TO植株的抗性筛选，T3纯合株系的分子 鉴定（潮霉素抗性基因和35S启动子区的引物的扩增），获得了 F1，F4-F7等五个具有不同 长度的PMM-Al-promoter的阳性转基因株系。
[0038] (6)检测了 Fl，F4-F7转基因阳性株系中的⑶S基因表达，表明TuPMM-Alpromoter 发挥功能的最下区段在ATG上游0. 42-0. 62kb范围内。如图5所示，拟南芥阳性转基因株系 中⑶S基因的表达。因 Fl和F4区段的启动子不能驱动报告基因⑶S的表达，其后F5-F7均 能驱动⑶S的表达，说明PMM-Alpromoter发挥功能的最小区段大在ATG上游0. 42-0. 62kb 范围内（如序列SEQ ID No. 3所示）。
[0039] 表2 :克隆植物表达载体和鉴定阳性转基因植物所用的引物
[0040]
【主权项】
1. 二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A，其特征在于，其核苷 酸序列如SEQIDNo. 2所示。2. 二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A的功能片段，其特征 在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示。3. 权利要求1所述的二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A在 转基因技术中的应用。4. 权利要求2所述的二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子pTuPMM-A的 功能片段在转基因技术中的应用。
【专利摘要】本发现涉及分子生物学领域，具体涉及二倍体乌拉尔图小麦磷酸甘露糖变位酶基因启动子TuPMM-A1及其应用。本发明克隆了TuPMM-A1基因的启动子p TuPMM-A，证明该启动子驱动的基因表达主要在根、茎、叶、幼穗等器官中表达，在发育的种子表达量较低，干种子中未检测到PMM蛋白的积累。功能验证表明，该启动子在翻译起始点上游0.42-0.62kb范围内发挥的功能。该启动子可用于驱动目标基因主要在叶片中表达。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/113, A01H5/10
【公开号】CN104894134
【申请号】CN201510363925
【发明人】余春梅, 刘鑫燕, 曹云英, 陈艳红, 冒志宇
【申请人】南通大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
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