一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体及其应用
一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一条经突变和截短优化获得的与石房蛤毒素 特异性结合的高亲和力适配体，为样品中痕量STX的分离富集，石房蛤毒素的快速检测，中 和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物的制备，以及水体中毒素的去除奠定了基础。
【背景技术】
[0002] 石房蛤毒素（Saxitoxin，STX)属于麻痹性贝类毒素家族，为胍胺类神经性毒素， 是目前已知的最强有力的小分子神经毒素之一。它来源于多种淡水蓝细菌和海洋甲藻，通 过食物链蓄积于贝类、蟹类等水产品中，主要通过阻断可兴奋细胞表面的钠离子通道，使细 胞膜失去极化状态，从而阻断神经肌肉的传导，导致人类和海洋动物产生麻痹性贝类中毒。 小鼠腹腔注射、静脉注射以及口服的半数致死量LD 5tl分别是S-IOyg kg'3.4yg kg<和 260 yg kg'世界各地都有包括STX在内的麻痹性贝类毒素分布，尤其是欧洲及北美一些 国家。我国东南沿海一带地区也经常发生食用有毒蛤类、螺类、贝类引发的人中毒事件。为 了保证人类的健康不受威胁，对石房蛤毒素进行监测显得尤为重要。联合国卫生组织和联 合国粮农组织规定及推荐的标准是80 μ gSTXeq/lOOg，即每一百克贝类软组织中PSP毒性 的STX当量不得高于80 μ g。
[0003] 人类多因误食含STX的贝类等海产品而发生中毒，中毒症状往往因食入的量不同 而不同。轻度中毒表现为恶心、呕吐、腹泻，局部皮肤有麻或刺痛感。重度中毒后，表现为神 经肌肉麻痹，随意肌无力，呼吸肌收缩无力，血压下降，心率减慢，心律失常，患者多感到身 体有漂浮感，严重中毒15min内就可死亡，STX中毒的死亡率约为10%左右。对STX中毒目 前没有特效药，临床上主要是采取催吐、洗胃，用活性炭吸附胃内的毒素。4-氨基吡啶可以 拮抗STX的毒性作用，起到治疗效果，但4-氨基吡啶毒副作用大，安全剂量范围小。
[0004] 鉴于STX的高危害性和分布的广泛性，世界各国均将其列为水产品安全检 验的必检项目。长期以来一直用于STX检测的方法是国际上公认的小鼠生物学分析 (Jellett, J. F. , Stewartm, J. E. , Laycock, Μ. V. Toxicological evaluation of saxitoxin, neosaxitoxin, gonyautoxin II, gonyautoxin II plus III and decarba-moylsaxitoxin with the mouse neuroblastoma cell bioassay· Toxicol. In Vitrol995,9 :57 - 65.)〇然 而，为了减少动物的使用，我们仍需要建立快速，高通量的筛选方法，从而有效的监测STX。 对于一种快速检测方法而言，最关键的部分是STX的识别元件，如常用的抗体和受体等。然 而，目前常用的识别元件仍存在多种不足，例如，抗体的制备有限和动物的使用等。
[0005] 核酸适配体是从随机寡核苷酸序列库中经由SELEX(指数富集性配体系统进化， Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术筛选得到的一段 寡核苷酸序列。由于单链寡核苷酸序列容易形成发卡、假结、G-四连体等二级结构，故能 与靶分子如药物，蛋白质，其他无机或有机分子高亲和力特异性结合。相对于抗体，适配体 存在多种优势，包括其稳定性，低免疫原性，强组织渗透性，高一致性，不需要动物等，故适 配体作为分析识别元件在检测，诊断和治疗方面都很有前景。据报道，NHI研宄团队已经 通过SELEX技术筛选得到一条与STX特异结合的DNA适配体，APTSTX1，可以成为STX快速 高通量检测中候选的分析识别元件APTstxi的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示（Handy，S. M. , Yakesj B. J. , DeGrassej J. a, Campbell, K. , Elliott, C. T. , Kanyuckj K. M. , Degrassej S. L First report of the use of a saxitoxin-protein conjugate to develop a DNA aptamer to a small molecule 如1；[11.1'01；!_(3011.2013,61，30 - 37)。然而，关于该适配体的 亲和常数检测、优化及应用尚无相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体。本发明 的另一目的是提供该适配体在制备样品中痕量STX的分离富集试剂中、在制备石房蛤毒素 检测试剂或试剂盒中、在制备预防或治疗石房蛤毒素中毒药物中，以及在制备去除水体中 石房蛤毒素制剂中等多方面的应用。
[0007] 本发明的主要技术方案是：以APTstxi为基础，通过突变和截短的方法进行优化得 到一条特异性结合STX的高亲和力适配体，命名为M-30f。该寡核苷酸适配体可用于样品中 痕量STX的分离富集，STX的分析检测，中和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物的制 备，以及水体中毒素的去除。
[0008] 本发明的第一方面，是提供了一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体 (M-30f)，其核苷酸序列如下：
[0009] 5'-TTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACAGGTTCATTG-3'（SEQ ID NO :2)。
[0010] 本发明所述的寡核苷酸适配体，在其5'端或3'端可以进行FITC、氨基、生物素或 地高辛化学修饰。
[0011] 2013年，NHI研宄团队通过磁珠法筛选得到可以与小分子STX相结合的适配体 APTSTX1，APTstxi的核苷酸序列如下：
[0012] 5 ' -GGTATTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGTAGATGGCTC TAACTCTCCTCT-3'（SEQ ID N0:1)。
[0013] 本发明首先对APTsm进行突变，期望从中找到亲和力更高而并未通过SELEX筛选 出来的序列。我们设计了多条突变序列（包括单点突变及多点突变），将鸟嘌呤核苷酸任 一端或两端的核苷酸也突变为鸟嘌呤核苷酸，因为鸟嘌呤核苷酸为G-四联体结构所必需。 借助QGRS Mapper软件进行结构预测，我们将可能折叠成G-四联体结构的序列进行合成并 采用生物膜干涉的方法进行亲和力测定。与原始序列相比，其中部分序列亲和力得到提高， 而亲和力最高的是M-30，128nM，比APT sm提高了 30倍。在此基础上，我们对M-30进行进 一步截短，分别将两端的游离序列和茎-环结构逐个移除，并进行亲和力测定。通过对这些 截短序列的结构与亲和力之间的关系进行分析，我们发现其结合STX的核心序列是5'端的 两个茎-环结构。将其他多余的核苷酸移除后，我们得到M-30f，通过生物膜干涉的方法测 得其Kd值为133nM，保留了与STX的高亲和力。并且该适配体与STX的基因类似物GTX2, 3 并不结合，表现出与STX结合的高特异性。
[0014] 本发明的第二方面，是提供了上述适配体M-30f在制备样品中STX的分离富集试 剂中的应用。
[0015] 本发明还提供了上述适配体M_30f在制备石房蛤毒素检测试剂或试剂盒中的应 用。所述的试剂或试剂盒可用于快速检测水体或水产品中的STX。
[0016] 本发明还提供了上述适配体M_30f在制备预防或治疗石房蛤毒素中毒药物中的 应用。所述的药物也为中和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物、或为石房蛤毒素拮抗 剂等。所述的药物可以缓解、治愈石房蛤毒素中毒导致的恶心、呕吐、腹泻、神经肌肉麻痹、 呼吸无力、血压下降、心率减慢、心律失常等症状。
[0017] 本发明还提供了上述适配体M-30f在制备去除水体或水产品中石房蛤毒素制剂 中的应用。所述的制剂可以完全去除水体或水产品中的石房蛤毒素，或者降低水体或水产 品中石房蛤毒素的含量使其达到联合国卫生组织和联合国粮农组织规定及推荐的标准以 下。
[0018] 本发明通过多种方法，例如ELISA、细胞生物学分析和小鼠生物检测等，对M-30f 与STX之间的相互作用进行了研宄。研宄发现，M-30f不仅可以与STX结合，还能拮抗STX 的钠离子通道抑制活性。作为STX的分子识别元件，M-30f具有很好的实际应用前景，可以 用于样品中痕量STX的分离富集，石房蛤毒素的快速检测，中和石房蛤毒素钠离子通道抑 制作用的药物的制备，以及水体中毒素的去除。
[0019] 因此，本发明的M_30f面向实际应用具有巨大的潜力。
【附图说明】
[0020] 图1是全长序列M-30经mfold软件预测得到的二级结构。
[0021 ] 图2是M-30的截短序列的模拟二级结构图。
[0022] 图3是M-30f与STX的结合解离曲线。
[0023] 图4是采用ELISA的方法研宄M-30f与STX之间的相互作用的结果。
[0024] 图5是采用细胞学分析的方法对STX进行检测的标准曲线。 图6是采用细胞学分析的方法研宄M-30f与STX之间的相互作用的结果。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0026] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除 非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此 外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实 施方法与材料仅作示范之用。
[0027] 实施例1.适配体APTstxi的突变
[0028] 首先，我们向APTsm序列中引入单点突变。我们将序列中鸟嘌呤核苷酸任意一端 的核苷酸突变为鸟嘌呤核苷酸。通过这种方法，我们得到了 22条单点突变的寡核苷酸序列， 突变的位点分别是 3, 6,8, 12,13, 15, 20, 22, 25, 30, 32, 37, 41，43, 48, 50, 55, 57, 58, 60, 61 和64。根据QGRS Mapper软件预测的结果，22条突变序列中有9条序列（M-6, M-8, M-12， M-13，M-15，M-20，M-22，M-30和M-32)可能形成G-四联体结构。我们将上述的9条序列合 成并采用生物膜干涉技术来评价它们的STX结合能力（见表1)。类似地，我们还引入了多 点突变，将鸟嘌呤核苷酸附近的两个或三个核苷酸替代为鸟嘌呤核苷酸，合成了 6条可能 形成G-四联体结构的序列，并通过生物膜干涉的方法评价其STX结合能力（见表2)。在得 到的众多突变序列中，M-30与STX的亲和力最高。
[0 029] 生物膜干涉技术测定的方法如下：
[0030] 生物膜干涉技术是一种免标记技术。生物膜干涉仪器（OctetRED 96)发射白光到 生物芯片表面并收集光学膜层两个表面的反射光。受到光学膜层厚度的影响，一些频率下， 两个表面的反射光形成了相长干涉（蓝色），而另一些形成了相消干涉（红色）。这些干涉 光被光谱仪所检测到，并形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相位位移强度（nm)显示。因 此，结合到芯片表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位 移，而这种位移直接反映出芯片表面生物膜的厚度。
[0031] 首先，冻干的生物素标记适配体用PBS-T溶解并倍比稀释至1 μM。所有适配体使 用前均需要经过95°C热变性5min后立即0°C复性IOmin的变复性处理过程，以促进它们 的重新折叠，最后4°C放置，以便后期检测分析使用。将适配体，一定浓度的靶分子，缓冲液 各200 μ L分别加入到各反应孔中后，芯片按照设定的程序依次浸入到各反应孔，经过平衡 (PBS-T，Imin)，适配体耦合（适配体，5min)，解离（PBS-T，5min)和平衡（PBS-T，2min)四个 步骤将适配体连接到sSA芯片（包被有链霉亲和素）表面。然后，各芯片分别与不同浓度 的靶分子STX (5 μ M，10 μ M和20 μ M)和非特异性靶分子膝沟藻毒素 GTX2, 3 (20 μ M)进行相 互作用，经过结合和解离过程各5min后得到响应值。生物膜干涉技术中，适配体的偶联和 样本分析采用的缓冲液均为PBS-T。另外设置三个sSA对照芯片，分别只加入适配体，STX/ GTX2, 3,或者两者都不加作为本底对照。对照芯片的响应值借助Octet数据分析软件CFR Part IlVersion 6. X从样品芯片的响应值中扣除，同时采用1 :1的结合模式对响应数据进 行拟合，得到适配体与靶分子之间的结合解离曲线，结合速率常数Kon，解离速率常数Kdis 以及亲和常数Kd值。
[0032] 表1. APTsm及多条单点突变序列的动力学参数
[0033]
[0034] (注：M-6即将APTsm序列中的第6位核苷酸突变为鸟嘌呤核苷酸，其余命名同 此。）
[0035] 表2.多点突变序列QD及其Kd值
[0036]
[0037]
[0038] (注：划线为突变位点。）
[0039] 实施例2.适配体的截短优化
[0040] 利用mfold软件，我们对M-30的二级结构进行了预测，如图1所示。通过将 M-30两端的单链序列或者四个茎-环结构中的任意一个进行移除，我们得到了 5条序列 (M-30a，M-30b，M-30c，M-30d，M-30e ;如图2)，分别合成并采用生物膜干涉技术对其Kd值进 行测定（表3)。
[0041] 五条序列中，M-30a，M-30d和M-30e分别将两端的游离核苷酸，第三个茎-环和第 四个茎-环结构移除，经测定，其Kd值与全长序列M-30的Kd值非常接近。然而，将第一 个或第二个茎-环结构移除后（M-30b、M-30c)，适配体的亲和力显著降低。这表明第一个 和第二个茎-环结构对于靶分子识别非常关键。基于这些结果和我们的推理，我们合成了 M-30f，将第三个和第四个茎-环结构以及两端的冗余核苷酸序列均移除。与预期结果一 致，M-30f的亲和力与全长M-30近似，并未因为截短受到损伤。
[0042] 表3.多条截短序列的动力学参数
[0043]
[0044] 实施例3.利用生物膜干涉技术对M-30f与STX结合的亲和力以及特异性进行分 析
[0045] 利用生物素-链霉亲和素的作用将1 μΜ M_30f偶联到链霉亲和素包被的芯片表 面后，与不同浓度的STX (5 μΜ，10 μΜ，20 μΜ)相互作用并得到相应的响应曲线，利用数据 分析软件采用1:1结合模式对不同浓度STX的响应曲线进行拟合，得到两者相互作用的结 合解离曲线，如图3, Kd值为133ηΜ。此外，以GTX2,3(20yM)为靶分子采用生物膜干涉技 术进行分析时，并未观察到响应。这表明M-30f并未与GTX2, 3产生交叉反应，保留了其针 对STX的特异性。
[0046] 实施例4.采用酶联免疫吸附实验（ELISA)的方法对M-30f与STX之间的相互作 用进行研宄
[0047] 本实施例中采用的是直接竞争性ELISA方法，96孔板表面包被了二抗（羊抗兔抗 体）。样品中的STX与酶标STX竞争溶液中的兔抗STX抗体上的结合位点。然后STX抗体 与96孔板上包被的羊抗兔抗体结合。通过清洗和底物的加入，得到蓝色信号。信号的强度 与样品中的STX浓度呈反比。显色一定时间后，终止反应，利用酶标仪检测450nm的吸光度 值。利用标准曲线得出样品中毒素的浓度。每个样品，对照或标准品，均三复孔检测。
[0048] 将变复性处理后的适配体（ΚΓ8, KT7和I(T6M))与(λ 8ng/ml STX室温共孵育30min 后，利用超滤离心管（3kD，0. 5ml，12000rpm 30min)分离得到游离的STX，再通过直接竞争 性ELISA的方法检测游离的STX浓度。由于超滤管的使用，避免了适配体直接加入到ELISA 反应体系中时与酶标毒素的结合导致的潜在干扰。结果如图4所示，M-30f可以与STX结 合；由于M-30f的结合以及超滤作用，导致游离STX量的减少；M-30f及M-30f-STX均被截 留在超滤浓缩液中。
[0049] 实施例5.采用细胞学分析的方法对M_30f与STX之间的相互作用进行研宄
[0050] 首先建立Neur〇-2a细胞模型用于STX的检测。Neur〇-2a细胞用加入10%胎牛 血清，2mM谷氨酰胺，ImM丙酮酸钠，50U/ml青霉素、50 μ g/ml链霉素的RPMI-1640完全培 养基，在37°C，5% C02条件下培养。藜芦定（veratridine，钠离子通道激动剂）和卩圭巴因 (ouabain，钠泵抑制剂）联合使用可以开放多种细胞的钠离子通道导致细胞死亡。而STX能 阻断藜芦定、哇巴因的开放钠离子通道的作用，从而保护细胞。选择对数生长期的Ne Ur〇-2a 细胞进行胰酶消化，培养基稀释后细胞计数，铺板，每孔200 μ L，10000个细胞。置于培养箱 中培养24h后将96孔板中旧培养基弃掉，加入待检测样品，用新鲜培养基补足至200 μ L。 每组3复孔。设立空白对照：培养基；阴性对照：哇巴因、藜芦定单独作用于细胞，终浓度 分别为lmM，〇. ImM ;阳性对照：唾巴因、藜芦定共同作用于细胞。每组五复孔，哇巴因、藜芦 定、STX样品均加入10 μ L，用培养基补足至200 μ L。继续培养24h后进行细胞增殖-毒性 检测实验（CCK-8)显色，将原有的培养基弃掉，用多通道移液器加入200 μ L新鲜培养基和 20 μ LCCK-8试剂，注意不要在孔中形成气泡，将培养板再放在细胞培养箱中孵育45-60min 后用酶标仪检测OD45tl。作标准曲线，如图5所示，随着STX的浓度升高，对钠离子通道的阻 断作用增强，细胞存活数增多，450nm波长处的吸光度增强。结果表明，Neur〇-2a细胞模型 已经成功建立。
[0051] 将不同浓度的STX(0. 2, 0. 8和3. 2ng/孔）与经过变复性处理的10_7mol/L适配 体（M-30f)室温孵育30分钟后，一同作为检测样品加入到Ne Ur〇-2a细胞模型中进行检测。 STX(0. 2,0. 8和3. 2ng/well)单独加入到反应体系中作为对照。观察适配体的加入是否影 响毒素对Neur〇-2a细胞的保护作用，从而研宄适配体与STX之间的相互作用。结果如图6 所示，M-30f的加入导致了细胞活力的下降。这表明M-30f可以与STX结合，并拮抗STX的 钠离子通道抑制活性，阻断STX的保护作用。
[0052] 实施例6.采用小鼠生物学分析法对M_30f与STX之间的相互作用进行研宄
[0053] 每组六只雌性ICR小鼠，体重19. 6±0. 4克（约4周龄），分别将300 μ L不同浓 度的STX (12. 75,12,11. 25,10. 5,9. 75 μ g/kg)滤出液静脉注射给药，观察每组的小鼠存活 率。随着毒素的剂量升高，组内小鼠的存活数目减少，即存活率下降（表4)。当给予的STX 剂量为11. 25 μ g/kg时，组内的6只小鼠5只死亡；该浓度在后期的研宄中作为对照浓度。 随后，为了排除适配体本身的毒性效应，我们将4.95mg/kg适配体（M-30f)单独静脉注射， 未出现致死效应。以STX(11. 25 μ g/kg)超滤滤出液为对照，将STX(11. 25 μ g/kg)与适配 体（M-30f，4.95mg/kg)共同孵育后的超滤液进行静脉注射，并未造成小鼠死亡。这表明， M-30f与STX可以结合，并且一部分STX以适配体-毒素复合物的形式被截留在浓缩液中， 直接导致给予小鼠的STX剂量的减少。
[0054] 表4.不同剂量STX对小鼠的相对毒性
[0055]
[0056] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 与石房蛤毒素特异性结合的适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2. 根据权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体，其特征在于，在该适配 体的5'端或3'端进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。3. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备样品中痕量STX的分 离富集试剂中的应用。4. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备石房蛤毒素检测试 剂或试剂盒中的应用。5. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备预防或治疗石房蛤 毒素中毒药物中的应用。6. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备中和石房蛤毒素钠 离子通道抑制作用的药物中的应用。7. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备去除水体或水产品 中石房蛤毒素制剂中的应用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，提供了一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体，该单链DNA适配体的序列为SEQ ID NO：2。通过对体外筛选出来的适配体进行突变和截短获得了具有更高亲和力且特异识别石房蛤毒素的单链寡核苷酸适配体。该适配体具有广阔的应用前景，可以用于样品中痕量STX的分离富集，石房蛤毒素的快速检测，中和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物的制备，以及水体中毒素的去除。
【IPC分类】G01N33/53, C12N15/115, C02F1/58, A23L1/015, A61P39/02, A61K31/7088
【公开号】CN104894135
【申请号】CN201510209821
【发明人】郑欣, 胡波, 高顺祥, 刘德婧, 孙铭娟, 王梁华, 焦炳华
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月28日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一条经突变和截短优化获得的与石房蛤毒素 特异性结合的高亲和力适配体，为样品中痕量STX的分离富集，石房蛤毒素的快速检测，中 和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物的制备，以及水体中毒素的去除奠定了基础。
【背景技术】
[0002] 石房蛤毒素（Saxitoxin，STX)属于麻痹性贝类毒素家族，为胍胺类神经性毒素， 是目前已知的最强有力的小分子神经毒素之一。它来源于多种淡水蓝细菌和海洋甲藻，通 过食物链蓄积于贝类、蟹类等水产品中，主要通过阻断可兴奋细胞表面的钠离子通道，使细 胞膜失去极化状态，从而阻断神经肌肉的传导，导致人类和海洋动物产生麻痹性贝类中毒。 小鼠腹腔注射、静脉注射以及口服的半数致死量LD 5tl分别是S-IOyg kg'3.4yg kg<和 260 yg kg'世界各地都有包括STX在内的麻痹性贝类毒素分布，尤其是欧洲及北美一些 国家。我国东南沿海一带地区也经常发生食用有毒蛤类、螺类、贝类引发的人中毒事件。为 了保证人类的健康不受威胁，对石房蛤毒素进行监测显得尤为重要。联合国卫生组织和联 合国粮农组织规定及推荐的标准是80 μ gSTXeq/lOOg，即每一百克贝类软组织中PSP毒性 的STX当量不得高于80 μ g。
[0003] 人类多因误食含STX的贝类等海产品而发生中毒，中毒症状往往因食入的量不同 而不同。轻度中毒表现为恶心、呕吐、腹泻，局部皮肤有麻或刺痛感。重度中毒后，表现为神 经肌肉麻痹，随意肌无力，呼吸肌收缩无力，血压下降，心率减慢，心律失常，患者多感到身 体有漂浮感，严重中毒15min内就可死亡，STX中毒的死亡率约为10%左右。对STX中毒目 前没有特效药，临床上主要是采取催吐、洗胃，用活性炭吸附胃内的毒素。4-氨基吡啶可以 拮抗STX的毒性作用，起到治疗效果，但4-氨基吡啶毒副作用大，安全剂量范围小。
[0004] 鉴于STX的高危害性和分布的广泛性，世界各国均将其列为水产品安全检 验的必检项目。长期以来一直用于STX检测的方法是国际上公认的小鼠生物学分析 (Jellett, J. F. , Stewartm, J. E. , Laycock, Μ. V. Toxicological evaluation of saxitoxin, neosaxitoxin, gonyautoxin II, gonyautoxin II plus III and decarba-moylsaxitoxin with the mouse neuroblastoma cell bioassay· Toxicol. In Vitrol995,9 :57 - 65.)〇然 而，为了减少动物的使用，我们仍需要建立快速，高通量的筛选方法，从而有效的监测STX。 对于一种快速检测方法而言，最关键的部分是STX的识别元件，如常用的抗体和受体等。然 而，目前常用的识别元件仍存在多种不足，例如，抗体的制备有限和动物的使用等。
[0005] 核酸适配体是从随机寡核苷酸序列库中经由SELEX(指数富集性配体系统进化， Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术筛选得到的一段 寡核苷酸序列。由于单链寡核苷酸序列容易形成发卡、假结、G-四连体等二级结构，故能 与靶分子如药物，蛋白质，其他无机或有机分子高亲和力特异性结合。相对于抗体，适配体 存在多种优势，包括其稳定性，低免疫原性，强组织渗透性，高一致性，不需要动物等，故适 配体作为分析识别元件在检测，诊断和治疗方面都很有前景。据报道，NHI研宄团队已经 通过SELEX技术筛选得到一条与STX特异结合的DNA适配体，APTSTX1，可以成为STX快速 高通量检测中候选的分析识别元件APTstxi的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示（Handy，S. M. , Yakesj B. J. , DeGrassej J. a, Campbell, K. , Elliott, C. T. , Kanyuckj K. M. , Degrassej S. L First report of the use of a saxitoxin-protein conjugate to develop a DNA aptamer to a small molecule 如1；[11.1'01；!_(3011.2013,61，30 - 37)。然而，关于该适配体的 亲和常数检测、优化及应用尚无相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体。本发明 的另一目的是提供该适配体在制备样品中痕量STX的分离富集试剂中、在制备石房蛤毒素 检测试剂或试剂盒中、在制备预防或治疗石房蛤毒素中毒药物中，以及在制备去除水体中 石房蛤毒素制剂中等多方面的应用。
[0007] 本发明的主要技术方案是：以APTstxi为基础，通过突变和截短的方法进行优化得 到一条特异性结合STX的高亲和力适配体，命名为M-30f。该寡核苷酸适配体可用于样品中 痕量STX的分离富集，STX的分析检测，中和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物的制 备，以及水体中毒素的去除。
[0008] 本发明的第一方面，是提供了一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体 (M-30f)，其核苷酸序列如下：
[0009] 5'-TTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACAGGTTCATTG-3'（SEQ ID NO :2)。
[0010] 本发明所述的寡核苷酸适配体，在其5'端或3'端可以进行FITC、氨基、生物素或 地高辛化学修饰。
[0011] 2013年，NHI研宄团队通过磁珠法筛选得到可以与小分子STX相结合的适配体 APTSTX1，APTstxi的核苷酸序列如下：
[0012] 5 ' -GGTATTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGTAGATGGCTC TAACTCTCCTCT-3'（SEQ ID N0:1)。
[0013] 本发明首先对APTsm进行突变，期望从中找到亲和力更高而并未通过SELEX筛选 出来的序列。我们设计了多条突变序列（包括单点突变及多点突变），将鸟嘌呤核苷酸任 一端或两端的核苷酸也突变为鸟嘌呤核苷酸，因为鸟嘌呤核苷酸为G-四联体结构所必需。 借助QGRS Mapper软件进行结构预测，我们将可能折叠成G-四联体结构的序列进行合成并 采用生物膜干涉的方法进行亲和力测定。与原始序列相比，其中部分序列亲和力得到提高， 而亲和力最高的是M-30，128nM，比APT sm提高了 30倍。在此基础上，我们对M-30进行进 一步截短，分别将两端的游离序列和茎-环结构逐个移除，并进行亲和力测定。通过对这些 截短序列的结构与亲和力之间的关系进行分析，我们发现其结合STX的核心序列是5'端的 两个茎-环结构。将其他多余的核苷酸移除后，我们得到M-30f，通过生物膜干涉的方法测 得其Kd值为133nM，保留了与STX的高亲和力。并且该适配体与STX的基因类似物GTX2, 3 并不结合，表现出与STX结合的高特异性。
[0014] 本发明的第二方面，是提供了上述适配体M-30f在制备样品中STX的分离富集试 剂中的应用。
[0015] 本发明还提供了上述适配体M_30f在制备石房蛤毒素检测试剂或试剂盒中的应 用。所述的试剂或试剂盒可用于快速检测水体或水产品中的STX。
[0016] 本发明还提供了上述适配体M_30f在制备预防或治疗石房蛤毒素中毒药物中的 应用。所述的药物也为中和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物、或为石房蛤毒素拮抗 剂等。所述的药物可以缓解、治愈石房蛤毒素中毒导致的恶心、呕吐、腹泻、神经肌肉麻痹、 呼吸无力、血压下降、心率减慢、心律失常等症状。
[0017] 本发明还提供了上述适配体M-30f在制备去除水体或水产品中石房蛤毒素制剂 中的应用。所述的制剂可以完全去除水体或水产品中的石房蛤毒素，或者降低水体或水产 品中石房蛤毒素的含量使其达到联合国卫生组织和联合国粮农组织规定及推荐的标准以 下。
[0018] 本发明通过多种方法，例如ELISA、细胞生物学分析和小鼠生物检测等，对M-30f 与STX之间的相互作用进行了研宄。研宄发现，M-30f不仅可以与STX结合，还能拮抗STX 的钠离子通道抑制活性。作为STX的分子识别元件，M-30f具有很好的实际应用前景，可以 用于样品中痕量STX的分离富集，石房蛤毒素的快速检测，中和石房蛤毒素钠离子通道抑 制作用的药物的制备，以及水体中毒素的去除。
[0019] 因此，本发明的M_30f面向实际应用具有巨大的潜力。
【附图说明】
[0020] 图1是全长序列M-30经mfold软件预测得到的二级结构。
[0021 ] 图2是M-30的截短序列的模拟二级结构图。
[0022] 图3是M-30f与STX的结合解离曲线。
[0023] 图4是采用ELISA的方法研宄M-30f与STX之间的相互作用的结果。
[0024] 图5是采用细胞学分析的方法对STX进行检测的标准曲线。 图6是采用细胞学分析的方法研宄M-30f与STX之间的相互作用的结果。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0026] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除 非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此 外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实 施方法与材料仅作示范之用。
[0027] 实施例1.适配体APTstxi的突变
[0028] 首先，我们向APTsm序列中引入单点突变。我们将序列中鸟嘌呤核苷酸任意一端 的核苷酸突变为鸟嘌呤核苷酸。通过这种方法，我们得到了 22条单点突变的寡核苷酸序列， 突变的位点分别是 3, 6,8, 12,13, 15, 20, 22, 25, 30, 32, 37, 41，43, 48, 50, 55, 57, 58, 60, 61 和64。根据QGRS Mapper软件预测的结果，22条突变序列中有9条序列（M-6, M-8, M-12， M-13，M-15，M-20，M-22，M-30和M-32)可能形成G-四联体结构。我们将上述的9条序列合 成并采用生物膜干涉技术来评价它们的STX结合能力（见表1)。类似地，我们还引入了多 点突变，将鸟嘌呤核苷酸附近的两个或三个核苷酸替代为鸟嘌呤核苷酸，合成了 6条可能 形成G-四联体结构的序列，并通过生物膜干涉的方法评价其STX结合能力（见表2)。在得 到的众多突变序列中，M-30与STX的亲和力最高。
[0 029] 生物膜干涉技术测定的方法如下：
[0030] 生物膜干涉技术是一种免标记技术。生物膜干涉仪器（OctetRED 96)发射白光到 生物芯片表面并收集光学膜层两个表面的反射光。受到光学膜层厚度的影响，一些频率下， 两个表面的反射光形成了相长干涉（蓝色），而另一些形成了相消干涉（红色）。这些干涉 光被光谱仪所检测到，并形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相位位移强度（nm)显示。因 此，结合到芯片表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位 移，而这种位移直接反映出芯片表面生物膜的厚度。
[0031] 首先，冻干的生物素标记适配体用PBS-T溶解并倍比稀释至1 μM。所有适配体使 用前均需要经过95°C热变性5min后立即0°C复性IOmin的变复性处理过程，以促进它们 的重新折叠，最后4°C放置，以便后期检测分析使用。将适配体，一定浓度的靶分子，缓冲液 各200 μ L分别加入到各反应孔中后，芯片按照设定的程序依次浸入到各反应孔，经过平衡 (PBS-T，Imin)，适配体耦合（适配体，5min)，解离（PBS-T，5min)和平衡（PBS-T，2min)四个 步骤将适配体连接到sSA芯片（包被有链霉亲和素）表面。然后，各芯片分别与不同浓度 的靶分子STX (5 μ M，10 μ M和20 μ M)和非特异性靶分子膝沟藻毒素 GTX2, 3 (20 μ M)进行相 互作用，经过结合和解离过程各5min后得到响应值。生物膜干涉技术中，适配体的偶联和 样本分析采用的缓冲液均为PBS-T。另外设置三个sSA对照芯片，分别只加入适配体，STX/ GTX2, 3,或者两者都不加作为本底对照。对照芯片的响应值借助Octet数据分析软件CFR Part IlVersion 6. X从样品芯片的响应值中扣除，同时采用1 :1的结合模式对响应数据进 行拟合，得到适配体与靶分子之间的结合解离曲线，结合速率常数Kon，解离速率常数Kdis 以及亲和常数Kd值。
[0032] 表1. APTsm及多条单点突变序列的动力学参数
[0033]
[0034] (注：M-6即将APTsm序列中的第6位核苷酸突变为鸟嘌呤核苷酸，其余命名同 此。）
[0035] 表2.多点突变序列QD及其Kd值
[0036]
[0037]
[0038] (注：划线为突变位点。）
[0039] 实施例2.适配体的截短优化
[0040] 利用mfold软件，我们对M-30的二级结构进行了预测，如图1所示。通过将 M-30两端的单链序列或者四个茎-环结构中的任意一个进行移除，我们得到了 5条序列 (M-30a，M-30b，M-30c，M-30d，M-30e ;如图2)，分别合成并采用生物膜干涉技术对其Kd值进 行测定（表3)。
[0041] 五条序列中，M-30a，M-30d和M-30e分别将两端的游离核苷酸，第三个茎-环和第 四个茎-环结构移除，经测定，其Kd值与全长序列M-30的Kd值非常接近。然而，将第一 个或第二个茎-环结构移除后（M-30b、M-30c)，适配体的亲和力显著降低。这表明第一个 和第二个茎-环结构对于靶分子识别非常关键。基于这些结果和我们的推理，我们合成了 M-30f，将第三个和第四个茎-环结构以及两端的冗余核苷酸序列均移除。与预期结果一 致，M-30f的亲和力与全长M-30近似，并未因为截短受到损伤。
[0042] 表3.多条截短序列的动力学参数
[0043]
[0044] 实施例3.利用生物膜干涉技术对M-30f与STX结合的亲和力以及特异性进行分 析
[0045] 利用生物素-链霉亲和素的作用将1 μΜ M_30f偶联到链霉亲和素包被的芯片表 面后，与不同浓度的STX (5 μΜ，10 μΜ，20 μΜ)相互作用并得到相应的响应曲线，利用数据 分析软件采用1:1结合模式对不同浓度STX的响应曲线进行拟合，得到两者相互作用的结 合解离曲线，如图3, Kd值为133ηΜ。此外，以GTX2,3(20yM)为靶分子采用生物膜干涉技 术进行分析时，并未观察到响应。这表明M-30f并未与GTX2, 3产生交叉反应，保留了其针 对STX的特异性。
[0046] 实施例4.采用酶联免疫吸附实验（ELISA)的方法对M-30f与STX之间的相互作 用进行研宄
[0047] 本实施例中采用的是直接竞争性ELISA方法，96孔板表面包被了二抗（羊抗兔抗 体）。样品中的STX与酶标STX竞争溶液中的兔抗STX抗体上的结合位点。然后STX抗体 与96孔板上包被的羊抗兔抗体结合。通过清洗和底物的加入，得到蓝色信号。信号的强度 与样品中的STX浓度呈反比。显色一定时间后，终止反应，利用酶标仪检测450nm的吸光度 值。利用标准曲线得出样品中毒素的浓度。每个样品，对照或标准品，均三复孔检测。
[0048] 将变复性处理后的适配体（ΚΓ8, KT7和I(T6M))与(λ 8ng/ml STX室温共孵育30min 后，利用超滤离心管（3kD，0. 5ml，12000rpm 30min)分离得到游离的STX，再通过直接竞争 性ELISA的方法检测游离的STX浓度。由于超滤管的使用，避免了适配体直接加入到ELISA 反应体系中时与酶标毒素的结合导致的潜在干扰。结果如图4所示，M-30f可以与STX结 合；由于M-30f的结合以及超滤作用，导致游离STX量的减少；M-30f及M-30f-STX均被截 留在超滤浓缩液中。
[0049] 实施例5.采用细胞学分析的方法对M_30f与STX之间的相互作用进行研宄
[0050] 首先建立Neur〇-2a细胞模型用于STX的检测。Neur〇-2a细胞用加入10%胎牛 血清，2mM谷氨酰胺，ImM丙酮酸钠，50U/ml青霉素、50 μ g/ml链霉素的RPMI-1640完全培 养基，在37°C，5% C02条件下培养。藜芦定（veratridine，钠离子通道激动剂）和卩圭巴因 (ouabain，钠泵抑制剂）联合使用可以开放多种细胞的钠离子通道导致细胞死亡。而STX能 阻断藜芦定、哇巴因的开放钠离子通道的作用，从而保护细胞。选择对数生长期的Ne Ur〇-2a 细胞进行胰酶消化，培养基稀释后细胞计数，铺板，每孔200 μ L，10000个细胞。置于培养箱 中培养24h后将96孔板中旧培养基弃掉，加入待检测样品，用新鲜培养基补足至200 μ L。 每组3复孔。设立空白对照：培养基；阴性对照：哇巴因、藜芦定单独作用于细胞，终浓度 分别为lmM，〇. ImM ;阳性对照：唾巴因、藜芦定共同作用于细胞。每组五复孔，哇巴因、藜芦 定、STX样品均加入10 μ L，用培养基补足至200 μ L。继续培养24h后进行细胞增殖-毒性 检测实验（CCK-8)显色，将原有的培养基弃掉，用多通道移液器加入200 μ L新鲜培养基和 20 μ LCCK-8试剂，注意不要在孔中形成气泡，将培养板再放在细胞培养箱中孵育45-60min 后用酶标仪检测OD45tl。作标准曲线，如图5所示，随着STX的浓度升高，对钠离子通道的阻 断作用增强，细胞存活数增多，450nm波长处的吸光度增强。结果表明，Neur〇-2a细胞模型 已经成功建立。
[0051] 将不同浓度的STX(0. 2, 0. 8和3. 2ng/孔）与经过变复性处理的10_7mol/L适配 体（M-30f)室温孵育30分钟后，一同作为检测样品加入到Ne Ur〇-2a细胞模型中进行检测。 STX(0. 2,0. 8和3. 2ng/well)单独加入到反应体系中作为对照。观察适配体的加入是否影 响毒素对Neur〇-2a细胞的保护作用，从而研宄适配体与STX之间的相互作用。结果如图6 所示，M-30f的加入导致了细胞活力的下降。这表明M-30f可以与STX结合，并拮抗STX的 钠离子通道抑制活性，阻断STX的保护作用。
[0052] 实施例6.采用小鼠生物学分析法对M_30f与STX之间的相互作用进行研宄
[0053] 每组六只雌性ICR小鼠，体重19. 6±0. 4克（约4周龄），分别将300 μ L不同浓 度的STX (12. 75,12,11. 25,10. 5,9. 75 μ g/kg)滤出液静脉注射给药，观察每组的小鼠存活 率。随着毒素的剂量升高，组内小鼠的存活数目减少，即存活率下降（表4)。当给予的STX 剂量为11. 25 μ g/kg时，组内的6只小鼠5只死亡；该浓度在后期的研宄中作为对照浓度。 随后，为了排除适配体本身的毒性效应，我们将4.95mg/kg适配体（M-30f)单独静脉注射， 未出现致死效应。以STX(11. 25 μ g/kg)超滤滤出液为对照，将STX(11. 25 μ g/kg)与适配 体（M-30f，4.95mg/kg)共同孵育后的超滤液进行静脉注射，并未造成小鼠死亡。这表明， M-30f与STX可以结合，并且一部分STX以适配体-毒素复合物的形式被截留在浓缩液中， 直接导致给予小鼠的STX剂量的减少。
[0054] 表4.不同剂量STX对小鼠的相对毒性
[0055]
[0056] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 与石房蛤毒素特异性结合的适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2. 根据权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体，其特征在于，在该适配 体的5'端或3'端进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。3. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备样品中痕量STX的分 离富集试剂中的应用。4. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备石房蛤毒素检测试 剂或试剂盒中的应用。5. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备预防或治疗石房蛤 毒素中毒药物中的应用。6. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备中和石房蛤毒素钠 离子通道抑制作用的药物中的应用。7. 如权利要求1所述的与石房蛤毒素特异性结合的适配体在制备去除水体或水产品 中石房蛤毒素制剂中的应用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，提供了一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体，该单链DNA适配体的序列为SEQ ID NO：2。通过对体外筛选出来的适配体进行突变和截短获得了具有更高亲和力且特异识别石房蛤毒素的单链寡核苷酸适配体。该适配体具有广阔的应用前景，可以用于样品中痕量STX的分离富集，石房蛤毒素的快速检测，中和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物的制备，以及水体中毒素的去除。
【IPC分类】G01N33/53, C12N15/115, C02F1/58, A23L1/015, A61P39/02, A61K31/7088
【公开号】CN104894135
【申请号】CN201510209821
【发明人】郑欣, 胡波, 高顺祥, 刘德婧, 孙铭娟, 王梁华, 焦炳华
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月28日
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